DE69221086T2

DE69221086T2 - Reagenzzusammensetzungen und ihre Verwendung zur Erzeugung von kugelförmigen roten Blutzellen

Info

Publication number: DE69221086T2
Application number: DE69221086T
Authority: DE
Inventors: Daniel Ben-David; Gregory M Colella; Albert Cupo; Sophie S Fan; Gena Fischer; Grace E Martin; Leonard Ornstein
Original assignee: Bayer AG; Mount Sinai School of Medicine
Current assignee: Bayer AG; Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Priority date: 1991-12-05
Filing date: 1992-11-27
Publication date: 1997-11-13
Anticipated expiration: 2012-11-28
Also published as: EP0545313A1; CA2077790A1; CA2077790C; JP2711786B2; AU2816692A; DK0545313T3; US5284771A; AU661728B2; IL103056A; KR100276145B1; DE69221086D1; ATE155887T1; TW265412B; US5633167A; JPH06180316A; EP0545313B1; ES2104802T3; IL103056A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Reagenszusammensetzungen sowie deren Verwendung bei der Zell-Analyse und insbesondere Reagenszusammensetzungen sowie deren Verwendung bei der Herstellung von Vollblutproben zur verbesserten elektrooptischen Bestimmung des Volumens und/oder der Protein- Konzentration, des Protein-Gehalts und/oder Nucleinsäure-Galts von großen Zahlen von Zellen durch Lichtstreu- und -absorptions- und/oder -fluoreszenz-Fließzytometrieverfahren.
Zu Beginn der Erschließung des Ggebiets der Zytofotometrie, der Wissenschaft der ouantitativen Bestimmung der Eigenschaften individueller Zellen durch Messung ihrer Wechselwirkungen mit Lichstrahlen (gewöhnlich mittels verschiedener Arten von Mikroskopen), legte Caspersson (Caspersson T., Skand. Arch. Physiol., 1936, 73 Suppl. 8, 1-151) dar, daß man durch Fokussieren einer Lichtpunktquelle auf das Zentrum einer sphärischen Zelle sicher war, daß alle optischen Wege durch die Zelle genau dieselben und gleich dem Zelldurchmesser sein würden. Im Prinzip würde dies eine genaue Messung der Konzentration einer Licht-absorbierenden Species von Molekülen aus der gemessenen optischen Dichte der Zelle ermöglichen (Pollister, A.W., und Ornstein, L., "The Photometric Chemical Analysis of Cell", in Mellors, R.C., Ed., Analytical Cytology, 2. Ausgabe, McGraw-Hill, New York, 1959, 431-518). Es vergingen allerdings ca. 50 Jahre, bis dargelegt wurde, daß, durch gezielte und gesteuerte Umwandlung nicht-sphährischer Zellen in perfekte Kugeln, die Analyse von Fließzytometrie-Meßergebnissen von durch Zellen gestreutem Licht stark verbessert werden konnte (siehe Kim und Ornstein sowie Tycko, diskutiert weiter unten) Die weitere Verbesserung bei einer derartigen gezielten Kugelbildung gemäß der vorliegenden Erfindung erweitert die Anwendbarkeit einer gesteuerten Kugelbildung von Zellen nun wesentlich auf eine entsprechende Anwendung zur empfindlichen Messung winziger Mengen absorbierender Moleküle in Zellen durch Absorptions/Streufließzytrometrie sowie für die genaue gleichzeitige Messung von Zellvolumen und Zellgesamtproteinkonzentration (oder äquivalent dazu, von Brechungsindex, Dichte oder Gesamtzellfeststoffen) durch das Tycko- Verfahren.
Bei allen höheren Lebewesen besteht das Blut aus einem wässrigen Flüssiganteil (dem Plasma), worin Korpuskeln verschiedener Arten suspendiert sind: die roten Blutzellen (Erythrozyten), die weißen Blutzellen (Leukozyten) und die Blutplättchen. Plasma weist eine Zusammensetzung aus ungefähr 90% Wasser, 9% Protein, 0,9% Salzen und Spuren anderer Materialien wie Zucker, Harnstoff, Harnsäure und dgl. auf.
Die Zellen oder Korpuskeln des peripheren Bluts (d.h. des Bluts ausserhalb des Knochenmarks) werden in zwei Hauptgruppen eingeteilt: Erythrozyten, deren Primäraufgabe der Transport von Sauerstoff ist, sowie Leukozyten, deren Primärfunktionen das Immunsystem und die Zerstörung körperfremder Materialien betreffen. Zusätzlich zu diesen beiden Hauptgruppen, enthält das Blut auch die sogenannten Blutplättchen, die bei der Hämostasis wichtig sind.
Die Endstufen einer Erythrozyt-Reifung erfolgen nach deren Freisetzung aus dem Knochenmark, wobei diese Zellen im Aussenblut zirkulieren Diese jungen roten Zellen, oder "Reticulozyten", haben ihren Kern verloren, und somit ihre Befähigung zur Teilung oder zur Synthese von Ribonudeinsäure (RNA). Obwohl diese Funktionen aufgehört haben, sind Reticulozyten noch metabolisch aktiv und eine Zeit lang zur Protein-Synthese befähigt, wobei sie Eisen zur Häm-Synthese aufnehmen und die notwendigen metabolischen Reaktionen durchführen, die zur Aufrechterhaltung eines energiereichen Zustands erforderlich sind. Diese Zellen lassen sich gewöhnlich äußerst einfach von reifen Erythrozyten unterscheiden, indem man sie mit Lösungen kationischer Farbstoffe zusammenbringt, die mit der anionischen RNA in den Reticulozyten reagieren und als feines oder grobes gefärbtes "Reticulum" innerhalb der Reticulozyten ausfallen, was den Reticulozyten ihren Namen gibt.
Obwohl Reticulozyten normalerweise ca. 0,5 bis 2% der Gesamtpopulation an roten Blutzellen ausmachen, kann sich dieser Prozentsatz unter abnormen Bedingungen und Zuständen dramatisch verändern. Beispielsweise sind Reticulozyt-Zählungen viele Jahre lang als diagnostische Hilfe bei der Untersuchung von Blutdyscrasien und als ein Index für die Regeneration der roten Blutzellen in der Folge von Hämorrhage sowie zur Verfolgung und Überwachung einer frühen Toxizität bei der Chemotherapie bestimmter bösartiger Krankheiten herangezogen worden.
Nucleinsäuren (RNA und DNA) stellen Polyanionen dar, die praktisch mit jedem kationischen Frbstoff gefärbt werden können. Die RNA in Reticulozyten kann mit lediglich einigen wenigen kationischen Farbstoffen gefärbt werden (einschließlich Brilliant-Kresylblau (BCG), Neu-Methylenblau (NMB), Auramin O (AuO), Acridin-Orange (AO), Thiazol-Orange (TO) und Pyronin Y (PY)). Unter diesen Farbstoffen kann lediglich eine Untergruppe dazu gebracht werden, in die Zellen (und somit zu deren Färbung) rasch einzudringen. Diese Untergruppe schließt NMB und AO ein. Geschwindigkeit und Ausmaß der Färbung von Reticulozyten hängt von der extrazellulären Konzentration des Farbstoffs, der Eindringgeschwindigkeit des Farbstoffs durch die Reticulozyt- Membran sowie von der Stärke der spezifischen Bindungskonstante zwischen dem kationischen Farbstoff und der Reticulozyt-RNA ab. Die letzteren beiden Eigenschaften sind unterschiedlich und nicht leicht vorhersagbar für den jeweiligen Farbstoff, so daß Untersuchungen auf Basis von Versuch und Irrtum notwendig sind, um geeignete Reticulozyt-Färbungen herauszufinden. Nicht alle kationischen Substanzen sind dazu befähigt, in intakte rote Zellen (und Reticulozyt) -Membranen einzudringen, und die Natur der Anionen, die notwendigerweise die Kationen begleiten, kann bewirken, ob oder ob nicht die kationische Substanz rasch, langsam oder überhaupt nicht eindringt. Hydrophobe Moleküle durchdringen im allgemeinen Membranen roter Zellen schneller als hydrophile Moleküle, und kleine Moleküle durchdringen im allgemeinen Membranen schneller als große Moleküle. Lediglich eine Untergruppe von Salzen oder Puffermitteln, welche mit diesen kationischen Farbstoffen vermischt werden, die Reticulozyten zu färben vermögen, ermöglicht eine rasche Färbung; d.h., der "richtige" Farbstoff mit dem "falschen" Puffer kann "für immer" verhindern, Reticulozyten zu färben Erneut sind Versuch und Irrtum notwendig, um geeignete Formulierungen und Zubereitungen von Reticulozytfärbungsmischungen herauszufinden. Somit ist es, trotz verschiedener "Regeln", die als Richtlinien dienen können, noch nicht möglich, von vornherein vorauszusagen, ob und unter welchen Bedingungen ein besonderer kationischer Farbstoff Reticulozyten rasch durchdringen und färben könnte.
Das grundsätzliche Konzept der Fließzytometrie beruht im wesentlichen darauf, daß Zellen, 1 zu einem Zeitpunkt, einen spezifischen Fühlbereich durchlaufen. In typischer Weise durchlaufen, mittels hydrodynamischer Fokussierung, Einzelzellen die Fühlzone, die aus einer fokussierten Lichtquelle und einem Nachweissystem zur Messung gestreuten, absorbierten oder fluoreszenten Lichts besteht.
Der Effekt, den ein Partikel auf das Licht ausübt, das es durchschneidet, kann auf vielen Wegen nachgewiesen werden. Im allgemeinen weist das Partikel einen Brechungsindex auf, der sich von demjenigen des Medium unterscheidet, worin es suspendiert ist. Es wird daher Licht streuen, mit dem es durch eine Reihe von Winkeln hindurch beleuchtet wird, und zwar mit variierenden Intensitäten, die von jener Brechungsindexdifferenz, der Partikelgröße, seiner Form und internen Variationen bei Brechungsindex und Brechungsstruktur sowie von der wellenlänge des Beleuchtungslichts abhängen.
(Für homogene Kugeln liefert die Mie-Streu-Theorie eine vollständige Beschreibung der Verteilung sowie der Intensitäten von gestreutem Licht.) Ein Partikel mag ebenfalls etwas an einfallendem Licht absorbieren. In letzterem Fall mag ein Teil des absorbierten Lichts als Fluoreszenz wieder ausgestrahlt werden, in typischer Weise bei längerer Wellenlänge als der Wellenlänge des absorbierten Lichts.
Diese und andere Effekte können mit Licht-Detektoren gemessen werden, die so angeordnet sind, daß verschiedene Winkelintervalle gestreuten, ungestreuten und fluoreszierten Lichts gemessen werden.
Sind Partikel so klein wie Zellen, in typischer Weise mit einem Durchmesser von weniger als 15 µm, kann die Anzahl an Photonen im Beleuchtungsstrahl, die von ihrem Durchgang bei hoher Geschwindigkeit beeinflußt werden (in typischer Weise Hunderte bis Tausende breiträumiger Zellen pro Sekunde), und insbesondere verglichen mit der Anzahl von Photonen pro Sekunde, die auf den beleuchteten Teil des Suspensionsstroms einfallen, (und verglichen mit der Hintergrundbeleuchtung eines Absorptionsdetektors (und sogar eines Fluoreszenzdetektors)) sehr klein sein. Daher hängt die Empfindlichkeitsgrenze des Nachweises kleiner besonderer Unterschiede zwischen Partikeln in kritischer Weise vom Photonenfluß ab (welcher zumindest von der innewohnenden "Helligkeit" der Lichtquelle abhängt), und wie groß die Perturbationen des Photonenflusses sind, die durch andere kleine und große Unterschiede zwischen den Partikeln erzeugt werden.
Die Hauptquellen eines Störungsrauschens in Absorptions-, Streu- und Fluoreszenzfließzytometriesignalen können ziemlich verschieden für jede Art eines Signals sein. In erster Näherung sind die Größen bzw. Stärken von Fluoreszenzsignalen aus gefärbten oder ungefärbten Zellen nahezu unbeeinflußt von Form oder Orientation der Zellen, aus denen die Signale kommen, wogegen Streu- und Absorptionssignale von Form und Orientation sehr stark beeinflußt werden. Als ein Extrembeispiel übt die native bikonkave Form von Human-Erythrozyten einen tiefreichenden Effekt auf die Absorptions- und Streusignale aus, die sie erzeugen, und zwar Effekte, die größer als die kleinen Absorptionssignale typischer klassich gefärbter Reticulozyten sind (siehe Fig. 8). Dies stellt den Hauptgrund dar, warum, vor dem erfolgreichen Abschluß der vorliegenden Erfindung, Absorptionsfließzytometrieverfahren zur Reticulozyt-Zählung oder ganz allgemein zur Messung niedriger Konzentrationen absorbierender Moleküle in Zellen nicht geeignet waren. Andererseits üben schwach fluoreszierende Materialien in Zellen oder (z.B. ungebundene Fluoreszenzfarbstoffe) in ihrem Umgebungsmedium eigentlich keinen Effekt auf Absorptions- oder Streusignale aus.
Es sind einige halbautomatisierte Verfahren verfügbar&sub1; die zur Zählung des Reticulozyten-Prozentsatzes in einer antikoagulierten Vollblutprobe angewandt werden können. Bei jedem der bestehenden Verfahren wird ein Verdünnungsmittel, das einen organischen kationischen Farbstoff, wie AO, AuO oder TO, enthält, verwendet, um die RNA innerhalb der Reticulozyten zu färben. Der Farbstoff durchdringt die Zellmembran, wird an die RNA gebunden und fällt gewöhnlich ein "Reticulum" innerhalb eines jeden Reticulozyt aus. Die Menge an Signal aus gefärbter RNA ist grob protportioonal dem RNA-Gehalt. Nach sauberer Färbung kann ein Fluoreszenz-Fließzytometer, ausgerüstet mit der geeigneten Anregungslichtquelle (in typischer Weise ein Argonion-Laser, der bei 488 nm emittiert) und mit einem Emissionsdetektionssystem, zur Ermittlung des Prozentsatzes an Reticulozyten im Effluens angewandt werden.
Es sind verschiedene Verfahren zur Untersuchung von Reticulozyten in Vollblutproben unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen und Anwendung von Fließzytometrieverfahren in der Patentliteratur offenbart.
Beispielsweise ist in US 3 684 377 von Adams und Kamentzky eine Farbstoffzusammensetzung zur differentiellen Blutanalyse offenbart, welche eine wässrige Lösung von Acridin-Orange enthält, die einen pH-Faktor und eine Osmolalität innerhalb normaler physiologischer Bereiche für Humanblut aufweist. Die Farbstoffzusammensetzung kann zum Zählen von Reticulozyten verwendet werden, indem man die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Fluoreszenzsignals mit einem Erythrozyt-Streusignal mißt.
Adams offenbart in US 3 883 247 ein dem Verfahren von Adams und Kamentsky ähnliches Verfahren, worin eine Farbstoffzusammensetzung verwendet wird, die Acridin-Orange in einer Konzentration von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;&sup5; g/ml enthält.
In US 4 336 029 von Natale ist eine Reagenszusammensetzung offenbart, die eine wässrige Lösung des Farbstoffs AO, Zitration und Paraformaldehyd bei einem pH von ca. 7,4 und einer isotonischen Osmolalität enthält. Die Konzentrationen der verschiedenen Ingredientien wurden ausgewählt, um die Farbstoff-Aufnahme der Reticulozyten und Plättchen zu maximieren, wobei sich für die Farbstoff-Aufnahme ergibt, daß sie innerhalb 2 bis 5 Minuten der Vermischung der Blutprobe und der Reagenszusammensetzung erfolgt. Ein automatisiertes Verfahren zum Nachweis von Plättchen und Reticulozyten unter Anwendung des Natale-Reagens ist in US 4 325 706 von Gershman et al. offenbart.
Im Reagens gemäß US 4 707 451 von Sage, Jr., werden Reticulozyten mit Thioflavin T oder Chrysanilin gefärbt. Es wurde herausgefunden&sub1; daß eine Vollblutprobe wirksam gefärbt wurde, indem eine 25 µl Anteilsmenge des Farbstoffs in einer isotonischen Sahne-Lösung (0,2 mg/ml) mit 10 µl Antikoaguliertem Vollblut vermischt wurde, wobei die Mischung ca. 7 Minuten lang inkubiert wurde.
In US 4 883 867 offenbaren Lee et al. eine Farbstoffzusammensetzung zur RNA- oder DNA-Färbung. Die Färbezusammensetzung enthält TO als die bevorzugte Farbstoffverbindung. Die Reticulozyten werden in einer Minimalzeit von 30 Minuten gefärbt.
Ein Reagens zur Reticulozyt-Zählung mit Fließzytometrieverfahren ist in US 4 971 917 von Kuroda beschrieben, welches ein Carbonat-Salz enthält, um die nicht-spezifische Färbung der reifen Erythrozyten durch den Farbstoff, z.B. AuO, zu verringern, um zu verhindern, daß die reifen Erythrozyten irrtümlich als Reticulozyten bei der Fluoreszenzfließzytrometrieanalyse gezählt werden.
In US 4 981 803 ist ein Reagens zur Reticulozyt-Zählung beschrieben, welches zwei Lösungen umfaßt, nämlich eine Vorratslösung zur Färbung, worin ein Farbstoff AuO in einem nicht-wässrigen Lösungsmittel gelöst ist, sowie eine Puffer-Lösung, die den optimalen Färbungsbedingungen Genüge leistet.
Ein weiteres Reticulozyt-Färbungsreagens für Fluoreszenz- Fließzytometrieverfahren, enthaltend AuO, offenbaren Kuroda et al. in US 4 985 176. Diese Literaturstelle enthält die technische Lehre einer Inkubationszeit des Reagens und der Probe von irgendwo zwischen 30 Sekunden und 20 Minuten.
Wie oben bereits ausgeführt, vermag nur eine kleine Untergruppe kationischer Farbstoffe Reticulozyten selektiv zu färben, und nur eine noch kleinere Untergruppe dieser Verbindungen durchdringt Reticulozyten rasch. Die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzten kationischen Farbstoffverbindungen vermögen die Reticulozyten in wengier als 5 Minuten zu färben, so daß sich eine auf Basis einer Fließzytometrie durchgeführte Analyse von Reticulozyten ausführen läßt, kurz nachdem die Blutprobe und die Reagenszusammensetzung vermischt worden sind, wodurch sich die vorliegende Erfindung für automatisierte Verfahren gut anwenden läßt.
Quaternierte AO-Derivate zur Quantifizierung von Reticulozyten sind in US 5 075 556 von Fan und Fischer, mit dem Titel "Compounds and Reagent Comositions and Their Use in the Quantitative Determination of Reticulocytes in Whole Blood", beschrieben. Das Reagens von Fan et al. enthält 10&supmin;&sup6;&supmin;g/ml eines AO-Derivats in einer Puffer-Lösung, die Paraformaldehyd und Kahumoxalat enthält. Diese Reagenszusammensetzung färbt Reticulozyten, wodurch die quantitative Fluoreszenzfließzytrometrie-Analyse von Reticulozyten in einer Blutprobe bereitgestellt ist. Weder dieses Reagens noch eines der oben genannten Reagentien enthalten ein Kugelbildungsmittel, um die oben diskutierten Probleme zu verhindern, die im Zusammenhang mit einem Orientierungsrauschen auftreten, und keines ermöglicht die gleichzeitige Bestimmung weiterer diagnostisch signifikatner Parameter wie des Volumen und der Hämoglobin-Konzentration der Reticulozyten und Erytrhozyten auf einer Zelle-für-Zelle-Basis.
Shapiro und Stevens offenbaren die Verwendung von Oxazin 750 zur Bestimmung des DNA-Gehalts durch Fließzytometrie in "Flow Gytometry of DNA Content Using Oxazine 750 or Related Laser Dyes With 633 nm Excitation, Gytometry, Bd. 7, S. 107-110 (1986)". Die Zellen werden mit 10 bis 30 µM Oxazin 750 gefärbt und durch Zugabe von Ethanol für die DNA-Bestimmung fixiert. Shapiro und Stevens beanspruchen, daß Oxazin 750 nicht erscheint bzw. auftritt, um RNA zu färben. Ausserdem ermöglichen solche Protokolle mit Oxazin 750 die Reticulozyt-.Zählung oder eine gleichzeitige Bestimmung weiterer diagnostisch signifikater Parameter roter Blutzellen wie des Volumens und der Hämoglobin-Konzentration auf einer Zelle-für-Zelle-Basis nicht.
Wie oben bereits dargelegt, beruht ein Nachteil der Reticulozyt- Mengenbestimmung durch die Anwendung eines Absorptions- oder Streulichtfließzytometer auf dem Unvermögen, zwischen Orientierungsrauschen und Reticulozyt-Signalen zu unterscheiden. Menschliche rote Blutzellen und viele weitere rote Blutzellen von säugetieren weisen die Form bikonkaver Scheiben auf. Die Menge an durch solche asymmetrischen roten Blutzellen gestreutem Licht schwankt mit der Orientierung der Zelle. Demnach erzeugen zwei identische rote Blutzellen sehr verschiedene Streulicht- und Absorptionssignale, wenn sie die Fuhlzone durchlaufen, es sei denn, ihre Orientierungen in der Zone sind identisch. Das Ergebnis ist, daß die Verteilung von Größen und Stärken von Streu- und Absorptionssignalen für normale rote Zellen sehr breit und bimodal ausfällt (siehe Fig. 8A und 8B). Zwei rote Blutzellen, die identisch sind, mit der Ausnahme, daß in 1 Zelle eine kleine Menge gefärbtes Reticulum vorliegt, erzeugen im allgemeinen große Signalunterschiede auf Streulicht- und Absorptionsdetektoren wegen ihrer unterschiedlichen Orientierungen. Tritt dies ein, wird der sehr kleine Unterschied, den das gefärbte Reticulum erzeugen könnte, im Orientierungsrauschen begraben.
US 4.575.490 und 4.412.004 von Kim und Ornstein lehrt ein Verfahren zur Eliminierung des Orientierungsrauschens bei der Messung des Volumen roter Blutzellen in einem Fließzytometer. Deren Verfahren beinhaltet eine isovolumetrische Kugelbildung ungefärbter roter Blutzellen, um jegliche Orientierungsunterschiede zwischen den Zellen zu eliminieren, um eine präzisere und genauere Messung des Zellvolumen zu ermöglichen. Jede rote Blutzelle wird aus einer bikonkaven Form in eine perfekte Kugel durch ein oberflächenaktives Kugelbildungsmittel überführt. Es werden ein "pufferndes" Protein und/oder ein Aldehyd-Fixierungsmittel zusammen mit dem Kugelbildungsmittel zur Vermeidung einer Lysis der Erythrozyten angewandt und eingesetzt. Die von Kim und Ornstein beschriebenen anionischen oberflächenaktiven Mittel können im Zusammenhang mit Reticulozyt-Färbungen nicht angewandt und eingesetzt werden, weil bei deren Verwendung festgestellt worden ist, daß sie rasch mit den zur Färbung und Fällung des Reticulum verwendeten kationischen Farbstoffen reagieren und diese ausfällen.
In US 4 735 504 von Tycko ist der für rote Blutzellen vorgesehene Kanal des TECHNICON H 1-Systems offenbart, und zwar ein Fließzytometer, das ein voll automatisiertes Verfahren und entsprechende Maßnahmen zur Bestimmung der individuellen und mittleren Erythrozyt-Volumina (MCV) und der individuellen und mittleren Korpuskular-Hämoglobin-Konzentrationen (MCHC) der Erythrozyten in einer antikoagulierten Vollblutprobe bereitstellt. Bei diesem Verfahren werden die roten Blutzellen in einer 2 µl Anteilsmenge einer Vollblutprobe zuerst verdünnt und dann isovolumetrisch unter Anwendung des eben beschriebenen Verfahrens von Kim und Ornstein in die Kugelform überführt. Nach einer Inkubationsdauer von 20 Sekunden werden diese Zellen, im wesentlichen 1 zu jedem Zeitpunkt, durch die beleuchtete Meßzone innerhalb des für die roten Zellen vorgesehenen Kanals des Analysiergeräts geleitet. Größe und Stärke des durch diese Zellen in zwei getrennte Winkelintervalle gestreuten Lichts werden gemessen. Die Auswahl der Lichtquelle und der Detektionswinkel sind bei dieser Anwendungsform kritisch. Ist die Lichtquelle ein Hehum-Neon-Laser, der Licht bei 633 nm ausstrahlt, betragen die zwei gestreuten Lichtsammelwinkelintervalle 2 bis 3 Grad (2º bis 3º) und 5 bis 15 Grad (50 bis 150). Sobald das Ausmaß des gestreuten Lichts in jedem Intervall bekannt für eine Zelle ist, werden das Volumen und die Hämoglobin- Konzentration für diese Zelle durch Vergleich mit durch die Mie-Streu- Theorie vorhergesagten Werten bestimmt. Volumen (V) und Hämoglobin- Konzentration (HC) für jede Zelle werden im Gedächtnis behalten, und die MCV- und MCHC-Werte werden bei der Beendigung des Probenmeßzyklus durch im Stand der Technik bekannte Verfahren berechnet, wie bei Tycko diskutiert. Das V- und HC-Verteilungszytogramm und die V- und HC-Histogramme werden durch diese Berechnungen erstellt.
Keines der obigen Verfahren unterscheidet zwischen Reticulozyten und Nicht-Reticulozyten, und die früher beschriebenen und durchgeführten Verfahren können nicht dazu angewandt werden, die diagnostisch signifikanten Paramter der Reticulozyten und Erythrozyten wie des Volumen und der Hämoglobin-Konzentration auf einer Zelle-für-Zelle-Basis getrennt zu ermitteln und zu bestimmen.
Eine weitere Schwierigkeit bei der Aufzeichnung und Erstellung von Reticulozyt-Zählungen mit einem Fließzytometer beruht auf der Schwierigkeit zwischen Reticulozyt-Detektionssignalen, Signalen reifer roter Blutzellen und dem Systemrauschen zu unterscheiden. Die gefärbten Stränge von RNA sind zahlreich in jungen Reticulozyten und erzeugen Signale relativ großer Stärke beim Nachweis mit einem Fließzytometer. Allerdings enthalten reifere Zellen wenige gefärbte RNA und erzeugen kleinere Signale, die durch das Rauschen des Fließzytometer-Meßsystems maskiert sein können.
Es besteht ein Bedarf für Verfahren und Reagentien, die sich zur Identifizierung von Reticulozyten unter gleichzeitiger Messung, in getrennter Weise, des Volumen, der Hämoglobin-Konzentration und des Hämoglobin-Gehalts von Reticulozyten und Erythrozyten in einer Vollblutprobe durch Lichtstreuund -absorptions- oder -fluoreszenzfließzytometrieverfahren eignen.
Gemäß einer Prämisse der Erfindung wurde ein kationischer Farbstoff in einer Variante des gut bekannten Standes der Technik zur Färbung des Reticulum verwendet. Zusätzlich wurden Fließzytometrieverfahren entwickelt, um Fluoreszenz und/oder Absorption zur Detektion bzw. zum Nachweis von Reticulozyten auszunutzen und anzuwenden. Im Falle der Absorption wurde die Kugelbildung roter Zellen angewandt, um Orientierungsrauschen zu eliminieren (siehe Fig. 8C und 8D). (Es sei angemerkt, daß, wenn kein gleichzeitiges präzises Ermitteln und Messen des ursprünglichen Zellvolumens betroffen ist, es für die Kugelbildung nicht notwendig ist, daß sie isovolumetrisch oder vollständig ausfällt, um das meiste Orientierungsrauschen zu beseitigen.) Unter Anwendung einer isovolumetrischen Kugelbildung und der vorgenannten Verfahren von Tycko für Fluoreszenz- und Absorptionsverfahren sowie eines Reagens, das Reticulozyten auch selektiv färbt, ermöglicht die Erfindung die gleichzeitige Messung des Volumen sowie des Hämoglobin eines Reticulozyt und einer reifen roten Zelle auf einer Zelle-für-Zelle-Basis. (Es sei angemerkt, daß, wenn die Kugelbildung vollständig und nicht isovolumetrisch ist, aber einen bekannten Faktor X der Isotonizität aufweist, worin X von ca. 0,5 bis 2 (von 0,15 bis 0,60 Osm) schwankt, unter Anwendung von Tycko's Verfahren mit einer Korrektur mit 1/x für das Volumen und einer Korrektur mit X für die Protein-(z.B. Hämoglobin)-Konzentration, dann Originalwerte berechnet werden können.)
Zur Anwendung von Tycko's Verfahren wird eine Lichtquelle benötigt, die monochromatisches Licht in einem Bereich ausstrahlt, worin Hämoglobin sehr transparent ist, und zwar in typischer Weise eine Lichtquelle wie ein roter Helium-Neon(HeNe) -Laser oder ein Laser mit einer noch längeren Wellenlänge. Dies bedeutet, daß, falls jene Wellenlänge auch für die Absorptionsmessung eingesetzt wird, der Farbstoff ein blauer Farbstoff mit einer starken Absorption von rotem Licht sein muß.
Es wurden Verwendung und Einsatz nicht-ionischer, kationischer und zwitterionischer oberflächenaktiver Mittel untersucht im Hinblick auf ihre Kompatibilität mit kationischen Farbstoffen und als Kugelbildungsmittel für eine rote Zelle, wie dies durch die technische Lehre von Kim und Ornstein vorgeschlagen wäre. Wie im Verfahren von Kim und Ornstein, wurde ein Protein (in typischer Weise Rinderserumalbumin) verwendet, um die Konzentration der oberflächenaktiven Mittel zu "puffern", um die Lysis einer roten Zelle zu verlangsamen. Eine Anzahl derartiger oberflächenaktiver Mittel (z.B. Triton X100 und Laurylpropylamidobetain) funktionierten zufriedenstellend. Es wurde dabei dann unbeabsichtigt herausgefunden, daß Laurylpropylamidobetain und einige weitere zwitterionischen oberflächenaktiven Mittel (z.B. DDAPS und TDAPS) eine Protein-Pufferung nicht erforderlich machten, um die Lysis roter Zellen zu verzögern, und daß sie ideale alternative Kugelbildungsmittel für alle Arten von Blutzellen für die Verfahren von Kim und Ornstein darstellten. Weil sie keine Protein-Pufferung erforderlich machen, wird es durch sie ermöglicht, daß ein stabiles und einfacheres Reagens bereitgestellt ist, das hergestellt werden soll. (Die Fixierungsstufen von Kim und Ornstein sind nicht länger obligatorisch; außerdem werden die Probleme eines bakteriellen Wachstums in Protein-haltigen Reagentien ebenfalls vermieden.)
Es ist also eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Reagenszusammensetzung sowie ein entsprechendes Verfahren zur Bildung von Zellkugeln in einer Blutprobe bereitzustellen und anzugeben, um (das im Zusammenhang mit dem einschlägigen Nachweisverfahren auftretende) Orientierungsrauschen zu verringern oder zu beseitigen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die obige Reagenszusammensetzung und das Verfahren zur Kugelbildung roter Blutzellen bereitzustellen und anzugeben.
Noch ein Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es, die obige Reagenszusammensetzung und das Verfahren zur gleichzeitigen Kugelbildung roter Blutzellen und von Reticulozyten sowie zur Färbung von Reticulozyten bereitzustellen und anzugeben.
Des weiteren ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die obige Reagenszusammensetzung und das Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung des Volumen, der Hämoglobin-Konzentration und des Hämoglobin-Gehalts von Reticulozyten und Erythrozyten in einer Vollblutprobe durch Absorptions- und Streulichtfließzytometrie bereitzustellen und anzugeben.
Schließlich ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die obige Reagenszusammensetzung und das Verfahren zur gleichzeitigen Unterscheidung zwischen jeweils den roten Blutzellen und den Reticulozyten und zur entsprechenden Zählung innerhalb einer Blutprobe sowie zur Bestimmung des Volumen, des Hämoglobin-Gehalts, der Hämoglobin-Konzentration, des mittleren Erythrozyt-Volumen und der mittleren Korpuskular-Hämoglobin- Konzentration eines jeden Zelltyps, ermittelt aus Messungen auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis, bereitzustellen und anzugeben.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält eine Reagenszusammensetzung einen organischen kationischen Farbstoff zur Färbung der Reticulozyten und eine Puffer-Lösung zur Aufrechterhaltung des pH- Wertes bei ca. 6 bis ca. 9. Der Farbstoff kann der blaue Absorptionsfarbstoff Oxazin 750 (erhältlich von Exciton, Inc. von Dayton, Ohio), der die Struktur aufweist:
oder der blaue Absorptionsfarbstoff Neu-Methylenblau sein, der die Struktur aufweist:
Das Puffersystem der Reagenszusammensetzung enthält geeignete Puffer, um den pH-Wert der Reagenszusammensetzung bei ca. 6 bis ca. 9 zu halten. Die Lösung kann einen oder mehrere der folgenden Bestandteile in der angegebenen Konzentration enthalten, wobei die endgültige Osmolalität mit KCL oder NaCl eingestellt wird, um ca. 250 bis ca. 330 mosm zu ergeben:
Vorzugsweise wird die Lösung zubereitet, um den pH-Wert der Reagenszusammensetzung bei ca. 7 bis ca. 8 zu halten, und sie kann einen oder mehrere der folgenden Bestandteile in den angegebenen Konzentrationsbereichen enthalten, wobei eine Osmolalität von ca. 280 bis ca. 300 mosm eingehalten wird:
Es ist herausgefunden worden, daß die Reagenszusammensetzung bestimmte Anionen und Kationen enthalten sollte, um es zu erleichtern, daß der Farbstoff die Membran einer roten Zelle durchdringt. Derartige Anionen können Bicarbonat, Chlorid, Borat, Barbitat, Oxalat (Ox) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) einschließen. Aber bei nicht allen Anionen ist festgestellt worden, daß sie wirksam sind, das Eindringen des Farbstoffs durch die Zellmembranen hindurch zu fördern. Als beispielsweise eines oder mehrere der folgenden Anionen, wie Malat, Tartrat und Phosphat, in der Reagenszusammensetzung als die einzigen wesentlicheren Anionen enthalten waren, konnte nur eine geringe, wenn überhaupt, Unterscheidung zwischen Reticulozyten und Erythrozyten gemacht werden. Mögliche Kationen schließen Kalium, Natrium, Trishydroxymethylamino(Tris) oder Triethanolamin (TEA) ein.
Die Reagenszusammensetzung kann dazu verwendet werden, Reticulozyten in einer Vollblutprobe unter Anwendung der Verfahrenstechnik einer Streu/Absorptionsfließzytrometrie zu identifizieren. Das Verfahren in seiner breitesten Anwendungsform beinhaltet, daß man eine Anteilsmenge von Vollblut mit einer der obigen Reagenszusammensetzungen vermischt. Nach einer geeigneten Inkubationszeit läßt man dann die Proben/Reagensmischung, 1 Zelle zu einem Zeitpunkt, durch einen spezifischen Fühlbereich des Fließzytometer laufen. Mittels hydrodynamischer Fokussierung durchlaufen einzelne Zellen die Fühlzone, wo sie mit einer fokussierten Lichtquelle mit einer geeigneten Beleuchtungswellenlänge beleuchtet werden. Mindestens 1 Streulichtsignal und mindestens 1 Absorptionssignal werden für die Zellen auf einer Zelle-zu-Zelle-Basis gemessen. Aus diesen Messungen können die Reticulozyten von den Erythrozyten unterschieden werden.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die obige Reagenszusammensetzung ferner ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel, um die roten Blutzellen und Reticulozyten isovolumetrisch einer Kugelbildung zu unterziehen. Das zwitterionische Kugelbildungsmittel ist vorzugsweise ein Akylamidobetain oder ein Alkylbetain wie Lauramidopropylbetain (LAB), Cocoamidopropylbetain (CAPB) und Cocoamidosulfobetain (CASB). Weitere bevorzugte Kugelbildungsmittel sind N-Tetradecyl- N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (TDAPS) und N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (DDAPS). TDAPS und DDAPS sind die am meisten bevorzugten Kugelbildungsmittel, weil sie die stabilste Probenzubereitung ergeben.
Um in wirksamer Weise aus den Reticulozyten und roten Blutzellen innerhalb einer Blutprobe Kugeln isovolumetrisch zu bilden, beträgt die Konzentration des Kugelbildungsmittels in der Reagenszusammensetzung ca. 3,9 bis ca. 148 µg/ml. Vorzugsweise ist das Kugelbildungsmittel in einer Menge von ca. 12 bis ca. 87,5 µg/ml LAB, von ca. 3,9 bis ca. 11,8 µg/ml TDAPS, von ca. 49,3 bis ca. 148 µg/ml DDAPS, von ca. 8,8 bis ca. 17,5 µg/ml CAPB oder von ca. 12,5 bis ca. 15 µg/ml CASB vorhanden.
Gemäß der Erfindung ist herausgefunden worden, daß, in der Gegenwart der oben beschriebenen Puffer-Systeme, die Konzentration von Neu- Methylenblau in der zur Färbung von RNA benötigten Reagenszusammensetzung im Bereich von ca. 10 bis ca. 100 µg/ml liegt.
Ebenfalls ist herausgefunden worden, daß beispielsweise in der Gegenwart der oben beschriebenen Puffer-Systeme die Konzentration von Oxazin 750 in der zur Färbung von RNA erforderlichen Reagenszusammensetzung niedrig ist, d.h. im Bereich von ca. 2 bis ca. 15 µg/ml, und die durch den Puffer gesteigerte Durchdringung führt in den Reticulozyten zu einer Färbung der RNA mit Farbstoff in weniger als 5 Minuten. Eine derartig niedrige Konzentration an Farbstoff minimiert die Nicht-Reticulozyt-Färbung reifer Erythrozyten, was zu einer guten Signaitrennung vom Hintergrundrauschen führt. Eine derartig rasche Färbung macht die Reagenszusammensetzung in hohem Maße kompatibel mit automatisierten Verfahren.
Durchläuft diese Vollblut-Reagenszusammensetzungsmischung den Fühlbereich eines Fließzytometer, wird das von jeder Zelle gestreute und absorbierte Licht gemessen, die Erythrozyten lassen sich von Reticulozyten unterscheiden, und das Volumen und die Hämoglobin-Konzentration jedes Reticulozyt oder Erythrozyt kann ermittelt und bestimmt werden. Die Anzahl an Reticulozyten und Erythrozyten und der Hämoglobin-Gehalt, das mittlere Zellvolumen, die mittlere Korpuskular-Hämoglobin-Konzentration und das mittlere Zellhämoglobin der Reticulozyten oder Erythrozyten werden aus dem gemessenen Wert für Zelle-zu-Zelle-Volumen und -Hämoglobin-Konzentration berechnet.
Die vorliegende Erfindung umfaßt demgemäß die nachfolgend beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren, wobei der Umfang der Erfindung in den Ansprüchen angegeben ist.
Die obigen und weitere Gegenstände und signifikante Vorteile der vorliegenden Erfindung sollten durch die nun folgende detaillierte Beschreibung davon zusammen mit den beigefügten Zeichnungen klargestellt sein, in denen:
Fig. 1A, 1B und 1C schematische Darstellungen der Beleuchtungsoptiken, Detektionsoptiken bzw. des Detektionssignalprozeßrechnersystems eines Streu/Absorptionsfließzytometer zur Durchführung der Grundzüge der vorliegenden Erfindung sind;
Fig. 2A(1) und 28(1) Zytogramme roter Lichtstreuung gegen Rot- Absorption und Fig. 2A(2) und 28(2) Zytogramme von Rotlicht- Niederwinkelstreuung gegen Rotlicht-Hochwinkelstreuung für eine Vollblutprobe sind, enthaltend partiell in die Kugelform überführte rote Zellen und mit Oxazin 750 bzw. Neu-Methylenblau gefärbte Reticulozyten, gemäß Beispiel 1;
Fig. 3A(1) und 3B(1) Zytogramme von Rotlichtstreuung gegen Rot- Absorption und Fig. 3A(2) und 3B(2) Zytogramme von Rotlicht- Niederwinkelstreuung gegen Rotlicht-Hochwinkelstreuung für eine Vollblutprobe sind, enthaltend vollkommen in die Kugelform überführte rote Zellen und mit Oxazin 750 bzw. Neu-Methylenblau gefärbte Reticulozyten, gemäß Beispiel 2;
Fig. 4A und 4B die Korrelation zwischen den MCV- und MCHC-Daten für mit Oxazin 750-Farbstoff gemäß Beispiel 4 gefärbte Reticulozyten zeigen;
Fig. 5A(1) und 5B(1) Zytogramme von Rotlichtstreuung gegen Rot- Absorption und Fig. 5A(2) und 5B(2) Zytrogramme von Rotlicht- Niederwinkelstreuung gegen Rotlicht-Hochwinkelstreuung für eine Vollblutprobe sind, enthaltend vollkommen in die Kugelform überführte rote Zellen und mit Oxazin 750 bzw. Neu-Methylenblau gefärbte Reticulozyten unter Pseudo-Absorptionskorrektur gemäß Beispiel 3;
Fig. 6 ein Vergleich des Prozentsatzes von Reticulozyten ist, die in einer Vollblutprobe unter Einsatz des Oxazin 750 enthaltenden Reagens der vorliegenden Erfindung sowie unter Anwendung des NCCLS-Bezugsverfahrens nachgewiesen sind, gemäß Beispiel 3;
Fig. 7 ein Zytogramm von HC gegen V mit Reticulozyten, identifiziert durch "+", und mit als " " dargestellten roten Zellen ist; sowie
Fig. 8A und 8B Zytogramme von Rotlichtstreuung gegen Rot-Absorption bzw. von Rotlicht-Hochwinkelstreuung gegen Rotlicht-Niederwinkelstreuung für ungefärbte, nicht in die Kugelform überführte rote Blutzellen sind; Fig. 8C und 8D ähnliche Zytogramme für ungefärbte, in die Kugelform überführte rote Blutzellen sind; Fig. 8C ist bezüglich Pseudo-Absorption korrigiert worden.
Betreffend Fig. 1A und 1B, sind in stilisierter Form funktionale und strukturelle Darstellungen von Teilen einer Fließzytometervorrichtung gezeigt, die zur Durchführung der Prinzipien der vorliegenden Erfindung angewandt werden kann. Tatsächlich stellt die Vorrichtung ein besonderes System dar, das seinerseits wiederum eine Modifikation eines im Handel unter der Handelsbezeichnung TECHNICON H 1 erhältlichen Systems ist, das von der hier auftretenden Bezeichneten verkauft wird.
Die Vorrichtung beinhaltet die Prinzipien einer Fließzytometrie zur Zell-Analyse und schließt die Kapazität zur sensorischen Erfassung der Lichtstreuungs- und Lichtabsorptionsreaktionen von Zellen mit spezifische Beleuchtungstypen ein. Nur diejenigen Komponenten von primärem Belang bezüglich der Erfindung sind gezeigt. Somit veranschaulichen die Zeichnungen nicht alle der mechanischen und elektrischen Elemente, d.h. Motoren, Magnetspulen, Pumpen, Ventile, Sensoren, die zu Antrieb und Steuerung der verschiedenen Komponenten der Vorrichtung erforderlich sind. Alle diese Elemente können jede bekannte, herkömmliche Form aufweisen, die von einem auf dem einschlägigen Gebiet tätigen Durchschnittsfachmann mit Wissen und Erkenntnis der nachfolgend angegebenen Information bezüglich der gewünschten Betriebsart und Verfahrenstechnik der verschiedenen Komponenten in einer Fließzytometrievorrichtung gemäß der Erfindung zur Behandlung der Proben in der beabsichtigten Weise rasch zu realisieren ist.
In den allgemeinsten Begriffen beschrieben, liefern eine Mantel-Strom- Fließzelle und unterstützende Hydraulikelemente zubereitete Zellen zum Punkt der Messung. Die Zellen sind auf ein zylindrisches Volumen begrenzt, das zentral zum Querschnittsflächenfließkanal der Fließzelle fließt bzw. liegt. Die Fließzellenkonstruktion ist identisch mit der im TECHNICON H 1- System eingesetzten. Das Hydrauliksystem ist ziemlich einfach und besteht aus lediglich zwei Peristaltikpumpen und deren verbundener Leitung. Die Schubpumpe und Röhre liefern den Mantelschub mit einer Geschwindigkeit von 1,6 x 10&supmin;&sup7; m³/sec; die Probe wird mit einer Geschwindigkeit von 3,5 x 10&supmin;¹&sup0; m³/sec geliefert; der Fließkanal innerhalb der Fließzelle ist 250 auf 250 µ m groß. Der sich ergebende zylindrische Probenstrom, der axial innerhalb des Schubstroms fließt, weist einen Durchmesser von 7 µm und eine Geschwindigkeit von 2,5 m/s auf.
Das Primärziel ist es, ein optisches System zur Verfügung zu stellen, das eine Absorptionsmessung unterstützt, zusätzlich zu den beiden Streukanälen für die roten Zellen, die durch das TECHNICON H 1-System bereitgestellt sind. Das optische System des Streu/Absorptionsfließzytometer kann ganz allgemein in zwei Untersysteme eingeteilt werden: a) die Beleuchtungsoptiken (Fig. 1A) sowie b) die Detektionsoptiken (Fig. 1B).
Was nun zuerst Fig. 1A betrifft, so ist das optische Beleuchtungssystem ganz allgemein mit der Bezugsziffer 10 bezeichnet und enthält einen Helium-Neon-Laser 12, der einen 2 mW Lichstrahl bei 633 nm ausstrahlt. Dieser Strahl wird durch zwei Reflektionssp£egel 14 und 16 aufgefaltet, welche eine Adjustierung der Laserstrahlposition ergeben. Die Adjustierung befähigt die Strahlachse dazu, mit den physikalischen optischen Achsen der Beleuchtungsoptiken zusammenzufallen. Der Strahl wird dann durch das Paar von Zylinderlinsen 18 und 20 zu einem 192 x 77 µm elliptisch geformten Strahl (beim 1/e²) geformt. Die 192 µm Abmessung wird durch die 150 mm Brennpunktslängenzylinderlinse 18 gebildet, und sie beleuchtet die Längsachse der A-1-Öffnung 22 (die parallel zur Blattebene in Fig. 1A liegt) . Die 77 µ m Abmessung wird durch die 60 mm Brennpunktslängenzylinderlinse 20 gebildet, und sie beleuchtet die kurze Achse der A-1-Öffnung. Die A-1-Öffnung ist 653 x 89 µm groß. Das Beleuchtungsdublett 23 erzeugt eine elliptisch geformte Gaussian-Intesitätsverteilung von 37,4 x 12,6 µm in der Fließzelle 24. Die kürzere Achse der Ellipse liegt parallel zur Fließrichtung, die senkrecht verläuft, d.h. in der Richtung von Pfeil 26.
Zellen, die das Meßvolumen durchlaufen, streuen und absorbieren die einfallende Strahlung. Das gestreute und absorbierte Licht wird in den in Fig. 1B schematisch dargestellten Detektionsoptiken eingefangen und gemessen. Das ungestreute Licht und das bis zu 19,5º gestreute Licht werden durch die hochnumerische Öffnungs (Hi-NA) -linse 28 gesammelt und kollimatiert. Der Strahl wird in zwei Teile durch den 30/70 (30% Reflektion, 70% Transmission) Strahlspalter 30 gespalten. Der Strahl 32 wird auf eine Fotodiode reflektiert und zur Absorptionsmessung herangezogen, während der durchgelassene Strahl 34 durch den 20/80 (20% Reflektion, 80% Transmission) Strahispalter 36 weiter aufgespalten wird, um zwei Streukanäle zu ergeben. Der reflektierte Streukanal 38 weist einen 5 bis 15º-Dunkelstop 40 auf, während der durchgelassene Kanal 42 einen 2 bis 3º-Dunkelstop 44 aufweist. Das durch jede dieser Dunkelstop-Optiken 40, 44 gehende Licht wird dann durch die Linsen 46 bzw. 48 auf die Fotodioden 50 bzw. 52 herunterfokussiert. Neutraldichtefilter 54, 56 und 57 sind dann eingesetzt, um die Lichtmengengehalte bei jeder Fotodiode auf ein Niveau herabzusetzen, das sich für die Standard-Detektoren und -Vorverstärker eignet.
Der Strahl 32 wird durch die Linse 58 auf einen Detektor Vorverstärker 60 fokussiert. Der Vorverstärker-Ausstoß ist proportional zur optischen Stärke bzw. Energie, die durch das System hindurchgelassen werden. Es sammelt ungestreutes und bis zu Winkeln von bis zu 19,5º gestreutes Licht. Innerhalb dieses Winkelintervalls werden ca. 98% des durch in Kugelform überführte Erythrozyten und Reticulozyten gestreuten Lichts gesammelt.
Der Absorptionskanal des im Handel erhältlichen TECHNICON H 1-Geräts ist zur Messung einer zellulären Absorption nicht optimiert. Die Absorptionssignale sind vom selben Niveau wie das Rauschen auf dem Absorptionsvorverstärker. Es wurde ein mathematisches Modell des Absorptionsdetektionsprozesses entwickelt. Dieses Modell sagte voraus, daß das Signal dramatisch mit einem Absinken bei durch den Laser in der Fließzelle bestrahlten Beleuchtungsfläche verbessert würde. Die Größe des Spalts wurde von einem Nominalwert von 150 x 20 µm (am TECHNICON H 1-System) auf einen Nominalwert von 40 x 20 µm herabgesetzt, um das Signal/Rauschverhältnis um einen Faktor von 3,75 zu erhöhen.
Das Signal (Puishöhe) aus dem Absorptionsvorverstärker beträgt 20 bis 50 Millivolt. Dies ist viel kleiner als für die Signalprozeßrechnerelektroniken erforderlich. Es wurde eine zweite Zugewinnstufe dem Absorptionsvorverstärker mit einem Zugewinn von ca. 25 zugefügt. Dies erhöhte die Pulshöhen um ca. 1 Volt.
Der Zugewinn des Vorverstärkerstroms und der optischen Dichte des Neutraldichtefilters in jedem Streukanal wurden gewählt, um mittlere Pulssignalstärken von ca. 2 Volt beim Ausstoß eines jeden Kanals zu erzeugen, als TECHNICON (TCN) optisches Testmaterial (OTM, TCH T03-1704) einem Assayverfahren unterzogen wurde. OTM besteht aus in Kugeln überführte und aus harten fixierten roten Blutzellen. Dieses Material ist im Handel vom hier auftretenden Bezeichneten erhältlich und zur Verwendung am TECHNICON H 1 - System angepaßt. Dies ermöglicht dann einen Feinabgleich des Gesamtzugewinns in jedem Kanal unter Anwendung eines Zugewinnverstärkers für eine Variable in der Post-Detektionssignalprozeßrechner-Hardware.
Ein funktionelles Blockdiagramm des Post-Detektionssignalprozeßrechnersystems ist in Fig. lC gezeigt. Das System besteht aus einem Vor- Verstärker 62, einem Zugewinnverstärker 64 für eine Variable, einen Pulshöhenanalysiergerät 66, einen Analog-zu-Digital-Umwandler 68 und Datenerfassungs-Hardware (Computer) 70 und -Software.
Die Elektroniksysteme für das System bestehen im großen und ganzen aus dem 4 Cyte-System, erhältlich von Howard Shapiro, M.D., P.C., Cambridge, MA, (4 Cyte Model FE Front End und 4 Cyte Model 1 Interface Card). Das Pulshöhenanalysiergerät, der Analog-zu-Digital-Umwandler und die Datenerfassungssoftware sind jeweils durch Komponenten des 4 Cyte-Systems dargestellt. Diese Komponenten erzeugen gehaltene Pulse, die die Puishöhen bis zu 4 Input-Signalen darstellen, und sie ermöglichen die Festlegung des "gültigen" Pulshöhenschwellenwerts. Die 4 Cyte-Grenzflächenkarte wird in Zusammenwirken mit der 4 Cyte-Software zur Analog/Digital-Umwandlung von bis zu 4 Input-Signalen und zum Einfang jener Werte in der RAM-Memory des Wirtscomputers verwendet. Die digitalisierten Signale werden in Listenform gespeichert. Es gibt 5 8-Bit-Bytes Informationen für jede Zelle, eine für jede der vier gemessenen Parameter und eine zur Etikettierung. Der Wirtsscomputer für diese Versuche war ein IBM PC/XT Klon, ausgerüstet mit einem Farbenerfassungs- und -aufzeichnungsgerät und einem mathematischen Coprozessrechner. Eine Datenreduktion kann an jedem IBM-kompatiblen Computer durchgeführt werden.
In den folgenden Beispielen sind Reagenszusammensetzungen und Verfahren zur Identifikation von Reticulozyten und zur Charakterisierung von Reticulozyten und roten Blutzellen unter Anwendung von Absorptionsfließzytometrie-Verfahrenstechniken angegeben. Es wurden standardmäßige, im Handel erhältliche Reagensgrad-Materialien, wenn immer möglich, eingesetzt. Es sollte selbstverständlich sein, daß die folgenden Zubereitungen und Vorgehensweisen lediglich zum Zwecke der Verdeutlichung angegeben sind, und daß weitere Bestandteile, Anteusmengen und Vorgehensweisen in übereinstimmung mit dem Gesamtoffenbarungsgehalt der vorliegenden Erfindung angewandt werden können.

Beispiel 1:

Streu- und Absorptionsmessungen zur Unterscheidung von Reticulozyten und Erythrozyten innerhalb einer Blutprobe unter Anwendung einer Reagenszusammensetzung und eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung
Oxazin 750-Farbstoff wurde in einer 1 mg/ml N,N-Dimethylformamid- Vorratslösung aufbewahrt. Ein Arbeitsreagens wurde hergestellt, indem der Farbstoff-Vorrat zu einer Puffer-Lösung gegeben wurde, die die folgenden Komponenten in den angegebenen Konzentrationen enthielt:
Oxazin 750 6 µg/ml
Calciumchlorid 0,3 mM
Kaliumchlorid 4,0 mM
Magnesiumchlorid 88,0 mM
Natriumphosphat (Dreibasig) 0,5 mM
Natriumbicarbonat 20,0 mM
Die endgültigen Werte für Osmolalität und pH des in dieser Untersuchung eingesetzten Arbeitsreagens betrugen 272 mmol/kg bzw. 8,1.
Proben wurden mit der Hand in einer Weise gemischt, welche das Verfahrensschema für eine Probe roter Zellen des automatisierten TECHNICON H 1- Systems simulierte. Teströhrchen aus Glas wurden mit 5 ml Arbeitsreagens gefüllt, 5 µl einer Blutprobe wurden dann in das Reagens pipettiert, wobei das Reagens mit einem Vortex-Mixer gerührt wurde. Die 1:1000-Verdünnung von Blut wurde dann in die Probenlinie der Fließzytometrievorrichtung eingespeist. In ungefähr 2 Minuten lief die Probe durch die Fließzelle und wurde dann mit einer Helium-Neon-Laserquelle zur Analyse von roter Zelle und Reticulozyt bestrahlt. Jede Probe wurde zweimal gemessen, falls es das Probenvolumen zuließ. Die mikroskopische Untersuchung ergab, daß die meisten roten Zellen und Reticulozyten in dieser Mischung teilweise in die Kugelform überführt waren.
Bei Beendigung der Analyse wurden die Rohdaten in der Form eines Rot- Streu- gegen Rot-Absorptionszytogramm, Fig. 2A, wiedergegeben. Es wurden deutliche Zellpopulationen auf der Basis ihrer besonderen Streu- und Absorptionssignale klar beobachtet. Die Erythrozyt-Population fällt in den Bereich A zwischen der senkrechten Achse und der Vertikallinie X. Diese Zellen zeigen hohe Streusignale und niedrige Zellabsorptionssignale. Der Hauptteil der Reticulozyt-Population fällt in den Bereich rechts von X, den Bereich B. Diese Zellen sind von den reifen Erythrozyten wegen der höheren Absorptionssignale aus ihrer mit Oxazin 750 gefärbten RNA unterscheidbar. Die Plättchen-Population liegt im Bereich C unterhalb der Linie Y, und der Koinzidenzbereich liegt im Bereich D über der Linie Z. Die Plättchen ergeben relativ schwachse Streusignale, verglichen mt den Reticulozyten.
Auf Basis der Absorptionstrennung zwischen reifen Erythrozyten und Reticulozyten kann die Reticulozyt-Zählung einer Patientenprobe ermittelt werden, indem man elektronische "Fenster" erzeugt, welche die Bereiche von gestreutem Licht und Absorption definieren, welche wiederum Reticulozyten und Erythrozyten identifizieren. Die Anzahl von Reticulozyten und reifen Erythrozyten, welche in jedes "Fenster" fallen, wird ermittelt, so daß der Prozentsatz der Reticulozyten und Erythrozyten, der in der Gesamtzellpopulation vorhanden ist, dann berechnet wird. In Fig. 2A(1) werden das Reticulozyt-"Fenster" durch Bereich B und das Reif-Erythrozyt-"Fenster" durch Bereich A ermittelt und bestimmt. Es sei angemerkt, daß in Fig. 2A(2) und in allen folgenden Streu/Streuzytogrammen die nicht-linearen Gitterüberlappungen die Orte eines konstanten Volumen und eines konstanten Brechungsindex für perfekte Kugeln gemäß dem oben angegebenen Verfahren von Tycko anzeigen.
Der Bezugsprozentsatz von Reticulozyten in jeder Probe wurde bestimmt unter Anwendung der manuellen mikroskopischen Verfahrensweise, empfohlen vom National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Bei diesem Verfahren wurde ein kleines Volumen der Probe hergestellt, und es wurde der Prozentsatz von Reticulozyten in der Probe mit Hilfe eines Mikroskops gezählt. Das Mikroskop war mit einem 100 X Ölimmersionsobjektiv und einem 10 X Okular ausgerüstet. Ein Minimum von 1000 Zellen wurde für jede Probe gezählt. Eine Miller-Scheibe wurde in das Okular des Mikroskops eingelegt, um die Zählgenauigkeit zu verbessern. Jede rote Zelle, die zwei oder mehr Partikel blauen Materials nach der Färbung enthielt, wurde als Reticulozyt markiert. Die Reticulozyt-Zählung einer Patientenprobe wurde mit 2,3% durch diese Fließzytometrietechnik gemessen. Dieselbe Blutprobe wurde auch mit dem NCCLS-Verfahren analysiert. Das Ergebnis war eine Reticulozyt-Zählung von 1,7%.
Ein zweiter Versuch wurde durchgeführt, um zwischen Reticulozyt- und Erythrozyt-Populationen zu unterscheiden, als Zellen mit Neu-Methylenblau gefärbt und mit dem Streu/Absorptionsfließzytometer gemessen wurden. Die Puffer-Zubereitung war dieselbe wie die für die Oxazin 750 enthaltende Reagenszusammensetzung. Die Konzentration von Neu-Methylenblau-Farbstoff im Arbeitsreagens, welcher das Oxazin 750 ersetzte, betrug 60 µg/ml. Es erfolgten die oben beschriebenen Probenzubereitungen und Analysenprotokolle. Allerdings ergab die mikroskopische Untersuchung, daß die roten Zellen und Reticulozyten weniger in die Kugelform überführt waren als in der Oxazin 750-Mischung. Die Rohdaten aus der Analyse wurden in der Form eines Rot- Streu-gegen-Rot-Absorptions-Zytogramm (Fig. 2B(1)) wiedergegeben. Es sei angemerkt, daß, im Vergleich zu Fig. 2A(1), sowohl die Absorptions- als auch die Streusignale mehr verbreitert sind, wahrscheinlich wegen Orientierungsrauschen. Auf Basis der Absorptionstrennung zwischen Erythrozyten und Reticulozyten wurde die Reticulozyt-Zählung der Patientenprobe mit 2,2% gemessen. Bei der Analyse gemäß dem NCCLS-Verfahren wurde eine Reticulozyt- Zählung von 1,7% erhalten.

Beispeil 2:

Streu- und Absorptionsmessungen zur Unterscheidung von Reticulozyten und Erythrozyten in einer Blutprobe unter Einsatz der Reagenszusammensetzung von Beispiel 1, enthaltend ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel.
Ein zweiter Satz von Versuchen wurde durchgeführt, wobei die Reagenszusammensetzung von Beispiel 1 verwendet wurde, die aber ferner ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel enthielt, um die roten Blutzellen und Reticulozyten isovolumentrisch in die Kugelform zu überführen.
Für jeden Versuch wurde ein Arbeitsreagens hergestellt, indem man zur Reagens zusammensetzung das oberflächenaktive Lauramidopropylbetain zugab, so daß die Endkonzentration des oberflächenaktiven Mittels im Reagens 63 µg/ml betrug. Es erfolgte die oben bezüglich Beispiel 1 beschriebene Probenzubereitung.
Bei Betrachtung durch ein Mikroskop wurde an den reifen roten Zellen und Reticulozyten in einer zubereiteten Probe festgestellt, daß sie perfekt in die Kugelform überführt und die Reticulozyten gefärbt waren. Manb eachte den Unterschied zwischen Fig. 8A und 8B sowie 2 und 3, welcher die steigende Herabsetzung beim Orientierungsrauschen mit steigender Vollständigkeit der Kugelbildung belegt.
Fig. 3A(1) belegt den höheren Unterscheidungsgrad zwischen Reticulozyt- und Erythrozyt-Populationen, als Zellen mit der Reagenszusammensetzung gefärbt wurden, die den Oxazin 750 Farbstoff und das oben genannte oberflächenaktive Mittel enthielt. Man beachte, daß in Fig. 8C, ein ungefärbter Vergleich, im Bereich B leer von Zellen ist. Die Reticulozyt-Zählung einer Patientenprobe wurde mit 8,0% mit diesem Verfahren gemessen. Dieselbe Blutprobe wurde auch mit dem NCCLS-Verfahren analysiert. Das Ergebnis war eine Reticulozyt-Zählung von 9,1%.
Fig. 3B(1) belegt den Unterscheidungsgrad zwischen Reticulozyt- und Erythrozyt-Populationen, als Zellen mit der Reagenszusammensetzung gefärbt wurden, die den Neu-Methylenblau-Farbstoff und das oben genannte oberflächenaktive Mittel enthielt.
Die Reticulozyt-Zählung einer Patient enprobe wurde mit 5,0% mit diesem Verfahren gemessen. Dieselbe Blutprobe wurde auch mit den NCCLS-Verfahren analysiert. Das Ergebnis war eine Reticulozyt-Zählung von 9,1%.

Beispiel 3:

Korrelationsuntersuchung mit der Reagenszusammensetzung und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung und dem NCCLS-Bezugsverfahren unter Anwendung von Absorptionsdaten, die bezüglich Pseudo-Absorption korrigiert waren.
Das Detektionsoptik-Subsystem sammelt sowohl das gestreute als auch das ungestreute Licht aus Zellen, die den Laserstrahl in der Fließzelle durchlaufen. Zellen streuen Licht in alle Richtungen. Die relative Hi-NA- Linse im Optiksystem, die oben beschrieben ist, nimmt das Licht auf, das in einem Keil gestreut ist, der auf der optischen Achse mit einem Halbwinkel bis zu 19,50 zentriert ist. Somit ist das Licht, das in Winkeln von größer als 19,50 gestreut ist, verloren. Als Ergebnis "erscheinen", beim Versuch zur Messung cellulärer Absorption, vollständig nicht-absorbierende Zellen, um bis zu einigen Prozenten des einfallenden Lichts zu absorbieren (Pseudo- Absorption). Die gemessene Absorption kann wie folgt dargestellt werden:
Absorptionssignal = Pseudo-Absorption + Hämoglobin-Absorption + Farbstoff-Absorption
Das Signal aus der Pseudo-Absorption einer Reihe von roten Blutzellen weist typischerweise dieselbe Größe und Stärke wie das tatsächliche Absorptionssignal aus einem gefärbten Reticulozyt auf. Dies setzt den Trenngrad der gefärbten Reticulozyten von den ungefärbten roten Blutzellen auf dem Absorptionszytogramm herab. Das Signal/Rauschverhältnis des Absorptionskanals kann verbesset werden, indem man das Signal korrigiert, um die Pseudo- Absorptions- und Hämoglobin-Absorptionskomponenten aus jedem Absorptionssignal von roter Zelle und Reticulozyt entfernt. Die Menge an Pseudo- Absorption und Hämoglobin-Absorption kanri für jede gegebene Zell berechnet werden, indem man die wohl bekannte Mie-Lichtsteuerungstheorie anwendet, die in dem vorgenannten Tycko-Patent beschrieben ist. Der Streuquerschnitt für das Winkelintervall 19,50 bis 1800 plus der Hämoglobin- Absorptionsanteil, S&sub3;, können wie folgt berechnet werden:
S&sub3; = Π a² Qext - S(λ, ns, θ&sub3;, Δθ&sub3;; V, HC)
worin a der Radius der in die Kugelform überführten Zelle, λ die Anregungs-(oder Beleuchtungs)wellenlänge, n&sub5; der Brechungsindex des Probenstroms und -schubs und Qext der Extinktionswirkungsgrad der Zelle sind, und, für den Fall von Pseudo-Absorption, θ&sub3; = 0º und Δθ&sub3; = 19,5º. S&sub3;-Werte sind für alle erwarteten Werte von V und HC tabelliert.
Die Korrektur einer Pseudo-Absorption wird wie folgt durchgeführt: Das V und HC müssen zuerst aus den zwei Streusignalen aus einer Zelle aus dem Streu-Streu-Zytogramm&sub1; beschrieben bei Tycko, ermittelt und bestimmt werden. S&sub3; wird dann durch Einsetzen für das gemessene V und HC in die Nachschlag- und Aufsuchtabelle herausgefunderi und vom mit dem Absorptionskanal gemessenen Wert abgezogen. Das Ergebnis ist die tatsächliche Absorption aufgrund Färbung der Zelle. Das gemessene Absorptionssignal kann abgeglichen werden, indem man die folgende Beziehung einsetzt, um nur die Farbstoffabsorption für jede Zelle zurückzulassen:
Farbstoff-Absorption = Absorptionssignal - Hämoglobin-Absorption - Pseudo-Absorption
= Absorptionssignal - S&sub3;
Für alle Daten wird der abgeglichene Wert für die Rohdatenparameter vor der Schwellwertbestimmung und Etikettierung ersetzt. Irgendwelche Objekte bzw. Gegenstände, deren Rotstreuparameter auf der V-HC-Tafel nicht erscheinen, werden im Datenanalyseschema nicht zur Kenntnis genommen. Diese Daten werden dann erneut wiedergegeben, wobei das Rotstreu-gegen Absorptionszytogramm die korrigierten Werte reflektiert, gezeigt in Fig. 5A und 5B.
Es wurde eine Untersuchung durchgeführt, um das Leistungsvermögen von Oxazin 750 bei Verwendung in einer Reageriszusammensetzung im Streu/Absorptionsfließzytometer mit dem NCCLS-Handverfahren zu vergleichen.
Es wurden Blutproben mit der Reagenszusammensetzung gefärbt. Reticulozyten im selben Satz von Blutproben wurden auch unter Anwendung des NCCLS- Verfahrens gezählt.
Die Proben-Zubereitung und die Analysenprotokolle waren dieselben wie die bezüglich Beispiel 2 beschriebenen, mit der Ausnahme, daß die zusätzliche Pseudo-Absorptionskorrektur durchgeführt wurde.
Bei Betrachtung durch ein Mikroskop wurde an den reifen roten Zellen und den Reticulozyten in einer zubereiteten Probe festgestellt, daß sie perfekt in die Kugelform überführt und die Reticulozyten gefärbt waren.
Die aus diesen beiden Verfahren erhaltenen Reticulozyt-Zell- Prozentsätze sind in Fig. 6 verglichen. Bei einer Konzentration von 2 µg Oxazin 750/ml in der Reagenszusammensetzung zeigte sich eine enge Korrelation bei den Messungen unter Anwendung der Reagenszusammensetzung und der Fließzytometrievorrichtung von Fig. 1 und bei den mit dem NCCLS- Bezugsverfahren erhaltenen Meßwerten. Der Korrelationskoeffizient für die durch orthogonale Regressionsanalyse erhaltenen Meßwerte betrug 0,92.

Beispiel 4:

Korrelationsuntersuchung mit dem Absorptionsfließzytometer und dem TECHNICON H 1-Bezugsverfahren unter Verwertung von bezüglich Pseudo- Absorption korrigierten Absorptionsdaten.
Nach Pseudo-Absorptionskorrektur und geeigneter Zuordnung wurden die Erythrozyt- und Reticulozyt-Indices, MCV und MCHC getrennt ermittelt und bestimmt und verglichen mit den Werten, erhalten mit der Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung mit Streu/Absorptionsfließzytometrie und TECHNICON H 1-Messungen. Fig. 4A und 4B zeigen die Korrelationsdaten für MCV bzw. MCHC für die Gesamtheit der roten Blutzellen.
Fig. 7 zeigt als "+" markierte Reticülozyten in einem HC- gegen V- Zytogramm.
Es sind einige Vorteile der vorliegenden Erfindung aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich, welche eine Reagenszusammensetzung und ein Verfahren zur Zubereitung einer Vollblutprobe zur elektrooptischen gleichzeitigen Quantifizierung des Volumens, des Hämoglobin-Gehalts und der Hämoglobin-Konzentration von Reticulozyten und Erythrozyten mit Absorptionsfließzytrometrieverfahren betreffen.
Im Lichte der obigen Ausführungen ist es ersichtlich, daß verschiedene Aufgaben der Erfindung gelöst sind und weitere vorteilhafte Ergebnisse erhalten werden.

Claims

1. Verfahren zur Behandlung roter Blutzellen von Säugetieren in einer Vollblutprobe, die anschließend in wirksamer Weise elektrooptisch gemessen werden kann, wobei man eine atikoagulierte Vollblutprobe mit einer Reagenslösung behandelt, die ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel als Kugelbildungsmittel enthält, wobei das genannte oberflächenaktive Mittel keine zugefügte Protein-Pufferung erforderlich macht, um die Lysis einer roten Zelle zu verzögern, und wobei das Mittel in der Reagenszusammensetzung in einer Konzentration vorhanden ist, die eine im wesentlichen vollkommene Kugelbildung der reifen Erythrozyten und der Reticulozyten in der genannten Vollblutprobe ergibt, um Orientierungsrauschen zu eliminieren, wenn die genannte Probe und das Reagens einer Fließztometrielichtstreumessung unterzogen werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Konzentration des zwitterionischen oberflächenaktiven Mittels in der verdünnten Probe ca. 3,9 bis ca. 148 µg/ml beträgt.

3. Verfahren zur Identifizierung von Unterklassen von Zellen von Interesse in einer Blutprobe durch Fließzytometrie, welches die Stufen umfaßt, in denen man:

(a) eine Anteilsmenge der genannten Blutprobe mit. einer wässrigen Reagenszusammensetzung, die ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel als Kugelbildungsmittel enthält, zur Bildung einer Suspension vermischt, worin das oberflächenaktive Mittel eine zugefügte Protein-Pufferung zur Verzögerung der Lysis einer roten Zelle nicht benötigt, und wobei die Reagenszusammensetzung eine Lösung umfaßt, die eine Tonizität von ca. 0,5- bis 2,0-fach isotonisch aufweist;

(b) die genannte Suspension aus Stufe (a) mit im wesentlichen einer Zelle zu einem Zeitpunkt durch eine Fläche fokussierter optischer Beleuchtung laufen läßt;

(c) das von jeder Zelle gestreute Licht nachweist und mißt; und man

(d) die genannten Zellen der genannten Unterklasse von Interesse zumindest anteilweise auf der Basis der gemessenen Stärke des genannten gestreuten Lichts unterscheidet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, worin: Stufe (a) beinhaltet, daß man eine Farbstoffverbindung zufügt, um eine Unterklasse von Zellen von Interesse selektiv zu färben; Stufe (c) beinhaltet, daß man das von jeder Zelle gestreute Licht und absorbierte Licht nachweist und mißt; und Stufe (d) beinhaltet, daß man die genanten Zellen der genannten Unterklasse von Interesse mindestens anteuweise auf der Basis der gemessenen Stärken des genannten gestreuten und absorbierten Lichts unterscheidet.

5. Verfahren zur Identifizierung von Unterklassen von Zellen von Interesse in einer Blutprobe durch Fließzytometrie, welches die Stufen umfaßt, in denen man:

(a) eine Anteilsmenge der genannten Blutprobe mit einer wässrigen Reagenszusammensetzung zur Bildung einer Suspension vermischt, worin die Reagenszusammensetzung eine Farbstoffverbindung, die die Nudeinsäuren der Zellen färbt, einen Puffer zur Einstellung des pH-Wertes auf ca. 8 bis ca. 9 und ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel als Kugelbildungsmittel aufweist, worin das oberflächenaktive Mittel eine zugefügte Protein- Pufferung oder ein Fixierungsmittel zur Verzögerung der Lysis einer roten Zelle nicht benötigt;

(c) das von jeder Zelle gestreute und absorbierte Licht nachweist und mißt; und man

(d) die genannten Zellen der genannten Unterklasse von Interesse mindestens anteilweise auf der Basis der gemessenen Stärken des genannten gestreuten und absorbierten Lichts unterscheidet.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die genannte, in Stufe (a) beschriebene Farbstoffverbindung ein kationischer Farbstoff ist, und wobei die genannte Gesamtpufferkonzentraiton isotonisch ist, um die Zellen in der blutprobe isovolumetrisch in die Kugelform zu überführen.

7. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 6, worin das oberflächenaktive Mittel von Stufe (a) aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Lauramidopropylbetain, N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1- propansulfonat, N-Dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, Cocoamidopropylbetain und aus Cocoamidosulfobetain.

8. Verfahren zur Charakterisierung von Reticulozyten und Erythrozyten in einer Blutprobe durch Fließzytometrie, welches die Stufen umfaßt,, in denen man:

(a) eine Anteilsmenge der genannten Blutprobe mit einer Reagenszusammensetzung vermischt, die eine organische kationische Farbstoffverbindung, ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel als Kugelbildungsmittel und eine Puffer-Lösung enthält, um eine Suspension zu bilden, worin die genannte Farbstoffverbindung die Ribonucleinsäure der Reticulozyten färbt, und worin ferner das genannte zwitterionische oberflächenaktive Mittel eine zugefügte Protein-Pufferung zur Verzögerung der Lysis einer roten Zelle nicht benötigt;

(b) die genannte Suspension aus Stufe (a) im wesentlichen mit einer Zelle zu einem Zeitpunkt durch eine Fläche fokussierter optischer Beleuchtung laufen läßt;

(c) das von jeder Zelle gestreute Licht und absorbierte Licht nachweist und mißt;

(d) gefärbte und ungefärbte Zellen auf der Basis der gemessenen Stärken des genannten gestreuten und absorbierten Lichts identifiziert; und man

(e) die Anzahl, das Volumen, die Hämoglobin-Konzentration und RNA- Konzentration eines jeden Reticulozyt und Erythrozyt auf der Basis der gemessenen Stärken des genannten gestreuten und absorbierten Lichts ermittelt und bestimmt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das in Stufe (a) beschriebene oberflächenaktive Mittel ein Alkylbetain, ein Alkylamidobetain oder aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Lauramidopropylbetain, N-Tetradec:yl- N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, Cocoamidopropylbetain und aus Cocoamidosulfobetain.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 und 9, worin das in Stufe (a) beschriebene oberflächenaktive Mittel in einer Menge von ca. 3,9 bis ca. 148 µg/ml vorhanden ist.

11. Reagenszusammensetzung zur Behandlung roter Blutzellen von Säugetieren in einer Vollblutprobe, die anschließend in wirksamer Weise elektrooptisch gemessen werden kann, wobei d£e genannte Reagenszusammensetzung ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel als Kugelbildungsmittel aufweist, um Orientierungsrauschen zu eliminieren, wenn die genannte Probe und das Reagens einer Fließzytometrie-Lichtmessung unterzogen werden; worin das genannte zwitterionische oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration vorhanden ist, die (i) eine im wesentlichen vollkommene Kugelbildung der reifen Erythrozyten und der Reticulozyten in der genannten Vollblutprobe ergibt und (ii) Protein-Pufferung zur Verzögerung der Lysis einer roten Zelle nicht benötigt.

12. Reagenszusammesnetzung zur Charakterisierung von Reticulozyten in einer Vollblutprobe durch Fließzytometrie, wobei die genannte Zusammensetzung eine Farbstoffverbindung in einer zur Färbung der Ribonucleinsäure innerhalb der genannten Reticulozyten wirksamen Menge und ein zwitterionisches oberflächenaktives Mittel in einer zur isovolumetrisch erfolgenden Kugelbildung der Reticulozyten und Erythrozyten wirksamen Menge aufweist, worin das genannte oberflächenaktive Mittel Protein-Pufferung zur Verzögerung der Lysis einer roten Zelle nicht benötigt.

13. Reagenszusammensetzung gemäß Anspruch 12, worin die genannte Farbstoffverbindung ein kationischer Farbstoff ist.

14. Reagens gemäß Anspruch 11 oder 12, worin die Konzentration des zwitterionischen oberflächenaktiven Mitteis in der verdünnten Probe ca. 3,9 bis ca. 148 µg/ml beträgt.

15. Reagenszusammensetzung von Anspruch 11 oder 12, worin die genannte Reagenszusammensetzung eine Lösung umfaßt, die eine Tonizität von ca. 0,5- bis 2,0-fach isotonisch aufweist.

16. Reagenszusammensetzung gemäß Anspruch 11 oder 12, worin die genannte Reagenszusammensetzung einen pH-Puffer enthält, um den pH-Wert bei ca. 6 bis ca. 9 zu halten.

17. Reagenszusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 16, worin das genannte zwitterionische oberflächenaktive Mittel ein Alkylbetain, ein Alkylamidobetain oder aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Lauramidopropylbetain, N-Tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1- propansulfonat, N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat, Cocoamidopropylbetain und aus Cocoamidosulfobetain.