-
HINTERGRUND
-
Diese Erfindung betrifft Partikelanalysen
in einem automatisierten hämatologischen
Analysator. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Reagenziensystem
und ein Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von Retikulozyten
in einer Vollblutprobe.
-
Der Retikulozyt ist eine unreife
rote Blutzelle ("RBC") welche noch retikuläres Material
(ribosomale und messenger RNA) enthält, obwohl die Zelle in diesem
Stadium ihrer Entwicklung den Zellkern ausgestoßen hat. Rote Blutzellen betreten
den Blutstrom normalerweise als Retikulozyten. Die Erythropoiese beginnt
mit den Erythroblasten und schreitet durch mehrere Generationen
von intermediären
kernhaltigen Zellen im Knochenmark fort und endet mit den Retikulozyten.
Unter anämischen
oder hypoxischen Bedingungen kann dieser Vorgang verkürzt sein,
was bedeutet, dass Retikulozyten in einem früheren Stadium als üblich in
den Blutstrom eintreten. Diese frühen Retikulozyten werden erkannt
durch die zusätzliche
Menge von RNA, welche sie enthalten, so wie durch ihre äußere Ausmaße, geringeren
Hämoglobingehalt,
und durch den größeren Zeitraum,
den sie als Retikulozyten im Blutstrom verbleiben.
-
Die Retikulozytenzählung betrifft
daher die rote Blutzellproduktion und ist nützlich bei der Diagnose und
der Behandlung von Anämie.
Die Retikulozytenzählungen
waren historisch sehr eng verknüpft mit
der Ätiologie
und der Einteilung der Anämien.
Die Retikulozytenzahl ist erhöht
bei hämolytischen
Anämien,
Pyruvatkinasemangel, Sichelzellenanämie, Thalassämien, und
vermindert bei megaloblastischen Anämien, aplastischen Anämien und
allgemeiner Knochenmarksdysfunktion.
-
Die Retikulozytenzahl wurde kürzlich verwendet,
um die toxischen Wirkungen von chemotherapeutischen Wirkstoffen
auf das Knochenmark zu beurteilen. Kurz ausgedrückt, werben Hämatologen einstimmig
für die
Verwendung der Retikulozytenzahl als ein Indikator für die RBC
Produktion.
-
Das am üblichsten verwendete Verfahren
zur Zählung
von Retikulozyten ist das manuelle mikroskopische Verfahren. Brilliant
Cresyl Blau wurde hauptsächlich
verwendet, bis neues Methylen Blau ("NMB")
1949 durch Brecher eingeführt
wurde. Das aktuellste National Committee for Clinical Laboratory Standards
("NCCLS") Veröffentlichung
(NCCLS Document H44-P) verlangt nach der Verwendung einer NMB Färung bei
seinem Referenzverfahren. Ein gleiches Volumen Blut wird gemischt
mit dem LMB Farbstoff und mindestens drei Minuten und bis zu fünfzehn Minuten
lang inkubiert, um der RNA zu gestatten auszufällen. Ein Blutausstrich wird
gemacht, und die gefärbten
Retikulozyten werden mikroskopisch gezählt. Eine Miller Okularscheibe
wird in das Okular eingesetzt. Die Fläche des kleineren Quadrats,
welches in dem Okular gesehen wird, ist 1/9 jener des größeren Quadrats.
Die roten Blutzellen werden in dem kleineren Quadrat gezählt, wohingegen
die Retikulozyten in dem größeren Quadrat
gezählt
werden. Zwanzig aufeinanderfolgende Felder werden gezählt und
der Anteil der Retikulozyten wird berechnet durch das Teilen der
gesammten Retikulozyten in den großen Quädraten durch die gesamten roten Blutzellen
in den kleinen Quadraten nach Multiplikation mit 9, und danach durch
das Multiplizieren des Ergebnisses mit 100. Der Nachteil des manuellen Verfahrens
ist, dass es arbeitsintensiv, ungenau, zeitaufwendig und subjektiv
ist.
-
Reagenzien zur in vitro Diagnostik
enthalten üblicherweise
Konservierungsstoffe. Ein solcher Konservierungsstoff ist verfügbar unter
dem Warenzeichen Proclin
TM, welches im Eigentum
von Rohm und Haas ist. Gemäß Chapman "An effective biocide for
in vitro diagnostic reagents and other products", Am. Clin. Lab., August 1994, bezeichnet
dieses Warenzeichen ein Produkt, das kommerziell verfügbar ist
von Supelco, Inc., Bellefonte, PA, und 0,70% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on
und 2,30% 5-Chlor-2- methyl-4-isothazolin-3-on
als Wirkstoffe enthalt Gemäß einer
Broschüre,
veröffentlicht
von Supelco aus dem Jahr 1996, enthält Proclin
TM die
aktiven Wirkstoffe ebenso wie auch 93–95% modifiziertes Glykol und
2–3% Alkylcarbonat
als inerte Inhaltsstoffe. Gemäß
US 5,468,7975 , ist das
in Proclin
TM enthaltene Alkylcarbonat Triethylorthoformat
und das modifizierte Glykol, das in Proclin
TM enthalten
ist, ist Dipropylenglykol.
-
Viele Versuche wurden unternommen,
um die Nachteile des manuellen Verfahrens durch Mittel der Durchfluß-zytrometrischen
Technologie unter Verwendung fluoreszierender Farbstoffe zu korrigieren.
In den 1980'er Jahren
wurde Pyronin Y ("PY") und Acridin Orange
("AO") verwendet, um Retikulozyten
in Durchflußzytometern
zu färben
und zu zählen.
Mehrere halbautomatisierte, durchflußzytometrische Verfahren sind
nun verfügbar,
um Retikulozyten aus einer Vollblutprobe zu zählen. Bei jedem der existierenden
Verfahren wurde ein Verdünner,
welcher einen kationischen Farbstoff enthält, wie zum Beispiel Auramin
O ("AuO"), oder Thiazol Orange ("TO"), verwendet, um
die RNA in den Retikulozyten zu färben. Während des Inkubationszeitraums
penetriert der Farbstoff langsam die Zellmembran und bindet an die
RNA innerhalb jedes Retikulozyten. Die Menge an Signal, die durch
die gefärbten
Retikulozyten erzeugt wird, wenn die Probe durch die Nachweiszone
hindurchtritt, ist proportional zu dem RNA Gehalt innerhalb jedes
Retikulozyten. Ein Durchflußzytometer,
welches mit der geeigneten Anregungslichtquelle und mit dem Emissionsnachweissystem ausgestattet
ist, kann somit verwendet werden, um den Prozentsatz von Retikulozyten
in einer Vollblutprobe zu bestimmen.
-
Ein unterscheidendes Merkmal dieser
durchflußzytometrischen
Techniken ist die Verwendung mindestens eines fluoreszierenden Farbstoffes.
Die Fluoreszenz ist gekennzeichnet durch die Aussendung von Licht
mit einer Wellenlänge,
welche unterschiedlich ist von dem Anregungslicht. Licht in einer bestimmten
Wellenlängenbande
wird durch das fluoreszierende Material (das Fluorophor) absorbiert
und Licht mit einer längeren
Bande wird ausgesendet. Die Menge von ausgesendetem Licht ist signifikant
kleiner als das Niveau des Anregungslichtes. Es ist notwendig, optische
Komponenten wie zum Beispiel Filter einzubringen, um den Nachweis
und die Messung nur des gewünschten
Fluoreszenzsignals zu gestatten. Im Gegensatz dazu erfordert ein
Nachweissystem, welches die Streuung nachweist und mißt, keine solchen
Filter, da das gestreute Licht dieselbe Wellenlänge wie das einfallende Licht
besitzt. Zusätzlich können billigere
und weniger leistungsfähige
Lichtquellen verwendet werden bei nicht-Fluoreszenz-Nachweissystemen,
da solche fluoreszenzstimmulierenden Lichtquellen nicht notwendig
sind in elektrooptischen Systemen, die auf dem Nachweis der lichtbrechenden
Eigenschaften der Zellen basieren.
-
Die U.S. Patent Nr. 5,350,695 und
5,438,003 von Colella, et al., und 5,284,771 von Fan et al. beschreiben
Verfahren und Reagenzienzusammensetzungen, welche die Behandlung
einer Vollblutprobe mit einer einzelnen Reagenzienlösung umfassen,
die einen kationischen Farbstoff wie zum Beispiel NMB oder Oxazin
750 umfaßt,
um RNA in Retikulozyten auszufällen
und zu färben,
und einen zwitterionischen Wirkstoff, um die Zellen sphärisch zu
machen. Miler Inc., ein Inhaber dieser Patente hat kürzlich einige
der obigen Verfahren in ihr neuestes H*3® Hämatologie-Instrument eingebracht.
Dieses Gerät
ist mit einer Helium/Neon ("HeNe") Lichtquelle ausgestattet,
und der Farbstoff Oxazin 750 wird verwendet, um die RNS innerhalb
der Retikulozyten zu färben und
auszufällen,
wobei ein zwitterionisches Tensid verwendet wird, um die RBCs und
Retikulozyten sphärisch
zu machen als Vorbereitung für
volumetrische Messungen. Die Sensitivität des Verfahrens beim Nachweis
von Gruppe IV Retikulozyten hat sich als schlecht erwiesen.
-
EP
0 545 313 offenbart ein Verfahren und eine Reagenzienzusammensetzung,
welche ein zwitterionisches Tensid zur Erlangung einer sphärischen Form
der Zellen zur Elimination von Orientierungssignalen umfaßt, einen
Farbstoff zur Färbung
der Retikulozyten und eine Pufferlösung zum Erhalt des pHs von
etwa 6 bis etwa 9.
-
Ein unterschiedlicher Ansatz wird
unternommen durch die Coulter Corporation in WO 94/27146. Hier wird
eine NMB gefärbte
Probe manuell mit einer auf Schwefelsäure basierenden Reagenzie behandelt,
um die RBCs auszublenden. Coulter nennt seine Technologie VCS (Volumen,
Conductivity (Leitfähigkeit)
und Scatter (Lichtstreuung)) und hat ein solches halbautomatisiertes
Retikulozytenverfahren in ihre STKS® und
MAXMTM hämatologischen
Analysatoren eingebracht. Bei der Coulter VCS Retikulozytenbestimmung
wird die Blutprobe offline mit. NMB Farbstoff gemischt und bei Raumtemperatur
für 5 Minuten
inkubiert. Ein kleines Volumen der gefärbten Blutprobe wird dann mit
einer Reinigungslösung
verdünnt,
welche Schwefelsäure
enthält.
Die Reinigungs- oder "Ausblendungs"-Lösung bewirkt
ein Anschwellen der Zelle, wodurch diese sphärisch wird und das Hämoglobin
tritt aus den Zellen aus. Die vorbereitete Probe wird dann nach
einer vorgeschriebenen und sehr kritischen Zeitspanne in einen Coulter STKS
oder MAXMTM Hämatologieanalyser
aspiriert, um die Analyse abzuschließen. Die Retikulozyten, reife
RBCs, Leukozyten und Trombozyten werden unterschieden aufgrund der
Basis einer Kombination von Lichtstreuung und Impedanz (Volumen)
Messungen. Allerdings ist das Timing extrem kritisch für das Ausblendungsstadium:
ein zu langer Zeitraum bewirkt die Lyse der roten Blutzellen; ein
zu kurzer führt zu
einer schlechten Auflösung
der Retikulozyten und der reifen RBCs.
-
Sowohl das Miles, Inc. Als auch die
Coulter Verfahren stellen somit signifikante Probleme dar und erfordern
Anstrengungen hinsichtlich des Bedieners des Instruments, um genaue
Bestimmungen zu sichern. Dies ist insbesondere der Fall hinsichtlich der
Färbezeit
und des „Ausblendens" des gefärbten Präparats.
-
Demzufolge besteht ein Bedürfnis nach
einem Retikulozytenverfahren, das für bestehende hämatologische
Analysatoren angepaßt
werden kann ohne signifikante Veränderungen der Bauteile oder die
Notwendigkeit der Substitution, oder des Wechsels, von on-board
Reagenzien.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Es werden Reagenzien und Verfahren
für die Differenzierung
und Konzentrationsbestimmung von Retikulozyten in einer Blutprobe
bereitgestellt.
-
Insbesondere wird ein Reagenziensystem, welches
eine Retikulozyten-färbende
Reagenzie und eine Verdünnerreagenzie
umfaßt;
bereitgestellt, um automatisierte, Lichtstreuungsbestimmungen von Retikulozyten
zu ermöglichen.
-
Genauer gesagt, wird das Reagenziensystem
dieser Erfindung verwendet, um Retikulozyten in der hypotonen (lytischen)
Umgebung eines automatisierten elektro-optischen Hämatologie-Analysators zu färben und
zu schützen.
-
Im allgemeinen umfaßt der Retikulozyten-färbende Reagenzienbestandteil
des Reagenziensystems einen nicht ionischen oder zwitterionischen
Wirkstoff, um die RBCs sphärisch
zu machen, einen überschüssigen Anteil
von Farbstoff, welcher jegliches Nukleinsäurematerial innerhalb der RBCs färbt und
ausfällt
und eine hohe Konzentration eines Elektrolyten.
-
Vorzugsweise umfaßt die Retikulozyten-färbende Reagenzie
von etwa 0,7 bis etwa 1,3 Gramm eines Nukleinsäure-Farbstoffes pro Liter an
Verdünnerreagenzie,
worin der Farbstoff gewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Azure B, Neuem Methylen Blau, Brilliant
Cresyl Blau und Oxazin 750, von etwa 3 bis etwa 7 Milligramm eines
Retikulozyten sphärisch-machenden
Wirkstoffes pro Liter an Verdünnerreagenzie,
gewählt
aus der Gruppe bestehend aus n-Dodecyl β-D Maltosid, N-Dodecyl-N, N-Dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat
(DDAPS) und N-Tetradecyl-N, N-Dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (TDAPS),
und von etwa 17 bis etwa 23 Gramm pro Liter an Verdünnerreagenzie
eines Elektrolyten gewählt
aus der Gruppe bestehend aus den Ammonium-, Kalium- und Natriumsalzen
von Oxalsäure.
-
Am meisten bevorzugt umfaßt die Retikulozyten-färbende Reagenzie
von etwa 19,0 bis etwa 21,0 Gramm Kaliumoxalat, Monohydrat; von
etwa 0,95 bis etwa 1,05 Gramm Neues Methylen Blau; von etwa 4,75
bis etwa 5,25 mg n-Dodecyl β-D-Maltosid; und
etwa 1,0 Liter der Verdünnerreagenzie.
-
Die Verdünnerreagenzien-Komponente des Reagenziensystems, die
getrennt oder in Kombination mit der Formulierung der Retikulozyten-färbenden Reagenzie
verwendet wird, umfaßt
von etwa 2,33 bis etwa 2,57 Gramm Natriumphosphat, dibasisch; von etwa
0,38 bis etwa 0,42 Gramm Kaliumphosphat, monobasisch; von etwa 0,18
bis etwa 0,22 Gramm Dinatrium EDTA, Dihydrat; von etwa 7,25 bis
8,86 Natriumchlorid; von etwa 0,36 bis etwa 0,44 Gramm Kaliumehlorid;
von etwa 0,28 bis etwa 0,35 Gramm ProclinTM 300;
und deionisiertes Wasser, auf 1 Liter.
-
Stärker bevorzugt umfaßt die Verdünnerreagenzie
von etwa 2,33 bis etwa 2,57 Gramm Natriumphophat, dibasisch; von
etwa 0,38 bis etwa 0,42 Gramm Kaliumphosphat, monobasisch; von etwa 0,19
bis etwa 0,21 Gramm Dinatrium EDTA, Dihydrat; von etwa 7,65 bis
etwa 8,45 Gramm Natriumchlorid; von etwa 0,38 bis 0,42 Gramm Kaliumchlorid;
von etwa 0,30 bis 0,33 Gramm Proclin 300; und ionenfreies Wasser
auf 1 Liter. Der pH der Verdünnerreagenzie
ist in dem Bereich von etwa 7,2 bis etwa 7,6 mit einer Osmolarität von mehr
als 550 mOs/kg.
-
Ein anderer Aspekt der Erfindung
liefert ein Verfahren zur Differenzierung und Quantifierzung von
Retikulozyten in einer Blutprobe. Das Verfahren umfaßt die Kombination
von etwa 3,7 bis etwa 4,3 ml der obigen Retikulozyten-färbenden
Lösung
mit von etwa 10 μl
bis etwa 40 μl
antikoaguliertem Vollblut. Die entstehende Mischung wird für etwa 15
Minuten bis etwa 4 Stunden inkubiert. Dann wird die Mischung im
wesentlichen mit einer Geschwindigkeit von einer Zelle zu einem
Zeitpunkt durch eine beleuchtete Durchflußzelle hindurchgeleitet und
mindestens 10° und
90° Lichtstreuungsdaten
von dem beleuchteten Durchflußstrom
werden gesammelt. Die gesammelten Daten werden dann analysiert und
die Retikulozyten werden daraus differenziert.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
-
1 ist
ein beispielhaftes Histogramm der 10 Grad Lichtstreuungswerte für eine Patientenprobe nach
Entfernung von Werten, die außerhalb
des Bereiches liegen, wie in Beispiel 1 beschrieben.
-
2 ist
eine Darstellung eines Histogramms der 90 Grad Lichtstreuungsdaten
für die
gleiche Probe wie in 1,
nach der Entfernung von Klumpen von Patienten und gleichzeitigen
Ereignissen wie in Beispiel 2 beschrieben.
-
3 zeigt
die Korrelation der Ergebnisse des vorliegenden Retikulozytenassays
mit einem anderen Referenzverfahren.
-
4 zeigt
die Korrelation der Ergebnisse des vorliegenden Retikulozytenassays
mit einem anderen Referenzverfahren.
-
5 ist
ein Flußdiagramm
der Software Flußskripte
für die
Modifikation an einen kommerziellen hämatologischen Analysator.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Ausführungsformen der Erfindung
umfassen im allgemeinen Reagenzien und Verfahren zur Quantifizierung
der Konzentrationen von Retikulozyten in einer Blutprobe. Genauer
dienen das Verfahren und die Reagenzien dazu, Retikulozyten in einer
Blutprobe zu färben
und nachzuweisen. Die gefärbte
Probe kann dann durch einen automatisierten hämatologischen Analysator analysiert
werden. Die Lichtstreuungsdaten werden gesammelt, wobei der Retikulozytengehalt
der Probe quantitativ bestimmt wird.
-
Im allgemeinen umfaßt das Verfahren
die Inkubation einer Blutprobe mit einem oder mehreren Reagenzien.
Die gefärbte
Probe wird dann mit einem automatisierten elektro-optischen hämatologischen Analysator
analysiert, wie zum Beispiel dem Cell-Dyn® 3500
Hämatologieinstrument,
erhältlich von
Abbott Laboratories Diagnostics Division, Santa Clara, CA. Dieser
Typ von Instrument analysiert eine Probe von antikoaguliertem Blut,
durch die Durchführung
eines oder mehrerer optischer und elektrischer Messungen, was quantitative
hämatologische
Information bezüglich
der Blutprobe liefert.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein CELL-DYN® 3500 Hämatologieinstrument
verändert,
um die Quantifizierung der Retikulozyten zu erleichtern. Modifikationen
werden in der Software durchgeführt,
welche den Betrieb des Instruments steuert. Beispiele solcher Softwaremodifikationen sind dargestellt
in den Flußdiagrammen
von 5. Das modifizierte
Analyseverfahren ist im wesentlichen ähnlich zu der optischen Analyse
weißer
Blutzellen (WOC), die durch dieses Instrument in einer unmodifizierten
Form durchgeführt
wird, wobei die Daten von mindestens 0°, 10° und 90° Lichtstreuung verwendet werden.
Die wesentlichen Modifikationen umfassen die Elimination einer Inkubation
der Blutprobe, welche normalerweise mit der hypotonen Abtrennungsreagenzie
auf dem Instrument auftritt; das Unvermögen des optischen Blutsensors;
und die Implementierung eines neuen Datenerfassungs- und Analyseprogramms.
-
In einer Ausführungsform wird ein Reagenziensystem
bereitgestellt. Ein Bestandteil dieses Systems ist ein Retikulozyten-färbendes
Reagenz, welches von 0,7 bis etwa 3,3 Gramm eines Nukleinsäurefarbstoffes
umfaßt,
gewählt
aus der Gruppe bestehend aus Azure B, Neues Methylen Blau ("NMB"), Billiant Cresyl
Blau und Oxazin 750, von etwa 3 bis etwa 7 Milligramm eines Retikulozyten
sphärisch
machenden Wirkstoffs gewählt
aus der Gruppe bestehend aus n-Dodecyl β-D-Maltosid, N-Dodecyl-N, N-Dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat
(DDAPS) und N-Tetradecyl-N,
N-Dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (TDAPS) von etwa 17 bis etwa
23 Gramm eines Elektrolyten gewählt
aus der Gruppe bestehend aus den Ammonium-, Kalium- und Natriumsalzen
von Oxalsäure.
-
Dieses färbende Reagenz wird vor oder
während
der Anwendung mit einem Verdünnerreagenz kombiniert.
Die oben und hierin danach aufgelisteten Konzentrationen basieren
auf einer pro Liter Konzentration mit dem Verdünnerreagenz.
-
Der Verdünnerreagenzbestandteil des
Reagenzsystems, welches in Verbindung mit dem Retikulozyten-färbenden
Reagenz verwendet wird, umfaßt
von etwa 2,33 bis etwa 2,57 Gramm Natriumphosphat, dibasisch; von
etwa 0,38 bis etwa 0,42 Gramm Kaliumphosphat, monobasisch; von etwa 0,18
bis etwa 0,22 Gramm Dinatrium EDTA, Dihydrat; von etwa 7,25 bis
etwa 8,86 Gramm Natriumchlorid; von etwa 0,36 bis etwa 0,44 Gramm
Kaliumchlorid; von etwa 0,28 bis 0,35 Gramm Proclin 300TM und
deionisiertes Wasser, auf 1 Liter.
-
Das vorliegende Verfahren umfaßt, in einer Ausführungform,
den Zusatz von etwa 20 μl
Vollblut, gemischt mit EDTA, um eine Koagulation zu verhindern,
mit etwa am des Retikulozytenreagenziensystems, das oben beschrieben
ist, und die Inkubation dieser Mischung bei Raumtemperatur für zwischen etwa
15 Minuten bis etwa 4 Stunden. Die inkubierte Mischung wird dann
einem analytischen Instrument zugeführt, wobei die Lichtstreuungseigenschaften der
Zellen detektiert, gesammelt, differenziert und quantifiert werden.
Die Datenerfassung umfaßt
zumindest 10 und 90 Grad Lichtstreuungsmessugnen. 0 Grad Streuungssignale
können
ebenfalls verwendet werden, insbesondere zur Anwendung als ein Schwellenwert
für die
10 und 90 Grad Brechungssignale.
-
Die folgende darstellende Beschreibung
einer Ausführungsform
des Analyseverfahrens bezieht sich auf die Bestandteile, Verfahren
und Datenausgaben eines Zell-DYN® 3500,
der modifiziert wurde durch die Flußskriptsoftware, die in 5 beispielhaft dargestellt
ist. Es wird vorausgesetzt, daß ein solches
modifiziertes Zell-DYN® 3500 Instrument kommerziell
verfügbar
sein wird von Abbott Laboratories, welcher interessierter Rechtsnachfolger
im Hinblick auf diese Erfindung ist, irgendwann im Laufe des Jahres
1996.
-
Ein wichtiger Vorteil des Reagenziensystems und
des Verfahrens dieser Erfindung ist der Schutz, den die Reagenzien,
insbesondere der Verdünnerbestandteil,
für die
Retikulozyten liefert, wenn sie der feindlichen Umgebung eines Analysators
unterworfen werden, welcher eine lytische Abtrennungsreagenzie verwendet.
Dieser Vorteil bedeutet, dass kostenaufwendige Instrumenten-Hardware-Modifikationen
und on board-Reagenzien oder Veränderungen der
Reagenzien, nicht notwendig sind.
-
Sobald modifiziert, wird die Softwareroutine, oder
das Flußskript
("RET"), dargestellt in 5, durch die Auswahl der "RETEC" Option aus dem "SPECIMEN TYPE" Menü implementiert,
welches dem Bediener des CELL-DYN® 3500
vorgelegt wird. Bei der Analyse auf Retikulozyten werden andere Routineanalysen,
wie zum Beispiel RBC Messung, WBC Impetanzmessund oder Hämoglobinmessungen
nicht durchgeführt.
-
Sobald der Druckknopf gedrückt wird,
wird das Flußskript
RET eingeleitet. Das Flußskript
RET ruft die Sequenz QSO (siehe Anhang) , wartet auf das Ende der
Sequenz QSO und endet dann
-
Die Sequenz QSO bewirkt, dass eine
Probe von Blut (inkubiert mit der Reagenzie wie oben beschrieben)
in die offene Sonde für
etwa 3,3 Sekunden aspiriert wird. Der Blutprobensensor des Cell-DYN® 3500
wird in diesem modifizierten Flußskript nicht verwendet aufgrund
der vorherigen Verdünnung
der Probe während
ihres Vorbehandlungsverfahrens. Der aspirierte Anteil der Probe
wird dann zu dem Abtrennventil durch eine peristaltische Pumpe übergeleitet,
und der offene Sondenreinigungsblock bewegt sich, um eine Reinigung
der offenen Sonde zu ermöglichen.
Diese Routine beginnt dann die Sequenzen QPN und QCN wartet deren
Ende ab und endet dann.
-
Die Sequenze QCN, eine der Sequenzen, die
von QSO abgerufen wird, bereitet die WOC Mischkammer vor, um die
Probe von dem Abtrennventil aufzunehmen. Diese Routine füllt das
Verdünnerreservoir über die
Sequenz LD8 (nicht modifiziert hinsichtlich der Standardversion,
die in dem Cell-DYN 3500 verwendet wird). Die Probe und das Reagenz
werden übergeleitet
in die WOC Mischkammer durch eine Spritzenpumpe, und die Sequenz LS5
(nicht modifiert hinsichtlich der Standardversion, die in dem Cell-DYN® 3500
verwendet wurde) füllt das
Abtrennreservoir mit dem Standard Cell-DYN 3500 Abtrennreagenz.
Die Abfallkammern werden geleert, die Proben werden gemischt und
die Sequenz QWC wird abgerufen, um die WOC (optische Zählungs-)
Messungen einzuleiten. Die Datenpuffer werden geleert, bevor Daten
von den optischen Messungen gesammelt werden. Die Routine rotiert
dann das Abtrennventil in die Aspirationsposition. Die Cell-DYN
3500 Datenstation wird angewiesen die Daten von den optischen Messungen
zu empfangen, und die Sequenz QPL wird aufgerufen, um das Flußpanel zu
reinigen. QCN endet dann.
-
Die Sequenz QPN, die andere Routine,
die durch QSO aufgerufen wird, aspiriert überschüssiges Blut aus der offenen
Probenaspirationssonde und die verschlossene Probenaspirationssonde
(nicht in der Retikulozytenanalyse verwendet, aber aspiriert, um das
Y fitting zu leeren) und reinigt die offene Probenaspirationsleitung.
Das Äußere der
offenen Probenaspirationssonde wird gereinigt und die Sequenz QCL
wird aufgerufen. Die Sequenz QPN endet dann Die Sequenz QWC wird
aufgerufen durch die Sequenz QCN. Sie leitet die Probe zu der WOC
Probenpassage über,
setzt diese Passage auf einen Druck von etwa 9 psi und spritzt die
Probe in die WOC Flußzelle
ein. Der Verdünnerreagenzienfluß (wie oben formuliert)
wird eingeleitet durch die WOC Flußzelle, und ein 9 psi Akkumulatoreinlaß wird verschlossen, um
zu sichern, daß der
Abtrennfluß durch
die Durchflußzelle
geleitet wird. Die Datenerfassung wird durchgeführt durch das Sammeln von 10
Grad und 90 Grad Lichtstreuungssignalen, wie beschrieben in den
folgenden Beispielen. Die 0 Grad Streuung wird verwendet, um die
0 Grad und 90 Grad Daten auszulösen.
Wenn die optische Datensammlung abgeschlossen ist, endet die Sequenz
QWC.
-
Die Sequenz QPL wird durch die Sequenz QCN
aufgerufen. Diese Routine lädt
die sekundären 12
Zoll des Quecksilber-Vakuumakkumulators
auf, leert die Abfallkammer Nr. 2, füllt die WOC Probenspritze und
reinigt die WOC Probenpassage. Der Druck in den Reagenzienleitungen
zu dem Abtrennventil wird abgelassen, die Probenmischleitungen werden
geleert und die Listenmodus-Datenerfassung wird
abgeschaltet, wonach die Sequenz QPL endet.
-
Spezifische Datenanalyseverfahren
werden in den folgenden Beispielen beschrieben.
-
Beispiel 1
-
Quantifizierung von Retikulozyten
in einer Vollblutprobe
-
- 1. Eine Reagenzienlösung wurde hergestellt durch
das Mischen von etwa 20,0 gramm Kaliumoxalat, Monohydrat, etwa 1,0
Gramm Neues Methylen Blau und etwa 5,0 mg n-Dodecyl β-D-Maltosid
(alle verfügbar
von Sigma Chemical Compyn, St. Louis, MO) mit etwa 1,0 Liter einer
Verdünnerreagenzie.
Die Zusammensetzung der Verdünnerreagenzie
war: Natriumphosphat; dibasisch, 2,45 Gramm; Kaliumphosphat, monobasisch,
0,40 Gramm, Dinatrium EDTA, Dihydrta 0,20 Gramm, Natriumchlorid
8,05 Gramm; Kaliumchlorid, 0,40 Gramm; Proclin 300TM;
0,315 Gramm; und deionisiertes Wasser auf 1 Liter. Der pH des Verdünnerreagenz
war in dem Bereich von etwa 7,2 bis etwa 7,6 und seine Osmolarität war > 550 mos/kg.
- 2. Etwa 20 μl
Vollblut, gemischt mit EDTA um Koagulation zu verhindern, wurden
dann gemischt mit etwa 4 ml der Reagenzienlösung und inkubiert bei Raumtemperatur
für etwa
15 Minuten bis 4 Stunden.
- 3. Die Probe wurde in einen Cell-DYN® 3500
Hämatologieanalysator
aspiriert und durch ihn analysiert in dem WOC Kanal unter Verwendung
der Standard Cell-DYN® 3500 Reagenzien, die
normalerweise für
die WBC Analyse verwendet werden. Das Flußskript des Analysators wurde
verändert,
um die übliche
Inkubation des Blutes und des Abtrennreagenz zu eliminieren und
um den Infrarotsensor abzuschalten, welcher normalerweise die erste
Aspiration der Blutprobe detektiert. Diese beiden Modifikationen
werden erzielt durch die Flußskripte,
die in 5 offenbart sind.
- 4. Daten bestehend aus mindestens 10 Grad Lichtstreuungs- und 90 Grad Lichtstreuungswerten
für bis
zu 30,000 Ereignisse werden erhalten und durch das Instrument gespeichert.
Die Daten werden gespeichert als 8-Bit Zahlen im Bereich von 0 bis
255.
- 5. Die Daten für
Ereignisse mit Werten außerhalb des
Bereiches, wie zum Beispiel 10 Grad Lichtstreuungswerte von 255
oder 90 Grad Lichtstreuungswerten von 255 werden aus der Analyse
entfernt.
- 6. Daten für
Ereignisse, welche verknüpft
sind mit Trombozytenklumpen und gleichzeitigen Ereignissen werden
entfernt wie folgt:
- a. die Standardabweichung der restlichen 10 Grad Lichtstreuungsdaten
wird berechnet. Ein beispielhaftes Histogramm für 10 Grad Lichtstreuungswerte
für eine
Patientenprobe nach Entfernung von Werten, die außerhalb
der Skala liegen, ist in 1 gezeigt.
- b. Der Modus der restlichen 10 Grad Lichtstreuungsdaten wird
bestimmt unter Verwendung des Verfahrens beschrieben in Beispiel
2.
- c. Daten für
alle Ereignisse, deren 10 Grad Lichtstreuungswerte mehr als zwei
Standardabweichungen höher
oder niedriger als der berechnete Modus sind, werden aus der
- 7. Die Retikulozyten werden aus den restlichen Daten wie folgt
quantifiert:
- a. Der Modus für
die übrig
bleibenden 90 Grad Lichtstreuungsdaten wird berechnet unter Verwendung
des Verfahrens beschrieben in Beispiel 2. Ein Histogramm der 90
Grad Lichtstreuungsdaten für
die gleiche Probe wie in 1 (nach
Entfernung der Trombozytenklumpen und gleichzeitigen Ereignisse)
ist in 2 dargestellt.
- b. Sämtliche
Ereignisse mit 90 Grad Lichtstreuungswerten welche größer sind
als etwa zwei mal der 90 Grad Lichtstreuungsmodus werden als Retikulozyten
angenommen.
- c. Die Retikulozytenzählung
wird angepaßt
durch das Substrahieren eines Wertes gleich mit 0,002 mal der Gesamtzahl
von Ereignissen, die durch das Instrument gemessen werden (die sogenannte
Instrumenten "roh-Zählung"), was die angepaßte Retikulozytenzählung ergibt.
- d. Der Retikulozytenprozentsatz wird berechnet durch die Division
der angepaßten
Retikulozytenzählung
durch die Anzahl der übrigbleibenden
10 Grad Lichtstreuungsereignisse (die Ereignisse, die in der Analyse
verbleiben, nach dem Abschluß von
Schritt 6).
-
In dem Beispiel, das in den 1 und 2 dargestellt ist, betrug der Retikulozytenprozentsatz 13,25
Prozent. Die linearen Regressions- und Korrelationsanalysen des
vorliegenden Retikulozytenassays und der Referenzverfahren sind
in den 3 und 4 gezeigt. 3 zeigt die Retikulozytenfraktion, die
durch dieses Verfahren bestimmt wurde, (gekennzeichnet mit "CD3500") gegen die Retikulozytenfraktion
bestimmt durch ein unabhängiges
Verfahren, (gekennzeichnet mit "CD4000") für Blutproben von
38 Patienten. Das unabhängige
Verfahren ist im Detail beschrieben in WO96/33396.
-
Der Korrelationskoeffizient zwischen
den beiden Verfahren ist 0,937, was die Genauigkeit des hierin beschriebenen
Verfahrens zeigt. Die Spur für die
am besten passende gerade Linie ist 0,85, mit einem γ-Schittpunkt
von 0,95 4 zeigt die
Retikulozytenfraktion bestimmt durch dieses Verfahren (markiert "CD3500") gegen die Retikulozytenfraktion
bestimmt unter Verwendung des FACScan® Instrument/Thiazol
orange Reagenziensystems, verfügbar von
Becton Dickinson und Companyl, San Jose, CA. (markiert "Facscan"), für die gleichen
38 Blutproben. Die Korrelation zwischen diesen beiden Verfahren
ist 0,959, mit einer Spur von 0,91 und einem γ-Schnittpunkt von 0,1 für die am
besten passende gerade Linie, was weiterhin die Genauigkeit und
die Nützlichkeit
dieses Analyseverfahrens zeigt.
-
Beispiel 2
-
Berechnung
von Lichtstreuungsdatenmodi
-
Die Berechnung des Modus von Lichtstreuungswerten
wie beschrieben in Beispiel 1 kann durchgeführt werden wie folgt:
- 1. Ein 256 bin Histogramm wird erzeugt für die Werte
von Lichtstreuungsdaten, deren Modus erwünscht ist.
- 2. Das Histogramm wird vier (4) mal geglättet durch Anwendung des binominalen
Glättungsalgorithmus: Mi = 0.1Ni–2 +
0.2Ni–1 +
0.4Ni + 0.2Ni+1 +
0.1N1+2 worin
Ni die
anfänglichen
Gehalte von bin i ist, und
Mi ist die
geglätteten
Gehalte von bin i.
- 3. Der maximale Wert des viermal geglätteten Histrogramms wird durch
zwei (2) geteilt, um den 50% Wert zu ergeben.
- 4. Der bin in dem ursprünglichen
(ungeglätteten) Histogramm,
welches den höchsten
bin unterhalb des Peaks besitzt, dessen Anzahl an Gehalten weniger
oder gleich dem 50% Wert ist, wird bezeichnet als der niedrige Kanal.
Die Anzahl von Datenpunkten in diesem bin und allen bins unterhalb
dieses bins werden als untere Kanalpunkte bezeichnet.
- 5. Der bin in dem ursprünglichen
(ungeglätteten) Histogramm,
welcher der niedrigste bin oberhalb des Peaks ist, dessen Anzahl
an Gehalten kleiner oder gleich dem 50% Wert ist, wird als der hohe Kanalpunkt
bezeichnet. Die Anzahl von Datenpunkten in diesem bin und alle bins
unterhalb dieses bins werden als die hohen Kanalpunkte bezeichnet.
- 6. Der Punkt wird bestimmt, welcher die Anzahl von Punkten zwischen
dem hohen und dem niedrigen Kanal in zwei Hälften trennt:
- a. Die niedrigen Kanalpunkte werden von den hohen Kanalpunkten
substrahiert, was die Differenz ergibt.
- b. Die Hälfte
(0,5) der Differenz wird zu den hohen Kanalpunkten hinzuaddiert,
was die Anzahl von Ereignissen in und unterhalb des Mittelpunktkanals
(den Mittelpunktkanalwert) ergibt.
- c. Der niedrigste Kanal, für
den die Anzahl von Datenpunkten in oder unterhalb des Kanals gleich oder
größer dem
Mittelpunktkanalwert ist, wird bestimmt.
- 7. Der Kanal, welcher in Schritt 6 lokalisiert wurde, wird als
der Modus bezeichnet und für
die weitere Analyse wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet.
-
Beispiel 3
-
Quantifizierung von Retikulozyten
-
Bei einer alternativen Ausführungform
werden
- 1. Schritte 1 bis 5 von Beispiel 1 durchgeführt, was die
Daten ergibt, einschließlich
10 und 90 Grad Lichtstreuungswerte für bis zu 30,000 zelluläre Ereignisse.
- 2. Die Daten aus Schritt 1 werden aufgetrennt in etwa 4 bis
6 im wesentlichen gleich große
Gruppen (von etwa 5,000 bis 7,500 Ereignisse jeweils).
- 3. Die Analyseverfahren aus Schritt 6 bis Schritt 7b aus Beispiel
1 werden unabhängig
für jede Gruppe
durchgeführt,
was 4 bis 6 Werte von Gruppen-Retikulozytenzählungen ergibt, welche addiert
werden, um die Retikulozytenzählung
zu ergeben.
- 4. Die Retikulozytenzählung
wird angepaßt
durch Substraktion von 0,002 mal der gesamten Anzahl von Ereignissen,
die durch das Instrument nachgewiesen werden (die sogenannte Instrumenten "roh- Zählung").
- 5. Der Retikulozytenanteil wird berechnet durch die Division
der angepaßten
Retikulozytenzählung
durch die Summe der Ereignisse in jeder Gruppe, die nach der Entfernung
von Ereignissen außerhalb
der Skala, Plättchenklumpen
und gleichzeitigen Ereignissen wie in Beispiel 1 beschrieben, übrigbleibt.