JP3725553B2 - 網状赤血球を鑑別および同定するための試薬系および方法 - Google Patents
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Description
発明の背景
本発明は、自動化血液学分析器における粒子分析に関するものである。特に本発明は、全血試料における網状赤血球を検出および同定するための試薬系および方法に関するものである。網状赤血球は未成熟の赤血球（「ＲＢＣ」）であって、まだ網状物質（リボソームＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ）を含有するが、その成長段階にて細胞は核を排斥している。赤血球は一般に網状赤血球として血流に流入する。赤血球形成は赤芽球にて始まり、骨髄における中間の有核細胞の数世代を介し進行して網状赤血球で終端する。貧血性もしくは低酸素の条件下で、この過程は短縮しうると共に正常よりも早い段階の網状赤血球が血流に流入する。これら早期の網状赤血球は、これらが含有する過剰量のＲＮＡ並びにその大きい寸法、低いヘモグロビン含有量により、並びに血流中に網状赤血球としてより長時間存続することによって認識される。
したがって、網状赤血球カウント数は赤血球生成に関連すると共に貧血症の診断および治療に有用である。網状赤血球カウント数は歴史的に貧血症の病因学および分類に極めて緊密に関連する。網状赤血球カウント数は血液分解性貧血症、ピルビン酸キナーゼ欠損症、鎌状細胞貧血症、地中海貧血症にて増大すると共に巨赤芽球貧血症、再生不良性貧血症および一般的骨髄機能障害にて減少する。網状赤血球カウント数は、骨髄に対する化学療法剤の毒性作用を評価すべく最近使用されている。最近、血液学者は一致して網状赤血球カウント数をＲＢＣ生成の指標として推奨する。
網状赤血球を計数するための最も一般的に使用される方法は入力顕微鏡法である。ニュー・メチレン・ブルー（「ＮＭＢ］）がブレッヒャーにより１９４９年に導入されるまで、ブリリアント・クレシル・ブルーが主として使用された。極く最近のナショナル・コミティー・フォア・クリニカル・ラボラトリー・スタンダード（「ＮＣＣＬＳ」）の刊行物（ＮＣＣＬＳドキュメントＨ４４−Ｐ）は、その参考方法にてＮＭＢ染色の使用を要求している。同容積の血液をＮＭＢ染料と混合すると共に、少なくとも３分間〜約１５分間にわたり保温してＲＮＡを沈澱させる。血液塗沫を行い、染色された網状赤血球を顕微鏡にて係数する。ミラー・接眼ディスクを接眼レンズに挿入する。接眼レンズ内で観察された小さい正方形の面積は、大きい正方形の面積の１／９である。赤血球を小さい正方形で計数する一方、網状赤血球を大きい正方形にて計数する。順次に２０個の視野を計数すると共に、網状赤血球の比率を大きい正方形における全網状赤血球を９を掛算した後の小さい正方形における全赤血球により割算し、次いでその結果に１００を掛算して計算する。この人力方法の欠点は労力を要し、不正確であり、時間を消費し、かつ主観的なものとなる点である。
人力方法の欠点を、蛍光染料を用いるフローサイトメトリー技術によって修正すべく多くの試みがなされている。１９８０年代に、ピロニンＹ（「ＰＹ」）およびアクリジン・オレンジ（「ＡＯ」）が、フローサイトメーターにおける網状赤血球の染色および計数に用いられた。幾つかの半自動化フローサイトメトリー法が、全血試料から網状赤血球を計数すべく現在使用可能である。現存する各方法においては、例えばオーラミンＯ（「ＡｕＯ」）もしくはチアゾール・オレンジ（「ＴＯ」）のような陽イオン型染料を含有する希釈剤を用いて、網状赤血球内のＲＮＡを染色する。保温期間に際し、染料はゆっくり細胞膜に浸透して各網状赤血球内のＲＮＡに結合する。試料が検出帯域を通過する際に染色網状赤血球により発生した信号の量は各網状赤血球内のＲＮＡ含有量に比例する。適切な励起光源および発光検出システムを装着したフローサイトメータを使用して、全血試料における網状赤血球の比率を決定することができる。
これらフローサイトメトリー技術の顕著な特徴は、少なくとも１種の蛍光染料の使用である。蛍光は、励起光とは異なる波長の発光を特徴とする。特定波長バンドにおける光は蛍光物質（フルオロフォア）により吸収され、より長いバンドの光が発光する。発光する光の量は、励起光のレベルよりも顕著に少ない。たとえばフィルタのような光学部品を組み込んで、所望の蛍光シグナルのみの検出および測定を可能にすることが必要である。これに反し、散乱を検出および測定する検出システムはこの種のフィルタを必要としない。何故なら、散乱光は入射光と同じ波長を有するからである。さらに非蛍光検出システムには、より低コストおよびより弱い光源を用いることができる。何故なら、この種の蛍光刺激光源は細胞の光散乱特性を検出することに基づく電気−光学システムに必要とされないからである。
コレラ等に係る米国特許第５，３５０，６９５号および第５，４３８，００３号、並びにファン等に係る米国特許第５，２８４，７７１号は、全血試料を、たとえばＮＭＢもしくはオキサジン７５０のような陽イオン型染料を含む単一の試薬溶液で処理して網状赤血球におけるＲＮＡを沈澱させると共に染色し、さらに双性イオン剤をも含んで細胞を球状にすることからなる方法および試薬組成物を開示している。これら米国特許の出願人であるマイルス・インコーポレーションは、幾つかの上記方法をその最新のＨ＊３（商標）血液学装置に最近組み込んだ。この装置にはヘリウム−ネオン（「ＨｅＮｅ」）光源を装着すると共に、染料オキサジン７５０を用いて網状赤血球内のＲＮＡを染色および沈澱させる一方、双性イオン型界面活性剤を用いて容量測定の準備に際しＲＢＣおよび網状赤血球を球状にする。第ＩＶ族網状赤血球を検出する際のこの方法の感度は貧弱であることが証明されている。
異なる手法がコールター・コーポレーションによりＷＯ９４／２７１４６号で採用される。ここではＮＭＢ染色試料を人力で硫酸系試薬により処理して、ＲＢＣを「ゴースト」させる。コールターはその技術をＶＣＳ（ボリューム、コンダクチビティーおよびスキャッター）と称し、この種の半自動化網状赤血球法をそのＳＴＫＳ（商標）およびＭＡＸＭ（商標）血液学分析器に組み込んでいる。コールターのＶＣＳ網状赤血球測定においては、血液試料をオフラインにてＮＭＢ染料と混合し、室温にて５分間保温する。次いで小容積の染色血液試料を、硫酸を含有する清澄用溶液で希釈する。清澄用もしくは「ゴースト用」溶液は細胞を膨潤させて球状となし、さらにヘモグロビンを細胞から漏出させる。所定の極めて臨界的な時間の後、作成試料を次いでコールターＳＴＫＳ（商標）もしくはＭＡＸＭ（商標）血液学分析器に注入して分析を完了する。網状赤血球、成熟ＲＢＣ、白血球および血小板は光散乱測定とインピーダンス（ボリウム）測定との組合せに基づき区別される。しかしながら、ゴースト段階につきタイミングが極めて重要である。時間が長過ぎればＲＢＣの溶解が生じ、短過ぎれば網状赤血球および成熟ＲＢＣの解像が貧弱となる。
マイルス・インコーポレーションおよびコールター社の両方法はしたがって重大な問題を提起すると共に、正確な測定を確保するには装置操作員の側で努力を必要とする。これは特に、染色時間および染色調整物の「ゴースト化」に関する場合である。
したがってハードウェアーを大きく変更することなしに或いは内蔵された試薬の置換もしくは交換の必要なしに、現存する血液学分析器に適用しうる網状赤血球法に対するニーズが存在する。
発明の要点
血液試料における網状赤血球を鑑別および濃度測定するための試薬および方法が提供される。
特に、網状赤血球染色用試薬と希釈剤試薬とを含む試薬系が、網状赤血球の自動化光散乱測定を可能にすべく提供される。
より詳細には、本発明の試薬系を用いて、自動化電気−光学血液学分析器の低張性（分解性）環境にて網状赤血球を染色および保護する。
一般に試薬系の網状赤血球染色用試薬成分はＲＢＣを球状にする陰イオン型もしくは双性イオン型薬剤、ＲＢＣ内の全ての核酸物質を染色および沈澱させる過剰量の染料および高濃度の電解質を含む。
好ましくは網状赤血球染色用試薬は約０．７〜約１．３ｇの核酸染料を希釈剤試薬１Ｌ当たりに含み、ここで染料はアズールＢ、ニュー・メチレン・ブルー、ブリリアント・クレシル・ブルーおよびオキサジン７５０よりなるから選択され、さらに約３〜約７ｍｇの網状赤血球球状化剤を希釈剤試薬１Ｌ当たりに含み、この希釈剤試薬はｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＤＤＡＰＳ）およびＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＴＤＡＰＳ）から選択され、さらに希釈剤試薬１Ｌ当たり約１７〜約２３ｇの修酸のアンモニウム塩、カリウム塩およびナトリウム塩よりなる群から選択される電解質を含む。
特に好ましくは網状赤血球染色用試薬は約１９．０〜約２１．０ｇのシュウ酸カリウム（一水塩）と約０．９５〜約１．０５ｇのニュー・メチレン・ブルーと約４．７５〜約５．２５ｍｇのｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシドと約１．０Ｌの希釈剤試薬とを含む。
網状赤血球染色用試薬の処方とは別途に或いは組合せて使用される試薬系の希釈剤試薬成分は約２．３３〜約２．５７ｇの燐酸ナトリウム（二塩基性）と約０．３８〜約０．４２ｇの燐酸カリウム（一塩基性）と約０．１８〜約０．２２ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム（二水塩）と約７．２５〜約８．８６ｇの塩化ナトリウムと約０．３６〜約０．４４ｇの塩化カリウムと約０．２８〜約０．３５ｇのプロクリン３００と１Ｌまでの脱イオン水とを含む。
より好ましくは希釈剤試薬は約２．３３〜約２．５７ｇの燐酸ナトリウム（二塩基性）と約０．３８〜０．４２ｇの燐酸カリウム（一塩基性）と約０．１９〜約０．２１ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム（二水塩）と約７．６５〜約８．４５ｇの塩化ナトリウムと約０．３８〜約０．４２ｇの塩化カリウムと約０．３０〜約０．３３ｇのプロクリン３００と１Ｌまでの脱イオン水とを含む。希釈剤試薬のｐＨは約７．２〜約７．６の範囲であって、５５０ｍＯｓ／ｋｇより大のモル浸透圧濃度を有する。
他面において本発明は、血液試料における網状赤血球を鑑別および定量するための方法を提供する。この方法は、約３．７〜約４．３ｍＬの上記網状赤血球染色溶液を約１０〜約４０μＬの凝固防止された全血と合わすことからなっている。得られる混合物を約１５分間〜約４時間にわたり保温する。次いで混合物を一度に実質的に１個の細胞にて照明フローセルに通過させると共に、照明流から少なくとも１０°および９０°の光散乱データを集める。集めたデータを次いで分析すると共に、網状赤血球をそこから鑑別する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例１に記載したオフスケール値を除去した後の患者試料に関する１０°散乱値のヒストグラムの例である。
第２図は、患者凝血物および合併イベントを実施例２に記載したように除去した後の第１図におけると同じ試料に関する９０°散乱データのヒストグラムの例である。
第３図は現在の網状赤血球分析の結果と他の対照法との相関関係を示す。
第４図は現在の網状赤血球分析の結果と他の対照法との相関関係を示す。
第５図は市販の血液学分析器に対する改変のためのソフトウェアーフロースクリプトの流れ図である。
好適具体例の詳細な説明
本発明の具体例は一般に血液の試料における網状赤血球の濃度を定量するための試薬および方法からなっている。より詳細には、この方法および試薬は血液試料における網状赤血球を染色すると共に検出する。次いで染色された試料を自動化血液学分析器により分析することができる。光散乱データを集めると共に試料の網状赤血球含有量を定量する。
一般にこの方法は、血液試料を１種もしくはそれ以上の試薬と共に保温することからなっている。次いで染色された試料を、たとえばセル−ダイン（商標）３５００血液学装置のようなアボット・ラボラトリース社、ダイアグノスチックス部門、サンタ・クララ、ＣＡから入手しうる自動化電気−光学血液学分析器で分析する。この種類の装置は凝固防止された血液の試料を分析して１回もしくはそれ以上の光学的および電気的測定を行い、血液試料に関する定量的な血液学情報を得る。
好適具体例においてはセル−ダイン（商標）３５００血液学装置を網状赤血球の定量を容易化すべく改変する。改変は装置の操作を制御するソフトウェアーで行われる。この種のソフトウェアー改変の例を第５図のフロースプリプトに示す。改変された分析法は一般に少なくとも０°、１０°および９０°の光散乱データを用いる未改変型の装置により行われる白血球光学分析（ＷＯＣ）に類似する。主たる改変は、一般に装置の内蔵低張性シース（ｓｈｅａｔｈ）試薬で行う血液試料保温の排除；光学血液センサの不能化；および新たなデータ獲得および分析プログラムの実施からなっている。
１具体例において、試薬系が提供される。この系の１成分は網状赤血球染色用試薬であってアズールＢ、ニュー・メチレン・ブルー（「ＮＭＢ」）、ブリリアント・クレシル・ブルーおよびオキサジン７５０よりなる群から選択される約０．７〜約１．３ｇの核酸染料とｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＤＤＡＰＳ）およびＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＴＤＡＰＳ）よりなる群から選択される約３〜約７ｍｇの網状赤血球球状化剤とシュウ酸のアンモニウム塩、カリウム塩およびナトリウム塩よりなる群から選択される約１７〜約２３ｇの電解質とを含む。この染色用試薬を、希釈剤試薬と共に使用する前または使用の際に合する。上記および以下の各濃度は、希釈剤試薬を用いた１Ｌ当たりの濃度に基づくものである。
網状赤血球染色用試薬と組合せて使用する試薬系の希釈剤試薬成分は約２．３３〜約２．５７ｇの燐酸ナトリウム（二塩基性）と約０．３８〜約０．４２ｇの燐酸カリウム（一塩基性）と約０．１８〜約０．２２ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム（二水塩）と約７．２５〜約８．８６ｇの塩化ナトリウムと約０．３６〜約０．４４ｇの塩化カリウムと約０．２８〜約０．３５ｇのプロクリン３００と１Ｌまでの脱イオン水とを含む。
本発明の方法は１具体例において、凝固を防止すべくＥＤＴＡと混合した約２０μＬの全血を約４ｍＬの上記網状赤血球試薬系に添加し、この混合物を室温にて約１５分間〜約４時間にわたり保温することからなっている。保温した混合物を次いで分析装置に供給し、ここで細胞の光散乱特性を検出し、収集し、鑑別し、かつ定量する。データ収集は少なくとも１０°および９０°の光散乱測定を含む。０°の散乱シグナルを、特に１０°および９０°の散乱シグナルの域値として使用すべく用いることもできる。
分析法の具体例に関する以下の例示説明は、第５図に例示したフロースクリプトソフトウェアーにより改変されたセル−ダイン（商標）３５００の各部品、プロセスおよびデータ出力を示す。この種の改変されたセル−ダイン（商標）３５００装置は本出願人であるアボット・ラボラトリース社から１９９６年に市販されていると思われる。
本発明の試薬系および方法の重要な利点は網状赤血球を分解性シース試薬を用いる分析器の有害環境にかけた際の各試薬（特に希釈剤成分）による網状赤血球の保護である。この利点は、高価な装置ハードウェアーの改変および内蔵試薬または試薬交換を必要としないことを意味する。
改変した後、第５図に示したソフトウェアー定形的プログラムもしくはフロースクリプト（「ＲＥＴ」）を、セル−ダイン（商標）３５００の操作員に示された「スペシメン・タイプ」メニューから「ＲＥＴＩＣ」オプションを選択して実施する。網状赤血球につき分析する場合、たとえばＲＢＣ測定、ＷＢＣインピーダンス測定またはヘモグロビン測定のような他の定形的な分析は行わない。
タッチプレートを押してフロースクリプトＲＥＴを開始させる。フロースクリプトＲＥＴは一連の手順ＱＳＯ（アペンディックス参照）を呼出し、一連の手順ＱＳＯの終了を待機し、次いで終了させる。
一連の手順ＱＳＯは血液の試料（上記試薬と共に保温）を開口プローブ中へ約３．３秒間にわたり吸入させる。セル−ダイン（商標）３５００の血液試料センサは、この改変フロースクリプトにおいて予備処理過程に際し試料を事前に希釈するため用いられない。試料の吸入部分を次いでペリスタリックポンプによりシアー（ｓｈｅａｒ）弁まで移送し、開口プローブの清浄用ブロックを移動させて開口プローブ清浄を可能にする。次いで、この定形プログラムは一連の手順ＱＰＮおよびＱＣＮを開始し、これらが終了するのを待機し、次いで終了させる。
ＱＳＯにより呼出される一連の手順の１つである一連の手順ＱＣＮはシアー弁から試料を受入れるようにＷＯＣ混合チャンバーを準備する。この定形プログラムは一連の手順ＬＤ８を介し希釈剤貯槽を満たす（セル−ダイン（商標）３５００で用いた標準型から改変されない）。試料および試薬を注射器ポンプによりＷＯＣ混合チャンバーに移送し、一連の手順ＬＳ５（セル−ダイン（商標）３５００で用いた標準型から改変しない）は標準セル−ダイン（商標）３５００シース試薬でシース貯槽を満たす。廃棄チャンバーを空にし、試料を混合し、一連の手順ＱＷＣを呼出してＷＯＣ（光学計数）測定を開始させる。光学測定からのデータを集める前に、データバッファーをクリアーする。次いで定形プログラムはシアー弁を吸入位置まで回転させる。セル−ダイン（商標）３５００データステーションに光学測定からのデータを受入れるよう指示し、一連の手順ＱＰＬを呼び出してフローパネルを清浄する。次いでＱＣＮを終了させる。
ＱＳＯにより呼出される他の定形プログラムである一連の手順ＱＰＮは過剰の血液を開口試料吸入プローブおよび閉鎖試料吸入プローブ（網状赤血球分析には使用されないが、吸入されてＹ型取付管をはっきりさせる）から吸入すると共に、開口試料吸入ラインを清浄する。開口試料吸入プローブの外側を清浄すると共に、一連の手順ＱＣＬを呼出す。次いで一連の手順ＱＰＮを終了させる。
一連の手順ＱＷＣを一連の手順ＱＣＮにより呼出す。これは試料をＷＯＣ試料通路まで移送し、この通路を約９ｐｓｉまで加圧し、試料をＷＯＣフローセル中へ注入する。希釈剤試料流（上記のように処方）をＷＯＣフローセル中に流し始め、９ｐｓｉアキュミュレータ入口を閉鎖して、シース流がフローセルに通過するよう確保する。データ収集は、１０°および９０°の散乱シグナルを以下の実施例に記載するように収集して行う。０°の散乱を用いて、１０°および９０°のデータ収集を開始させる。光学データ収集が完了すれば、一連の手順ＱＷＣを終了させる。
一連の手順ＱＰＬを一連の手順ＱＣＮにより呼出す。この定形プログラムは水銀減圧アキュミュレータの第二１２インチを再充填し、廃棄室Ｎｏ．２を空にし、ＷＣＯ試料注射器を満たし、次いでＷＣＯ試料通路を清浄する。シアー弁までの試薬ラインにおける圧力を解除し、試料混合ラインを清浄し、リストモードデータ収集を止め、その後に一連の手順ＱＰＬを終了させる。
以下、実施例により特定データ分析法につき説明する。
実施例１
全血試料における網状赤血球の定量
１． 約２０．０ｇのシュウ酸カリウム（一水塩）と約１．０ｇのニュー・メチレン・ブルーと約５．０ｍｇのｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（これらは全てシグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ＭＯから入手しうる）とを約１．０Ｌの希釈剤試薬と混合することにより試薬溶液を作製した。希釈剤試薬の組成は次の通りであった：燐酸ナトリウム（二塩基性）２．４５ｇ；燐酸カリウム（一塩基性）０．４０ｇ；ＥＤＴＡ二ナトリウム（二水塩）０．２０ｇ；塩化ナトリウム、８．０５ｇ；塩化カリウム、０．４０ｇ；プロクリン３００ ０．３１５ｇ；および１Ｌまでの脱イオン水。希釈剤試薬のｐＨは約７．２〜約７．６の範囲であり、その浸透圧モル濃度は＞５５０ｍＯｓ／ｋｇであった。
２． ＥＤＴＡと混合して凝血を防止した約２０μＬの全血を次いで約４ｍＬの試薬溶液と混合し、室温にて約１５分間〜４時間にわたり保温した。
３． 試料を、一般にＷＢＣ分析につき用いられる標準セル−ダイン（商標）３５００試薬を用いＷＯＣチャンネルにてセル−ダイン（商標）３５００血液学分析器に吸入すると共に分析した。分析器のフロースクリプトを、血液およびシース試薬の通常の保温を排除すると共に一般に血液試料の吸入を検出するような赤外線センサを不能にするよう改変した。これら改変の両者は、第５図に示したフロースクリプトにより行われる。
４． ３０，０００イベントまでの少なくとも１０°散乱値および９０°散乱値よりなるデータを集め、装置に記憶させる。データを０〜２５５の範囲の８−ビット数として記憶させた。
５． ２５５の１０°散乱値または２５５の９０°散乱値のようなオフスケール数値を有するイベントのデータを分析から除去する。
６． 血小板凝血物に関連したイベントおよび合併イベントのデータを次のように除去する：
ａ． 残余の１０°散乱値の標準偏差を計算する。オフスケール値を除去した後の患者試料に関する１０°散乱値のヒストグラムの例を第１図に示す。
ｂ． 残余の１０°散乱値データのモードを、実施例２に記載した手順により決定する。
ｃ． １０°散乱値が計算モードよりも高い或いは低い約２の標準偏差より大である全てのイベントのデータを分析から除去する。
７． 網状赤血球を残余のデータから次のように定量する：
ａ． 残余の９０°散乱データのモードを実施例２に記載した手順により計算する。第１図におけると同じ試料の９０°散乱データのヒストグラム（血小板凝血および合併イベントの除去後）を第２図に示す。
ｂ． ９０°散乱モードの約２倍より大である９０°散乱値を有する全てのイベントが網状赤血球であると考えられる。
ｃ． 網状赤血球カウント数を、装置により測定された全イベント数の０．００２倍に等しい数値を引算して調整し（いわゆる装置の「原カウント数」）、調整網状赤血球カウント数を得る。
ｄ． 網状赤血球比率を、調整網状赤血球カウント数を残余の１０°散乱イベントの個数により割算して計算する（これらイベントは工程６の完了後における分析にて残留する）。
第１図および第２図に示した実施例において、網状赤血球比率は１３．２５％であった。現網状赤血球分析および対照過程の直線回帰分析および相関分析を第３図および第４図に示す。第３図は、この方法により決定された網状赤血球フラクション（標識「ＣＤ３５００」）と独立方法により決定された網状赤血球フラクション（標識「ＣＤ４０００」）との関係を３８名の患者からの血液試料につき示す。独立した方法については米国特許出願第０８／４２６，４０８号［１９９５年４月２１日出願の「網状赤血球を迅速分析するための組成物および方法」］に詳細に記載されている。これら２種の方法の間の相関計数は０．９３７であり、ここに説明した方法の精度を示す。最良の適合直線の傾斜は０．８５であり、０．９５のｙ切片を有する。第４図は、この方法により決定された網状赤血球フラクション（標識「ＣＤ３５００」）とＦＡＣＳｃａｎ（商標）装置／チアゾール・オレンジ試薬系（ベクトン・ジキンソン・アンド・カンパニー、サン・ヨセ、ＣＡを用いて決定された網状赤血球フラクション［標識「ファクスキャン」］との関係を同じ３８種の血液試料につき示す。これら２種の方法の間の相関は０．９５９であり、最良の適合直線につき０．９１の傾斜および０．１のｙ切片を有し、これはさらにこの分析法の正確度を示すと共に有用性をも示す。
実施例２
散乱データモードの計算
実施例１に記載した散乱値のモードの計算は次のように行うことができる：
１． ２５６ ｂｉｎヒストグラムを、所望するモードの散乱データの数値につき形成させる。
２． ヒストグラムを、二項式平滑化アルゴリズム：
Ｍｉ＝０．１Ｎi-2＋０．２Ｎi-1
＋０．４Ｎi＋０．２Ｎi+1＋０．１Ｎi+2
［式中、Ｎiはｂｉｎ ｉの初期含有量であり、
Ｍiはｂｉｎ ｉの平滑化含有量である］
を用いて４回平滑化させる。
３． ４回の平滑化ヒストグラムの最大値を２で割算して５０％値を得る。
４． 含有数が５０％値より低いまたは等しいピークよりも低い最高ｂｉｎである初期（非平滑化）ヒストグラムにおけるｂｉｎを低チャンネルと称する。このｂｉｎおよびこのｂｉｎより低い全てのｂｉｎにおけるデータ点の数を低チャンネル点と称する。
５． 含有数が５０％値より低いまたは等しいピークよりも高い最低ｂｉｎである初期（非平滑化）ヒストグラムにおけるｂｉｎを高チャンネルと称する。このｂｉｎおよびこのｂｉｎより低い全てのｂｉｎにおけるデータ点の数を高チャンネル点と称する。
６． 高チャンネルと低チャンネルとの間の点の数を２分する点を見出す：
ａ． 低チャンネル点を高チャンネル点から引算して差を得る。
ｂ． この差の半分（０．５）を低チャンネル点に加算して、中間点チャンネルおよびそれ以下のイベント数（中間点チャンネル値）を得る。
ｃ． そのチャンネルおよびそれ以下のデータ点の個数が中間点チャンネル値に等しい或いはそれより大である最低チャンネルを見出す。
７． 工程６で見出したチャンネルをモードと称し、実施例１に記載した他の分析に用いる。
実施例３
網状赤血球の定量
代案実施例：
１． 実施例１の工程１〜５を行って、３０，０００細胞イベントまでの１０°および９０°散乱値を含むデータを得る。
２． 工程１からのデータを約４〜６個の実質的に等しい大きさの群に分割する（それぞれ約５，０００〜７，５００イベント）。
３． 実施例１の工程６〜工程７ｂの分析手順を各群につき独立して行い、グループ網状赤血球カウント数の４〜６数値を得、これらを合計して網状赤血球カウント数を得る。
４． 装置により検出された全イベント数の０．００２倍を引算して網状赤血球カウント数を調整する（いわゆる装置「原カウント数」）。
５． 調整網状赤血球カウント数を実施例１に記載したオフスケールイベント、血小板凝血物および合併イベントの除去後に残留する各群におけるイベントの合計で割って網状赤血球フラクションを計算する。
本発明は、自動化血液学分析器における粒子分析に関するものである。特に本発明は、全血試料における網状赤血球を検出および同定するための試薬系および方法に関するものである。網状赤血球は未成熟の赤血球（「ＲＢＣ」）であって、まだ網状物質（リボソームＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ）を含有するが、その成長段階にて細胞は核を排斥している。赤血球は一般に網状赤血球として血流に流入する。赤血球形成は赤芽球にて始まり、骨髄における中間の有核細胞の数世代を介し進行して網状赤血球で終端する。貧血性もしくは低酸素の条件下で、この過程は短縮しうると共に正常よりも早い段階の網状赤血球が血流に流入する。これら早期の網状赤血球は、これらが含有する過剰量のＲＮＡ並びにその大きい寸法、低いヘモグロビン含有量により、並びに血流中に網状赤血球としてより長時間存続することによって認識される。
したがって、網状赤血球カウント数は赤血球生成に関連すると共に貧血症の診断および治療に有用である。網状赤血球カウント数は歴史的に貧血症の病因学および分類に極めて緊密に関連する。網状赤血球カウント数は血液分解性貧血症、ピルビン酸キナーゼ欠損症、鎌状細胞貧血症、地中海貧血症にて増大すると共に巨赤芽球貧血症、再生不良性貧血症および一般的骨髄機能障害にて減少する。網状赤血球カウント数は、骨髄に対する化学療法剤の毒性作用を評価すべく最近使用されている。最近、血液学者は一致して網状赤血球カウント数をＲＢＣ生成の指標として推奨する。
網状赤血球を計数するための最も一般的に使用される方法は入力顕微鏡法である。ニュー・メチレン・ブルー（「ＮＭＢ］）がブレッヒャーにより１９４９年に導入されるまで、ブリリアント・クレシル・ブルーが主として使用された。極く最近のナショナル・コミティー・フォア・クリニカル・ラボラトリー・スタンダード（「ＮＣＣＬＳ」）の刊行物（ＮＣＣＬＳドキュメントＨ４４−Ｐ）は、その参考方法にてＮＭＢ染色の使用を要求している。同容積の血液をＮＭＢ染料と混合すると共に、少なくとも３分間〜約１５分間にわたり保温してＲＮＡを沈澱させる。血液塗沫を行い、染色された網状赤血球を顕微鏡にて係数する。ミラー・接眼ディスクを接眼レンズに挿入する。接眼レンズ内で観察された小さい正方形の面積は、大きい正方形の面積の１／９である。赤血球を小さい正方形で計数する一方、網状赤血球を大きい正方形にて計数する。順次に２０個の視野を計数すると共に、網状赤血球の比率を大きい正方形における全網状赤血球を９を掛算した後の小さい正方形における全赤血球により割算し、次いでその結果に１００を掛算して計算する。この人力方法の欠点は労力を要し、不正確であり、時間を消費し、かつ主観的なものとなる点である。
人力方法の欠点を、蛍光染料を用いるフローサイトメトリー技術によって修正すべく多くの試みがなされている。１９８０年代に、ピロニンＹ（「ＰＹ」）およびアクリジン・オレンジ（「ＡＯ」）が、フローサイトメーターにおける網状赤血球の染色および計数に用いられた。幾つかの半自動化フローサイトメトリー法が、全血試料から網状赤血球を計数すべく現在使用可能である。現存する各方法においては、例えばオーラミンＯ（「ＡｕＯ」）もしくはチアゾール・オレンジ（「ＴＯ」）のような陽イオン型染料を含有する希釈剤を用いて、網状赤血球内のＲＮＡを染色する。保温期間に際し、染料はゆっくり細胞膜に浸透して各網状赤血球内のＲＮＡに結合する。試料が検出帯域を通過する際に染色網状赤血球により発生した信号の量は各網状赤血球内のＲＮＡ含有量に比例する。適切な励起光源および発光検出システムを装着したフローサイトメータを使用して、全血試料における網状赤血球の比率を決定することができる。
これらフローサイトメトリー技術の顕著な特徴は、少なくとも１種の蛍光染料の使用である。蛍光は、励起光とは異なる波長の発光を特徴とする。特定波長バンドにおける光は蛍光物質（フルオロフォア）により吸収され、より長いバンドの光が発光する。発光する光の量は、励起光のレベルよりも顕著に少ない。たとえばフィルタのような光学部品を組み込んで、所望の蛍光シグナルのみの検出および測定を可能にすることが必要である。これに反し、散乱を検出および測定する検出システムはこの種のフィルタを必要としない。何故なら、散乱光は入射光と同じ波長を有するからである。さらに非蛍光検出システムには、より低コストおよびより弱い光源を用いることができる。何故なら、この種の蛍光刺激光源は細胞の光散乱特性を検出することに基づく電気−光学システムに必要とされないからである。
コレラ等に係る米国特許第５，３５０，６９５号および第５，４３８，００３号、並びにファン等に係る米国特許第５，２８４，７７１号は、全血試料を、たとえばＮＭＢもしくはオキサジン７５０のような陽イオン型染料を含む単一の試薬溶液で処理して網状赤血球におけるＲＮＡを沈澱させると共に染色し、さらに双性イオン剤をも含んで細胞を球状にすることからなる方法および試薬組成物を開示している。これら米国特許の出願人であるマイルス・インコーポレーションは、幾つかの上記方法をその最新のＨ＊３（商標）血液学装置に最近組み込んだ。この装置にはヘリウム−ネオン（「ＨｅＮｅ」）光源を装着すると共に、染料オキサジン７５０を用いて網状赤血球内のＲＮＡを染色および沈澱させる一方、双性イオン型界面活性剤を用いて容量測定の準備に際しＲＢＣおよび網状赤血球を球状にする。第ＩＶ族網状赤血球を検出する際のこの方法の感度は貧弱であることが証明されている。
異なる手法がコールター・コーポレーションによりＷＯ９４／２７１４６号で採用される。ここではＮＭＢ染色試料を人力で硫酸系試薬により処理して、ＲＢＣを「ゴースト」させる。コールターはその技術をＶＣＳ（ボリューム、コンダクチビティーおよびスキャッター）と称し、この種の半自動化網状赤血球法をそのＳＴＫＳ（商標）およびＭＡＸＭ（商標）血液学分析器に組み込んでいる。コールターのＶＣＳ網状赤血球測定においては、血液試料をオフラインにてＮＭＢ染料と混合し、室温にて５分間保温する。次いで小容積の染色血液試料を、硫酸を含有する清澄用溶液で希釈する。清澄用もしくは「ゴースト用」溶液は細胞を膨潤させて球状となし、さらにヘモグロビンを細胞から漏出させる。所定の極めて臨界的な時間の後、作成試料を次いでコールターＳＴＫＳ（商標）もしくはＭＡＸＭ（商標）血液学分析器に注入して分析を完了する。網状赤血球、成熟ＲＢＣ、白血球および血小板は光散乱測定とインピーダンス（ボリウム）測定との組合せに基づき区別される。しかしながら、ゴースト段階につきタイミングが極めて重要である。時間が長過ぎればＲＢＣの溶解が生じ、短過ぎれば網状赤血球および成熟ＲＢＣの解像が貧弱となる。
マイルス・インコーポレーションおよびコールター社の両方法はしたがって重大な問題を提起すると共に、正確な測定を確保するには装置操作員の側で努力を必要とする。これは特に、染色時間および染色調整物の「ゴースト化」に関する場合である。
したがってハードウェアーを大きく変更することなしに或いは内蔵された試薬の置換もしくは交換の必要なしに、現存する血液学分析器に適用しうる網状赤血球法に対するニーズが存在する。
発明の要点
血液試料における網状赤血球を鑑別および濃度測定するための試薬および方法が提供される。
特に、網状赤血球染色用試薬と希釈剤試薬とを含む試薬系が、網状赤血球の自動化光散乱測定を可能にすべく提供される。
より詳細には、本発明の試薬系を用いて、自動化電気−光学血液学分析器の低張性（分解性）環境にて網状赤血球を染色および保護する。
一般に試薬系の網状赤血球染色用試薬成分はＲＢＣを球状にする陰イオン型もしくは双性イオン型薬剤、ＲＢＣ内の全ての核酸物質を染色および沈澱させる過剰量の染料および高濃度の電解質を含む。
好ましくは網状赤血球染色用試薬は約０．７〜約１．３ｇの核酸染料を希釈剤試薬１Ｌ当たりに含み、ここで染料はアズールＢ、ニュー・メチレン・ブルー、ブリリアント・クレシル・ブルーおよびオキサジン７５０よりなるから選択され、さらに約３〜約７ｍｇの網状赤血球球状化剤を希釈剤試薬１Ｌ当たりに含み、この希釈剤試薬はｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＤＤＡＰＳ）およびＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＴＤＡＰＳ）から選択され、さらに希釈剤試薬１Ｌ当たり約１７〜約２３ｇの修酸のアンモニウム塩、カリウム塩およびナトリウム塩よりなる群から選択される電解質を含む。
特に好ましくは網状赤血球染色用試薬は約１９．０〜約２１．０ｇのシュウ酸カリウム（一水塩）と約０．９５〜約１．０５ｇのニュー・メチレン・ブルーと約４．７５〜約５．２５ｍｇのｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシドと約１．０Ｌの希釈剤試薬とを含む。
網状赤血球染色用試薬の処方とは別途に或いは組合せて使用される試薬系の希釈剤試薬成分は約２．３３〜約２．５７ｇの燐酸ナトリウム（二塩基性）と約０．３８〜約０．４２ｇの燐酸カリウム（一塩基性）と約０．１８〜約０．２２ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム（二水塩）と約７．２５〜約８．８６ｇの塩化ナトリウムと約０．３６〜約０．４４ｇの塩化カリウムと約０．２８〜約０．３５ｇのプロクリン３００と１Ｌまでの脱イオン水とを含む。
より好ましくは希釈剤試薬は約２．３３〜約２．５７ｇの燐酸ナトリウム（二塩基性）と約０．３８〜０．４２ｇの燐酸カリウム（一塩基性）と約０．１９〜約０．２１ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム（二水塩）と約７．６５〜約８．４５ｇの塩化ナトリウムと約０．３８〜約０．４２ｇの塩化カリウムと約０．３０〜約０．３３ｇのプロクリン３００と１Ｌまでの脱イオン水とを含む。希釈剤試薬のｐＨは約７．２〜約７．６の範囲であって、５５０ｍＯｓ／ｋｇより大のモル浸透圧濃度を有する。
他面において本発明は、血液試料における網状赤血球を鑑別および定量するための方法を提供する。この方法は、約３．７〜約４．３ｍＬの上記網状赤血球染色溶液を約１０〜約４０μＬの凝固防止された全血と合わすことからなっている。得られる混合物を約１５分間〜約４時間にわたり保温する。次いで混合物を一度に実質的に１個の細胞にて照明フローセルに通過させると共に、照明流から少なくとも１０°および９０°の光散乱データを集める。集めたデータを次いで分析すると共に、網状赤血球をそこから鑑別する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例１に記載したオフスケール値を除去した後の患者試料に関する１０°散乱値のヒストグラムの例である。
第２図は、患者凝血物および合併イベントを実施例２に記載したように除去した後の第１図におけると同じ試料に関する９０°散乱データのヒストグラムの例である。
第３図は現在の網状赤血球分析の結果と他の対照法との相関関係を示す。
第４図は現在の網状赤血球分析の結果と他の対照法との相関関係を示す。
第５図は市販の血液学分析器に対する改変のためのソフトウェアーフロースクリプトの流れ図である。
好適具体例の詳細な説明
本発明の具体例は一般に血液の試料における網状赤血球の濃度を定量するための試薬および方法からなっている。より詳細には、この方法および試薬は血液試料における網状赤血球を染色すると共に検出する。次いで染色された試料を自動化血液学分析器により分析することができる。光散乱データを集めると共に試料の網状赤血球含有量を定量する。
一般にこの方法は、血液試料を１種もしくはそれ以上の試薬と共に保温することからなっている。次いで染色された試料を、たとえばセル−ダイン（商標）３５００血液学装置のようなアボット・ラボラトリース社、ダイアグノスチックス部門、サンタ・クララ、ＣＡから入手しうる自動化電気−光学血液学分析器で分析する。この種類の装置は凝固防止された血液の試料を分析して１回もしくはそれ以上の光学的および電気的測定を行い、血液試料に関する定量的な血液学情報を得る。
好適具体例においてはセル−ダイン（商標）３５００血液学装置を網状赤血球の定量を容易化すべく改変する。改変は装置の操作を制御するソフトウェアーで行われる。この種のソフトウェアー改変の例を第５図のフロースプリプトに示す。改変された分析法は一般に少なくとも０°、１０°および９０°の光散乱データを用いる未改変型の装置により行われる白血球光学分析（ＷＯＣ）に類似する。主たる改変は、一般に装置の内蔵低張性シース（ｓｈｅａｔｈ）試薬で行う血液試料保温の排除；光学血液センサの不能化；および新たなデータ獲得および分析プログラムの実施からなっている。
１具体例において、試薬系が提供される。この系の１成分は網状赤血球染色用試薬であってアズールＢ、ニュー・メチレン・ブルー（「ＮＭＢ」）、ブリリアント・クレシル・ブルーおよびオキサジン７５０よりなる群から選択される約０．７〜約１．３ｇの核酸染料とｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＤＤＡＰＳ）およびＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＴＤＡＰＳ）よりなる群から選択される約３〜約７ｍｇの網状赤血球球状化剤とシュウ酸のアンモニウム塩、カリウム塩およびナトリウム塩よりなる群から選択される約１７〜約２３ｇの電解質とを含む。この染色用試薬を、希釈剤試薬と共に使用する前または使用の際に合する。上記および以下の各濃度は、希釈剤試薬を用いた１Ｌ当たりの濃度に基づくものである。
網状赤血球染色用試薬と組合せて使用する試薬系の希釈剤試薬成分は約２．３３〜約２．５７ｇの燐酸ナトリウム（二塩基性）と約０．３８〜約０．４２ｇの燐酸カリウム（一塩基性）と約０．１８〜約０．２２ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム（二水塩）と約７．２５〜約８．８６ｇの塩化ナトリウムと約０．３６〜約０．４４ｇの塩化カリウムと約０．２８〜約０．３５ｇのプロクリン３００と１Ｌまでの脱イオン水とを含む。
本発明の方法は１具体例において、凝固を防止すべくＥＤＴＡと混合した約２０μＬの全血を約４ｍＬの上記網状赤血球試薬系に添加し、この混合物を室温にて約１５分間〜約４時間にわたり保温することからなっている。保温した混合物を次いで分析装置に供給し、ここで細胞の光散乱特性を検出し、収集し、鑑別し、かつ定量する。データ収集は少なくとも１０°および９０°の光散乱測定を含む。０°の散乱シグナルを、特に１０°および９０°の散乱シグナルの域値として使用すべく用いることもできる。
分析法の具体例に関する以下の例示説明は、第５図に例示したフロースクリプトソフトウェアーにより改変されたセル−ダイン（商標）３５００の各部品、プロセスおよびデータ出力を示す。この種の改変されたセル−ダイン（商標）３５００装置は本出願人であるアボット・ラボラトリース社から１９９６年に市販されていると思われる。
本発明の試薬系および方法の重要な利点は網状赤血球を分解性シース試薬を用いる分析器の有害環境にかけた際の各試薬（特に希釈剤成分）による網状赤血球の保護である。この利点は、高価な装置ハードウェアーの改変および内蔵試薬または試薬交換を必要としないことを意味する。
改変した後、第５図に示したソフトウェアー定形的プログラムもしくはフロースクリプト（「ＲＥＴ」）を、セル−ダイン（商標）３５００の操作員に示された「スペシメン・タイプ」メニューから「ＲＥＴＩＣ」オプションを選択して実施する。網状赤血球につき分析する場合、たとえばＲＢＣ測定、ＷＢＣインピーダンス測定またはヘモグロビン測定のような他の定形的な分析は行わない。
タッチプレートを押してフロースクリプトＲＥＴを開始させる。フロースクリプトＲＥＴは一連の手順ＱＳＯ（アペンディックス参照）を呼出し、一連の手順ＱＳＯの終了を待機し、次いで終了させる。
一連の手順ＱＳＯは血液の試料（上記試薬と共に保温）を開口プローブ中へ約３．３秒間にわたり吸入させる。セル−ダイン（商標）３５００の血液試料センサは、この改変フロースクリプトにおいて予備処理過程に際し試料を事前に希釈するため用いられない。試料の吸入部分を次いでペリスタリックポンプによりシアー（ｓｈｅａｒ）弁まで移送し、開口プローブの清浄用ブロックを移動させて開口プローブ清浄を可能にする。次いで、この定形プログラムは一連の手順ＱＰＮおよびＱＣＮを開始し、これらが終了するのを待機し、次いで終了させる。
ＱＳＯにより呼出される一連の手順の１つである一連の手順ＱＣＮはシアー弁から試料を受入れるようにＷＯＣ混合チャンバーを準備する。この定形プログラムは一連の手順ＬＤ８を介し希釈剤貯槽を満たす（セル−ダイン（商標）３５００で用いた標準型から改変されない）。試料および試薬を注射器ポンプによりＷＯＣ混合チャンバーに移送し、一連の手順ＬＳ５（セル−ダイン（商標）３５００で用いた標準型から改変しない）は標準セル−ダイン（商標）３５００シース試薬でシース貯槽を満たす。廃棄チャンバーを空にし、試料を混合し、一連の手順ＱＷＣを呼出してＷＯＣ（光学計数）測定を開始させる。光学測定からのデータを集める前に、データバッファーをクリアーする。次いで定形プログラムはシアー弁を吸入位置まで回転させる。セル−ダイン（商標）３５００データステーションに光学測定からのデータを受入れるよう指示し、一連の手順ＱＰＬを呼び出してフローパネルを清浄する。次いでＱＣＮを終了させる。
ＱＳＯにより呼出される他の定形プログラムである一連の手順ＱＰＮは過剰の血液を開口試料吸入プローブおよび閉鎖試料吸入プローブ（網状赤血球分析には使用されないが、吸入されてＹ型取付管をはっきりさせる）から吸入すると共に、開口試料吸入ラインを清浄する。開口試料吸入プローブの外側を清浄すると共に、一連の手順ＱＣＬを呼出す。次いで一連の手順ＱＰＮを終了させる。
一連の手順ＱＷＣを一連の手順ＱＣＮにより呼出す。これは試料をＷＯＣ試料通路まで移送し、この通路を約９ｐｓｉまで加圧し、試料をＷＯＣフローセル中へ注入する。希釈剤試料流（上記のように処方）をＷＯＣフローセル中に流し始め、９ｐｓｉアキュミュレータ入口を閉鎖して、シース流がフローセルに通過するよう確保する。データ収集は、１０°および９０°の散乱シグナルを以下の実施例に記載するように収集して行う。０°の散乱を用いて、１０°および９０°のデータ収集を開始させる。光学データ収集が完了すれば、一連の手順ＱＷＣを終了させる。
一連の手順ＱＰＬを一連の手順ＱＣＮにより呼出す。この定形プログラムは水銀減圧アキュミュレータの第二１２インチを再充填し、廃棄室Ｎｏ．２を空にし、ＷＣＯ試料注射器を満たし、次いでＷＣＯ試料通路を清浄する。シアー弁までの試薬ラインにおける圧力を解除し、試料混合ラインを清浄し、リストモードデータ収集を止め、その後に一連の手順ＱＰＬを終了させる。
以下、実施例により特定データ分析法につき説明する。
実施例１
全血試料における網状赤血球の定量
１． 約２０．０ｇのシュウ酸カリウム（一水塩）と約１．０ｇのニュー・メチレン・ブルーと約５．０ｍｇのｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド（これらは全てシグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ＭＯから入手しうる）とを約１．０Ｌの希釈剤試薬と混合することにより試薬溶液を作製した。希釈剤試薬の組成は次の通りであった：燐酸ナトリウム（二塩基性）２．４５ｇ；燐酸カリウム（一塩基性）０．４０ｇ；ＥＤＴＡ二ナトリウム（二水塩）０．２０ｇ；塩化ナトリウム、８．０５ｇ；塩化カリウム、０．４０ｇ；プロクリン３００ ０．３１５ｇ；および１Ｌまでの脱イオン水。希釈剤試薬のｐＨは約７．２〜約７．６の範囲であり、その浸透圧モル濃度は＞５５０ｍＯｓ／ｋｇであった。
２． ＥＤＴＡと混合して凝血を防止した約２０μＬの全血を次いで約４ｍＬの試薬溶液と混合し、室温にて約１５分間〜４時間にわたり保温した。
３． 試料を、一般にＷＢＣ分析につき用いられる標準セル−ダイン（商標）３５００試薬を用いＷＯＣチャンネルにてセル−ダイン（商標）３５００血液学分析器に吸入すると共に分析した。分析器のフロースクリプトを、血液およびシース試薬の通常の保温を排除すると共に一般に血液試料の吸入を検出するような赤外線センサを不能にするよう改変した。これら改変の両者は、第５図に示したフロースクリプトにより行われる。
４． ３０，０００イベントまでの少なくとも１０°散乱値および９０°散乱値よりなるデータを集め、装置に記憶させる。データを０〜２５５の範囲の８−ビット数として記憶させた。
５． ２５５の１０°散乱値または２５５の９０°散乱値のようなオフスケール数値を有するイベントのデータを分析から除去する。
６． 血小板凝血物に関連したイベントおよび合併イベントのデータを次のように除去する：
ａ． 残余の１０°散乱値の標準偏差を計算する。オフスケール値を除去した後の患者試料に関する１０°散乱値のヒストグラムの例を第１図に示す。
ｂ． 残余の１０°散乱値データのモードを、実施例２に記載した手順により決定する。
ｃ． １０°散乱値が計算モードよりも高い或いは低い約２の標準偏差より大である全てのイベントのデータを分析から除去する。
７． 網状赤血球を残余のデータから次のように定量する：
ａ． 残余の９０°散乱データのモードを実施例２に記載した手順により計算する。第１図におけると同じ試料の９０°散乱データのヒストグラム（血小板凝血および合併イベントの除去後）を第２図に示す。
ｂ． ９０°散乱モードの約２倍より大である９０°散乱値を有する全てのイベントが網状赤血球であると考えられる。
ｃ． 網状赤血球カウント数を、装置により測定された全イベント数の０．００２倍に等しい数値を引算して調整し（いわゆる装置の「原カウント数」）、調整網状赤血球カウント数を得る。
ｄ． 網状赤血球比率を、調整網状赤血球カウント数を残余の１０°散乱イベントの個数により割算して計算する（これらイベントは工程６の完了後における分析にて残留する）。
第１図および第２図に示した実施例において、網状赤血球比率は１３．２５％であった。現網状赤血球分析および対照過程の直線回帰分析および相関分析を第３図および第４図に示す。第３図は、この方法により決定された網状赤血球フラクション（標識「ＣＤ３５００」）と独立方法により決定された網状赤血球フラクション（標識「ＣＤ４０００」）との関係を３８名の患者からの血液試料につき示す。独立した方法については米国特許出願第０８／４２６，４０８号［１９９５年４月２１日出願の「網状赤血球を迅速分析するための組成物および方法」］に詳細に記載されている。これら２種の方法の間の相関計数は０．９３７であり、ここに説明した方法の精度を示す。最良の適合直線の傾斜は０．８５であり、０．９５のｙ切片を有する。第４図は、この方法により決定された網状赤血球フラクション（標識「ＣＤ３５００」）とＦＡＣＳｃａｎ（商標）装置／チアゾール・オレンジ試薬系（ベクトン・ジキンソン・アンド・カンパニー、サン・ヨセ、ＣＡを用いて決定された網状赤血球フラクション［標識「ファクスキャン」］との関係を同じ３８種の血液試料につき示す。これら２種の方法の間の相関は０．９５９であり、最良の適合直線につき０．９１の傾斜および０．１のｙ切片を有し、これはさらにこの分析法の正確度を示すと共に有用性をも示す。
実施例２
散乱データモードの計算
実施例１に記載した散乱値のモードの計算は次のように行うことができる：
１． ２５６ ｂｉｎヒストグラムを、所望するモードの散乱データの数値につき形成させる。
２． ヒストグラムを、二項式平滑化アルゴリズム：
Ｍｉ＝０．１Ｎi-2＋０．２Ｎi-1
＋０．４Ｎi＋０．２Ｎi+1＋０．１Ｎi+2
［式中、Ｎiはｂｉｎ ｉの初期含有量であり、
Ｍiはｂｉｎ ｉの平滑化含有量である］
を用いて４回平滑化させる。
３． ４回の平滑化ヒストグラムの最大値を２で割算して５０％値を得る。
４． 含有数が５０％値より低いまたは等しいピークよりも低い最高ｂｉｎである初期（非平滑化）ヒストグラムにおけるｂｉｎを低チャンネルと称する。このｂｉｎおよびこのｂｉｎより低い全てのｂｉｎにおけるデータ点の数を低チャンネル点と称する。
５． 含有数が５０％値より低いまたは等しいピークよりも高い最低ｂｉｎである初期（非平滑化）ヒストグラムにおけるｂｉｎを高チャンネルと称する。このｂｉｎおよびこのｂｉｎより低い全てのｂｉｎにおけるデータ点の数を高チャンネル点と称する。
６． 高チャンネルと低チャンネルとの間の点の数を２分する点を見出す：
ａ． 低チャンネル点を高チャンネル点から引算して差を得る。
ｂ． この差の半分（０．５）を低チャンネル点に加算して、中間点チャンネルおよびそれ以下のイベント数（中間点チャンネル値）を得る。
ｃ． そのチャンネルおよびそれ以下のデータ点の個数が中間点チャンネル値に等しい或いはそれより大である最低チャンネルを見出す。
７． 工程６で見出したチャンネルをモードと称し、実施例１に記載した他の分析に用いる。
実施例３
網状赤血球の定量
代案実施例：
１． 実施例１の工程１〜５を行って、３０，０００細胞イベントまでの１０°および９０°散乱値を含むデータを得る。
２． 工程１からのデータを約４〜６個の実質的に等しい大きさの群に分割する（それぞれ約５，０００〜７，５００イベント）。
３． 実施例１の工程６〜工程７ｂの分析手順を各群につき独立して行い、グループ網状赤血球カウント数の４〜６数値を得、これらを合計して網状赤血球カウント数を得る。
４． 装置により検出された全イベント数の０．００２倍を引算して網状赤血球カウント数を調整する（いわゆる装置「原カウント数」）。
５． 調整網状赤血球カウント数を実施例１に記載したオフスケールイベント、血小板凝血物および合併イベントの除去後に残留する各群におけるイベントの合計で割って網状赤血球フラクションを計算する。
Claims (10)
- （１）ａ． ２．３３〜２．５７ｇの燐酸ナトリウム（二塩基性）、
ｂ． ０．３８〜０．４２ｇの燐酸カリウム（一塩基性）、
ｃ． ０．１８〜０．２２ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム（二水塩）、
ｄ． ７．２５〜８．８６ｇの塩化ナトリウム、
ｅ． ０．３６〜０．４４ｇの塩化カリウムおよび
ｆ． ０．２８〜０．３５ｇの５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンと２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物をグリコール中に含む防腐剤、さらに
ｇ． １Ｌまでの脱イオン水
を含む希釈剤試薬（この希釈剤試薬は７．２〜７．６のｐＨを有すると共に５５０ｍＯｓ／ｋｇより大の浸透圧モル濃度を有する）；並びに
（２）ａ． アズールＢ、ニュー・メチレン・ブルー、ブリリアント・クレシル・ブルーおよびオキサジン７５０よりなる群から選択される０．７〜１．３ｇの核酸染料、
ｂ． ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＤＤＡＰＳ）およびＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＴＤＡＰＳ）よりなる群から選択される３〜７ｍｇの網状赤血球球状化剤および
ｃ． シュウ酸のアンモニウム塩、カリウム塩およびナトリウム塩よりなる群から選択される１７〜２３ｇの電解質［上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は前記希釈剤試薬の１Ｌ当たりである］を含む網状赤血球染色用試薬
を含むことを特徴とする網状赤血球を測定するための試薬系。 - 網状赤血球染色用試薬が１９．０〜２１．０ｇのシュウ酸カリウム（一水塩）と０．９５〜１．０５ｇのニュー・メチレン・ブルーと４．７５〜５．２５ｍｇのｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシドとを含む請求の範囲第１項に記載の試薬系。
- 網状赤血球染色用試薬が２０．０ｇのシュウ酸カリウム（一水塩）と１．０ｇのニュー・メチレン・ブルーと５．０ｍｇのｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシドとを含む請求の範囲第２項に記載の試薬系。
- 希釈剤試薬が２．３３〜２．５７ｇの燐酸ナトリウム（二塩基性）と０．３８〜０．４２ｇの燐酸カリウム（一塩基性）と０．１９〜０．２１ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム（二水塩）と７．６５〜８．４５ｇの塩化ナトリウムと０．３８〜０．４２ｇの塩化カリウムと０．３０〜０．３３ｇの５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物をグリコール中に含む防腐剤とを含む請求の範囲第１項に記載の試薬系。
- 希釈剤試薬が２．４５ｇの燐酸ナトリウム（二塩基性）と０．４０ｇの燐酸カリウム（一塩基性）と０．２０ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム（二水塩）と８．０５ｇの塩化ナトリウムと０．４０ｇの塩化カリウムと０．３１５ｇの５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物をグリコール中に含む防腐剤とを含む請求の範囲第４項に記載の試薬系。
- ａ． 血液試料の一部を網状赤血球試薬系と混合して試料／試薬の混合物を生成させ、網状赤血球試薬系は（１）アズールＢ、ニュー・メチレン・ブルー、ブリリアント・クレシル・ブルーおよびオキサジン７５０よりなる群から選択される０．７〜１．３ｇの核酸染料とｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＤＤＡＰＳ）およびＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＴＤＡＰＳ）よりなる群から選択される３〜７ｍｇの網状赤血球球状化剤とシュウ酸のアンモニウム塩、カリウム塩およびナトリウム塩よりなる群から選択される１７〜２３ｇの電解質と、さらに（２）１Ｌの希釈剤試薬（この希釈剤試薬は７．２〜７．６のｐＨを有すると共に５５０ｍＯｓ／ｋｇより大きな浸透圧モル濃度を有する）とを含み、希釈剤試薬は２．３３〜２．５７ｇの燐酸ナトリウム（二塩基性）と０．３８〜０．４２ｇの燐酸カリウム（一塩基性）と０．１９〜０．２１ｇのＥＤＴＡ二ナトリウム（二水塩）と７．６５〜８．４５ｇの塩化ナトリウムと０．３８〜０．４２ｇの塩化カリウムと０．３０〜０．３３ｇの５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンと２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンの混合物をグリコール中に含む防腐剤とを含み；
ｂ． 試料／試薬の混合物を１５分間〜４時間にわたり保温し；
ｃ． 混合物を一度に実質的に１個の細胞にて集中光学照明の領域に通過させ、この通過に際し混合物を流れとして流動させると共に、試料／試薬の流れを低張性シース試薬の流動する流れ内にさらに包被させ；
ｄ． 流れにおける細胞により散乱された光を検出すると共にそこからデータを発生させ；
ｅ． 発生した散乱光データを収集し；
ｆ． 流れ内の他の細胞から網状赤血球を少なくとも部分的に収集散乱光データに基づき鑑別する
ことを特徴とする全血試料における網状赤血球の鑑別および定量方法。 - 散乱光を０°、１０°および９０°の角度で検出する請求の範囲第６項に記載の方法。
- 網状赤血球の鑑別が少なくとも部分的に１０°および９０°の散乱光に基づく請求の範囲第６項に記載の方法。
- 血小板凝血物および合併イベントを収集した１０°散乱光データにより排除する請求の範囲第８項に記載の方法。
- ３．７〜４．３ｍＬの網状赤血球試薬系を１０〜４０μＬの凝固防止された全血と混合する請求の範囲第６項に記載の方法。
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