ES2206613T3 - Sistema de reactivo y procedimiento de diferenciacion y de identificacion de reticulocitos. - Google Patents
Sistema de reactivo y procedimiento de diferenciacion y de identificacion de reticulocitos.Info
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Abstract
LA TOTALIDAD DE LA SANGRE SE MEZCLA CON UN SISTEMA REACTIVO DE RETICULOCITOS QUE TIENE UN REACTIVO DE COLORACION DE LOS RETICULOCITOS Y UN REACTIVO DILUENTE, USADO EN COMBINACION. LA MEZCLA SE INCUBA A LA TEMPERATURA AMBIENTE, ENTRE APROXIMADAMENTE 15 MINUTOS Y APROXIMADAMENTE 4 HORAS. ENTONCES LA MEZCLA INCUBADA SE ANALIZA Y SE DETECTAN, SE RECOGEN, SE DIFERENCIAN Y SE CUANTIFICAN LAS PROPIEDADES DE DISPERSION DE LA LUZ DE LAS CELULAS. LA RECOPILACION DE LOS DATOS INCLUYE, AL MENOS, LA DETECCION DE LA DISPERSION DE LA LUZ DE 10 Y DE 90 GRADOS.
Description
Sistema de reactivo y procedimiento de
diferenciación y de identificación de reticulocitos.
La invención se refiere al análisis de partículas
en un analizador hematológico automatizado. En particular, esta
invención se refiere a un sistema de reactivos y a un método para la
detección e identificación de reticulocitos en una muestra de
sangre completa.
El reticulocito es un eritrocito inmaduro
("RBC", abreviadamente en inglés "red blood cell") que
todavía contiene material reticular (ARN ribosómico y mensajero)
incluso aunque en este estado de su desarrollo la célula haya
expulsado el núcleo. Normalmente, los eritrocitos entran en la
corriente sanguínea como reticulocitos. La eritropoyesis comienza
con el eritroblasto y continua a través de varias generaciones de
células nucleadas intermedias en la médula ósea, finalizando en el
reticulocito. En condiciones anémicas o hipóxicas el proceso puede
acortarse, entrando a la corriente sanguínea reticulocitos de un
estado más temprano que el normal. Estos reticulocitos tempranos se
reconocen por la cantidad extra de ARN que contienen, así como por
su mayor tamaño, menor contenido en hemoglobina y por el mayor
tiempo que persisten como reticulocitos en la corriente
sanguínea.
Por tanto, el recuento de reticulocitos, se
refiere a la producción de eritrocitos y es útil en el diagnóstico y
el tratamiento de la anemia. Históricamente, los recuentos de
reticulocitos han estado muy cercanamente asociados con la
etiología y clasificación de las anemias. El recuento de
reticulocitos se incrementa en las anemias hemolíticas, deficiencia
de piruvato quinasa, anemia drepanocítica, talasemias y disminuye
en la anemia megaloblástica, anemia aplásica y en la disfunción
general de la médula ósea. Recientemente, el recuento de
reticulocitos se ha usado para valorar los efectos tóxicos de los
agentes quimioterapéuticos en la médula. En pocas palabras, los
hematólogos fomentan unánimemente el recuento de reticulocitos como
índice de producción de RBC.
El método de recuento de reticulocitos más usado
de un modo común es el procedimiento microscópico manual. El azul
brillante de cresilo se ha usado predominantemente hasta que el azul
de metileno nuevo ("NMB", abreviadamente en inglés "New
Methylene Blue") fue introducido en 1949 por Brecher. La
publicación más reciente del Comité nacional para los patrones de
laboratorio clínico ("NCCLS", abreviadamente en inglés
"National Committee for Clinical Laboratory Standards")
(documento NCCLS H44-P) demanda el uso de un
colorante NMB en su método de referencia. Se mezcla un volumen igual
de sangre con el colorante NMB y se incuba durante al menos tres
minutos y hasta aproximadamente 15 minutos para permitir que el ARN
precipite. Se hace un frotis de sangre y se cuentan los
reticulocitos teñidos en el microscopio. Se inserta un disco ocular
Miller en el ocular (del microscopio). El área del cuadrado más
pequeño visto dentro del ocular es 1/9 del cuadrado mayor. Se
cuentan los eritrocitos en el cuadrado más pequeño, mientras que se
cuentan los reticulocitos en el cuadrado mayor. Se cuenta en 20
campos sucesivos y la proporción de reticulocitos se calcula
dividiendo el total de reticulocitos en los cuadrados mayores entre
el total de eritrocitos en los cuadrados más pequeños después de
multiplicar por 9 y, seguidamente, se multiplica el resultado por
100. El inconveniente del método manual es que es laborioso,
impreciso, requiere tiempo y es subjetivo.
Normalmente, los reactivos de diagnóstico in
vitro contienen conservantes. Uno de tales conservantes está
disponible bajo la marca Proclin^{TM}, que pertenece a Rohm and
Haas. De acuerdo con Chapman, "An effective biocide for in
vitro diagnostic reagents and other products", Am. Clin.
Lab., agosto 1994, esta marca identifica un producto que es
suministrado comercialmente por Supelco, Inc., Bellefonte, PA, y
contiene
2-metil-4-isotiazolin-3-ona
0,70% y
5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona
2,30% como ingredientes activos. De acuerdo con el folleto publicado
por Supelco en 1996, el Proclin^{TM} contiene dichos ingredientes
activos así como glicol modificado 93-95% y
carbonato de alquilo 2-3% como ingredientes
inertes. De acuerdo con el documento US 5.468.7975, el carbonato de
alquilo contenido en el Proclin^{TM} es trietilortoformato y el
glicol modificado contenido en el Proclin^{TM} es
dipropilenglicol.
Se han llevado a cabo muchos intentos para
corregir las deficiencias del método manual mediante la tecnología
de la citometría de flujo usando colorantes fluorescentes. En los
años 80 se usaron pironina Y ("PY", abreviadamente en inglés
"Pyronin Y") y naranja de acridina ("AO", abreviadamente
en inglés "Acridine Orange") para teñir y contar reticulocitos
en citómetros de flujo. Ahora, están disponibles varios métodos de
citometría de flujo semiautomatizados para contar reticulocitos a
partir de una muestra de sangre completa. En cada uno de los métodos
que existen, se usa un diluyente que contiene un colorante
catiónico, tal como auramina O ("AuO", abreviadamente en inglés
"Auramine O") o naranja de tiazol ("TO", abreviadamente en
inglés "Thiazole Orange"), para teñir el ARN del interior de
los reticulocitos. Durante el período de incubación, el colorante
penetra lentamente a través de la membrana de la célula y se une al
ARN del interior de cada reticulocito. La cantidad de señal generada
por los reticulocitos teñidos a medida que la muestra pasa a través
de la zona de detección es proporcional al contenido de ARN del
interior de cada reticulocito. Por tanto, un citómetro de flujo
equipado con la fuente de iluminación de excitación apropiada y el
sistema de detección de emisión puede usarse para determinar el
porcentaje de reticulocitos en una muestra de sangre completa.
Una característica distintiva de estas técnicas
de citometría de flujo es el uso de al menos un colorante
fluorescente. La fluorescencia se caracteriza por la emisión de luz
a una longitud de onda diferente de la luz de excitación. La luz en
una banda de longitud de onda particular se absorbe por la sustancia
fluorescente (el fluoróforo) y se emite luz de una banda más larga.
La cantidad de luz emitida es significativamente menor que el nivel
de la luz de excitación. Es necesario incorporar componentes ópticos
tales como filtros para permitir la detección y la medida de
solamente la señal fluorescente deseada. Por el contrario, un
sistema de detección que detecta y mide dispersiones no requiere
tales filtros, ya que la luz dispersada tiene la misma longitud de
onda que la luz incidente. Adicionalmente, los sistemas no
fluorescentes de detección pueden utilizar fuentes luminosas de
coste menor y menos potentes ya que tales fuentes de luz
fluorescente estimulante no son necesarias en los sistemas
electro-ópticos que se basan en la detección de las propiedades de
dispersión de la luz de las células.
Las patentes de Estados Unidos Nº 5.350.695 y
5.438.003 de Colella y col., y Nº 5.284.771 de Fan y col., describen
métodos y composiciones de reactivos que comprenden el tratamiento
de una muestra de sangre completa con una solución de reactivos
única que comprende un colorante catiónico tal como NMB u oxazina
750 para precipitar y teñir el ARN en los reticulocitos y un a ión
bipolar para hacer esféricas a las células. Miles Inc., un
cesionario de estas patentes, ha incorporado recientemente algunos
de los métodos anteriores en su último instrumento de hematología
H*3®. Este instrumento está equipado con una fuente luminosa de
helio / neón ("HeNe") y se usa colorante oxazina 750 para
teñir y precipitar el ARN del interior de los reticulocitos,
mientras que se usa un tensioactivo bipolar para hacer esféricos a
los RBC y los reticulocitos en preparación de las medidas
volumétricas. Se ha comprobado que la sensibilidad del método para
detectar los reticulocitos del grupo IV es pobre.
El documento EP 0 545 313 describe un método y
una composición de reactivos que comprende un tensioactivo bipolar
para hacer esféricas a las células eliminando el ruido de la
orientación, un colorante para teñir los reticulocitos y una
solución tamponada para mantener el pH entre aproximadamente 6 y
aproximadamente 9.
En el documento WO 94/27146, Coulter Corporation
toma un diferente abordaje. En ese documento se trata de un modo
manual una muestra teñida con NMB con un reactivo a base de ácido
sulfúrico para volver "fantasmas" a los RBC. Coulter llama a su
tecnología VCS (volumen, conductividad y dispersión; abreviadamente
en inglés "volume, conductivity and scatter") y ha incorporado
tal método de recuento de reticulocitos semiautomatizado en sus
analizadores hematológicos STKS® y MAXM^{TM}. En la valoración
Coulter VCS de reticulocitos, el espécimen de sangre se mezcla
fuera del aparato con el colorante NMB y se incuba a temperatura
ambiente durante 5 minutos. Seguidamente, se diluye un pequeño
volumen de la muestra de sangre completa teñida con una solución de
aclarado que contiene ácido sulfúrico. La solución de aclarado o
"formadora de fantasmas" provoca que la célula se hinche,
volviéndose esférica y la hemoglobina se escapa fuera de la célula.
Seguidamente, la muestra preparada, después de un período de tiempo
prescrito y muy crítico, se aspira dentro de un analizador
hematológico STKS® o MAXM^{TM} de Coulter para completar el
análisis. Los reticulocitos, RBC maduros, leucocitos y trombocitos
se discriminan en base a una combinación de medidas de dispersión de
luz e impedancia (volumen). Sin embargo, la medida del tiempo es
extremadamente crítica durante el estado de fantasma: un tiempo
demasiado largo provocará la lisis de los RBC; un tiempo demasiado
corto dará como resultado una pobre resolución de los reticulocitos
y los RBC maduros.
Por tanto, los procedimientos de tanto Miles,
Inc. como Coulter presentan problemas significativos y requieren un
esfuerzo por parte del operador del instrumento para asegurar
valoraciones exactas. Este es el caso, especialmente, con respecto
al tiempo de tinción y la "formación de fantasmas" en la
preparación teñida.
De acuerdo con esto, hay una necesidad de
procedimientos de recuento de reticulocitos que puedan adaptarse a
los analizadores hematológicos existentes sin cambios significativos
en el equipo informático o sin requerir la sustitución o el cambio
de los reactivos del aparato.
Se proporcionan reactivos y un método para la
diferenciación y la valoración de la concentración de reticulocitos
en una muestra de sangre.
En particular, se proporciona un sistema de
reactivos que comprende un reactivo de tinción de reticulocitos y un
reactivo diluyente para permitir las valoraciones automatizadas de
la luz dispersada de los reticulocitos.
Más particularmente, el sistema de reactivos de
esta invención se utiliza para teñir y proteger a los reticulocitos
en el ambiente hipotónico (lítico) de un analizador hematológico
electro-óptico automatizado.
De un modo general, el componente reactivo de
tinción de los reticulocitos del sistema de reactivos comprende un
agente no iónico o bipolar para hacer esféricos a los RBC, una
sobreabundancia de colorante que tiñe y precipita cualquier
sustancia de ácido nucleico del interior de los RBC y una alta
concentración de un electrólito.
Preferentemente, el reactivo de tinción de los
reticulocitos comprende de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 1,3
gramos de un colorante de ácidos nucleicos por litro de reactivo
diluyente, siendo seleccionado el colorante del grupo que consiste
en azur B, azul de metileno nuevo, azul brillante de cresilo y
oxazina 750; de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 miligramos de
un agente para hacer esféricos a los reticulocitos por litro de
reactivo diluyente, seleccionado del grupo que consiste en
n-dodecil \beta-D maltósido,
N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propansulfonato
(DDAPS) y
N-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propansulfonato
(TDAPS) y de aproximadamente 17 a aproximadamente 23 gramos por
litro de reactivo diluyente de un electrólito seleccionado del
grupo que consiste en sales amónicas, potásicas y sódicas del ácido
oxálico.
Más preferentemente, el reactivo de tinción de
los reticulocitos comprende de aproximadamente 19,0 a
aproximadamente 21,0 gramos de oxalato potásico monohidratado; de
aproximadamente 0,95 a aproximadamente 1,05 gramos de azul de
metileno nuevo; de aproximadamente 4,75 a aproximadamente 5,25 mg de
n-dodecil \beta-D maltósido y
aproximadamente 1,0 litro del reactivo diluyente.
El componente reactivo diluyente del sistema de
reactivos, usado separadamente o en combinación con la formulación
del reactivo de tinción de reticulocitos, comprende de
aproximadamente 2,33 a aproximadamente 2,57 gramos de fosfato sódico
dibásico; de aproximadamente 0,38 a aproximadamente 0,42 gramos de
fosfato potásico monobásico; de aproximadamente 0,18 a
aproximadamente 0,22 gramos de EDTA disódico dihidratado; de
aproximadamente 7,25 a aproximadamente 8,86 gramos de cloruro
sódico; de aproximadamente 0,36 a aproximadamente 0,44 gramos de
cloruro potásico; de aproximadamente 0,28 a aproximadamente 0,35
gramos de Proclin^{TM} 300 y agua desionizada hasta 1 litro.
Más preferentemente, el reactivo diluyente
comprende de aproximadamente 2,33 a aproximadamente 2,57 gramos de
fosfato sódico dibásico; de aproximadamente 0,38 a aproximadamente
0,42 gramos de fosfato potásico monobásico; de aproximadamente 0,19
a aproximadamente 0,21 gramos de EDTA disódico dihidratado; de
aproximadamente 7,65 a aproximadamente 8,45 gramos de cloruro
sódico; de aproximadamente 0,38 a aproximadamente 0,42 gramos de
cloruro potásico; de aproximadamente 0,30 a aproximadamente 0,33
gramos de Proclin^{TM} 300 y agua desionizada hasta 1 litro. El pH
del reactivo diluyente está en el intervalo de aproximadamente 7,2
a aproximadamente 7,6, con una osmolalidad mayor de 550 mOs/kg.
Otro aspecto de la invención proporciona un
método para diferenciar y cuantificar reticulocitos en una muestra
de sangre. El método comprende combinar de aproximadamente 3,7 a
aproximadamente 4,3 ml de la solución de tinción de reticulocitos
anterior con aproximadamente 10 \mul a aproximadamente 40 \mul
de sangre completa anticoagulada. La mezcla resultante se incuba de
aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 4 horas. Seguidamente,
la mezcla se pasa, sustancialmente una célula cada vez, a través de
una celdilla de flujo iluminada y se recogen los datos de al menos
la luz dispersada a 10º y 90º a partir de la corriente de flujo
iluminada. Seguidamente, los datos recogidos se analizan y los
reticulocitos se diferencian de los mismos.
La figura 1 es un histograma de ejemplo de
valores de dispersión a 10 grados de una muestra de un paciente
después de eliminar los valores fuera de escala como se describe el
ejemplo 1.
La figura 2 es una ilustración de un histograma
de datos de dispersión a 90 grados de la misma muestra como en la
figura 1, después de eliminar los sucesos de los grumos del paciente
y los coincidentes tal como se describe en el ejemplo 2.
La figura 3 muestra la correlación de los
resultados del análisis de reticulocitos en curso con otro método de
referencia.
La figura 4 muestra la correlación de los
resultados del análisis de reticulocitos en curso con otro método de
referencia.
La figura 5 es un diagrama de flujo de los
guiones de flujo del programa para la modificación de un analizador
hematológico comercial.
De un modo general, las realizaciones de la
invención comprenden reactivos y métodos para cuantificar la
concentración de los reticulocitos en una muestra de sangre. Más
particularmente, el método y los reactivos se combinan para teñir y
detectar los reticulocitos en una muestra de sangre. Seguidamente,
la muestra teñida puede analizarse en un analizador hematológico
automatizado. Los datos de dispersión de la luz se recogen siendo
cuantificado el contenido en reticulocitos de la muestra.
En general, el método comprende incubar una
muestra de sangre con uno o más reactivos. Seguidamente, la muestra
teñida se analiza en un analizador hematológico electro-óptico
automatizado tal como el instrumento de hematología
Cell-Dyn® 3500 suministrado por Abbott Laboratories'
Diagnostics Division, Santa Clara, CA. Este tipo de instrumentos
analiza una muestra de sangre anticoagulada, llevando a cabo una o
más medidas ópticas y eléctricas y proporcionando información
hematológica cuantitativa concerniente a la muestra de sangre.
En una realización preferida, se modifica un
instrumento de hematología Cell-Dyn® 3500 para
facilitar la cuantificación de los reticulocitos. Las modificaciones
se efectúan en el programa que controla la operación del
instrumento. Los ejemplos de tales modificaciones del programa se
ilustran en los guiones de flujo de la figura 5. De un modo
general, el procedimiento de análisis modificado es similar al
análisis óptico de leucocitos (WOC, abreviadamente en inglés
"white blood cell") realizado en el instrumento sin modificar,
utilizando los datos de dispersión de la luz de al menos 0º, 10º y
90º. Las modificaciones principales comprenden la eliminación de la
incubación de la muestra de sangre que normalmente sucede con el
reactivo hipotónico de recubrimiento en el interior del instrumento;
la inhabilitación del sensor óptico de la sangre y la
implementación de un nuevo programa de adquisición de datos y
análisis.
En una realización, se proporciona un sistema de
reactivos. Un componente de este sistema es un reactivo de tinción
de reticulocitos que comprende de aproximadamente 0,7 a
aproximadamente 1,3 gramos de un colorante de ácidos nucleicos
seleccionado del grupo que consiste en azur B, azul de metileno
nuevo ("NMB"), azul brillante de cresilo y oxazina 750, de
aproximadamente 3 a aproximadamente 7 miligramos de un agente para
hacer esféricos a los reticulocitos seleccionado del grupo que
consiste en n-dodecil \beta-D
maltósido,
N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propansulfonato
(DDAPS) y
N-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propansulfonato
(TDAPS) y de aproximadamente 17 a aproximadamente 23 gramos de un
electrólito seleccionado del grupo que consiste en sales amónicas,
potásicas y sódicas del ácido oxálico. Este reactivo de tinción se
combina antes o durante el uso con un reactivo diluyente. Las
concentraciones enumeradas anteriormente y a partir de ahora están
en base a la concentración por litro de reactivo diluyente.
El componente reactivo diluyente del sistema de
reactivos, usado en combinación con el reactivo de tinción de
reticulocitos, comprende de aproximadamente 2,33 a aproximadamente
2,57 gramos de fosfato sódico dibásico; de aproximadamente 0,38 a
aproximadamente 0,42 gramos de fosfato potásico monobásico; de
aproximadamente 0,18 a aproximadamente 0,22 gramos de EDTA disódico
dihidratado; de aproximadamente 7,25 a aproximadamente 8,86 gramos
de cloruro sódico; de aproximadamente 0,36 a aproximadamente 0,44
gramos de cloruro potásico; de aproximadamente 0,28 a
aproximadamente 0,35 gramos de Proclin^{TM} 300 y agua desionizada
hasta 1 litro.
El presente método comprende, en una realización,
añadir aproximadamente 20 \mul de sangre completa, mezclada con
EDTA para prevenir la coagulación, a aproximadamente 4 ml del
sistema de reactivos de tinción de reticulocitos descrito
anteriormente e incubar esta mezcla a temperatura ambiente de
aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 4 horas. Seguidamente,
la mezcla incubada se expone a un instrumento analítico en el que se
detectan, recogen, diferencian y cuantifican las propiedades de
dispersión de la luz de las células. La recolección de datos
incluye las medidas de dispersión de la luz de al menos 10 y 90
grados. Las señales de dispersión a 0 grados también pueden
utilizarse, especialmente para usar como umbral de las señales de
dispersión a 10 y 90 grados.
La siguiente descripción ilustrativa de una
realización del procedimiento de análisis se refiere a los
componentes, procedimientos y resultados de un
CELL-DYN® 3500 modificado mediante el programa de
guión de flujo puesto como ejemplo en la figura 5. Se prevé que tal
instrumento CELL-DYN® 3500 modificado se
suministrará comercialmente por Abbott Laboratories, cesionario en
interés de esta invención, en algún momento de 1996.
Una ventaja importante del sistema de reactivos y
el método de esta invención es la protección que los reactivos,
particularmente el componente diluyente, confieren a los
reticulocitos cuando se someten al ambiente hostil de un analizador
que utiliza un reactivo de recubrimiento lítico. Esta ventaja
significa que las modificaciones costosas en el equipo informático
del instrumento y en los reactivos del instrumento o los cambios de
reactivos no son necesarios.
Una vez modificado, la secuencia de instrucciones
del programa o guión de flujo ("RET"), ilustrado en la figura
5, se implementa mediante la selección de la opción "RETIC" a
partir del menú "SPECIMEN TYPE" presentado al operador del
CELL-DYN® 3500. Cuando se analizan reticulocitos, no
se ejecutan otros análisis ordinarios tales como la medida de RBC,
medidas de impedancia WBC o medidas de hemoglobina.
Cuando la placa de contacto se presiona, el guión
de flujo RET se inicia. El guión de flujo RET pasa por la secuencia
QSO (véase el apéndice), espera a la secuencia QSO para terminar y
entonces termina.
La secuencia QSO provoca que una muestra de
sangre (incubada con el reactivo como se describe anteriormente) sea
aspirada dentro de la sonda abierta durante aproximadamente 3,3
segundos. El sensor de la muestra de sangre del
CELL-DYN® 3500 no se utiliza en este guión de flujo
modificado debido a la dilución previa de la muestra durante su
procedimiento de pretratamiento. Seguidamente, la porción aspirada
de la muestra se transfiere a la válvula de cierre por medio de una
bomba peristáltica y el bloque de limpieza de la sonda abierta se
mueve para permitir la limpieza de la sonda abierta. Seguidamente,
esta secuencia de instrucciones comienza con las secuencias QPN y
QCN, las espera para terminar y entonces termina.
La secuencia QCN, una de las secuencias requerida
por QSO, prepara la cámara WOC de mezclamiento para recibir la
muestra desde la válvula de cierre. Esta secuencia de instrucciones
llena el depósito del diluyente a través de la secuencia LD8 (sin
modificar de la versión estándar usada con el
CELL-DYN® 3500). La muestra y el reactivo se
transfieren a la cámara WOC de mezclamiento por medio de un émbolo y
la secuencia LS5 (sin modificar de la versión estándar usada con el
CELL-DYN® 3500) llena el depósito de recubrimiento
con el reactivo de recubrimiento estándar CELL-DYN®
3500. Las cámaras de desecho se vacían, las muestras se mezclan y la
secuencia QWC se requiere para comenzar las medidas WOC (recuento
óptico). Las memorias de tránsito de los datos se borran antes de
que se recojan los datos de las medidas ópticas. Seguidamente, la
secuencia de instrucciones hacer rotar la válvula de cierre hacia la
posición de aspiración. La estación de datos del
CELL-DYN® 3500 recibe instrucciones para tomar los
datos de las medidas ópticas y la secuencia QPL es requerida para
limpiar el panel de flujo. Seguidamente, QCN termina.
La secuencia QPN, la otra secuencia de
instrucciones requerida por QSO, aspira el exceso de sangre de la
sonda abierta de aspiración de la muestra y de la sonda cerrada de
aspiración de la muestra (no usada en el análisis de reticulocitos,
pero aspirada para limpiar el accesorio Y) y limpia la línea
abierta de aspiración de la muestra. La parte de fuera de la sonda
abierta de aspiración de la muestra se limpia y la secuencia QCL es
requerida. Seguidamente, la secuencia QPN termina.
La secuencia QWC es requerida por la secuencia
QCN. Transfiere la muestra a la vía WOC de la muestra, presuriza
esta vía hasta aproximadamente 62,055 kPa e inyecta la muestra en la
celdilla de flujo WOC. Se inicia el flujo del reactivo diluyente
(como se formuló anteriormente) a través de la celdilla de flujo
WOC y se cierra un conducto de admisión acumulador de 62,055 kPa
para asegurar que el flujo de recubrimiento se dirige a través de la
celdilla de flujo. La recolección de los datos se llevó a cabo
recogiendo la señal de dispersión a 10 grados y 90 grados como se
describen los siguientes ejemplos. La dispersión a 0º se utiliza
para desencadenar la recolección de datos a 10º y 90º. Cuando la
recolección de los datos ópticos se completa, la secuencia QWC
termina.
La secuencia QPL es requerida por la secuencia
QCN. Esta secuencia de instrucciones recarga el acumulador de vacío
secundario de 30,48 cm de mercurio, vacía la cámara Nº 2 de desecho,
llena la jeringuilla de la muestra WOC y limpia la vía WOC de la
muestra. Se libera la presión de las líneas de reactivo a la válvula
de cierre, se limpian las líneas de mezclamiento de la muestra y el
modo lista de recolección de datos se apaga, después de lo cual la
secuencia QPL termina.
Se describen métodos específicos de análisis de
datos en los siguientes ejemplos.
1. Se preparó una solución de reactivos mezclando
aproximadamente 20,0 gramos de oxalato potásico monohidratado,
aproximadamente 1,0 gramo de azul de metileno nuevo y
aproximadamente 5,0 mg de n-dodecil
\beta-D-maltósido (todo
suministrado por Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) con
aproximadamente 1,0 litro de un reactivo diluyente. La composición
del reactivo diluyente fue: 2,45 gramos de fosfato sódico dibásico,
0,40 gramos de fosfato potásico monobásico, 0,20 gramos de EDTA
disódico dihidratado, 8,05 gramos de cloruro sódico, 0,40 gramos de
cloruro potásico, 0,315 gramos de Proclin^{TM} 300 y agua
desionizada hasta 1 litro. El pH del reactivo diluyente estaba en el
intervalo de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,6 y su
osmolalidad era > 550 mOs / kg.
2. Seguidamente, se mezclaron aproximadamente 20
\mul de sangre completa, mezclada con EDTA para prevenir la
coagulación, con aproximadamente 4 ml de la solución de reactivos y
se incubó a temperatura ambiente de aproximadamente 15 minutos a 4
horas.
3. Se aspiró la muestra y se analizó en un
analizador hematológico Cell-Dyn® 3500 en el canal
WOC utilizando los reactivos estándar Cell-Dyn® 3500
que se utilizan normalmente en el análisis WBC. Se modificó el guión
de flujo del analizador para eliminar la incubación habitual de la
sangre con el reactivo de recubrimiento y para hacer inoperativo el
sensor infrarrojo que, de un modo normal, detectaría la aspiración
de la muestra de sangre. Ambas modificaciones se realizan mediante
los guiones de flujo descritos en la figura 5.
4. Se adquirieron y se guardaron en el
instrumento los datos que consisten en los valores de al menos la
dispersión a 10 grados y la dispersión a 90 grados de hasta 30.000
sucesos. Los datos se guardan como números de 8 bits que varían de 0
a 255.
5. Los datos de los sucesos con valores fuera de
escala, como los valores de dispersión a 10 grados de 255 o los
valores de dispersión a 90 grados de 255, se eliminan del
análisis.
6. Los datos de los sucesos asociados con grumos
de trombocitos y los sucesos coincidentes se eliminan como
sigue:
- a.
- Se calcula la desviación típica de los datos de dispersión a 10 grados que quedan. Se representa en la figura 1 un histograma de ejemplo de los valores de dispersión a 10 grados de una muestra de un paciente tras la eliminación de los valores fuera de escala.
- b.
- Se determina la moda de los datos de dispersión a 10 grados que quedan usando el procedimiento descrito en el ejemplo 2.
- c.
- Los datos de todos los sucesos cuyos valores de dispersión a 10 grados son mayores de aproximadamente dos desviaciones típicas, mayores o menores que la moda calculada, se eliminan del análisis.
7. Se cuantifican los reticulocitos de los datos
que quedan como sigue:
- a.
- Se calcula la moda de los datos de dispersión a 90 grados que quedan usando el procedimiento descrito en el ejemplo 2. Se ilustra en la figura 2 un histograma de los datos de dispersión a 90 grados de la misma muestra que en la figura 1 (tras la eliminación de los sucesos de los grumos de trombocitos y los coincidentes).
- b.
- Todos los sucesos con valores de dispersión a 90 grados que son mayores de aproximadamente dos veces la moda de las dispersión a 90 grados se consideran reticulocitos.
\newpage
- c.
- Se ajusta el recuento de reticulocitos mediante la sustracción de un valor igual a 0,002 veces el número total de sucesos medidos por el instrumento (llamado "raw count" en el instrumento), proporcionándose el recuento ajustado de reticulocitos.
- d.
- El porcentaje de reticulocitos se calcula dividiendo el recuento ajustado de reticulocitos entre el número de sucesos de dispersión a 10 grados que quedan (los sucesos que quedan en el análisis tras la conclusión de la etapa 6).
En el ejemplo ilustrado en las figuras 1 y 2, el
porcentaje de reticulocitos fue 13,25%. Se muestran en las figuras 3
y 4 los análisis de regresión lineal y correlación del análisis de
reticulocitos en curso y los procedimientos de referencia. La figura
3 muestra la fracción de reticulocitos valorada mediante este
método (denominada "CD3500") frente a la fracción de
reticulocitos valorada mediante un método independiente (denominada
"CD4000") de muestras de sangre de 38 pacientes. El método
independiente se describe en detalle en el documento WO96/33396.
El coeficiente de correlación entre los dos
métodos es 0,937, lo que indica la exactitud el método descrito en
el presente documento. La pendiente de la línea recta mejor
ajustada es 0,85 con un corte en el eje y en 0,95. La figura 4
muestra la fracción de reticulocitos valorada mediante este método
(denominada "CD3500") frente a la fracción de reticulocitos
valorada usando el sistema del instrumento FACScan® con el reactivo
naranja de tiazol, suministrado por Becton Dickinson and Company,
San José, CA (denominado "Facscan") para las mismas 38 muestras
de sangre. La correlación entre estos dos métodos es 0,959, con una
pendiente de 0,91 y un corte en el eje y en 0,1 para la línea recta
mejor ajustada, lo que indica adicionalmente la exactitud y
demuestra la utilidad de este método de análisis.
El cálculo de la moda de los valores de
dispersión tal como se describe en el ejemplo 1, puede realizarse
como sigue:
1. Se crea un histograma de 256 intervalos de
clase para los valores de los datos de dispersión cuya moda se
desea.
2. El histograma se suaviza cuatro (4) veces
mediante la aplicación del algoritmo binomial de suavizado:
M_{i} =
0,1N_{i-2}+0,2N_{i-1}+0,4N_{i}+0,2N_{i+1}+0,1N_{i+2}
en el
que
N_{i} es el contenido inicial del intervalo de
clase i, y
M_{i} es el contenido suavizado del intervalo
de clase i.
3. El valor máximo del histograma suavizado
cuatro veces se divide entre dos (2) para proporcionar el valor
50%.
4. El intervalo de clase en el histograma
original (no suavizado) que es el intervalo de clase más alto por
debajo del pico cuyo contenido suma un total menor o igual que el
valor 50% se denomina canal bajo. El número de puntos de datos en
este intervalo de clase y en todos los intervalos de clase por
debajo de este intervalo de clase se denomina puntos del canal
bajo.
5. El intervalo de clase en el histograma
original (no suavizado) que es el intervalo de clase más bajo por
encima del pico cuyo contenido suma un total menor o igual que el
valor 50% se denomina canal alto. El número de puntos de datos en
este intervalo de clase y en todos los intervalos de clase por
debajo de este intervalo de clase se denomina puntos del canal
alto.
6. Se coloca el punto que divide por la mitad el
número de puntos entre el canal alto y el bajo:
- a.
- Se sustraen los puntos del canal bajo de los puntos del canal alto, resultando la diferencia.
- b.
- La mitad de la diferencia (0,5) se añade a los puntos del canal bajo, resultando el número de sucesos en el canal del punto medio y por debajo del canal del punto medio (el valor del canal del punto medio).
- c.
- Se localiza el canal más bajo para el que el número de puntos de datos en ese canal y por debajo de ese canal sea igual o mayor que el valor del canal del punto medio.
7. El canal localizado en la etapa 6 se denomina
moda y se usa en análisis adicionales como se describe el ejemplo
1.
En una realización alternativa:
1. Se realizan las etapas 1 a 5 del ejemplo 1,
produciéndose datos que incluyen los valores de dispersión a 10 y a
90 grados de hasta 30.000 sucesos celulares.
2. Los datos de la etapa uno se dividen en
aproximadamente 4 a 6 grupos de tamaño sustancialmente igual (de
aproximadamente 5000 a 7500 sucesos en cada uno).
3. Se realizan los procedimientos de análisis de
la etapa 6 a la etapa 7b del ejemplo 1 independientemente para cada
grupo, produciéndose de 4 a 6 valores de grupo de recuentos de
reticulocitos que se suman para proporcionar el recuento de
reticulocitos.
4. El recuento de reticulocitos se ajusta
mediante la sustracción de 0,002 veces el número total de sucesos
detectado por el instrumento (llamado "raw count" en el
instrumento).
5. Se calcula la fracción de reticulocitos
dividiendo el recuento ajustado de reticulocitos entre la suma de
los sucesos de cada grupo que quedan después de eliminar los sucesos
fuera de escala, los de los grumos de trombocitos y los sucesos
coincidentes como se describe en el ejemplo 1.
Claims (10)
1. Un sistema de reactivos para la valoración de
los reticulocitos que comprende:
(1) Un reactivo diluyente que comprende:
- a.
- de aproximadamente 2,33 a aproximadamente 2,57 gramos de fosfato sódico dibásico,
- b.
- de aproximadamente 0,38 a aproximadamente 0,42 gramos de fosfato potásico monobásico,
- c.
- de aproximadamente 0,18 a aproximadamente 0,22 gramos de EDTA disódico dihidratado,
- d.
- de aproximadamente 7,25 a aproximadamente 8,86 gramos de cloruro sódico,
- e.
- de aproximadamente 0,36 a aproximadamente 0,44 gramos de cloruro potásico,
- f.
- de aproximadamente 0,28 a aproximadamente 0,35 gramos de Proclin^{TM} 300 y
- g.
- agua desionizada hasta 1 litro,
teniendo el reactivo diluyente un pH de
aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,6, con una osmolalidad mayor
de 550 mOs /
kg
(2) Un reactivo de tinción de reticulocitos que
comprende:
- a.
- de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 1,3 gramos de un colorante de ácidos nucleicos seleccionado del grupo que consiste en azur B, azul de metileno nuevo, azul brillante de cresilo y oxazina 750, de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 miligramos de un agente para hacer esféricos a los reticulocitos seleccionado del grupo que consiste en n-dodecil \beta-D maltósido, N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propansulfonato (DDAPS) y N-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propansulfonato (TDAPS) y
- b.
- de aproximadamente 17 a aproximadamente 23 gramos de un electrólito seleccionado del grupo que consiste en sales amónicas, potásicas y sódicas del ácido oxálico, siendo (a), (b) y (c) por litro de dicho reactivo diluyente.
2. El sistema de reactivos de la reivindicación
1, en el que el reactivo de tinción de reticulocitos comprende de
aproximadamente 19,0 a aproximadamente 21,0 gramos de oxalato
potásico monohidratado; de aproximadamente 0,95 a aproximadamente
1,05 gramos de azul de metileno nuevo y de aproximadamente 4,75 a
aproximadamente 5,25 mg de n-dodecil
\beta-D maltósido.
3. El sistema de reactivos de la reivindicación
2, en el que el reactivo de tinción de reticulocitos comprende
aproximadamente 20,0 gramos de oxalato potásico monohidratado;
aproximadamente 1,0 gramo de azul de metileno nuevo y
aproximadamente 5,0 mg de n-dodecil
\beta-D maltósido.
4. El sistema de reactivos de la reivindicación
1, en el que el reactivo diluyente comprende de aproximadamente 2,33
a aproximadamente 2,57 gramos de fosfato sódico dibásico, de
aproximadamente 0,38 a aproximadamente 0,42 gramos de fosfato
potásico monobásico, de aproximadamente 0,19 a aproximadamente 0,21
gramos de EDTA disódico dihidratado, de aproximadamente 7,65 a
aproximadamente 8,45 gramos de cloruro sódico, de aproximadamente
0,38 a aproximadamente 0,42 gramos de cloruro potásico y de
aproximadamente 0,30 a aproximadamente 0,33 gramos de Proclin^{TM}
300.
5. El sistema de reactivos de la reivindicación
4, en el que el reactivo diluyente comprende aproximadamente 2,45
gramos de fosfato sódico dibásico, aproximadamente 0,40 gramos de
fosfato potásico monobásico, aproximadamente 0,20 gramos de EDTA
disódico dihidratado, aproximadamente 8,05 gramos de cloruro sódico,
aproximadamente 0,40 gramos de cloruro potásico y aproximadamente
0,315 gramos de Proclin^{TM} 300.
6. Un método para diferenciar reticulocitos en
una muestra de sangre completa que comprende:
- a.
- Mezclar una parte alícuota de dicha muestra de sangre con el sistema de reactivos de reticulocitos para formar una mezcla muestra / reactivos, en la que el sistema de reactivos de reticulocitos comprende
- (1)
- Un reactivo de tinción de reticulocitos que comprende de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 1,3 gramos de un colorante de ácidos nucleicos seleccionado del grupo que consiste en azur B, azul de metileno nuevo, azul brillante de cresilo y oxazina 750; de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 miligramos de un agente para hacer esféricos a los reticulocitos seleccionado del grupo que consiste en n-dodecil \beta-D maltósido, N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propansulfonato (DDAPS) y N-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propansulfonato (TDAPS) y de aproximadamente 17 a aproximadamente 23 gramos de un electrólito seleccionado del grupo que consiste en sales amónicas, potásicas y sódicas del ácido oxálico y
- (2)
- Aproximadamente 1 litro de un reactivo diluyente que tiene un pH de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,6, con una osmolalidad mayor de 550 mOs / kg, siendo el reactivo diluyente el de la reivindicación 4,
- b.
- Incubar la mezcla muestra / reactivos de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 4 horas;
- c.
- Hacer pasar las células de la mezcla muestra / reactivos sustancialmente una a una a través de un área de iluminación óptica enfocada, provocando que durante dicho paso la mezcla muestra / reactivos fluya en una corriente y la corriente quede enfundada adicionalmente dentro de una corriente de flujo de un reactivo hipotónico de recubrimiento;
- d.
- Detectar la luz dispersada por las células de la corriente y generar los datos de la misma;
- e.
- Recoger los datos generados de luz dispersada y
- f.
- Diferenciar los reticulocitos de otras células de la corriente, al menos en parte, en base a los datos recogidos de luz dispersada.
7. El método de la reivindicación 6, en el que la
luz dispersada se detecta en los ángulos de aproximadamente 0º, 10º
y 90º.
8. El método de la reivindicación 6, en el que la
diferenciación de los reticulocitos es, al menos en parte, en base a
la luz dispersada a 10º y 90º.
9. El método de la reivindicación 8, en el que
los sucesos de los grumos de trombocitos y los coincidentes se
eliminan por medio de la recolección de datos de luz dispersada a
10º.
10. El método de la reivindicación 6, en el que
se mezclan de aproximadamente 3,7 a aproximadamente 4,3 ml del
sistema de reactivos de reticulocitos con aproximadamente 10 \mul
a aproximadamente 40 \mul de sangre completa anticoagulada.
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