JP2003344393A - 脳脊髄液などの体液試料をアッセイするための自動法およびそのための試薬 - Google Patents
脳脊髄液などの体液試料をアッセイするための自動法およびそのための試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 全血以外の体液試料中の細胞を固定し、２４
時間を超える保存後であっても正確な分析を安定して行
えるようにする。 【解決手段】 一定量の体液中の細胞を固定しかつ球状
化する。細胞は、懸濁し続け、２４時間より長い間その
容積および内容物を維持する。一定量の体液を、少なく
とも１種類のアルデヒド、少なくとも１種類の界面活性
剤およびシクロデキストリンを含む一定量の水性試薬組
成物と混合する。
時間を超える保存後であっても正確な分析を安定して行
えるようにする。 【解決手段】 一定量の体液中の細胞を固定しかつ球状
化する。細胞は、懸濁し続け、２４時間より長い間その
容積および内容物を維持する。一定量の体液を、少なく
とも１種類のアルデヒド、少なくとも１種類の界面活性
剤およびシクロデキストリンを含む一定量の水性試薬組
成物と混合する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、体液試料、特に脳
脊髄液（ＣＳＦ）を、試料中に見いだされる可能性のあ
る細胞成分の検出および定量のためにアッセイするため
の半自動法および全自動法ならびに試薬組成物に関す
る。本発明は、臨床応用に関連し、効率的で正確かつ信
頼のおけるアッセイを提供する。
脊髄液（ＣＳＦ）を、試料中に見いだされる可能性のあ
る細胞成分の検出および定量のためにアッセイするため
の半自動法および全自動法ならびに試薬組成物に関す
る。本発明は、臨床応用に関連し、効率的で正確かつ信
頼のおけるアッセイを提供する。
【０００２】
【従来の技術】脳脊髄液（ＣＳＦ）は、脳の２つの髄膜
間に存在し、脳半球および脊髄全体を循環する。ＣＳＦ
は、その下にある中枢神経組織の保護クッションとして
働き、その他の機能には、廃棄物の収集、栄養分の循
環、および中枢神経系の潤滑が含まれる。
間に存在し、脳半球および脊髄全体を循環する。ＣＳＦ
は、その下にある中枢神経組織の保護クッションとして
働き、その他の機能には、廃棄物の収集、栄養分の循
環、および中枢神経系の潤滑が含まれる。
【０００３】ＣＳＦ分析の主な臨床的役割は、細菌性髄
膜炎の診断、ウイルス性髄膜炎および真菌性髄膜炎、脳
炎、神経疾患の鑑別診断、ならびにＣＳＦが関与する白
血病の診断にある。ＣＳＦ分析の他の適応には、白血病
およびリンパ腫の治療を受けている患者のモニタリング
が含まれる。通常、ＣＳＦ試料の検査には化学的および
免疫学的試験、より具体的には微生物学的検査および赤
血球数（ＲＢＣ）、白血球数（ＷＢＣ）およびＷＢＣ分
画値を得るための血液分析が含まれる。これらの結果
は、臨床所見および放射線学的検査と相関し、臨床診断
を提供する。
膜炎の診断、ウイルス性髄膜炎および真菌性髄膜炎、脳
炎、神経疾患の鑑別診断、ならびにＣＳＦが関与する白
血病の診断にある。ＣＳＦ分析の他の適応には、白血病
およびリンパ腫の治療を受けている患者のモニタリング
が含まれる。通常、ＣＳＦ試料の検査には化学的および
免疫学的試験、より具体的には微生物学的検査および赤
血球数（ＲＢＣ）、白血球数（ＷＢＣ）およびＷＢＣ分
画値を得るための血液分析が含まれる。これらの結果
は、臨床所見および放射線学的検査と相関し、臨床診断
を提供する。
【０００４】現在、ＣＳＦ検体の血液分析は、大部分の
病院検査室で手動細胞計数および細胞鑑別法を用いて行
われている。今日、これらの分析は、臨床検査のうちで
最も大変な手作業の１つである。たとえば、現在の手動
法を用いるＣＳＦ１検体の分析には約３０〜４５分を要
する。現在、既存の血液学システムで利用できるＣＳＦ
分析の自動法は存在しない。
病院検査室で手動細胞計数および細胞鑑別法を用いて行
われている。今日、これらの分析は、臨床検査のうちで
最も大変な手作業の１つである。たとえば、現在の手動
法を用いるＣＳＦ１検体の分析には約３０〜４５分を要
する。現在、既存の血液学システムで利用できるＣＳＦ
分析の自動法は存在しない。
【０００５】通常、ＡＤＶＩＡ １２０（登録商標）分
析装置（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔａｒ
ｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）などの自動細胞計数装置または血
液分析装置は、全血の試料から細胞を数えるように設計
されている。このような機器で用いられる標準試薬は、
血漿の主成分の一部、たとえばアルブミン、リポタンパ
ク質などのさまざまな化学効果を補正する、またはそれ
らを利用するように設計されている（たとえば、特許文
献１および特許文献２を参照）。また、自動分析装置／
細胞計数装置は通常、１回の分析サイクル当たり単一血
液希釈液中の約２，０００から５０，０００個までの細
胞を計数する。さらに、計数可能な細胞が占める領域と
重なり合うわずか５から１０個の非細胞性粒子（または
前のサイクルから持ち越された５から１０個の細胞、す
なわちキャリーオーバー）の存在は、全血試料分析にお
ける確度および／または精度の極めてわずかな損失をも
たらすにすぎない。さらに、ＡＤＶＩＡ １２０などの
機器は通常、自動的に希釈された一定量の全血を受け入
れ、決まった計数時間に必要な細胞濃度を提供するよう
に設計されている。
析装置（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔａｒ
ｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）などの自動細胞計数装置または血
液分析装置は、全血の試料から細胞を数えるように設計
されている。このような機器で用いられる標準試薬は、
血漿の主成分の一部、たとえばアルブミン、リポタンパ
ク質などのさまざまな化学効果を補正する、またはそれ
らを利用するように設計されている（たとえば、特許文
献１および特許文献２を参照）。また、自動分析装置／
細胞計数装置は通常、１回の分析サイクル当たり単一血
液希釈液中の約２，０００から５０，０００個までの細
胞を計数する。さらに、計数可能な細胞が占める領域と
重なり合うわずか５から１０個の非細胞性粒子（または
前のサイクルから持ち越された５から１０個の細胞、す
なわちキャリーオーバー）の存在は、全血試料分析にお
ける確度および／または精度の極めてわずかな損失をも
たらすにすぎない。さらに、ＡＤＶＩＡ １２０などの
機器は通常、自動的に希釈された一定量の全血を受け入
れ、決まった計数時間に必要な細胞濃度を提供するよう
に設計されている。
【０００６】全血以外の体液、たとえば脳脊髄液は通
常、赤血球および血小板を含まず、溶存タンパク質をほ
とんど含まないかまったく含まず、白血球も全血の典型
的な数のわずか０．０１％を含むにすぎない。したがっ
て、全血細胞分析を取り扱う同じ自動機器を用い、この
ような他の血液以外の体液について細胞数を測定する場
合には、そのような試料の通常はほぼ無細胞の条件を補
償するように試薬および希釈液が設計されている必要が
ある。さらに、全血細胞分析とは異なり、機器の分析サ
イクルが５から１０個の真の細胞を含むにすぎない容積
の体液試料を取り扱う場合には、前記の非細胞性粒子お
よびキャリーオーバーの妨害が、血液以外の細胞をほと
んど含まないこのような体液の分析では問題となる。
常、赤血球および血小板を含まず、溶存タンパク質をほ
とんど含まないかまったく含まず、白血球も全血の典型
的な数のわずか０．０１％を含むにすぎない。したがっ
て、全血細胞分析を取り扱う同じ自動機器を用い、この
ような他の血液以外の体液について細胞数を測定する場
合には、そのような試料の通常はほぼ無細胞の条件を補
償するように試薬および希釈液が設計されている必要が
ある。さらに、全血細胞分析とは異なり、機器の分析サ
イクルが５から１０個の真の細胞を含むにすぎない容積
の体液試料を取り扱う場合には、前記の非細胞性粒子お
よびキャリーオーバーの妨害が、血液以外の細胞をほと
んど含まないこのような体液の分析では問題となる。
【０００７】ＣＳＦなどの血液以外の体液の試料では細
胞の濃度が低いため、同じ決まった計数時間に有用な精
度を得るには、試料の希釈を大きく減らさねばならな
い。さらに、ＣＳＦなどのまれな試料は、全血試料に比
べて特殊な範疇にあると考えられる。たとえば、体液試
料、たとえばＣＳＦは通常、たまに乃至は不定期的に検
査室に到着する。血液以外のたまに乃至は不定期的に到
着する試料の分析にあわせて全血試料に対する自動分析
装置の作業の流れを中断することは通常不都合である。
これらのタイプの試料がくると、普通は「ＳＴＡＴ」試
料としてすぐに分析されるが、一旦ためておいて後で分
析したり、より効率のよい一括処理にまわされたりする
こともある。しかしながら、このような未処理の体液試
料は通常、２〜６℃における２４時間の保存後であって
も多くの場合正確に分析することができる典型的な抗凝
血全血試料ほど安定ではない。
胞の濃度が低いため、同じ決まった計数時間に有用な精
度を得るには、試料の希釈を大きく減らさねばならな
い。さらに、ＣＳＦなどのまれな試料は、全血試料に比
べて特殊な範疇にあると考えられる。たとえば、体液試
料、たとえばＣＳＦは通常、たまに乃至は不定期的に検
査室に到着する。血液以外のたまに乃至は不定期的に到
着する試料の分析にあわせて全血試料に対する自動分析
装置の作業の流れを中断することは通常不都合である。
これらのタイプの試料がくると、普通は「ＳＴＡＴ」試
料としてすぐに分析されるが、一旦ためておいて後で分
析したり、より効率のよい一括処理にまわされたりする
こともある。しかしながら、このような未処理の体液試
料は通常、２〜６℃における２４時間の保存後であって
も多くの場合正確に分析することができる典型的な抗凝
血全血試料ほど安定ではない。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第３７４１８７５号明細書
【特許文献２】米国特許第４４１２００４号明細書
【特許文献３】米国特許第４５７５４９０号明細書
【特許文献４】米国特許第５０４５４７２号明細書
【特許文献５】米国特許第５３５０６９５号明細書
【特許文献６】米国特許第５３６０７３９号明細書
【特許文献７】米国特許第５４１１８９７号明細書
【特許文献８】米国特許第５４３８００３号明細書
【特許文献９】米国特許第５６３３１６７号明細書
【特許文献１０】米国特許第４７３５５０４号明細書
【特許文献１１】米国特許第６０２５２０１号明細書
【特許文献１２】米国特許第３７４１８７５号明細書
【特許文献１３】米国特許第４４７５４９０号明細書
【特許文献１４】米国特許第５８１７５１９号明細書
【特許文献１５】米国特許第５８８８７５２号明細書
【非特許文献１】Tycko, D.H. et al., 1983, “Cell b
y cell determination of andhemoglobin of isovolume
trically-sphered human red blood cells: A precisio
n cytophotometric surrogate for red cell morpholog
y”, Proc. Clinical Application of Flow, Sea Islan
d, Georgia
y cell determination of andhemoglobin of isovolume
trically-sphered human red blood cells: A precisio
n cytophotometric surrogate for red cell morpholog
y”, Proc. Clinical Application of Flow, Sea Islan
d, Georgia
【非特許文献２】Tycko, D.H. et al., 1985, “Flow-c
ytometric light scattering measurements of red blo
od cell volume and hemoglobin concentration”, App
l. Optics, 24, 1355-1365
ytometric light scattering measurements of red blo
od cell volume and hemoglobin concentration”, App
l. Optics, 24, 1355-1365
【非特許文献３】S. Takano et al., 1977, J. Amer, O
il Chem. Soc., 54:139-143
il Chem. Soc., 54:139-143
【非特許文献４】S. Takano et al., 1977, J. Amer. O
il Chem. Soc., 54:484-486
il Chem. Soc., 54:484-486
【非特許文献５】Z. El Rossi, C. Horvath, 1982, Chr
omatographia, 15:75-82
omatographia, 15:75-82
【非特許文献６】Kaminski and Linfield, 1979, J. Am
er. Oil Chem. Soc., 56:771-773
er. Oil Chem. Soc., 56:771-773
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】したがって、全血以外
のこのような体液試料を、２４時間以上の保存後であっ
てもその後の正確な分析を安全に行える状態に細胞を固
定する試薬と混合できることが望ましい。さらに、血液
以外の体液試料が関わるこのような特殊な手順の場合、
少なくとも数カ月間安定であり、必要な場合には、体液
試料を用いて得られる細胞数の確度が保証されるように
システム・ゲインを確認するために用いることができる
対照材料を開発することが通常必要である。本発明は、
これらの問題および要求を克服しかつ対処するために設
計されている。
のこのような体液試料を、２４時間以上の保存後であっ
てもその後の正確な分析を安全に行える状態に細胞を固
定する試薬と混合できることが望ましい。さらに、血液
以外の体液試料が関わるこのような特殊な手順の場合、
少なくとも数カ月間安定であり、必要な場合には、体液
試料を用いて得られる細胞数の確度が保証されるように
システム・ゲインを確認するために用いることができる
対照材料を開発することが通常必要である。本発明は、
これらの問題および要求を克服しかつ対処するために設
計されている。
【００１０】さらに、本発明は、ＣＳＦなどの体液試料
を分析するための自動法および手順、すなわち半自動法
および全自動法および手順を提供し、有利には、血液以
外の試料を分析するための効率的で、信頼のおける時間
のかからないアッセイを熟練開業医に提供する。
を分析するための自動法および手順、すなわち半自動法
および全自動法および手順を提供し、有利には、血液以
外の試料を分析するための効率的で、信頼のおける時間
のかからないアッセイを熟練開業医に提供する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、体液試料、特
に脳脊髄液（ＣＳＦ）試料を分析するため新たに開発さ
れたアッセイ（方法）であって、自動細胞計数装置また
は分析装置のダイレクト・サイトメトリーの特徴を利用
し、体液試料、たとえばＣＳＦ試料中で検出される赤血
球および白血球の値およびパラメータを与えて報告する
アッセイを提供する。この方法は半自動または全自動で
あり、ＡＤＶＩＡ １２０（登録商標）血液分析装置
（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔａｒｒｙｔ
ｏｗｎ、ＮＹ）などの自動血液分析装置またはフロー・
サイトメーターで行われることが好ましい。この方法
は、試料中のすべての細胞を懸濁状態で球状化（ｓｐｈ
ｅｒｅ）しかつ固定する試薬を併用して行われる。さら
に、ゲーティング・ソフトウェアを併用して、分析を受
けるＣＳＦ試料中の赤血球数（ＲＢＣ）、白血球数（Ｗ
ＢＣ）およびＷＢＣ分画値の分析および報告を行う。
に脳脊髄液（ＣＳＦ）試料を分析するため新たに開発さ
れたアッセイ（方法）であって、自動細胞計数装置また
は分析装置のダイレクト・サイトメトリーの特徴を利用
し、体液試料、たとえばＣＳＦ試料中で検出される赤血
球および白血球の値およびパラメータを与えて報告する
アッセイを提供する。この方法は半自動または全自動で
あり、ＡＤＶＩＡ １２０（登録商標）血液分析装置
（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔａｒｒｙｔ
ｏｗｎ、ＮＹ）などの自動血液分析装置またはフロー・
サイトメーターで行われることが好ましい。この方法
は、試料中のすべての細胞を懸濁状態で球状化（ｓｐｈ
ｅｒｅ）しかつ固定する試薬を併用して行われる。さら
に、ゲーティング・ソフトウェアを併用して、分析を受
けるＣＳＦ試料中の赤血球数（ＲＢＣ）、白血球数（Ｗ
ＢＣ）およびＷＢＣ分画値の分析および報告を行う。
【００１２】本発明の一態様は、迅速かつ信頼のおける
アッセイにおいてＣＳＦの血液細胞成分を検出するため
の半自動法または全自動法を提供することである。通
常、このような血液細胞成分はＣＳＦ中では極めて低濃
度であり、このことが従来の方法を用いて信頼できるよ
うに検出することを困難にしている。本発明によれば、
自動血液分析装置におけるＣＳＦの分析により、白血
球、赤血球、およびＷＢＣ分画値を測定しかつ定量する
ことができる。
アッセイにおいてＣＳＦの血液細胞成分を検出するため
の半自動法または全自動法を提供することである。通
常、このような血液細胞成分はＣＳＦ中では極めて低濃
度であり、このことが従来の方法を用いて信頼できるよ
うに検出することを困難にしている。本発明によれば、
自動血液分析装置におけるＣＳＦの分析により、白血
球、赤血球、およびＷＢＣ分画値を測定しかつ定量する
ことができる。
【００１３】本発明の別の態様は、自動分析装置で分析
する血液以外の体液試料と混合するための水性試薬（試
薬組成物）を提供することである。本発明によれば、体
液試料には、たとえば本明細書に記載したＣＳＦ、肺ま
たは気管支の洗浄液、滑液、腹水などが含まれる。試薬
組成物の配合は、本発明による半自動分析方法で使用す
るのに特に適している。
する血液以外の体液試料と混合するための水性試薬（試
薬組成物）を提供することである。本発明によれば、体
液試料には、たとえば本明細書に記載したＣＳＦ、肺ま
たは気管支の洗浄液、滑液、腹水などが含まれる。試薬
組成物の配合は、本発明による半自動分析方法で使用す
るのに特に適している。
【００１４】本発明の別の態様は、細胞が懸濁し続け、
長時間その容積および内容物を維持するように、体液試
料、またはその一定分取量中の細胞を固定しかつ球状化
する方法を提供する。この方法によれば、一定量の体液
を、混合物として少なくとも１種類のアルデヒド、少な
くとも１種類の界面活性剤およびシクロデキストリンを
含む溶液からなる一定量の水性試薬組成物と混合する。
本発明による好ましい試薬組成物では、アルデヒドはグ
ルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、またはグルタル
アルデヒドおよびホルムアルデヒドの組合せであり、界
面活性剤は両性イオン性洗浄剤であり、シクロデキスト
リンはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンで
ある。
長時間その容積および内容物を維持するように、体液試
料、またはその一定分取量中の細胞を固定しかつ球状化
する方法を提供する。この方法によれば、一定量の体液
を、混合物として少なくとも１種類のアルデヒド、少な
くとも１種類の界面活性剤およびシクロデキストリンを
含む溶液からなる一定量の水性試薬組成物と混合する。
本発明による好ましい試薬組成物では、アルデヒドはグ
ルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、またはグルタル
アルデヒドおよびホルムアルデヒドの組合せであり、界
面活性剤は両性イオン性洗浄剤であり、シクロデキスト
リンはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンで
ある。
【００１５】本発明の他の態様は、体液中の細胞をフロ
ー・サイトメトリーで分析するための対照材料であっ
て、分析される体液の細胞および本発明による上記水性
試薬組成物の混合物を含む対照材料を提供することであ
る。
ー・サイトメトリーで分析するための対照材料であっ
て、分析される体液の細胞および本発明による上記水性
試薬組成物の混合物を含む対照材料を提供することであ
る。
【００１６】本発明のさらに別の態様は、体液中の細胞
をフロー・サイトメトリーで分析するための対照材料で
あって、本明細書に記載の混合物中で固定しかつ球状化
された後の細胞を含み、その細胞が異なる安定化水溶液
中に再懸濁されている対照材料を提供することである。
をフロー・サイトメトリーで分析するための対照材料で
あって、本明細書に記載の混合物中で固定しかつ球状化
された後の細胞を含み、その細胞が異なる安定化水溶液
中に再懸濁されている対照材料を提供することである。
【００１７】本発明の別の態様は、本明細書に記載する
動作モードとそれに伴う実行サイクルを備えた自動ダイ
レクト・サイトメトリー分析装置であって、本発明にし
たがって全血以外の体液試料、たとえばＣＳＦの分析方
法を実施するものを提供することである。
動作モードとそれに伴う実行サイクルを備えた自動ダイ
レクト・サイトメトリー分析装置であって、本発明にし
たがって全血以外の体液試料、たとえばＣＳＦの分析方
法を実施するものを提供することである。
【００１８】本発明の他の態様、特徴および利点は、以
下の本発明の詳細な説明を読み、添付の図面に照らして
考えれば、さらによく理解されるであろう。
下の本発明の詳細な説明を読み、添付の図面に照らして
考えれば、さらによく理解されるであろう。
【００１９】
【添付図面の説明】図１Ａ〜１Ｄは、自動血液分析装置
（すなわち、Ｂａｙｅｒ ＡＤＶＩＡ １２０自動分析
装置）で検査した血小板に富む血漿（ＰＲＰ）のサイト
グラム（ｃｙｔｏｇｒａｍ）を示す図である。図１Ａお
よび１Ｂは、リン酸塩緩衝液で１：２０に希釈したＰＲ
Ｐ試料のダイレクト・サイトメトリー・サイトグラムを
示している。白血球、すなわちリンパ球（ＬＹＭＰＨ
ｓ）、単球（ＭＯＮＯｓ）、好中球（ＮＥＵＴｓ）、血
小板、および好酸球（ＥＯｓ）は、互いによく分離して
いる別個の集団を形成している。赤血球（ＲＢＣｓ）は
球状化されないため、別個の集団を形成せず、リンパ球
集団と部分的に重なり合っている。図１Ｃおよび１Ｄ
は、細胞を固定しかつ球状化するために本発明の試薬組
成物で１：２０に希釈した図１Ａおよび１Ｂと同じＰＲ
Ｐ試料のＣＳＦダイレクト・サイトメトリー・サイトグ
ラムを示している。図１Ａに比べると、固定されかつ球
状化された白血球の位置が移動し、より明瞭な細胞集団
を形成している。図１Ａとは対照的に、図１Ｃに見られ
る固定されかつ球状化された赤血球は、今度は別個の集
団を形成し、リンパ球と重なり合っていない。図１Ｂと
は対照的に、図１Ｄにおける好酸球は、はっきりと形成
した好中球集団とは分離しているように見える。図１Ｅ
は、固定されかつ球状化されたＰＲＰ試料のサイトグラ
ムを、オーバーレイされたミーマップと共に示してお
り、一組の座標の一方は細胞容積を示し、ほぼ直交する
他方は屈折率（乾燥質量濃度に比例する）を示してい
る。マップ上で容積は３０〜４１０ｆＬと異なり、３０
ｆＬ単位で示す。密度は０〜４９ｇ／ｄＬと異なり、５
ｇ／ｄＬ単位で示す。たとえば、好中球は１５０〜１８
０ｆＬの平均容積、２９〜３４ｇ／ｄＬの平均乾燥質量
を有する。
（すなわち、Ｂａｙｅｒ ＡＤＶＩＡ １２０自動分析
装置）で検査した血小板に富む血漿（ＰＲＰ）のサイト
グラム（ｃｙｔｏｇｒａｍ）を示す図である。図１Ａお
よび１Ｂは、リン酸塩緩衝液で１：２０に希釈したＰＲ
Ｐ試料のダイレクト・サイトメトリー・サイトグラムを
示している。白血球、すなわちリンパ球（ＬＹＭＰＨ
ｓ）、単球（ＭＯＮＯｓ）、好中球（ＮＥＵＴｓ）、血
小板、および好酸球（ＥＯｓ）は、互いによく分離して
いる別個の集団を形成している。赤血球（ＲＢＣｓ）は
球状化されないため、別個の集団を形成せず、リンパ球
集団と部分的に重なり合っている。図１Ｃおよび１Ｄ
は、細胞を固定しかつ球状化するために本発明の試薬組
成物で１：２０に希釈した図１Ａおよび１Ｂと同じＰＲ
Ｐ試料のＣＳＦダイレクト・サイトメトリー・サイトグ
ラムを示している。図１Ａに比べると、固定されかつ球
状化された白血球の位置が移動し、より明瞭な細胞集団
を形成している。図１Ａとは対照的に、図１Ｃに見られ
る固定されかつ球状化された赤血球は、今度は別個の集
団を形成し、リンパ球と重なり合っていない。図１Ｂと
は対照的に、図１Ｄにおける好酸球は、はっきりと形成
した好中球集団とは分離しているように見える。図１Ｅ
は、固定されかつ球状化されたＰＲＰ試料のサイトグラ
ムを、オーバーレイされたミーマップと共に示してお
り、一組の座標の一方は細胞容積を示し、ほぼ直交する
他方は屈折率（乾燥質量濃度に比例する）を示してい
る。マップ上で容積は３０〜４１０ｆＬと異なり、３０
ｆＬ単位で示す。密度は０〜４９ｇ／ｄＬと異なり、５
ｇ／ｄＬ単位で示す。たとえば、好中球は１５０〜１８
０ｆＬの平均容積、２９〜３４ｇ／ｄＬの平均乾燥質量
を有する。
【００２０】図２は、例示したＡＤＶＩＡ １２０血液
分析装置を用いて行う本発明による半自動ＣＳＦアッセ
イまたは他の体液アッセイの図解のフローチャートを示
す図である。
分析装置を用いて行う本発明による半自動ＣＳＦアッセ
イまたは他の体液アッセイの図解のフローチャートを示
す図である。
【００２１】図３Ａ〜３Ｃは、試料に対するさまざまな
試薬のオスモル濃度の効果を示す図である（表２）。目
標オスモル濃度１０７０ｍＯｓｍ（図３Ａ）、高オスモ
ル濃度１１４０ｍＯｓｍ（図３Ｂ）、低オスモル濃度１
０２４ｍＯｓｍ（図３Ｃ）の試薬を用いた同一ＰＲＰ試
料を示す。１：１に希釈後、上記から、非浸透性溶質が
それぞれ約３６０ｍＯｓｍ、４３０ｍＯｓｍおよび３１
４ｍＯｓｍの溶液と浸透圧的に等価な溶液が得られたこ
とに注目すべきである。白血球集団は、オスモル濃度の
増加に伴って時計回りに移動するが、サイトグラム中の
適切なゲーティング領域に依然として含まれ、正確に分
析することができる。このことは、本発明による試薬組
成物をオスモル濃度の範囲で配合できることを立証して
いる。
試薬のオスモル濃度の効果を示す図である（表２）。目
標オスモル濃度１０７０ｍＯｓｍ（図３Ａ）、高オスモ
ル濃度１１４０ｍＯｓｍ（図３Ｂ）、低オスモル濃度１
０２４ｍＯｓｍ（図３Ｃ）の試薬を用いた同一ＰＲＰ試
料を示す。１：１に希釈後、上記から、非浸透性溶質が
それぞれ約３６０ｍＯｓｍ、４３０ｍＯｓｍおよび３１
４ｍＯｓｍの溶液と浸透圧的に等価な溶液が得られたこ
とに注目すべきである。白血球集団は、オスモル濃度の
増加に伴って時計回りに移動するが、サイトグラム中の
適切なゲーティング領域に依然として含まれ、正確に分
析することができる。このことは、本発明による試薬組
成物をオスモル濃度の範囲で配合できることを立証して
いる。
【００２２】図４は、８０個のＣＳＦ試料について、Ｗ
ＢＣ結果を示し、ＷＢＣ数の手動分析結果とＡＤＶＩＡ
１２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ
の結果との相関を示す図である。
ＢＣ結果を示し、ＷＢＣ数の手動分析結果とＡＤＶＩＡ
１２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ
の結果との相関を示す図である。
【００２３】図５は、ＷＢＣ数が５個／μＬ以下の５２
個のＣＳＦ試料について、ＷＢＣ数の手動分析結果とＡ
ＤＶＩＡ １２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦ
アッセイの結果との相関を示し、手動結果の不正確さを
反映する±２ＳＤを示す図である。
個のＣＳＦ試料について、ＷＢＣ数の手動分析結果とＡ
ＤＶＩＡ １２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦ
アッセイの結果との相関を示し、手動結果の不正確さを
反映する±２ＳＤを示す図である。
【００２４】図６は、７４個のＣＳＦ試料における０か
ら１８４０のＲＢＣ数について、手動分析結果とＡＤＶ
ＩＡ １２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦアッ
セイ結果との相関を示す図である。
ら１８４０のＲＢＣ数について、手動分析結果とＡＤＶ
ＩＡ １２０分析装置で行った本発明によるＣＳＦアッ
セイ結果との相関を示す図である。
【００２５】図７は、７８個のＣＳＦ試料における好中
球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分析
装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関
を示している。この試験における試料は、好中球と確実
に識別するのに十分な好酸球を含んでいなかったため、
図７のグラフは、多形核球、すなわち好中球（ＮＥＵＴ
ｓ）と好酸球（ＥＯｓ）の総数のみを示す図である。
球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分析
装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関
を示している。この試験における試料は、好中球と確実
に識別するのに十分な好酸球を含んでいなかったため、
図７のグラフは、多形核球、すなわち好中球（ＮＥＵＴ
ｓ）と好酸球（ＥＯｓ）の総数のみを示す図である。
【００２６】図８は、７８個のＣＳＦ試料におけるリン
パ球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分
析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相
関を示す図である。
パ球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分
析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相
関を示す図である。
【００２７】図９は、７８個のＣＳＦ試料における単球
数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分析装
置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を
示す図である。
数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分析装
置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を
示す図である。
【００２８】図１０は、７８個のＣＳＦ試料における単
核球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分
析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相
関を示す図である。
核球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分
析装置で行った本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相
関を示す図である。
【００２９】図１１Ａ〜１１Ｈは、実施例１に記載の病
院検査室から得られたＣＳＦ試料の分析結果を示す図で
ある。図１１Ａ：正常でほぼ無細胞のＣＳＦ試料の分
析；図１１Ｃ：ＷＢＣ数の少ない試料の分析；図１１
Ｅ：約２０ＷＢＣのレベルでＷＢＣを含む試料の分析；
および図１１Ｇ：約１００ＷＢＣ／μＬのレベルの試料
の分析。図１１Ａ、１１Ｃ、１１Ｅ、および１１Ｇのサ
イトグラム下の表（すなわち、それぞれ図１１Ｂ、１１
Ｄ、１１Ｆ、および１１Ｈ）は、ＡＤＶＩＡ １２０自
動分析装置機器を用いて得られたＣＳＦアッセイ結果お
よび基準手動結果を示している。
院検査室から得られたＣＳＦ試料の分析結果を示す図で
ある。図１１Ａ：正常でほぼ無細胞のＣＳＦ試料の分
析；図１１Ｃ：ＷＢＣ数の少ない試料の分析；図１１
Ｅ：約２０ＷＢＣのレベルでＷＢＣを含む試料の分析；
および図１１Ｇ：約１００ＷＢＣ／μＬのレベルの試料
の分析。図１１Ａ、１１Ｃ、１１Ｅ、および１１Ｇのサ
イトグラム下の表（すなわち、それぞれ図１１Ｂ、１１
Ｄ、１１Ｆ、および１１Ｈ）は、ＡＤＶＩＡ １２０自
動分析装置機器を用いて得られたＣＳＦアッセイ結果お
よび基準手動結果を示している。
【００３０】図１２Ａおよび１２Ｂは、実施例４に記載
のＷＢＣ（図１２Ａ）およびＲＢＣ（図１２Ｂ）に関す
る回帰分析結果を示す図である。実験的に得られた（観
測された）細胞数は、白血球および赤血球に関して期待
値と一致している。
のＷＢＣ（図１２Ａ）およびＲＢＣ（図１２Ｂ）に関す
る回帰分析結果を示す図である。実験的に得られた（観
測された）細胞数は、白血球および赤血球に関して期待
値と一致している。
【００３１】
【発明の実施の形態】本発明は、ＣＳＦ試料などの体液
試料を分析するための正確かつ感度のよい半自動および
全自動アッセイを提供する。本発明の方法の利点は、試
料中に存在する可能性のあるすべての細胞を、細胞溶解
させることなく球状化しかつ固定する試薬を併用し、自
動血液分析装置または細胞計数装置のダイレクト・サイ
トメトリー・サンプリングの特徴を開発しかつ使用する
ことである。このアッセイ／方法は、通常は少量でほぼ
無細胞の体液試料を、正確に、信頼できるようにかつ感
度よく分析することを可能にする。
試料を分析するための正確かつ感度のよい半自動および
全自動アッセイを提供する。本発明の方法の利点は、試
料中に存在する可能性のあるすべての細胞を、細胞溶解
させることなく球状化しかつ固定する試薬を併用し、自
動血液分析装置または細胞計数装置のダイレクト・サイ
トメトリー・サンプリングの特徴を開発しかつ使用する
ことである。このアッセイ／方法は、通常は少量でほぼ
無細胞の体液試料を、正確に、信頼できるようにかつ感
度よく分析することを可能にする。
【００３２】ＣＳＦなどの血液以外の体液の分析は、特
にＡＤＶＩＡ １２０ダイレクト・サイトメトリー自動
機器などの血液分析装置で行われるときには、ゲーティ
ング・ソフトウェアを利用する。この分析装置で行われ
る新たに開発された水圧サイクルは、分析に少量の試料
を使用することを可能にし、また、このアッセイに必要
な清浄度を維持する。
にＡＤＶＩＡ １２０ダイレクト・サイトメトリー自動
機器などの血液分析装置で行われるときには、ゲーティ
ング・ソフトウェアを利用する。この分析装置で行われ
る新たに開発された水圧サイクルは、分析に少量の試料
を使用することを可能にし、また、このアッセイに必要
な清浄度を維持する。
【００３３】この分析で使用する新たな球状化および固
定試薬は、調製試料を保存し、正確に試料を分析するこ
とができる採取後の時間を延長する。このことは、体液
試料、たとえばＣＳＦ試料を、所望ならばバッチ式で分
析するか、将来の分析のために４℃で１週間までの保存
を可能にする。調製ＣＳＦ試料は、室温（たとえば１８
〜３０℃）で数時間保存することができる。したがっ
て、本発明の方法および試薬により、ＣＳＦ試料などの
体液試料は、それらの自動サイトメトリー分析までの時
間および分析の間の安定性という点で、血液試料と同様
の、またはより良好な挙動を示すことができる。
定試薬は、調製試料を保存し、正確に試料を分析するこ
とができる採取後の時間を延長する。このことは、体液
試料、たとえばＣＳＦ試料を、所望ならばバッチ式で分
析するか、将来の分析のために４℃で１週間までの保存
を可能にする。調製ＣＳＦ試料は、室温（たとえば１８
〜３０℃）で数時間保存することができる。したがっ
て、本発明の方法および試薬により、ＣＳＦ試料などの
体液試料は、それらの自動サイトメトリー分析までの時
間および分析の間の安定性という点で、血液試料と同様
の、またはより良好な挙動を示すことができる。
【００３４】血球を球状化するためにこれまでに開発さ
れた試薬には、等容積のままで赤血球も白血球も球状化
する両性イオン性サーファクタントが含まれる（たとえ
ば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献
５、特許文献６、特許文献７、特許文献８および特許文
献９を参照）。テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモ
ニオプロパンスルホネート（ＴＤＡＰＳ）などの両性イ
オン性サーファクタント（界面活性剤）を等張生理的溶
液中８．３ｍｇ／Ｌの濃度で用いて血小板に富む血漿
（ＰＲＰ）を１：２０に希釈し、ＡＤＶＩＡ １２０自
動分析装置でＲＢＣモードのダイレクト・サイトメトリ
ーにより細胞を検査すると、図１Ｃのようなサイトグラ
ムが得られる。
れた試薬には、等容積のままで赤血球も白血球も球状化
する両性イオン性サーファクタントが含まれる（たとえ
ば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献
５、特許文献６、特許文献７、特許文献８および特許文
献９を参照）。テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモ
ニオプロパンスルホネート（ＴＤＡＰＳ）などの両性イ
オン性サーファクタント（界面活性剤）を等張生理的溶
液中８．３ｍｇ／Ｌの濃度で用いて血小板に富む血漿
（ＰＲＰ）を１：２０に希釈し、ＡＤＶＩＡ １２０自
動分析装置でＲＢＣモードのダイレクト・サイトメトリ
ーにより細胞を検査すると、図１Ｃのようなサイトグラ
ムが得られる。
【００３５】ＰＲＰに関してはさらに、新たに混合した
正常血液の抗凝血試料を放置した場合、両凹面の赤血球
はコインが重なり合ったような細胞の重なりを形成し始
めることがよく知られている。これらは、個々の細胞
（赤血球、白血球、または血小板）の沈降速度よりもは
るかに早い速度で沈降し始める。約３０分から約１２０
分後（血液試料にもよるが）、血液は２つの区画、すな
わち赤血球が濃縮された暗赤色の下層と、白血球および
血小板が血漿中に懸濁し、また白血球１個当たり約１〜
２個の未沈降赤血球を含む黄色がかった淡紅色の上層と
に分離する。あまりに長く沈降が延長された場合には、
多くの白血球もまた赤血球層の頂面まで下降し、バフィ
ー・コートと呼ばれるものを形成する。通常、この上層
が血小板に富む血漿（ＰＲＰ）と呼ばれる。
正常血液の抗凝血試料を放置した場合、両凹面の赤血球
はコインが重なり合ったような細胞の重なりを形成し始
めることがよく知られている。これらは、個々の細胞
（赤血球、白血球、または血小板）の沈降速度よりもは
るかに早い速度で沈降し始める。約３０分から約１２０
分後（血液試料にもよるが）、血液は２つの区画、すな
わち赤血球が濃縮された暗赤色の下層と、白血球および
血小板が血漿中に懸濁し、また白血球１個当たり約１〜
２個の未沈降赤血球を含む黄色がかった淡紅色の上層と
に分離する。あまりに長く沈降が延長された場合には、
多くの白血球もまた赤血球層の頂面まで下降し、バフィ
ー・コートと呼ばれるものを形成する。通常、この上層
が血小板に富む血漿（ＰＲＰ）と呼ばれる。
【００３６】リンパ球（LYMPHs）、単球（MONOs）、好
中球（NEUTs）、好酸球（EOs）、血小板および赤血球
（RBCs）を表す点の集団は、図１Ａ、１Ｃおよび１Ｅの
サイトグラム上で個別に表示が付されている。これらの
代表的サイトグラムにおけるこれらの細胞の位置は、本
発明についてさらに論議するための有用な基準枠組みと
して役立つ。
中球（NEUTs）、好酸球（EOs）、血小板および赤血球
（RBCs）を表す点の集団は、図１Ａ、１Ｃおよび１Ｅの
サイトグラム上で個別に表示が付されている。これらの
代表的サイトグラムにおけるこれらの細胞の位置は、本
発明についてさらに論議するための有用な基準枠組みと
して役立つ。
【００３７】したがって、ＣＳＦなどの通常はほとんど
細胞を含まない体液を処理し、各細胞タイプについて図
１Ｃに示す位置とほぼ同じ位置でサイトグラムを作成す
ることが望ましい。その理由は、血液分析に通常用いら
れる自動細胞計数装置を用い、適切な閾値（ｔｈｒｅｓ
ｈｏｌｄｉｎｇ）アルゴリズムで各細胞集団中の細胞数
を正確に計数できるからである。さらに、各球状化細胞
の位置は、球状化細胞を特徴づけるのに役立つ２つのパ
ラメータ、すなわちその正確な容積およびその乾燥質量
濃度を記録する（図１Ｅ）（たとえば、非特許文献１、
非特許文献２、特許文献１０および特許文献１１を参
照）。
細胞を含まない体液を処理し、各細胞タイプについて図
１Ｃに示す位置とほぼ同じ位置でサイトグラムを作成す
ることが望ましい。その理由は、血液分析に通常用いら
れる自動細胞計数装置を用い、適切な閾値（ｔｈｒｅｓ
ｈｏｌｄｉｎｇ）アルゴリズムで各細胞集団中の細胞数
を正確に計数できるからである。さらに、各球状化細胞
の位置は、球状化細胞を特徴づけるのに役立つ２つのパ
ラメータ、すなわちその正確な容積およびその乾燥質量
濃度を記録する（図１Ｅ）（たとえば、非特許文献１、
非特許文献２、特許文献１０および特許文献１１を参
照）。
【００３８】通常の組織学的目的ならびにフロー・サイ
トメトリー分析の双方にとって、ホルムアルデヒドおよ
びグルタルアルデヒドなどのアルデヒドの水溶液が細胞
を固定するのに有用であることはよく知られている（た
とえば、特許文献１２、特許文献２および特許文献１３
を参照）。通常、グルタルアルデヒドはホルムアルデヒ
ドよりも低濃度でより有効であり、細胞をより迅速に固
定する。一方、固定は、球状化剤が目的を果たすことが
できる前に非球状細胞の形を固定するほど迅速であって
はならない。したがって、アルデヒドと球状化剤の濃度
の比、ならびに試薬の絶対濃度の選択は、分析すべき試
料の固定プロセスおよび試薬では比較的重要である。
トメトリー分析の双方にとって、ホルムアルデヒドおよ
びグルタルアルデヒドなどのアルデヒドの水溶液が細胞
を固定するのに有用であることはよく知られている（た
とえば、特許文献１２、特許文献２および特許文献１３
を参照）。通常、グルタルアルデヒドはホルムアルデヒ
ドよりも低濃度でより有効であり、細胞をより迅速に固
定する。一方、固定は、球状化剤が目的を果たすことが
できる前に非球状細胞の形を固定するほど迅速であって
はならない。したがって、アルデヒドと球状化剤の濃度
の比、ならびに試薬の絶対濃度の選択は、分析すべき試
料の固定プロセスおよび試薬では比較的重要である。
【００３９】さらに、最終的な試薬と試料の混合物にお
ける球状化剤とタンパク質の比も重要であり、これはサ
ーファクタントを「緩衝する」ために十分なタンパク質
濃度が必要なためである。しかしながら、両性イオン性
サーファクタントを使用することにより、赤血球につい
てはこの問題がそれほど重大ではないことが明らかにさ
れている（たとえば、特許文献９を参照）。たとえば、
グルタルアルデヒドとＴＤＡＰＳのさまざまな組合せを
等張食塩水で１：２０に希釈したＰＲＰと中性のｐＨで
混合した場合、赤血球を完全に球状化するのにちょうど
十分なＴＤＡＰＳの濃度が、一部の白血球の位置を、通
常、図１Ｃの基準サイトグラムにおける位置の左（およ
び下方）に移動させることが分かった。図１Ｃのサイト
グラムにおける白血球の位置に基づき、ミー（Ｍｉｅ）
マップを参照すると、これらの細胞が容積を変化させ、
溶質を漏出し、かつ乾燥質量を失うと判断された。しか
しながら、同じ濃度のＴＤＡＰＳおよびグルタルアルデ
ヒドを用い、等張食塩水の代わりに無細胞血漿でＰＲＰ
を希釈した場合には、細胞はサイトグラムにおいて「正
しい」位置に戻った。したがって、タンパク質濃度がさ
まざまに変化する中で、両性イオン性サーファクタント
は赤血球膜への損傷に関してはより「寛大」であるが、
血液試料中の白血球についてはそれほどでもないようで
ある。
ける球状化剤とタンパク質の比も重要であり、これはサ
ーファクタントを「緩衝する」ために十分なタンパク質
濃度が必要なためである。しかしながら、両性イオン性
サーファクタントを使用することにより、赤血球につい
てはこの問題がそれほど重大ではないことが明らかにさ
れている（たとえば、特許文献９を参照）。たとえば、
グルタルアルデヒドとＴＤＡＰＳのさまざまな組合せを
等張食塩水で１：２０に希釈したＰＲＰと中性のｐＨで
混合した場合、赤血球を完全に球状化するのにちょうど
十分なＴＤＡＰＳの濃度が、一部の白血球の位置を、通
常、図１Ｃの基準サイトグラムにおける位置の左（およ
び下方）に移動させることが分かった。図１Ｃのサイト
グラムにおける白血球の位置に基づき、ミー（Ｍｉｅ）
マップを参照すると、これらの細胞が容積を変化させ、
溶質を漏出し、かつ乾燥質量を失うと判断された。しか
しながら、同じ濃度のＴＤＡＰＳおよびグルタルアルデ
ヒドを用い、等張食塩水の代わりに無細胞血漿でＰＲＰ
を希釈した場合には、細胞はサイトグラムにおいて「正
しい」位置に戻った。したがって、タンパク質濃度がさ
まざまに変化する中で、両性イオン性サーファクタント
は赤血球膜への損傷に関してはより「寛大」であるが、
血液試料中の白血球についてはそれほどでもないようで
ある。
【００４０】体液試料の希釈液および／または混合物用
の試薬組成物を配合する目的にとって、成分または要素
として血漿またはタンパク質を含有する試薬を調製する
ことは、特にアルデヒドの存在下では好都合なことでは
なく、それは通常、アルデヒドがタンパク質と反応して
それらを架橋し、それによってタンパク質の溶解性、安
定性および緩衝能力を変化させるからである。したがっ
て、全血試料以外の体液試料と一緒に使用する本発明に
よれば、血漿タンパク質に代わって、サーファクタント
の緩衝液として働き、サーファクタントと可逆的に結合
する比較的アルデヒドに不活性な材料を含む試薬組成物
を設計した。
の試薬組成物を配合する目的にとって、成分または要素
として血漿またはタンパク質を含有する試薬を調製する
ことは、特にアルデヒドの存在下では好都合なことでは
なく、それは通常、アルデヒドがタンパク質と反応して
それらを架橋し、それによってタンパク質の溶解性、安
定性および緩衝能力を変化させるからである。したがっ
て、全血試料以外の体液試料と一緒に使用する本発明に
よれば、血漿タンパク質に代わって、サーファクタント
の緩衝液として働き、サーファクタントと可逆的に結合
する比較的アルデヒドに不活性な材料を含む試薬組成物
を設計した。
【００４１】全血以外の体液と混合するための試薬組成
物に含めるために適した材料として用いかつ新たに発見
した材料はシクロデキストリンである。大きな水溶性の
理由から、ヒドロキシプロピル化−β−シクロデキスト
リンが好ましい。修飾されていないアルファ（α）、ベ
ータ（β）およびガンマ（γ）シクロデキストリンも適
しているが、これら後者のタイプのシクロデキストリン
の低い水溶性が、製造の利便性に寄与する濃縮原液の調
製に使用することができる製剤をいくぶん制限すること
は理解されるであろう。
物に含めるために適した材料として用いかつ新たに発見
した材料はシクロデキストリンである。大きな水溶性の
理由から、ヒドロキシプロピル化−β−シクロデキスト
リンが好ましい。修飾されていないアルファ（α）、ベ
ータ（β）およびガンマ（γ）シクロデキストリンも適
しているが、これら後者のタイプのシクロデキストリン
の低い水溶性が、製造の利便性に寄与する濃縮原液の調
製に使用することができる製剤をいくぶん制限すること
は理解されるであろう。
【００４２】したがって、本発明の一実施形態は、自動
血液分析装置機器を用いて分析するための、ＣＳＦなど
の体液と混合するのに特に適している水性試薬組成物を
提供する。本発明によれば、この試薬は、細胞が長時間
懸濁し続け、それらの容積および内容物を維持するよう
に、一定量の体液中の細胞を固定しかつ球状化するため
に用いられる。その方法は、一定量の体液を、適切なア
ルデヒド、界面活性剤およびシクロデキストリンを含む
一定量の水性試薬、すなわち試薬組成物と混合して試薬
混合物を作成し、ダイレクト・サイトメトリーを用いる
自動分析装置で事実上１度に１個の細胞について混合物
を分析するものである。
血液分析装置機器を用いて分析するための、ＣＳＦなど
の体液と混合するのに特に適している水性試薬組成物を
提供する。本発明によれば、この試薬は、細胞が長時間
懸濁し続け、それらの容積および内容物を維持するよう
に、一定量の体液中の細胞を固定しかつ球状化するため
に用いられる。その方法は、一定量の体液を、適切なア
ルデヒド、界面活性剤およびシクロデキストリンを含む
一定量の水性試薬、すなわち試薬組成物と混合して試薬
混合物を作成し、ダイレクト・サイトメトリーを用いる
自動分析装置で事実上１度に１個の細胞について混合物
を分析するものである。
【００４３】本発明の水性試薬組成物は、少なくとも１
種類の固定剤、好ましくはホルムアルデヒド、グルタル
アルデヒド、またはそれらの組合せを含む。試薬中のホ
ルムアルデヒド含量は、ホルムアルデヒドの３７重量％
水溶液であるホルマリンを添加することによって調節す
る。ＣＳＦ試薬では、ホルムアルデヒドは、約１０ｇ／
Ｌから約２５ｇ／Ｌまで、具体的には約１５ｇ／Ｌから
約２３ｇ／Ｌまで、より具体的には約１７ｇ／Ｌから約
２３ｇ／Ｌまで、最も具体的には約１７．０３ｇ／Ｌか
ら約２３．０５ｇ／Ｌまで、好ましくは約１８．０ｇ／
Ｌから約２１．０ｇ／Ｌまで、より好ましくは約１９．
０ｇ／Ｌから約２１．０ｇ／Ｌまでの量で存在する。
種類の固定剤、好ましくはホルムアルデヒド、グルタル
アルデヒド、またはそれらの組合せを含む。試薬中のホ
ルムアルデヒド含量は、ホルムアルデヒドの３７重量％
水溶液であるホルマリンを添加することによって調節す
る。ＣＳＦ試薬では、ホルムアルデヒドは、約１０ｇ／
Ｌから約２５ｇ／Ｌまで、具体的には約１５ｇ／Ｌから
約２３ｇ／Ｌまで、より具体的には約１７ｇ／Ｌから約
２３ｇ／Ｌまで、最も具体的には約１７．０３ｇ／Ｌか
ら約２３．０５ｇ／Ｌまで、好ましくは約１８．０ｇ／
Ｌから約２１．０ｇ／Ｌまで、より好ましくは約１９．
０ｇ／Ｌから約２１．０ｇ／Ｌまでの量で存在する。
【００４４】試薬中のグルタルアルデヒド含量は、２５
重量％溶液または５重量％溶液を添加することによって
調節する。ＣＳＦ試薬では、グルタルアルデヒドは、約
１ｇ／Ｌから約５ｇ／Ｌまで、具体的には約２ｇ／Ｌか
ら約３ｇ／Ｌまで、より具体的には約２．１ｇ／Ｌから
約２．９ｇ／Ｌまで、さらにより具体的には約２．３ｇ
／Ｌから約２．８ｇ／Ｌまで、好ましくは約２．２５ｇ
／Ｌから約２．７５ｇ／Ｌまで、より好ましくは約２．
４ｇ／Ｌから約２．６ｇ／Ｌまでの量で存在する。ま
た、この製剤は、シクロデキストリン、好ましくはヒド
ロキシプロピル化β−シクロデキストリンを、約１０ｇ
／Ｌから約３５ｇ／Ｌまで、具体的には約１４ｇ／Ｌか
ら約３５ｇ／Ｌまで、より具体的には約１４．１ｇ／Ｌ
から約３５．２ｇ／Ｌまで、好ましくは約１５ｇ／Ｌか
ら約２１ｇ／Ｌまで、より具体的には約１５．５〜１
５．８ｇ／Ｌから約２１〜２１．１ｇ／Ｌまで、より好
ましくは約１６．７ｇ／Ｌから約１８．５ｇ／Ｌの量で
含む。さらに、界面活性剤、すなわち洗浄剤またはサー
ファクタントは、約１．５ｇ／Ｌから約３．０ｇ／Ｌま
で、好ましくは約１．８ｇ／Ｌから約２．５ｇ／Ｌま
で、より好ましくは約１．８ｇ／Ｌから約２．２ｇ／Ｌ
まで、さらにより好ましくは約１．９ｇ／Ｌから約２．
１ｇ／Ｌまで、さらにより好ましくは約１．８８ｇ／Ｌ
から約２．１２ｇ／Ｌの量で、試薬製剤に含まれてい
る。
重量％溶液または５重量％溶液を添加することによって
調節する。ＣＳＦ試薬では、グルタルアルデヒドは、約
１ｇ／Ｌから約５ｇ／Ｌまで、具体的には約２ｇ／Ｌか
ら約３ｇ／Ｌまで、より具体的には約２．１ｇ／Ｌから
約２．９ｇ／Ｌまで、さらにより具体的には約２．３ｇ
／Ｌから約２．８ｇ／Ｌまで、好ましくは約２．２５ｇ
／Ｌから約２．７５ｇ／Ｌまで、より好ましくは約２．
４ｇ／Ｌから約２．６ｇ／Ｌまでの量で存在する。ま
た、この製剤は、シクロデキストリン、好ましくはヒド
ロキシプロピル化β−シクロデキストリンを、約１０ｇ
／Ｌから約３５ｇ／Ｌまで、具体的には約１４ｇ／Ｌか
ら約３５ｇ／Ｌまで、より具体的には約１４．１ｇ／Ｌ
から約３５．２ｇ／Ｌまで、好ましくは約１５ｇ／Ｌか
ら約２１ｇ／Ｌまで、より具体的には約１５．５〜１
５．８ｇ／Ｌから約２１〜２１．１ｇ／Ｌまで、より好
ましくは約１６．７ｇ／Ｌから約１８．５ｇ／Ｌの量で
含む。さらに、界面活性剤、すなわち洗浄剤またはサー
ファクタントは、約１．５ｇ／Ｌから約３．０ｇ／Ｌま
で、好ましくは約１．８ｇ／Ｌから約２．５ｇ／Ｌま
で、より好ましくは約１．８ｇ／Ｌから約２．２ｇ／Ｌ
まで、さらにより好ましくは約１．９ｇ／Ｌから約２．
１ｇ／Ｌまで、さらにより好ましくは約１．８８ｇ／Ｌ
から約２．１２ｇ／Ｌの量で、試薬製剤に含まれてい
る。
【００４５】本発明の試薬で用いることができる好適な
界面活性剤、すなわちサーファクタントまたは洗浄剤に
は、非イオン性および両性イオン性サーファクタントが
含まれる。本発明の試薬組成物では、いくつかの種類の
両性イオン性サーファクタント、または非イオン性サー
ファクタントを球状化剤として用いることができる。サ
ーファクタントは、分析を受ける体液試料中に存在する
可能性のあるどの細胞も実質的に球状化するのに有効な
量で組成物中に存在する。
界面活性剤、すなわちサーファクタントまたは洗浄剤に
は、非イオン性および両性イオン性サーファクタントが
含まれる。本発明の試薬組成物では、いくつかの種類の
両性イオン性サーファクタント、または非イオン性サー
ファクタントを球状化剤として用いることができる。サ
ーファクタントは、分析を受ける体液試料中に存在する
可能性のあるどの細胞も実質的に球状化するのに有効な
量で組成物中に存在する。
【００４６】好適な種類の両性イオン性サーファクタン
トの非限定的例には、カルボキシベタイン、スルホベタ
イン（スルタインの別名でも知られる）、アミドベタイ
ンおよびスルホアミドベタインを含むベタイン類が含ま
れる。試薬組成物で用いるのに特に興味があるのは、Ｃ
8〜Ｃ18好ましくはＣ10〜Ｃ18アルキルベタイン、スル
ホベタイン、アミドベタイン、およびアミドベタイン、
たとえばラウリルアミドプロピルベタイン（ＬＡＢ）タ
イプのベタインである。
トの非限定的例には、カルボキシベタイン、スルホベタ
イン（スルタインの別名でも知られる）、アミドベタイ
ンおよびスルホアミドベタインを含むベタイン類が含ま
れる。試薬組成物で用いるのに特に興味があるのは、Ｃ
8〜Ｃ18好ましくはＣ10〜Ｃ18アルキルベタイン、スル
ホベタイン、アミドベタイン、およびアミドベタイン、
たとえばラウリルアミドプロピルベタイン（ＬＡＢ）タ
イプのベタインである。
【００４７】ベタインの類で好適な両性イオン性サーフ
ァクタントの非限定的例には、ｎ−アルキルジメチルア
ンモニオメタンカルボキシレート（ＤＡＭＣ）、ｎ−ア
ルキルジメチルアンモニオエタンカルボキシレート（Ｄ
ＡＥＣ）およびｎ−アルキルジメチルアンモニオプロパ
ンカルボキシレート（ＤＡＰＣ）が含まれる。スルホベ
タインの類の両性イオン性サーファクタントの例には、
ｎ−アルキルスルタイン、またはｎ−アルキルジメチル
アンモニオメタンスルホネート（ＤＡＭＳ）、ｎ−アル
キルジメチルアンモニオエタンスルホネート（ＤＡＥ
Ｓ）、ｎ−アルキルジメチルアンモニオプロパンスルホ
ネート（ＤＡＰＳ）およびｎ−アルキルジメチルアンモ
ニオブタンスルホネート（ＤＡＢＳ）などのｎ−アルキ
ルジメチルアンモニオアルキルスルホネートが含まれる
が、これらに限定されるものではない。「ＤＡＰＳ」サ
ーファクタント系では、ＴＤＡＰＳ（「Ｔ」はｎ−テト
ラデシルを表わす）；ＤＤＡＰＳ（「Ｄ」はドデシルを
表わす）が本発明では特に適しており、好ましい。
ァクタントの非限定的例には、ｎ−アルキルジメチルア
ンモニオメタンカルボキシレート（ＤＡＭＣ）、ｎ−ア
ルキルジメチルアンモニオエタンカルボキシレート（Ｄ
ＡＥＣ）およびｎ−アルキルジメチルアンモニオプロパ
ンカルボキシレート（ＤＡＰＣ）が含まれる。スルホベ
タインの類の両性イオン性サーファクタントの例には、
ｎ−アルキルスルタイン、またはｎ−アルキルジメチル
アンモニオメタンスルホネート（ＤＡＭＳ）、ｎ−アル
キルジメチルアンモニオエタンスルホネート（ＤＡＥ
Ｓ）、ｎ−アルキルジメチルアンモニオプロパンスルホ
ネート（ＤＡＰＳ）およびｎ−アルキルジメチルアンモ
ニオブタンスルホネート（ＤＡＢＳ）などのｎ−アルキ
ルジメチルアンモニオアルキルスルホネートが含まれる
が、これらに限定されるものではない。「ＤＡＰＳ」サ
ーファクタント系では、ＴＤＡＰＳ（「Ｔ」はｎ−テト
ラデシルを表わす）；ＤＤＡＰＳ（「Ｄ」はドデシルを
表わす）が本発明では特に適しており、好ましい。
【００４８】アミドベタインの類には、ｎ−アルキルア
ミドメタンジメチルアンモニオメタンカルボキシレート
またはｎ−アルキルアミドメタンジメチルアンモニオエ
タンカルボキシレートが含まれるが、これらに限定され
るものではない。好ましいアミドベタインは、ラウリル
アミドプロピルベタイン（ＬＡＢ）である。また、ｎ−
アルキルアミドメタンジメチルアンモニオメタンスルホ
ネート、ｎ−アルキルアミドメタンジメチルアンモニオ
エタンスルホネートおよびｎ−アルキルアミドメタンジ
メチルアンモニオプロパンスルホネートなどの類似のア
ミドベタインスルホネートも適している。さらに、脂肪
酸源としてココナッツ油を有するアミドベタイン、たと
えば、ココアミドプロピルベタイン（ＣＡＰＢ）および
ココアミドスルホベタイン（ＣＡＳＢ）を使用すること
も考えられる。ベタイン類、スルホベタイン類、アミド
ベタイン類およびアミドスルホベタイン類についての詳
細な説明は、関連文献である、たとえば非特許文献３、
非特許文献４、非特許文献５および非特許文献６に見い
だされる。
ミドメタンジメチルアンモニオメタンカルボキシレート
またはｎ−アルキルアミドメタンジメチルアンモニオエ
タンカルボキシレートが含まれるが、これらに限定され
るものではない。好ましいアミドベタインは、ラウリル
アミドプロピルベタイン（ＬＡＢ）である。また、ｎ−
アルキルアミドメタンジメチルアンモニオメタンスルホ
ネート、ｎ−アルキルアミドメタンジメチルアンモニオ
エタンスルホネートおよびｎ−アルキルアミドメタンジ
メチルアンモニオプロパンスルホネートなどの類似のア
ミドベタインスルホネートも適している。さらに、脂肪
酸源としてココナッツ油を有するアミドベタイン、たと
えば、ココアミドプロピルベタイン（ＣＡＰＢ）および
ココアミドスルホベタイン（ＣＡＳＢ）を使用すること
も考えられる。ベタイン類、スルホベタイン類、アミド
ベタイン類およびアミドスルホベタイン類についての詳
細な説明は、関連文献である、たとえば非特許文献３、
非特許文献４、非特許文献５および非特許文献６に見い
だされる。
【００４９】使用に適したその他の両性イオン性サーフ
ァクタントには、３−［（３−コラミドプロピル）ジメ
チルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡ
ＰＳ）および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチル
アンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネ
ート（ＣＨＡＰＳＯ）が含まれる。
ァクタントには、３−［（３−コラミドプロピル）ジメ
チルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡ
ＰＳ）および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチル
アンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネ
ート（ＣＨＡＰＳＯ）が含まれる。
【００５０】一般に、本発明で用いるのに適した非イオ
ン性サーファクタントには、アルキルグリコシド類が含
まれる。好ましい非イオン性サーファクタントには、ｎ
−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−
β−Ｄ−マルトシドおよびｎ−テトラデシル−β−Ｄ−
グルコシドが含まれる。
ン性サーファクタントには、アルキルグリコシド類が含
まれる。好ましい非イオン性サーファクタントには、ｎ
−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−
β−Ｄ−マルトシドおよびｎ−テトラデシル−β−Ｄ−
グルコシドが含まれる。
【００５１】通常、ｐＨを約ｐＨ４．０からｐＨ７．０
まで、好ましくはｐＨ４．５からｐＨ６．５まで、より
好ましくはｐＨ５．０からｐＨ６．４まで、さらにより
好ましくは約ｐＨ５．０から５．６までの範囲に維持す
るため、本発明の試薬組成物の製剤中に緩衝化剤も含ま
れる。ｐＨ範囲の上端では、試薬のグルタルアルデヒド
成分の貯蔵寿命は一般に短縮され、ｐＨ範囲の下端で
は、グルタルアルデヒドはホルムアルデヒドと競合せず
（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｅ）、細胞およびタンパク質ク
ランピングの早期発現につながる。緩衝化剤の非限定的
例には、Ｎａ2ＨＰＯ4および／またはＮａＨ2ＰＯ4、ク
エン酸およびその塩、コハク酸およびその塩、ならびに
ＥＤＴＡおよびその塩、たとえばＫ3ＥＤＴＡなどの塩
類が含まれ、その量は約４０ｍＭｏｌから約６０ｍＭｏ
ｌまで、より好ましくは約４８ｍＭｏｌから約５２ｍＭ
ｏｌまでである。
まで、好ましくはｐＨ４．５からｐＨ６．５まで、より
好ましくはｐＨ５．０からｐＨ６．４まで、さらにより
好ましくは約ｐＨ５．０から５．６までの範囲に維持す
るため、本発明の試薬組成物の製剤中に緩衝化剤も含ま
れる。ｐＨ範囲の上端では、試薬のグルタルアルデヒド
成分の貯蔵寿命は一般に短縮され、ｐＨ範囲の下端で
は、グルタルアルデヒドはホルムアルデヒドと競合せず
（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｅ）、細胞およびタンパク質ク
ランピングの早期発現につながる。緩衝化剤の非限定的
例には、Ｎａ2ＨＰＯ4および／またはＮａＨ2ＰＯ4、ク
エン酸およびその塩、コハク酸およびその塩、ならびに
ＥＤＴＡおよびその塩、たとえばＫ3ＥＤＴＡなどの塩
類が含まれ、その量は約４０ｍＭｏｌから約６０ｍＭｏ
ｌまで、より好ましくは約４８ｍＭｏｌから約５２ｍＭ
ｏｌまでである。
【００５２】クエン酸は、３つのｐＫａ、すなわち３．
１３、４．６７、および６．４０を有している。したが
って、特に約ｐＨ４．８から約ｐＨ６．４までのｐＨ範
囲においては本発明の目的にとって良好な緩衝液であ
る。６．４以上では、リン酸塩緩衝液を用いることが好
ましい。また、試薬組成物は、キレート化剤、たとえ
ば、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、またはその
塩（たとえば、Ｋ3ＥＤＴＡ）を含み、試薬の安定性を
維持することができる。
１３、４．６７、および６．４０を有している。したが
って、特に約ｐＨ４．８から約ｐＨ６．４までのｐＨ範
囲においては本発明の目的にとって良好な緩衝液であ
る。６．４以上では、リン酸塩緩衝液を用いることが好
ましい。また、試薬組成物は、キレート化剤、たとえ
ば、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、またはその
塩（たとえば、Ｋ3ＥＤＴＡ）を含み、試薬の安定性を
維持することができる。
【００５３】本発明による試薬組成物としては、グルタ
ルアルデヒドおよびホルムアルデヒド（ホルムアルデヒ
ドは細胞表面サイトを素早く満たし、さもないと遅発型
のグルタルアルデヒド誘発性細胞間および血漿タンパク
質架橋につながり、ついで細胞クランピングおよび／ま
たはタンパク質沈殿につながる）と、ヒドロキシプロピ
ル−β−シクロデキストリン、および両性イオン性サー
ファクタントであるＴＤＡＰＳとの組合せが特に好まし
い。
ルアルデヒドおよびホルムアルデヒド（ホルムアルデヒ
ドは細胞表面サイトを素早く満たし、さもないと遅発型
のグルタルアルデヒド誘発性細胞間および血漿タンパク
質架橋につながり、ついで細胞クランピングおよび／ま
たはタンパク質沈殿につながる）と、ヒドロキシプロピ
ル−β−シクロデキストリン、および両性イオン性サー
ファクタントであるＴＤＡＰＳとの組合せが特に好まし
い。
【００５４】下記の作業溶液への最終的希釈用である本
発明による上記の試薬の濃縮原液の典型的かつ非限定的
最終製剤は、水性（２０〜６７．６ｇ／Ｌ）ホルマリン
（７．４〜２５ｇ／Ｌホルムアルデヒド）、１〜６ｇ／
Ｌグルタルアルデヒド、１５〜４２ｇ／Ｌヒドロキシプ
ロピル−β−シクロデキストリン（Ｃｅｒｅｓｔａｒ８
２００４）、および２〜６ｇ／ＬのＴＤＡＰＳを含有
し、クエン酸ナトリウムまたはＮａ2ＨＰＯ4などの緩衝
塩でｐＨ５〜８に調整される。本発明の半自動アッセイ
で用いる本発明の試薬組成物の好ましい成分およびそれ
らの好ましい量の一覧を表１に示す。表１に示すＣＳＦ
試薬にとって好ましいｐＨ範囲は、約５．３〜５．５で
ある。この試薬組成物は、本法における使用、および長
期、たとえば少なくとも１年の保存に関して安定性を示
す。好ましい試薬および量は例および指針を示すもので
限定を意図していないことは理解されるであろう。
発明による上記の試薬の濃縮原液の典型的かつ非限定的
最終製剤は、水性（２０〜６７．６ｇ／Ｌ）ホルマリン
（７．４〜２５ｇ／Ｌホルムアルデヒド）、１〜６ｇ／
Ｌグルタルアルデヒド、１５〜４２ｇ／Ｌヒドロキシプ
ロピル−β−シクロデキストリン（Ｃｅｒｅｓｔａｒ８
２００４）、および２〜６ｇ／ＬのＴＤＡＰＳを含有
し、クエン酸ナトリウムまたはＮａ2ＨＰＯ4などの緩衝
塩でｐＨ５〜８に調整される。本発明の半自動アッセイ
で用いる本発明の試薬組成物の好ましい成分およびそれ
らの好ましい量の一覧を表１に示す。表１に示すＣＳＦ
試薬にとって好ましいｐＨ範囲は、約５．３〜５．５で
ある。この試薬組成物は、本法における使用、および長
期、たとえば少なくとも１年の保存に関して安定性を示
す。好ましい試薬および量は例および指針を示すもので
限定を意図していないことは理解されるであろう。
【表１】
【００５５】通常、作業溶液は、等張（たとえば、２９
０ミリオスモル、ｍＯｓｍｏｌ／Ｋｇ；ｍＯｓｍ）食塩
水または他の生理的溶液で原液を、たとえば１：５から
１：２０に希釈することによって作製する。ある目的で
は、張性が２００ｍＯｓｍと低い食塩溶液および４００
ｍＯｓｍと高い食塩溶液を用いることができる。作業溶
液は、約１０６０ｍＯｓｍから約１０８０ｍＯｓｍの作
業用張性で作成することが好ましく、通常はＣＳＦなど
の体液試料と１：１の希釈で混合する。作業溶液の大部
分の張性は、細胞膜を容易にかつ速やかに通過し、非浸
透性溶質の１０００ｍＯｓｍ溶液から予想される重大な
浸透圧による縮小にほとんど寄与しないホルムアルデヒ
ドに起因していることことに注目すべきである。実際、
１：１希釈後、作業溶液の浸透圧効果は、約３６０ｍＯ
ｓｍの塩溶液に相当する。
０ミリオスモル、ｍＯｓｍｏｌ／Ｋｇ；ｍＯｓｍ）食塩
水または他の生理的溶液で原液を、たとえば１：５から
１：２０に希釈することによって作製する。ある目的で
は、張性が２００ｍＯｓｍと低い食塩溶液および４００
ｍＯｓｍと高い食塩溶液を用いることができる。作業溶
液は、約１０６０ｍＯｓｍから約１０８０ｍＯｓｍの作
業用張性で作成することが好ましく、通常はＣＳＦなど
の体液試料と１：１の希釈で混合する。作業溶液の大部
分の張性は、細胞膜を容易にかつ速やかに通過し、非浸
透性溶質の１０００ｍＯｓｍ溶液から予想される重大な
浸透圧による縮小にほとんど寄与しないホルムアルデヒ
ドに起因していることことに注目すべきである。実際、
１：１希釈後、作業溶液の浸透圧効果は、約３６０ｍＯ
ｓｍの塩溶液に相当する。
【００５６】表２および図３Ａ〜３Ｃは、いくつかの異
なるオスモル濃度を有する試薬を用いて行ったＣＳＦア
ッセイの結果を示している。白血球集団は、サイトグラ
ム（図３Ａ〜３Ｃ）中の適切なゲーティング領域内にあ
り、オスモル濃度の増加に伴う時計回りの移動にもかか
わらず正確に分析することができる。したがって、本発
明による試薬は、本明細書に示されるように、各種オス
モル濃度において適切に作成されている。
なるオスモル濃度を有する試薬を用いて行ったＣＳＦア
ッセイの結果を示している。白血球集団は、サイトグラ
ム（図３Ａ〜３Ｃ）中の適切なゲーティング領域内にあ
り、オスモル濃度の増加に伴う時計回りの移動にもかか
わらず正確に分析することができる。したがって、本発
明による試薬は、本明細書に示されるように、各種オス
モル濃度において適切に作成されている。
【表２】
【００５７】一例として、ＣＳＦ分析法の好ましい実施
形態では、同容積のＣＳＦ試料を同容積のＣＳＦ試薬と
混ぜ、Ｂａｙｅｒ ＡＤＶＩＡ １２０自動分析装置な
どの自動機器にかける。この機器により分析することが
できるＣＳＦ試料の容積は、血球計におけるＣＳＦの顕
微鏡検査により現在分析することができる最大容積（た
とえば、１μｌ）の３．７倍である。その結果、計数精
度には３．７の平方根（すなわち、ＳＱＲＴ３．７）の
改善がある。したがって、本方法は、その安定性によ
り、通常は無細胞、あるいは無細胞に近いＣＳＦのよう
な試料を迅速に、正確に、信頼できるようにかつ効率的
に分析するのに有利である。
形態では、同容積のＣＳＦ試料を同容積のＣＳＦ試薬と
混ぜ、Ｂａｙｅｒ ＡＤＶＩＡ １２０自動分析装置な
どの自動機器にかける。この機器により分析することが
できるＣＳＦ試料の容積は、血球計におけるＣＳＦの顕
微鏡検査により現在分析することができる最大容積（た
とえば、１μｌ）の３．７倍である。その結果、計数精
度には３．７の平方根（すなわち、ＳＱＲＴ３．７）の
改善がある。したがって、本方法は、その安定性によ
り、通常は無細胞、あるいは無細胞に近いＣＳＦのよう
な試料を迅速に、正確に、信頼できるようにかつ効率的
に分析するのに有利である。
【００５８】本発明の別の態様は、脳脊髄液（ＣＳＦ）
に加え、それ以外の、たとえば胸水試料、肺または気管
支洗浄液試料、滑液試料、腹膜液試料、骨髄吸引試料、
腹水試料、痰試料、唾液試料、リンパ液、涙、血清、血
漿、精液、尿、または膀胱洗浄試料などの体液試料の分
析を包含する。このような試料は、かならずではない
が、細胞をほとんど含まないことが多い。細胞の濃度が
ＣＳＦにおけるよりも実質的に高い場合には、球状化／
固定試薬による１：１を超える希釈を用いる。したがっ
て、本方法の感度は、さまざまに異なる体液試料におけ
る細胞の分析に十分適している。また、このような体液
試料を本発明の試薬組成物と混ぜ、室温で少なくとも８
時間の安定性、および４℃で２４時間を超える安定性を
有する、より安定な試薬混合物を調製することができ
る。
に加え、それ以外の、たとえば胸水試料、肺または気管
支洗浄液試料、滑液試料、腹膜液試料、骨髄吸引試料、
腹水試料、痰試料、唾液試料、リンパ液、涙、血清、血
漿、精液、尿、または膀胱洗浄試料などの体液試料の分
析を包含する。このような試料は、かならずではない
が、細胞をほとんど含まないことが多い。細胞の濃度が
ＣＳＦにおけるよりも実質的に高い場合には、球状化／
固定試薬による１：１を超える希釈を用いる。したがっ
て、本方法の感度は、さまざまに異なる体液試料におけ
る細胞の分析に十分適している。また、このような体液
試料を本発明の試薬組成物と混ぜ、室温で少なくとも８
時間の安定性、および４℃で２４時間を超える安定性を
有する、より安定な試薬混合物を調製することができ
る。
【００５９】具体的であるが非限定的実施形態では、本
発明は、ＡＤＶＩＡ １２０血液分析装置によるＣＳＦ
試料の分析を包含する。タイミング・サイクルおよび分
析アルゴリズムに対する変更を含む適切なシステム／ソ
フトウェアの改良により、本発明の他の用途には、残留
するＲＢＣ、ＷＢＣおよび血小板の存在についての血液
バンクにおける新鮮凍結血漿ユニットのモニタリングが
含まれる。これらのユニットの品質管理にとって典型的
な許容範囲の細胞レベルは、それぞれ１〜６×１０3Ｒ
ＢＣ／μＬ未満、１００ＷＢＣ／μＬ未満および２０×
１０3ＰＬＴ／μＬ未満である。
発明は、ＡＤＶＩＡ １２０血液分析装置によるＣＳＦ
試料の分析を包含する。タイミング・サイクルおよび分
析アルゴリズムに対する変更を含む適切なシステム／ソ
フトウェアの改良により、本発明の他の用途には、残留
するＲＢＣ、ＷＢＣおよび血小板の存在についての血液
バンクにおける新鮮凍結血漿ユニットのモニタリングが
含まれる。これらのユニットの品質管理にとって典型的
な許容範囲の細胞レベルは、それぞれ１〜６×１０3Ｒ
ＢＣ／μＬ未満、１００ＷＢＣ／μＬ未満および２０×
１０3ＰＬＴ／μＬ未満である。
【００６０】本発明に包含され、本明細書に記載のよう
に、本明細書でＡＤＶＩＡ １２０ＣＳＦ試薬と呼ば
れ、ＡＤＶＩＡ １２０分析装置で分析するためにＣＳ
Ｆ試料を調製するための試薬組成物を開発した。ＣＳＦ
試料について記載した試薬および方法は、本発明によっ
て企図され上記に示したように、その他の体液試料の分
析にも適していることは理解されるであろう。したがっ
て、本明細書で使用する用語「ＣＳＦアッセイ」または
「ＣＳＦ試薬」には、ＣＳＦの他に、本明細書の他の場
所に示した通常はほぼ無細胞の他の体液に関するアッセ
イおよび試薬が含まれることを意味する。
に、本明細書でＡＤＶＩＡ １２０ＣＳＦ試薬と呼ば
れ、ＡＤＶＩＡ １２０分析装置で分析するためにＣＳ
Ｆ試料を調製するための試薬組成物を開発した。ＣＳＦ
試料について記載した試薬および方法は、本発明によっ
て企図され上記に示したように、その他の体液試料の分
析にも適していることは理解されるであろう。したがっ
て、本明細書で使用する用語「ＣＳＦアッセイ」または
「ＣＳＦ試薬」には、ＣＳＦの他に、本明細書の他の場
所に示した通常はほぼ無細胞の他の体液に関するアッセ
イおよび試薬が含まれることを意味する。
【００６１】一実施形態では、ＡＤＶＩＡ １２０ＣＳ
Ｆ法は、同容積の液体試料、たとえば脊髄液試料、およ
び球状化／固定試薬組成物を組み合わせてかつ混合し、
試薬／試料混合物を作成するオフライン調製を含む。す
なわち、ユーザは、同量の試料液（ＣＳＦ試料）および
ＣＳＦ試薬を混合することにより分析用試料を手動で調
製し、その混合物をＡＤＶＩＡ １２０自動機器中に吸
引する。
Ｆ法は、同容積の液体試料、たとえば脊髄液試料、およ
び球状化／固定試薬組成物を組み合わせてかつ混合し、
試薬／試料混合物を作成するオフライン調製を含む。す
なわち、ユーザは、同量の試料液（ＣＳＦ試料）および
ＣＳＦ試薬を混合することにより分析用試料を手動で調
製し、その混合物をＡＤＶＩＡ １２０自動機器中に吸
引する。
【００６２】一定量の体液試料（たとえば、ＣＳＦ）お
よびＣＳＦ試薬を含有する試薬混合物を含むように調製
しかつ混合された試料は、ＡＤＶＩＡ １２０分析装置
中への吸引前にはガラスまたはプラスチック・チューブ
中にある。分析を受ける試料について報告できる白血球
および赤血球パラメータ（たとえば、ＷＢＣ、ＲＢＣ、
および４要素のＷＢＣ百分率、すなわちリンパ球、単
球、好中球および好酸球の数および比率）を得るために
は、１度の試料吸引で十分である。
よびＣＳＦ試薬を含有する試薬混合物を含むように調製
しかつ混合された試料は、ＡＤＶＩＡ １２０分析装置
中への吸引前にはガラスまたはプラスチック・チューブ
中にある。分析を受ける試料について報告できる白血球
および赤血球パラメータ（たとえば、ＷＢＣ、ＲＢＣ、
および４要素のＷＢＣ百分率、すなわちリンパ球、単
球、好中球および好酸球の数および比率）を得るために
は、１度の試料吸引で十分である。
【００６３】大部分の細胞含有ＣＳＦ試料には、少数の
白血球が、さらに少数の赤血球および血小板と共に含ま
れる。これらの要素は、全血試料におけるよりも容易に
ＣＳＦ試料中のすべての細胞タイプを同時に数えかつ分
類することを可能にする。対照的に、全血試料は多数の
赤血球、血小板、および白血球を含む。赤血球の濃度が
高すぎるため、実質的に適切な計数を行うために血液試
料を希釈しなければならない。これらの条件下であって
も、典型的な血液分析装置のセンシング・ゾーンにおけ
る２個以上の赤血球の同時計数（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃ
ｅ）は、計数した事象総数の４％〜７％である。
白血球が、さらに少数の赤血球および血小板と共に含ま
れる。これらの要素は、全血試料におけるよりも容易に
ＣＳＦ試料中のすべての細胞タイプを同時に数えかつ分
類することを可能にする。対照的に、全血試料は多数の
赤血球、血小板、および白血球を含む。赤血球の濃度が
高すぎるため、実質的に適切な計数を行うために血液試
料を希釈しなければならない。これらの条件下であって
も、典型的な血液分析装置のセンシング・ゾーンにおけ
る２個以上の赤血球の同時計数（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃ
ｅ）は、計数した事象総数の４％〜７％である。
【００６４】本明細書および以下に記載の自動検出シス
テムでは、赤血球、血小板、および白血球は、別個のシ
グナル検出領域、すなわち集団を占有する。しかしなが
ら、赤血球同時発生シグナルは、好中球、好酸球、ある
場合には単球と同じシグナル検出領域を占有する。全血
では、赤血球と白血球の比が通常５００対１であるた
め、赤血球同時発生シグナルがこれらの白血球シグナル
をマスクし、適切に分類されないことがある。したがっ
て、全血試料においては赤血球および血小板とは別に白
血球を分析する必要がある。通常、これは、まず赤血球
を溶解し、次いで残った血小板および白血球を分析する
ことによって行われる。
テムでは、赤血球、血小板、および白血球は、別個のシ
グナル検出領域、すなわち集団を占有する。しかしなが
ら、赤血球同時発生シグナルは、好中球、好酸球、ある
場合には単球と同じシグナル検出領域を占有する。全血
では、赤血球と白血球の比が通常５００対１であるた
め、赤血球同時発生シグナルがこれらの白血球シグナル
をマスクし、適切に分類されないことがある。したがっ
て、全血試料においては赤血球および血小板とは別に白
血球を分析する必要がある。通常、これは、まず赤血球
を溶解し、次いで残った血小板および白血球を分析する
ことによって行われる。
【００６５】対照的に、ＣＳＦなどの体液試料における
赤血球および血小板の数、ならびに白血球に対する赤血
球および血小板の相対濃度が小さいことは、通常１回の
分析サイクルにおける単一測定チャンネル内でこれらの
試料成分のすべてを計数し、かつ分類することを可能に
する。このような全血以外の試料における低濃度の赤血
球は、赤血球同時発生をほとんどまたはまったくもたら
さないため、好中球、好酸球、および単球はマスクされ
ない。
赤血球および血小板の数、ならびに白血球に対する赤血
球および血小板の相対濃度が小さいことは、通常１回の
分析サイクルにおける単一測定チャンネル内でこれらの
試料成分のすべてを計数し、かつ分類することを可能に
する。このような全血以外の試料における低濃度の赤血
球は、赤血球同時発生をほとんどまたはまったくもたら
さないため、好中球、好酸球、および単球はマスクされ
ない。
【００６６】上記に基づき、体液細胞分析、たとえばＣ
ＳＦ細胞分析に適した方法は、光学フロー・サイトメー
ターのセンシング・ゾーン（フロー・セル）を介する体
液試料中の細胞の一列縦隊通過（すなわち、実質的に１
度に１個の細胞）を含む。各細胞がフロー・セルに焦点
を合わせた単色光のビームを遮断するため、細胞の大き
さおよび屈折率に特有の形で光を散乱する。３種類の適
切に配置された検出器は、赤血球、リンパ球＋好塩基
球、単球、好中球、および好酸球、ならびに血小板の別
個の集団を形成する散乱／散乱スペースおよび散乱／吸
収スペースにシグナルを生じる。
ＳＦ細胞分析に適した方法は、光学フロー・サイトメー
ターのセンシング・ゾーン（フロー・セル）を介する体
液試料中の細胞の一列縦隊通過（すなわち、実質的に１
度に１個の細胞）を含む。各細胞がフロー・セルに焦点
を合わせた単色光のビームを遮断するため、細胞の大き
さおよび屈折率に特有の形で光を散乱する。３種類の適
切に配置された検出器は、赤血球、リンパ球＋好塩基
球、単球、好中球、および好酸球、ならびに血小板の別
個の集団を形成する散乱／散乱スペースおよび散乱／吸
収スペースにシグナルを生じる。
【００６７】本発明の方法を実施する際に用いることが
できる、または使用に適応させることができる現在の自
動分析装置およびフロー・サイトメーター分析装置シス
テムには、Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔａ
ｒｒｙｔｏｗｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから市販されている
ＢＡＹＥＲ Ｈ*（商標）シリーズの自動血液分析装
置、たとえばＢＡＹＥＲ Ｈ*３（商標）分析装置およ
びＡＤＶＩＡ １２０分析装置が含まれる。このような
分析装置機器は、細胞検出ならびに細胞パラメータの定
量的および定性的分析のための散乱／散乱および散乱／
吸収システムと一緒に使用するのに適している。このよ
うな分析装置の非限定的説明は、特許文献１４、特許文
献８、特許文献５および特許文献１０に見いだされ、こ
れらの内容の全体を参照により本明細書に組み込む。適
切なハードウェアおよびシステム・コンポーネントを有
するその他の血液分析装置システムを本発明に従って使
用し、または使用に適応させることができることは理解
されるであろう。
できる、または使用に適応させることができる現在の自
動分析装置およびフロー・サイトメーター分析装置シス
テムには、Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔａ
ｒｒｙｔｏｗｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋから市販されている
ＢＡＹＥＲ Ｈ*（商標）シリーズの自動血液分析装
置、たとえばＢＡＹＥＲ Ｈ*３（商標）分析装置およ
びＡＤＶＩＡ １２０分析装置が含まれる。このような
分析装置機器は、細胞検出ならびに細胞パラメータの定
量的および定性的分析のための散乱／散乱および散乱／
吸収システムと一緒に使用するのに適している。このよ
うな分析装置の非限定的説明は、特許文献１４、特許文
献８、特許文献５および特許文献１０に見いだされ、こ
れらの内容の全体を参照により本明細書に組み込む。適
切なハードウェアおよびシステム・コンポーネントを有
するその他の血液分析装置システムを本発明に従って使
用し、または使用に適応させることができることは理解
されるであろう。
【００６８】本発明による低い試料希釈は、手動測定に
比べてより多数の細胞が計数され、より正確かつ詳細な
結果を得ることを可能にする。性能仕様書は、ＣＳＦソ
フトウェアを組み込んだＡＤＶＩＡ １２０自動システ
ムで行われる正常および異常ＣＳＦ試料に基づいてい
る。試料を含む試薬混合物は、ＣＳＦ分析のための分析
サイクルおよびユーティリティ・サイクルを用い、ＡＤ
ＶＩＡ １２０血液分析装置のダイレクト・サイトメト
リー水圧経路を介して吸引する。ＣＳＦ分析サイクル
は、最小容積の調製試料の吸引を可能にする。ユーティ
リティ・サイクル（リフレッシュおよび洗浄）は、流体
経路の清浄度を維持する画期的な水圧サイクルである。
通常、ＡＤＶＩＡ １２０分析装置は、そのコンピュー
タ・コンポーネントを介し、吸引された試薬混合物の試
料成分からＲＢＣおよびＷＢＣの絶対数、およびＷＢＣ
分画パラメータ値を算出する。場合により、各細胞の容
積および乾燥質量濃度ならびにこれらのパラメータの平
均値および比を記録することができる。
比べてより多数の細胞が計数され、より正確かつ詳細な
結果を得ることを可能にする。性能仕様書は、ＣＳＦソ
フトウェアを組み込んだＡＤＶＩＡ １２０自動システ
ムで行われる正常および異常ＣＳＦ試料に基づいてい
る。試料を含む試薬混合物は、ＣＳＦ分析のための分析
サイクルおよびユーティリティ・サイクルを用い、ＡＤ
ＶＩＡ １２０血液分析装置のダイレクト・サイトメト
リー水圧経路を介して吸引する。ＣＳＦ分析サイクル
は、最小容積の調製試料の吸引を可能にする。ユーティ
リティ・サイクル（リフレッシュおよび洗浄）は、流体
経路の清浄度を維持する画期的な水圧サイクルである。
通常、ＡＤＶＩＡ １２０分析装置は、そのコンピュー
タ・コンポーネントを介し、吸引された試薬混合物の試
料成分からＲＢＣおよびＷＢＣの絶対数、およびＷＢＣ
分画パラメータ値を算出する。場合により、各細胞の容
積および乾燥質量濃度ならびにこれらのパラメータの平
均値および比を記録することができる。
【００６９】アッセイ中にこの機器により分析されるＣ
ＳＦ試料の容積は、血球計におけるＣＳＦの顕微鏡検査
により通常分析される量の３．７倍である。したがっ
て、本発明は、計数精度にＳＱＲＴ３．７倍の改善をも
たらす。
ＳＦ試料の容積は、血球計におけるＣＳＦの顕微鏡検査
により通常分析される量の３．７倍である。したがっ
て、本発明は、計数精度にＳＱＲＴ３．７倍の改善をも
たらす。
【００７０】別の実施形態では、全自動法が本発明によ
り企図されている。全自動法は、吸引に続く機器におけ
る一定量の体液試料と試薬組成物の自動混合および自動
分析装置によるアッセイの実行を含む。このような全自
動アッセイは、オペレータによる手動操作の必要性を取
り除くことにより効率を高める。しかしながら、試料を
約４時間以上保存しなければならない場合には、半自動
法が好ましく、それは細胞固定により試料の変質を防ぐ
ためであることは理解されるであろう。
り企図されている。全自動法は、吸引に続く機器におけ
る一定量の体液試料と試薬組成物の自動混合および自動
分析装置によるアッセイの実行を含む。このような全自
動アッセイは、オペレータによる手動操作の必要性を取
り除くことにより効率を高める。しかしながら、試料を
約４時間以上保存しなければならない場合には、半自動
法が好ましく、それは細胞固定により試料の変質を防ぐ
ためであることは理解されるであろう。
【００７１】本発明のＣＳＦ試薬は、試料中のどの細胞
も球状化しかつ固定する試薬化合物を含む。適当な試薬
性能を検証するために、各試料または試料の各バッチ
（たとえば、ＣＳＦ試料）をアッセイする前に品質管理
（ＱＣ）品をアッセイすることが好ましい。ＣＳＦアッ
セイは、ＣＳＦソフトウェアを利用できる利用者にのみ
利用できることが好ましい。選択的利用可能性のさまざ
まな手段には、たとえば、試薬バー・コード、ウィザー
ド・キー、またはスマート・カードが含まれる。
も球状化しかつ固定する試薬化合物を含む。適当な試薬
性能を検証するために、各試料または試料の各バッチ
（たとえば、ＣＳＦ試料）をアッセイする前に品質管理
（ＱＣ）品をアッセイすることが好ましい。ＣＳＦアッ
セイは、ＣＳＦソフトウェアを利用できる利用者にのみ
利用できることが好ましい。選択的利用可能性のさまざ
まな手段には、たとえば、試薬バー・コード、ウィザー
ド・キー、またはスマート・カードが含まれる。
【００７２】ＡＤＶＩＡ １２０機器が半自動または全
自動ＣＳＦアッセイを行う具体的な実施形態では、自動
分析装置は、本明細書に記載の試料分析に関係するいく
つかのサイクルを行う。ダイレクト・サイトメトリー分
析、好ましくは本発明による半自動分析の場合には、体
液試料、たとえば髄液試料の導入をシステムによる分析
のためにオープン・チューブ吸引によって行う。オペレ
ータは、吸引プローブを調製試料中に入れ、システムの
前部にある吸引パッドを押し下げることにより吸引を始
める。ＣＳＦ分析サイクルには、試料導入（ｓｈｕｔｔ
ｌｅ）、計数および洗浄の３段階がある。
自動ＣＳＦアッセイを行う具体的な実施形態では、自動
分析装置は、本明細書に記載の試料分析に関係するいく
つかのサイクルを行う。ダイレクト・サイトメトリー分
析、好ましくは本発明による半自動分析の場合には、体
液試料、たとえば髄液試料の導入をシステムによる分析
のためにオープン・チューブ吸引によって行う。オペレ
ータは、吸引プローブを調製試料中に入れ、システムの
前部にある吸引パッドを押し下げることにより吸引を始
める。ＣＳＦ分析サイクルには、試料導入（ｓｈｕｔｔ
ｌｅ）、計数および洗浄の３段階がある。
【００７３】試料導入段階の間、バキューム・シャトル
・チャンバー（ＶＳＣ）のベント・バルブおよび廃液バ
ルブがほぼ同時に開き、シャトル・チャンバー内に留ま
っている残った液体をすべてパージする。次いで、ＶＳ
Ｃのベント・ポートが閉じ、ＶＳＣの試料入口が開き、
ＲＢＣダイレクト・サイトメトリー・バルブが開き、シ
ステム真空はＲＢＣダイレクト・サイトメトリー・ライ
ンを通って試料を引き上げる。試料は、Ｕｎｉｆｉｅｄ
Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｉｒｃｕｉｔ（ＵＦＣ）を速や
かに通過してＲＢＣコンセントリック・フロー・モジュ
ール（ＣＦＭ）の試料ラインに入り、ＣＦＭシャトル・
ポートからＵＦＣ内のシャトル・チャンバーに達する。
試料が導入されている間は、プランジャーが下がるごと
に正確な量の試料が試料ポンプ中に引き入れられる。
・チャンバー（ＶＳＣ）のベント・バルブおよび廃液バ
ルブがほぼ同時に開き、シャトル・チャンバー内に留ま
っている残った液体をすべてパージする。次いで、ＶＳ
Ｃのベント・ポートが閉じ、ＶＳＣの試料入口が開き、
ＲＢＣダイレクト・サイトメトリー・バルブが開き、シ
ステム真空はＲＢＣダイレクト・サイトメトリー・ライ
ンを通って試料を引き上げる。試料は、Ｕｎｉｆｉｅｄ
Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｉｒｃｕｉｔ（ＵＦＣ）を速や
かに通過してＲＢＣコンセントリック・フロー・モジュ
ール（ＣＦＭ）の試料ラインに入り、ＣＦＭシャトル・
ポートからＵＦＣ内のシャトル・チャンバーに達する。
試料が導入されている間は、プランジャーが下がるごと
に正確な量の試料が試料ポンプ中に引き入れられる。
【００７４】計数段階は、ＲＢＣ Ｓｈｅａｔｈバルブ
およびフロー・セル出口バルブが開くと共に始まり、シ
ース・ポンプが同時に下がる間に試料ポンプが押し上げ
られる。この効果は、一定速度で試料を引き上げ、ＣＦ
Ｍおよびフロー・セルを介して収めることである。試料
がフロー・セルを通過する間に試料中の細胞によって発
生するシグナルを取得する。試料計数が終わると、ＲＢ
Ｃ Ｓｈｅａｔｈバルブおよびフロー・セル出口バルブ
が閉じ、ＲＢＣ Ｓｈｅａｔｈ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｗａ
ｓｔｅバルブが開く。次いで、シース・シリンジが押し
上げ、分析済みの液体を廃棄物に送る。直ちに洗浄段階
が続き、試料ラインを通じて洗浄溶液（たとえば、特許
文献１５に記載の万能洗浄試薬溶液）を押し、次の試料
を調製するために乾燥する。
およびフロー・セル出口バルブが開くと共に始まり、シ
ース・ポンプが同時に下がる間に試料ポンプが押し上げ
られる。この効果は、一定速度で試料を引き上げ、ＣＦ
Ｍおよびフロー・セルを介して収めることである。試料
がフロー・セルを通過する間に試料中の細胞によって発
生するシグナルを取得する。試料計数が終わると、ＲＢ
Ｃ Ｓｈｅａｔｈバルブおよびフロー・セル出口バルブ
が閉じ、ＲＢＣ Ｓｈｅａｔｈ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｗａ
ｓｔｅバルブが開く。次いで、シース・シリンジが押し
上げ、分析済みの液体を廃棄物に送る。直ちに洗浄段階
が続き、試料ラインを通じて洗浄溶液（たとえば、特許
文献１５に記載の万能洗浄試薬溶液）を押し、次の試料
を調製するために乾燥する。
【００７５】ＣＳＦ分析サイクルの他に、自動ＣＳＦア
ッセイと一緒に使用するために他の２種類のサイクルを
開発した。ＣＳＦリフレッシュ・サイクルは、調製試料
の吸引前にシステムの清浄度を保証するためフロー・セ
ル中のバックグラウンド数を読み取るように設計した。
オペレータから依頼された場合には、ＣＳＦリフレッシ
ュ・サイクルは、ＵＦＣブロック内のすべての反応チャ
ンバー中に洗浄液を入れ、分析装置の前部経路（すなわ
ち、吸引プローブ、試料シヤー・バルブおよび関連ライ
ン）を洗浄し乾燥する。次いで、ＣＳＦ分析サイクルの
計数段階に記載した同じ技法を用い、システムはフロー
・セルを介して洗浄液を吸引し、フロー・セルを通過す
る液体の計数値を得る。
ッセイと一緒に使用するために他の２種類のサイクルを
開発した。ＣＳＦリフレッシュ・サイクルは、調製試料
の吸引前にシステムの清浄度を保証するためフロー・セ
ル中のバックグラウンド数を読み取るように設計した。
オペレータから依頼された場合には、ＣＳＦリフレッシ
ュ・サイクルは、ＵＦＣブロック内のすべての反応チャ
ンバー中に洗浄液を入れ、分析装置の前部経路（すなわ
ち、吸引プローブ、試料シヤー・バルブおよび関連ライ
ン）を洗浄し乾燥する。次いで、ＣＳＦ分析サイクルの
計数段階に記載した同じ技法を用い、システムはフロー
・セルを介して洗浄液を吸引し、フロー・セルを通過す
る液体の計数値を得る。
【００７６】ＣＳＦ洗浄サイクルは、ダイレクト・サイ
トメトリー・ラインおよびバルブに具体的に対処する追
加のクリーニング・サイクルを提供するように設計す
る。開始すると、システムは、ＲＢＣ Ｓｈｅａｔｈラ
インならびにＲＢＣおよびＰｅｒｏｘダイレクト・サイ
トメトリー・バルブを開く。サイクルが進行するにつ
れ、ダイレクト・サイトメトリー経路を介し、Ｐｅｒｏ
ｘチャンバー中にＣＦＭ試料ラインを通して洗浄液を逆
流置換（ｂａｃｋ ｆｌｕｓｈ）する。Ｐｅｒｏｘ廃液
バルブが開き、逆流置換した流出液を効率的に廃液に引
き込む。
トメトリー・ラインおよびバルブに具体的に対処する追
加のクリーニング・サイクルを提供するように設計す
る。開始すると、システムは、ＲＢＣ Ｓｈｅａｔｈラ
インならびにＲＢＣおよびＰｅｒｏｘダイレクト・サイ
トメトリー・バルブを開く。サイクルが進行するにつ
れ、ダイレクト・サイトメトリー経路を介し、Ｐｅｒｏ
ｘチャンバー中にＣＦＭ試料ラインを通して洗浄液を逆
流置換（ｂａｃｋ ｆｌｕｓｈ）する。Ｐｅｒｏｘ廃液
バルブが開き、逆流置換した流出液を効率的に廃液に引
き込む。
【００７７】全自動分析の場合には、ＡＤＶＩＡ １２
０の試料プローブ中にそのままのＣＳＦ試料を直接吸引
し、同容積の球状化／固定試薬による希釈は内部で起き
る。
０の試料プローブ中にそのままのＣＳＦ試料を直接吸引
し、同容積の球状化／固定試薬による希釈は内部で起き
る。
【００７８】本発明の半自動実施形態のためのＣＳＦ試
料調製は、本発明のＣＳＦ試薬によりＣＳＦ試料を手動
希釈するものである。ＣＳＦ試料の外観が反映するＣＳ
Ｆ試料の細胞密度は、ＣＳＦ試料と使用するＣＳＦ試薬
の比を決定する。たとえば、多数の赤血球を含有する試
料は、淡紅色から赤色に見え、多数の白血球を含有する
試料は、白っぽく不透明に見えるはずである。これらの
試料は、作業溶液で１：１に希釈する前の予備希釈を必
要とし、これに比べ、比較的少ない細胞を含有する透明
で無色の試料は予備希釈を必要としない。約５分間の最
小インキュベーション時間の後、調製試料をＣＳＦモー
ドのＡＤＶＩＡ １２０分析装置で分析する。自動分
析、たとえば半自動法による分析のために調製されたＣ
ＳＦ試料は、室温または４℃で約５分から約４時間安定
である。
料調製は、本発明のＣＳＦ試薬によりＣＳＦ試料を手動
希釈するものである。ＣＳＦ試料の外観が反映するＣＳ
Ｆ試料の細胞密度は、ＣＳＦ試料と使用するＣＳＦ試薬
の比を決定する。たとえば、多数の赤血球を含有する試
料は、淡紅色から赤色に見え、多数の白血球を含有する
試料は、白っぽく不透明に見えるはずである。これらの
試料は、作業溶液で１：１に希釈する前の予備希釈を必
要とし、これに比べ、比較的少ない細胞を含有する透明
で無色の試料は予備希釈を必要としない。約５分間の最
小インキュベーション時間の後、調製試料をＣＳＦモー
ドのＡＤＶＩＡ １２０分析装置で分析する。自動分
析、たとえば半自動法による分析のために調製されたＣ
ＳＦ試料は、室温または４℃で約５分から約４時間安定
である。
【００７９】好ましい態様では、ＡＤＶＩＡ １２０分
析装置は、システムと一体の部分として、ＣＳＦアッセ
イにおける試料を処理しかつ分析するように構成され
る。一般的には、市販のＷｉｎＭＤＩソフトウェア・パ
ッケージ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使
用し、ＣＳＦ試料分析を行うことができるようにＡＤＩ
ＶＡ １２０システムでフロー・サイトメトリー・デー
タを分析する。ＣＳＦ試料は、ＣＳＦモードの臨床用Ａ
ＤＶＩＡ １２０ソフトウェアで処理する。ＣＳＦ試料
は、ＭａｎｕａｌＯｐｅｎ Ｔｕｂｅ（ＭＯＴ）サンプ
ラーから単独またはバッチ式で分析することができる。
ＣＳＦ患者試料の身体的特徴は、コード化されたコメン
トとして機器に入力される。Ｂａｙｅｒ ＡＤＶＩＡ
１２０機器は、新たなＣＳＦ試料を分析するごとに新た
なＣＳＦ Ｒｕｎ Ｓｃｒｅｅｎを提供する。ＣＳＦ試
料は、それぞれ個別に単位の選択肢を有しており、すな
わち細胞数は、個／μＬまたは個／Ｌの単位で記録する
ことができる。ＣＳＦソフトウェアが入ったコンピュー
タへのアクセスは、たとえば、スマート・カード、ウィ
ザード、バー・コードまたはキーによって提供すること
ができる。
析装置は、システムと一体の部分として、ＣＳＦアッセ
イにおける試料を処理しかつ分析するように構成され
る。一般的には、市販のＷｉｎＭＤＩソフトウェア・パ
ッケージ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使
用し、ＣＳＦ試料分析を行うことができるようにＡＤＩ
ＶＡ １２０システムでフロー・サイトメトリー・デー
タを分析する。ＣＳＦ試料は、ＣＳＦモードの臨床用Ａ
ＤＶＩＡ １２０ソフトウェアで処理する。ＣＳＦ試料
は、ＭａｎｕａｌＯｐｅｎ Ｔｕｂｅ（ＭＯＴ）サンプ
ラーから単独またはバッチ式で分析することができる。
ＣＳＦ患者試料の身体的特徴は、コード化されたコメン
トとして機器に入力される。Ｂａｙｅｒ ＡＤＶＩＡ
１２０機器は、新たなＣＳＦ試料を分析するごとに新た
なＣＳＦ Ｒｕｎ Ｓｃｒｅｅｎを提供する。ＣＳＦ試
料は、それぞれ個別に単位の選択肢を有しており、すな
わち細胞数は、個／μＬまたは個／Ｌの単位で記録する
ことができる。ＣＳＦソフトウェアが入ったコンピュー
タへのアクセスは、たとえば、スマート・カード、ウィ
ザード、バー・コードまたはキーによって提供すること
ができる。
【００８０】本発明のＣＳＦアッセイにより測定される
パラメータを表３に示す。
パラメータを表３に示す。
【表３】
【００８１】半自動ＣＳＦ法では、分析装置は、ＣＳＦ
試料に対し、ＷＢＣ数、ＲＢＣ数、および４要素のＷＢ
Ｃ分画を実行する。この方法は、１時間当たり１２０試
料までの試料スループットを可能にする。体液を分析す
るための本半自動法は、アッセイ性能において、および
顧客にとって多くの利点を提供する。ＣＳＦなどの体液
のアッセイの自動化は、手動法を用いて得られる結果に
比べて著しく早く得られる結果を提供する。たとえば、
本発明による半自動アッセイ結果は１時間当たり約６０
から１２０試料の割合で得られるが、完全に手動のアッ
セイ結果は、１時間当たり１から２試料の割合で得られ
る。
試料に対し、ＷＢＣ数、ＲＢＣ数、および４要素のＷＢ
Ｃ分画を実行する。この方法は、１時間当たり１２０試
料までの試料スループットを可能にする。体液を分析す
るための本半自動法は、アッセイ性能において、および
顧客にとって多くの利点を提供する。ＣＳＦなどの体液
のアッセイの自動化は、手動法を用いて得られる結果に
比べて著しく早く得られる結果を提供する。たとえば、
本発明による半自動アッセイ結果は１時間当たり約６０
から１２０試料の割合で得られるが、完全に手動のアッ
セイ結果は、１時間当たり１から２試料の割合で得られ
る。
【００８２】さらに、半自動法が必要とするオペレータ
の技術は、手動の細胞計数に必要とされる技術より少な
い。細胞数、分画百分率および絶対数の一巡時間がより
早いのは、これらの値およびパラメータが自動的に計算
されるためである。エンド・ユーザは、仕事の減少、材
料のコスト、検査室効率の改善および一巡時間の短縮の
恩恵を受ける。さらに、この方法は、患者結果の確度お
よび精度の向上を提供し、患者結果をより早く医師に報
告することができる。労働時間も、たとえば、１試料に
つき少なくとも約２０分は短縮される。
の技術は、手動の細胞計数に必要とされる技術より少な
い。細胞数、分画百分率および絶対数の一巡時間がより
早いのは、これらの値およびパラメータが自動的に計算
されるためである。エンド・ユーザは、仕事の減少、材
料のコスト、検査室効率の改善および一巡時間の短縮の
恩恵を受ける。さらに、この方法は、患者結果の確度お
よび精度の向上を提供し、患者結果をより早く医師に報
告することができる。労働時間も、たとえば、１試料に
つき少なくとも約２０分は短縮される。
【００８３】本発明の別の態様は、ＣＳＦアッセイ・テ
スト・キットおよび他の体液をアッセイするためのテス
ト・キットを包含する。ＣＳＦキットには、設定サイク
ル数決定のための本発明による試薬組成物を含む試薬瓶
および、場合によるが、好ましくは、自動分析装置機器
でＣＳＦ試料または対照を処理するためのソフトウェア
・アクセスを可能にするスマート・カード、バー・コー
ドまたはキーが含まれることが好ましい。テスト・キッ
トは、たとえば対照試料および／または患者のＣＳＦ試
料を処理する約２５回のＣＳＦテスト用に十分な容積の
試薬組成物と一緒に包装されていることが好ましい。
スト・キットおよび他の体液をアッセイするためのテス
ト・キットを包含する。ＣＳＦキットには、設定サイク
ル数決定のための本発明による試薬組成物を含む試薬瓶
および、場合によるが、好ましくは、自動分析装置機器
でＣＳＦ試料または対照を処理するためのソフトウェア
・アクセスを可能にするスマート・カード、バー・コー
ドまたはキーが含まれることが好ましい。テスト・キッ
トは、たとえば対照試料および／または患者のＣＳＦ試
料を処理する約２５回のＣＳＦテスト用に十分な容積の
試薬組成物と一緒に包装されていることが好ましい。
【００８４】ＣＳＦ対照がテスト・キットの一部であっ
てもよく、あるいは対照は別個のキットとしてもよい。
ＣＳＦ対照については、テスト・キットとは別の対照キ
ット、２つの細胞数レベルで値が割り当てられたＣＳＦ
対照製品が含まれていることが好ましい。この２つの細
胞数対照は、２つの細胞数レベル、約１００ＷＢＣ／μ
Ｌの高対照および約１０ＷＢＣ／μＬの低対照を含む。
また、ＣＳＦ対照は、本発明による試薬組成物を含むこ
とが好ましい。
てもよく、あるいは対照は別個のキットとしてもよい。
ＣＳＦ対照については、テスト・キットとは別の対照キ
ット、２つの細胞数レベルで値が割り当てられたＣＳＦ
対照製品が含まれていることが好ましい。この２つの細
胞数対照は、２つの細胞数レベル、約１００ＷＢＣ／μ
Ｌの高対照および約１０ＷＢＣ／μＬの低対照を含む。
また、ＣＳＦ対照は、本発明による試薬組成物を含むこ
とが好ましい。
【００８５】さらに、ＣＳＦ対照品は、ロット番号、目
的値、許容できる範囲および有効期限などを各パラメー
タおよび各レベルについて提供する読みやすい（オペレ
ータにより）添付文書を含むことが好ましい。また、本
発明には、ユーザがシステムのバー・コード・リーダー
でバー・コードをスキャンでき、その後、適切な値（た
とえば、目標値、範囲など）が分析装置のＱＣファイル
中へ自動的に入力されるように、バー・コードを付けら
れた情報も包含される。また、キットには使用説明書が
含まれることが好ましい。
的値、許容できる範囲および有効期限などを各パラメー
タおよび各レベルについて提供する読みやすい（オペレ
ータにより）添付文書を含むことが好ましい。また、本
発明には、ユーザがシステムのバー・コード・リーダー
でバー・コードをスキャンでき、その後、適切な値（た
とえば、目標値、範囲など）が分析装置のＱＣファイル
中へ自動的に入力されるように、バー・コードを付けら
れた情報も包含される。また、キットには使用説明書が
含まれることが好ましい。
【００８６】本発明の、ＡＤＶＩＡ １２０自動分析装
置を用いて行うことが好ましいＣＳＦアッセイは、臨床
的確度も相対的確度も提供する。ＣＳＦ試料におけるＡ
ＤＶＩＡ １２０ＷＢＣ数を、基準手動数と比較する。
正常試料は、１μＬ当たり約０〜５個のＷＢＣ細胞を含
む試料と定義され、異常試料は、通常１μＬ当たり約５
個を超えるＷＢＣ細胞を含む試料と定義される。５４個
の正常試料および２６個の異常ＣＳＦ試料を使い基準方
法によって測定した研究は、ＡＤＶＩＡ １２０機器が
９５％以上の感度および８５％以上の特異性を有してい
ることを示した（実施例５）。多くの試料で計数される
細胞が、特に基準手動数では極めて少数であるため、統
計学的理由のみからもこのアッセイの性能は最適である
と考えられることは理解されるであろう。
置を用いて行うことが好ましいＣＳＦアッセイは、臨床
的確度も相対的確度も提供する。ＣＳＦ試料におけるＡ
ＤＶＩＡ １２０ＷＢＣ数を、基準手動数と比較する。
正常試料は、１μＬ当たり約０〜５個のＷＢＣ細胞を含
む試料と定義され、異常試料は、通常１μＬ当たり約５
個を超えるＷＢＣ細胞を含む試料と定義される。５４個
の正常試料および２６個の異常ＣＳＦ試料を使い基準方
法によって測定した研究は、ＡＤＶＩＡ １２０機器が
９５％以上の感度および８５％以上の特異性を有してい
ることを示した（実施例５）。多くの試料で計数される
細胞が、特に基準手動数では極めて少数であるため、統
計学的理由のみからもこのアッセイの性能は最適である
と考えられることは理解されるであろう。
【００８７】実施例
以下の実施例は、本発明を例示するための本発明の具体
的態様について記載し、当業者に本方法の説明を提供し
ている。これらの実施例は、本発明の理解および実施に
有用な具体的方法およびそのさまざまな態様を提供して
いるにすぎないことから、本発明を限定していると解釈
すべきではない。
的態様について記載し、当業者に本方法の説明を提供し
ている。これらの実施例は、本発明の理解および実施に
有用な具体的方法およびそのさまざまな態様を提供して
いるにすぎないことから、本発明を限定していると解釈
すべきではない。
【００８８】実施例１
本発明によるＣＳＦ試料の分析
図１１Ａ〜Ｈに示すサイトグラムは、病院検査室から得
られたＣＳＦ試料の分析から得られた結果を示してい
る。試料は、２時間以内に分析用として受領した。ＣＳ
Ｆ試料は、試料０．５ｍＬを本発明によるＣＳＦ試薬
０．５ｍＬに添加することにより調製した。試料および
試薬組成物の混合物を室温で５分インキュベートし、ダ
イレクト・サイトメトリー・モードのＡＤＶＩＡ １２
０自動分析装置に吸引した。試料取得からの生データ・
ファイルをＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｎｄ
ａｒｄ（ＦＣＳ）フォーマットに変換し、ＷｉｎＭＤＩ
ソフトウェアを用いてオフラインで分析した。図１１Ａ
は、正常でほぼ無細胞のＣＳＦ試料の分析結果を示して
いる。図１１Ｂは、図１１Ａに関連するＡＤＶＩＡ １
２０自動結果および基準手動ＣＳＦ結果を示している。
図１１Ｃは、ＷＢＣ数の少ない試料の分析結果を示して
いる。図１１Ｄは、図１１Ｃに関連するＡＤＶＩＡ １
２０自動結果および基準手動ＣＳＦ結果を示している。
図１１Ｅは、約２０ＷＢＣのレベルでＷＢＣを含む試料
の分析結果を示している。図１１Ｆは、図１１Ｅに関連
するＡＤＶＩＡ １２０自動結果および基準手動ＣＳＦ
結果を示している。図１１Ｇは、約１００ＷＢＣ／μＬ
のレベルの試料の分析結果を示している。図１１Ｈは、
図１１Ｇに関連するＡＤＶＩＡ １２０自動結果および
基準手動ＣＳＦ結果を示している。自動および手動値の
比較は、２つの方法間の良好な一致を示している。
られたＣＳＦ試料の分析から得られた結果を示してい
る。試料は、２時間以内に分析用として受領した。ＣＳ
Ｆ試料は、試料０．５ｍＬを本発明によるＣＳＦ試薬
０．５ｍＬに添加することにより調製した。試料および
試薬組成物の混合物を室温で５分インキュベートし、ダ
イレクト・サイトメトリー・モードのＡＤＶＩＡ １２
０自動分析装置に吸引した。試料取得からの生データ・
ファイルをＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｎｄ
ａｒｄ（ＦＣＳ）フォーマットに変換し、ＷｉｎＭＤＩ
ソフトウェアを用いてオフラインで分析した。図１１Ａ
は、正常でほぼ無細胞のＣＳＦ試料の分析結果を示して
いる。図１１Ｂは、図１１Ａに関連するＡＤＶＩＡ １
２０自動結果および基準手動ＣＳＦ結果を示している。
図１１Ｃは、ＷＢＣ数の少ない試料の分析結果を示して
いる。図１１Ｄは、図１１Ｃに関連するＡＤＶＩＡ １
２０自動結果および基準手動ＣＳＦ結果を示している。
図１１Ｅは、約２０ＷＢＣのレベルでＷＢＣを含む試料
の分析結果を示している。図１１Ｆは、図１１Ｅに関連
するＡＤＶＩＡ １２０自動結果および基準手動ＣＳＦ
結果を示している。図１１Ｇは、約１００ＷＢＣ／μＬ
のレベルの試料の分析結果を示している。図１１Ｈは、
図１１Ｇに関連するＡＤＶＩＡ １２０自動結果および
基準手動ＣＳＦ結果を示している。自動および手動値の
比較は、２つの方法間の良好な一致を示している。
【００８９】実施例２
確度の結果
取得した８０個のＣＳＦ試料について、本発明の方法お
よびＡＤＶＩＡ １２０自動分析装置を用いて得られた
データを基準手動値と比較した。下表４は、８０個のＣ
ＳＦ試料について得られたＲＢＣ、ＷＢＣおよびＷＢＣ
分画の絶対値を比較するための回帰統計を要約してい
る。すべてのＣＳＦ試料を以下のように調製した。ＣＳ
Ｆ試料は、試料０．５ｍＬを本発明によるＣＳＦ試薬
０．５ｍＬに添加することにより調製した。試料および
試薬混合物を室温で５分インキュベートし、ダイレクト
・サイトメトリー・モードのＡＤＶＩＡ １２０自動分
析装置に吸引した。試料取得からの生データ・ファイル
をＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ
（ＦＣＳ）フォーマットに変換し、ＷｉｎＭＤＩソフト
ウェアを用いてオフラインで分析した。
よびＡＤＶＩＡ １２０自動分析装置を用いて得られた
データを基準手動値と比較した。下表４は、８０個のＣ
ＳＦ試料について得られたＲＢＣ、ＷＢＣおよびＷＢＣ
分画の絶対値を比較するための回帰統計を要約してい
る。すべてのＣＳＦ試料を以下のように調製した。ＣＳ
Ｆ試料は、試料０．５ｍＬを本発明によるＣＳＦ試薬
０．５ｍＬに添加することにより調製した。試料および
試薬混合物を室温で５分インキュベートし、ダイレクト
・サイトメトリー・モードのＡＤＶＩＡ １２０自動分
析装置に吸引した。試料取得からの生データ・ファイル
をＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ
（ＦＣＳ）フォーマットに変換し、ＷｉｎＭＤＩソフト
ウェアを用いてオフラインで分析した。
【表４】
*端数を切り上げたＲＢＣ値；ＮＡ：該当せず
Ｓｙｘ、「推定の標準誤差」は、データ・ポイントが回
帰直線の周りに集まる程度である。ポイントが直線に近
ければ近いほど推定の標準誤差は小さく、比較されてい
る２つの方法間の一致は良好である。
帰直線の周りに集まる程度である。ポイントが直線に近
ければ近いほど推定の標準誤差は小さく、比較されてい
る２つの方法間の一致は良好である。
【００９０】図４は、本実施例に記載の実験から得られ
たＷＢＣ結果を示し、８０個のＣＳＦ試料について、Ｗ
ＢＣ数の手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分析装置で
行った本発明によるＣＳＦアッセイの結果との相関を示
している。図４および以下に記載の図では、すべてのＣ
ＳＦ試料は、前述の通りに調製した。
たＷＢＣ結果を示し、８０個のＣＳＦ試料について、Ｗ
ＢＣ数の手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分析装置で
行った本発明によるＣＳＦアッセイの結果との相関を示
している。図４および以下に記載の図では、すべてのＣ
ＳＦ試料は、前述の通りに調製した。
【００９１】図５は、ＷＢＣ数が５個／μＬ以下の試料
について、ＷＢＣ数の手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２
０分析装置で行った本発明による本実施例に記載の実験
から得られたＣＳＦアッセイの結果との相関プロットを
示し、５２個のＣＳＦ試料についてのこのように低い数
の不正確さを反映する±２ＳＤを示している。
について、ＷＢＣ数の手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２
０分析装置で行った本発明による本実施例に記載の実験
から得られたＣＳＦアッセイの結果との相関プロットを
示し、５２個のＣＳＦ試料についてのこのように低い数
の不正確さを反映する±２ＳＤを示している。
【００９２】図６は、７４個のＣＳＦ試料における０か
ら１８４０のＲＢＣ数について、ＲＢＣ数の手動分析結
果とＡＤＶＩＡ １２０分析装置で行った本発明による
本実施例に記載の実験から得られたＣＳＦアッセイ結果
との相関プロットを示している。
ら１８４０のＲＢＣ数について、ＲＢＣ数の手動分析結
果とＡＤＶＩＡ １２０分析装置で行った本発明による
本実施例に記載の実験から得られたＣＳＦアッセイ結果
との相関プロットを示している。
【００９３】図７は、７８個のＣＳＦ試料における好中
球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分析
装置で行った本発明による本実施例に記載の実験から得
られたＣＳＦアッセイ結果との相関プロットを示してい
る。この試験における試料は、好中球と識別するのに十
分な好酸球を含んでいなかったため、このグラフは、多
形核（ＰＭＮ）球の総数を示している。
球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分析
装置で行った本発明による本実施例に記載の実験から得
られたＣＳＦアッセイ結果との相関プロットを示してい
る。この試験における試料は、好中球と識別するのに十
分な好酸球を含んでいなかったため、このグラフは、多
形核（ＰＭＮ）球の総数を示している。
【００９４】図８は、７８個のＣＳＦ試料におけるリン
パ球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分
析装置で行った本発明による本実施例に記載の実験から
得られたＣＳＦアッセイ結果との相関プロットを示して
いる。
パ球数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分
析装置で行った本発明による本実施例に記載の実験から
得られたＣＳＦアッセイ結果との相関プロットを示して
いる。
【００９５】図９は、７８個のＣＳＦ試料における単球
数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分析装
置で行った本発明による本実施例に記載の実験から得ら
れたＣＳＦアッセイ結果との相関プロットを示してい
る。
数について、手動分析結果とＡＤＶＩＡ １２０分析装
置で行った本発明による本実施例に記載の実験から得ら
れたＣＳＦアッセイ結果との相関プロットを示してい
る。
【００９６】図１０は、７８個のＣＳＦ試料における単
核球（リンパ球と単球）数について、手動分析結果とＡ
ＤＶＩＡ １２０分析装置で行った本発明による本実施
例に記載の実験から得られたＣＳＦアッセイ結果との相
関プロットを示している。
核球（リンパ球と単球）数について、手動分析結果とＡ
ＤＶＩＡ １２０分析装置で行った本発明による本実施
例に記載の実験から得られたＣＳＦアッセイ結果との相
関プロットを示している。
【００９７】実施例３
精度の結果
本実施例は、ＡＤＶＩＡ １２０自動分析装置で行った
本発明の方法を用い、２個ずつ取得した３１個の病院Ｃ
ＳＦ試料から得られた精度に関する結果を示す。下式を
用いて再現性について試料を評価した。 ［（ΣΔ2）／２ｎ］1/2 （ここで、ΣΔは、２個の試料間の差の合計であり、ｎ
は、試料数である。）標準偏差（ＳＤ）および％ＣＶ
（変動係数、（１００×（ＳＤ／平均））をＷＢＣ、Ｒ
ＢＣ、ＰＭＮおよびＭＮ細胞数について算出し、これら
を表５に示す。
本発明の方法を用い、２個ずつ取得した３１個の病院Ｃ
ＳＦ試料から得られた精度に関する結果を示す。下式を
用いて再現性について試料を評価した。 ［（ΣΔ2）／２ｎ］1/2 （ここで、ΣΔは、２個の試料間の差の合計であり、ｎ
は、試料数である。）標準偏差（ＳＤ）および％ＣＶ
（変動係数、（１００×（ＳＤ／平均））をＷＢＣ、Ｒ
ＢＣ、ＰＭＮおよびＭＮ細胞数について算出し、これら
を表５に示す。
【表５】
【００９８】実施例４
直線性の結果
０％、０．０５％、０．１％、０．２％、１％、１０％
および１００％の直線性プールを血小板に富む血漿試料
から作製した。これらの試料をＣＳＦ試薬で１：１に希
釈し、ダイレクト・サイトメトリー・モードのＡＤＶＩ
Ａ １２０サイトメトリー分析装置で分析した。表６Ａ
は、本実施例に記載の分析から得られた５個の複製につ
いてＷＢＣおよびＲＢＣの期待値に対する測定値を示し
ている。表６Ｂに示すように、最大偏差についての結果
は直線性規格の範囲内であった。
および１００％の直線性プールを血小板に富む血漿試料
から作製した。これらの試料をＣＳＦ試薬で１：１に希
釈し、ダイレクト・サイトメトリー・モードのＡＤＶＩ
Ａ １２０サイトメトリー分析装置で分析した。表６Ａ
は、本実施例に記載の分析から得られた５個の複製につ
いてＷＢＣおよびＲＢＣの期待値に対する測定値を示し
ている。表６Ｂに示すように、最大偏差についての結果
は直線性規格の範囲内であった。
【表６Ａ】
【表６Ｂ】
図１２Ａおよび１２Ｂは、ＷＢＣ（図１２Ａ）およびＲ
ＢＣ（図１２Ｂ）に関する回帰分析結果を示している。
測定されたように、実験的に得られた（観測された）細
胞数は、白血球および赤血球に関して期待値と一致して
いる。
ＢＣ（図１２Ｂ）に関する回帰分析結果を示している。
測定されたように、実験的に得られた（観測された）細
胞数は、白血球および赤血球に関して期待値と一致して
いる。
【００９９】実施例５
臨床的感度および特異性
ＷＢＣ数について真理値表解析を用いて臨床的感度およ
び特異性を算出し、１μＬ当たり５個を超えるＷＢＣの
値を陽性と見なした。表７は、分布分類に関して試料を
評価するための図式を示している。表８は、自動法およ
び基準手動法を用いて分析された８０個のＣＳＦ試料の
分布を示している。１μＬ当たり５個を超えるＷＢＣの
存在を、試料が異常として分類した。方法比較の結果を
表９に示す。試料分布から導かれる統計値は、２つの方
法間で良い一致を示す。この比較では７個の試料が偽陽
性として分類され（表７）、以下のように説明できるで
あろう。自動法は、手動法に比べより大容積の試料およ
びより多くの細胞を計数するため、細胞事象を検出する
際には手動法よりも正確である。
び特異性を算出し、１μＬ当たり５個を超えるＷＢＣの
値を陽性と見なした。表７は、分布分類に関して試料を
評価するための図式を示している。表８は、自動法およ
び基準手動法を用いて分析された８０個のＣＳＦ試料の
分布を示している。１μＬ当たり５個を超えるＷＢＣの
存在を、試料が異常として分類した。方法比較の結果を
表９に示す。試料分布から導かれる統計値は、２つの方
法間で良い一致を示す。この比較では７個の試料が偽陽
性として分類され（表７）、以下のように説明できるで
あろう。自動法は、手動法に比べより大容積の試料およ
びより多くの細胞を計数するため、細胞事象を検出する
際には手動法よりも正確である。
【表７】
上表７において：
ＴＰ（真陽性）＝両方法が異常で一致した試料数
ＴＮ（真陰性）＝両方法の正常で一致した試料数
ＦＮ（偽陰性）＝基準法により異常と、および試験方法
により正常と判断された試料数 ＦＰ（偽陰性）＝基準法により正常と、および試験方法
により異常と判断された試料数 真理値表計算 ・一致率＝（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋Ｆ
Ｎ）×１００％ ・偽陰性率＝ＦＮ／（ＦＮ＋ＴＰ）×１００％ ・偽陽性率＝ＦＰ／（ＦＰ＋ＴＮ）×１００％ ・感度％＝（１００−ＦＮ率）＝異常のある試料におけ
る正確な判定の割合 ・特異性％＝（１００−ＦＰ率）＝異常のない試料にお
ける正確な判定の割合
により正常と判断された試料数 ＦＰ（偽陰性）＝基準法により正常と、および試験方法
により異常と判断された試料数 真理値表計算 ・一致率＝（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋Ｆ
Ｎ）×１００％ ・偽陰性率＝ＦＮ／（ＦＮ＋ＴＰ）×１００％ ・偽陽性率＝ＦＰ／（ＦＰ＋ＴＮ）×１００％ ・感度％＝（１００−ＦＮ率）＝異常のある試料におけ
る正確な判定の割合 ・特異性％＝（１００−ＦＰ率）＝異常のない試料にお
ける正確な判定の割合
【表８】
【表９】
【０１００】上表９における上記パーセンテージは、こ
のような少数の細胞が関わる分析が、統計学的サンプリ
ング誤差により、正確な結果、すなわち真陽性（ＴＰ）
または真陰性（ＴＮ）結果、または不正確な結果、すな
わち偽陽性（ＦＰ）または偽陰性につながることがいか
に多いかを示している。
のような少数の細胞が関わる分析が、統計学的サンプリ
ング誤差により、正確な結果、すなわち真陽性（ＴＰ）
または真陰性（ＴＮ）結果、または不正確な結果、すな
わち偽陽性（ＦＰ）または偽陰性につながることがいか
に多いかを示している。
【０１０１】本発明が関係する現況技術をより完全に説
明するため、本明細書で言及また引用したすべての発行
済みおよび権利の与えられた特許、特許出願、公開され
たＰＣＴおよび米国出願、論文、書籍、参考文献、リフ
ァレンス・マニュアルならびに要約の全体を参照により
本明細書に組み込む。
明するため、本明細書で言及また引用したすべての発行
済みおよび権利の与えられた特許、特許出願、公開され
たＰＣＴおよび米国出願、論文、書籍、参考文献、リフ
ァレンス・マニュアルならびに要約の全体を参照により
本明細書に組み込む。
【０１０２】本発明の範囲および精神を逸脱しない範囲
で前述の内容を変更することが可能であることから、上
記説明に含まれ、または添付の請求の範囲に定義される
内容は、本発明を記述および例示していると解釈される
ことを意図している。上記の教示に鑑みて、本発明の多
くの変更形態および変形形態が可能である。
で前述の内容を変更することが可能であることから、上
記説明に含まれ、または添付の請求の範囲に定義される
内容は、本発明を記述および例示していると解釈される
ことを意図している。上記の教示に鑑みて、本発明の多
くの変更形態および変形形態が可能である。
【図１Ａ】リン酸塩緩衝液で１：２０に希釈したＰＲＰ
試料のダイレクト・サイトメトリー・サイトグラムを示
す。
試料のダイレクト・サイトメトリー・サイトグラムを示
す。
【図１Ｂ】リン酸塩緩衝液で１：２０に希釈したＰＲＰ
試料のダイレクト・サイトメトリー・サイトグラムを示
す。
試料のダイレクト・サイトメトリー・サイトグラムを示
す。
【図１Ｃ】本発明の試薬組成物で１：２０に希釈した図
１Ａと同じＰＲＰ試料のＣＳＦダイレクト・サイトメト
リー・サイトグラムを示す。
１Ａと同じＰＲＰ試料のＣＳＦダイレクト・サイトメト
リー・サイトグラムを示す。
【図１Ｄ】本発明の試薬組成物で１：２０に希釈した図
１Ｂと同じＰＲＰ試料のＣＳＦダイレクト・サイトメト
リー・サイトグラムを示す。
１Ｂと同じＰＲＰ試料のＣＳＦダイレクト・サイトメト
リー・サイトグラムを示す。
【図１Ｅ】固体されかつ球状化されたＰＲＰ試料のサイ
トグラムをオーバーレイされたミーマップと共に示す。
トグラムをオーバーレイされたミーマップと共に示す。
【図２】本発明による半自動ＣＳＦアッセイまたは他の
体液アッセイを図解するフローチャートである。
体液アッセイを図解するフローチャートである。
【図３Ａ】試薬のオスモル濃度が１０７０ｍＯｓｍ（目
標濃度）であるときのＰＲＰ試料に対する効果を示す。
標濃度）であるときのＰＲＰ試料に対する効果を示す。
【図３Ｂ】試薬のオスモル濃度が１１４０ｍＯｓｍ（高
濃度）であるときのＰＲＰ試料に対する効果を示す。
濃度）であるときのＰＲＰ試料に対する効果を示す。
【図３Ｃ】試薬のオスモル濃度が１０２４ｍＯｓｍ（低
濃度）であるときのＰＲＰ試料に対する効果を示す。
濃度）であるときのＰＲＰ試料に対する効果を示す。
【図４】８０個のＣＳＦ試料について、ＷＢＣ数の手動
分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイの結果との相関
を示す図である。
分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイの結果との相関
を示す図である。
【図５】ＷＢＣ数が５個／μＬ以下の５２個のＣＳＦ試
料について、ＷＢＣ数の手動分析結果と本発明によるＣ
ＳＦアッセイの結果との相関を示す。
料について、ＷＢＣ数の手動分析結果と本発明によるＣ
ＳＦアッセイの結果との相関を示す。
【図６】ＲＢＣ数が０〜１８４０個である７４個のＣＳ
Ｆ試料について、ＲＢＣ数の手動分析結果と本発明によ
るＣＳＦアッセイ結果との相関を示す図である。
Ｆ試料について、ＲＢＣ数の手動分析結果と本発明によ
るＣＳＦアッセイ結果との相関を示す図である。
【図７】７８個のＣＳＦ試料について、好中球数の手動
分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を
示す。
分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を
示す。
【図８】７８個のＣＳＦ試料について、リンパ球数の手
動分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関
を示す。
動分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関
を示す。
【図９】７８個のＣＳＦ試料について、単球数の手動分
析結果と本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を示
す。
析結果と本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関を示
す。
【図１０】７８個のＣＳＦ試料について、単核球数の手
動分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関
を示す。
動分析結果と本発明によるＣＳＦアッセイ結果との相関
を示す。
【図１１Ａ】実施例１に記載の病院検査室から得られた
正常でほぼ無細胞のＣＳＦ試料の分析結果を示すサイト
グラムである。
正常でほぼ無細胞のＣＳＦ試料の分析結果を示すサイト
グラムである。
【図１１Ｂ】実施例１に記載の病院検査室から得られた
正常でほぼ無細胞のＣＳＦ試料の本発明によるＣＳＦア
ッセイ結果と対照手動分析結果を示す。
正常でほぼ無細胞のＣＳＦ試料の本発明によるＣＳＦア
ッセイ結果と対照手動分析結果を示す。
【図１１Ｃ】実施例１に記載の病院検査室から得られた
ＷＢＣ数の少ないＣＳＦ試料の分析結果を示すサイトグ
ラムである。
ＷＢＣ数の少ないＣＳＦ試料の分析結果を示すサイトグ
ラムである。
【図１１Ｄ】実施例１に記載の病院検査室から得られた
ＷＢＣ数の少ないＣＳＦ試料の本発明によるＣＳＦアッ
セイ結果と対照手動分析結果を示す。
ＷＢＣ数の少ないＣＳＦ試料の本発明によるＣＳＦアッ
セイ結果と対照手動分析結果を示す。
【図１１Ｅ】実施例１に記載の病院検査室から得られた
約２０ＷＢＣのレベルでＷＢＣを含むＣＳＦ試料の分析
結果を示すサイトグラムである。
約２０ＷＢＣのレベルでＷＢＣを含むＣＳＦ試料の分析
結果を示すサイトグラムである。
【図１１Ｆ】実施例１に記載の病院検査室から得られた
約２０ＷＢＣのレベルでＷＢＣを含むＣＳＦ試料の本発
明によるＣＳＦアッセイ結果と対照手動分析結果を示
す。
約２０ＷＢＣのレベルでＷＢＣを含むＣＳＦ試料の本発
明によるＣＳＦアッセイ結果と対照手動分析結果を示
す。
【図１１Ｇ】実施例１に記載の病院検査室から得られた
約１００ＷＢＣ／μＬのＣＳＦ試料の分析結果を示すサ
イトグラムである。
約１００ＷＢＣ／μＬのＣＳＦ試料の分析結果を示すサ
イトグラムである。
【図１１Ｈ】実施例１に記載の病院検査室から得られた
約１００ＷＢＣ／μＬのＣＳＦ試料の本発明によるＣＳ
Ｆアッセイ結果と対照手動分析結果を示す。
約１００ＷＢＣ／μＬのＣＳＦ試料の本発明によるＣＳ
Ｆアッセイ結果と対照手動分析結果を示す。
【図１２Ａ】実施例４に記載のＷＢＣに関する回帰分析
を示す。
を示す。
【図１２Ｂ】実施例４に記載のＲＢＣに関する回帰分析
を示す。
を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ゲナ フィッシャー
アメリカ合衆国 07640 ニュージャージ
イ，ハーリントン パーク，ノーマ ロー
ド 144
(72)発明者 デヴィッド ゼルマノヴィク
アメリカ合衆国 10952 ニューヨーク,
モンゼイ，スモレイ ドライヴ ８
(72)発明者 パメラ エルシンズ
アメリカ合衆国 12590 ニューヨーク,
ワッピンガーズ フォールズ，オール エ
ンジェルス ヒル ロード 204
(72)発明者 ジョランタ イー． クニッカ
アメリカ合衆国 10566 ニューヨーク,
ピークスキル，メドウラーク サークル
８
(72)発明者 マイケル ジェー． マリン
アメリカ合衆国 10960 ニューヨーク,
サウス ニアク，セダー ヒル アヴェニ
ュー 39
Ｆターム(参考） 2G045 AA25 BB20 BB29 BB51 CA11
CA17 CA26 CB03 CB07 CB08
CB11 CB13 CB14 DA77 FA37
JA01 JA04
Claims (10)
- 【請求項１】 一定量の体液中の細胞を固定しかつ球状
化する方法であって、細胞は、懸濁し続け、２４時間よ
り長い間その容積および内容物を維持し、一定量の体液
を、少なくとも１種類のアルデヒド、少なくとも１種類
の界面活性剤およびシクロデキストリンを含む一定量の
水性試薬組成物と混合することを含む方法。 - 【請求項２】 血液以外の体液を分析する方法であっ
て、 （ａ）一定量の体液を、少なくとも１種類のアルデヒ
ド、少なくとも１種類の界面活性剤およびシクロデキス
トリンを含む水溶液状の試薬組成物と混合すること、 （ｂ）自動分析装置中に試薬混合物を吸引すること、 （ｃ）ダイレクト・サイトメトリーにより実質的に１度
に１個の細胞について試薬混合物中の各成分を分析する
こと、および （ｄ）体液の各細胞成分の数を得ることを含む方法。 - 【請求項３】 アルデヒドは、ホルムアルデヒド、グル
タルアルデヒド、およびそれらの組合せからなる群から
選択される少なくとも１種類であり、界面活性剤は、両
性イオン性サーファクタントおよび非イオン性サーファ
クタントからなる群から選択される少なくとも１種類で
あり、シクロデキストリンは、アルファシクロデキスト
リン、ベータシクロデキストリンおよびガンマシクロデ
キストリンからなる群から選択される少なくとも１種類
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 アルデヒドは、ホルムアルデヒド、グル
タルアルデヒド、およびそれらの組合せからなる群から
選択される少なくとも１種類であり、界面活性剤は、両
性イオン性サーファクタントおよび非イオン性サーファ
クタントからなる群から選択される少なくとも１種類で
あり、シクロデキストリンは、アルファシクロデキスト
リン、ベータシクロデキストリンおよびガンマシクロデ
キストリンからなる群から選択される少なくとも１種類
である請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 体液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、胸水、肺
洗浄液、気管支洗浄液、滑液、腹膜液、骨髄吸引液、腹
水、痰、唾液、リンパ液、涙、血清、血漿、精液、尿、
および膀胱洗浄液からなる群から選択される請求項２に
記載の方法。 - 【請求項６】 水溶液中に、少なくとも１種類のアルデ
ヒド、少なくとも１種類の界面活性剤およびシクロデキ
ストリンを含む組成物。 - 【請求項７】 アルデヒドは、ホルムアルデヒド、グル
タルアルデヒド、およびそれらの組合せからなる群から
選択される少なくとも１種類であり、界面活性剤は、両
性イオン性サーファクタントおよび非イオン性サーファ
クタントからなる群から選択される少なくとも１種類で
あり、シクロデキストリンは、アルファシクロデキスト
リン、ベータシクロデキストリンおよびガンマシクロデ
キストリンからなる群から選択される少なくとも１種類
である、請求項６に記載の組成物。 - 【請求項８】 試薬組成物は、試薬ｐＨを約ｐＨ４．０
からｐＨ７．０までの範囲に維持するための緩衝剤をさ
らに含む請求項７に記載の組成物。 - 【請求項９】 体液中の細胞をフロー・サイトメトリー
分析するための対照材料であって、一定量の体液ならび
に少なくとも１種類のアルデヒド、少なくとも１種類の
界面活性剤およびシクロデキストリンを含む水性試薬組
成物の混合物を含む材料。 - 【請求項１０】 アルデヒドは、ホルムアルデヒド、グ
ルタルアルデヒド、およびそれらの組合せからなる群か
ら選択される少なくとも１種類であり、界面活性剤は、
両性イオン性サーファクタントおよび非イオン性サーフ
ァクタントからなる群から選択される少なくとも１種類
であり、シクロデキストリンは、アルファシクロデキス
トリン、ベータシクロデキストリンおよびガンマシクロ
デキストリンからなる群から選択される少なくとも１種
類である、請求項９に記載の対照材料。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US38185202P | 2002-05-20 | 2002-05-20 | |
| US60/381852 | 2002-05-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP3759512B2 JP3759512B2 (ja) | 2006-03-29 |
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ID=29584330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003142385A Expired - Lifetime JP3759512B2 (ja) | 2002-05-20 | 2003-05-20 | 脳脊髄液などの体液試料をアッセイするための自動法およびそのための試薬 |
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|---|---|
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| CA (1) | CA2428740A1 (ja) |
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