KR20180023061A - 소변 시료 분석 방법, 소변 시료 분석용 시약 및 소변 시료 분석용 시약 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 소변 중 유형 성분으로서 적어도 원주 및 적혈구를 검출하기 위한 소변 시료 분석 방법, 소변 시료 분석용 시약 및 소변 시료 분석용 시약 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 소변 중 유형 성분으로서 적어도 원주(圓柱) 및 적혈구를 검출하기 위한 소변 시료 분석 방법, 소변 시료 분석용 시약 및 소변 시료 분석용 시약 키트에 관한 것이다.
신장·요로계에서의 감염증, 염증성 병변, 변성 병변, 결석증, 종양 등의 질환에서는 각각의 질환에 따라 소변 중에 여러 가지 유형 성분이 출현한다. 유형 성분으로서는 적혈구, 원주, 백혈구, 상피 세포, 효모상 진균, 정자 등을 들 수 있다. 소변 중의 이들 성분을 분석하는 것은 신장·요로계의 질환이나 이상 부위의 추정을 하는데 있어서 중요하다. 예를 들면, 적혈구는 신장의 사구체로부터 요도에 이르는 경로에서의 출혈의 유무를 판정하는데 유용한 소변 중 유형 성분이다.
원주는 Tamm-Horsfall 뮤코 단백질과 소변 중 혈장 단백질(주로 알부민)의 응고 침전물을 기질로 하는 고형 성분이며, 주로 원위 요세관 및 집합관에서 형성된다. 이 기질만으로 이루어지는 원주는 초자 원주로 불리지만, 신장이나 요세관의 상태에 따라서는 초자 원주에 세포 등의 여러 가지 성분이 봉입되어 추가로 변성된 원주가 생기는 경우가 있다. 그 때문에, 원주는 신장 및 요세관의 병태나 장해의 정도를 파악하는데 유용한 소변 중 유형 성분이다.
원주 및 적혈구 등의 소변 중 유형 성분의 분석으로는 소변을 원심분리해 얻어지는 침전물(유형 성분)을 현미경으로 관찰하는 것에 의한 육안 검사가 널리 실시되고 있다. 또, 최근에는 플로우 사이토미터를 이용한 자동 분석법도 개발되고 있다. 예를 들면, 특허문헌 1에는 염색용 시약 및 희석용 시약으로 처리한 소변 시료를 플로우 사이토미터로 측정함으로써, 소변 중 유형 성분을 분석하는 방법이 기재되어 있다.
한편, 소변 중에는 형상이 원주와 매우 유사한 성분인 점액사(粘液絲)나, 세균이나 염류 등 응집체도 존재한다. 소변 시료 중의 원주의 수는 임상적으로 중요한 정보이므로, 원주의 검출시에는 원주와, 점액사 등의 원주와 유사한 성분을 변별하는 것이 중요해진다.
특허문헌 1에는 세포막 손상제로서의 계면활성제를 소변 시료 중에 약 50~5000mg/L의 농도로 첨가하여 백혈구를 손상시켜 강하게 염색함으로써, 백혈구와 소형 상피 세포를 변별하는 것이 기재되어 있다. 또, 특허문헌 1에는 세포막 손상제에 의해 적혈구를 용혈시킨 시료의 측정 결과와, 적혈구를 용혈시키지 않은 시료의 측정 결과를 비교함으로써, 적혈구와 결정 성분이나 효모상 진균를 변별할 수 있는 것이 기재되어 있다.
그렇지만, 소변 중의 적혈구를 분석하기 위해서, 시료를 2개 준비하여 각각 분석하는 것은 번잡하다. 따라서, 1개의 소변 시료로부터 소변 중의 적혈구를 검출할 수 있는 것이 바람직하다. 또, 소변 중의 원주를 검출하기 위해서는 상술한 바와 같이, 점액사와의 변별이 중요해진다. 따라서, 1개의 소변 시료로부터 소변 중의 원주 및 적혈구를 정확하게 검출하기 위해서는 적혈구를 용혈시키지 않고 검출하는 것과, 원주를 점액사 등의 불순물과 구별해 검출할 수 있는 것 모두가 요구된다.
상기의 점을 감안하여, 본 발명은 1개의 소변 시료로부터 원주 및 적혈구를 정밀도 양호하게 검출하는 것을 가능하게 하는 소변 시료 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또, 본 발명은 그 방법에 적합하게 이용되는 소변 시료 분석용 시약 및 소변 시료 분석용 시약 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 놀랍게도 측정 시료 중의 계면활성제의 농도를 2mg/L 이상 30mg/L 이하로 매우 낮게 함으로써, 적혈구를 실질적으로 손상시키지 않고 검출하며, 또한 원주를 불순물과 구별해 검출할 수 있는 것을 알아내어 본 발명을 완성했다.
따라서, 본 발명은 소변 시료와, 계면활성제를 포함하는 시약을 혼합하여 측정 시료를 조제하는 공정과, 조제 공정에서 얻어진 측정 시료에 포함되는 소변 중 유형 성분으로서 적어도 원주 및 적혈구를 검출하는 공정을 포함하며, 조제 공정에서 얻어진 측정 시료 중의 계면활성제의 농도가 2mg/L 이상 30mg/L 이하인 소변 시료 분석 방법을 제공한다.
또, 본 발명은 4mg/L 이상 50mg/L 이하의 계면활성제를 포함하는, 소변 중 유형 성분으로서 적어도 원주 및 적혈구를 검출하기 위한 소변 시료 분석용 시약을 제공한다.
추가로, 본 발명은 4mg/L 이상 50mg/L 이하의 계면활성제를 포함하는 제1 시약과, 원주 및 적혈구를 염색하기 위한 형광 색소를 포함하는 제2 시약을 포함하는, 소변 중 유형 성분으로서 적어도 원주 및 적혈구를 검출하기 위한 소변 시료 분석용 시약 키트를 제공한다.
본 발명에 의하면, 적혈구를 실질적으로 손상시키지 않고, 또한 원주 및 적혈구를 정밀도 양호하게 검출하는 것을 가능하게 한다.
도 1은 적혈구를 포함하는 소변 시료를 여러 가지 농도의 계면활성제의 존재 하에서 처리해 얻은 측정 시료에 포함되는 적혈구의 수를 나타내는 그래프이다.
도 2는 적혈구를 포함하는 소변 시료를 여러 가지 농도의 양이온성 계면활성제의 존재 하에서 처리해 얻은 측정 시료로부터 검출된 적혈구의 수를 나타내는 그래프이다.
도 3은 적혈구를 포함하는 소변 시료를 여러 가지 농도의 비이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제의 존재 하에서 처리해 얻은 측정 시료로부터 검출된 적혈구의 수를 나타내는 그래프이다.
도 4는 원주를 포함하지 않지만 원주와 유사한 불순물을 포함하는 소변 시료를, 여러 가지 농도의 양이온성 계면활성제의 존재 하에서 처리해 얻은 측정 시료로부터 검출된 불순물의 수를 나타내는 그래프이다.
도 5는 원주를 포함하지 않지만 원주와 유사한 불순물을 포함하는 소변 시료를, 여러 가지 농도의 비이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제의 존재 하에서 처리해 얻은 측정 시료로부터 검출된 불순물의 수를 나타내는 그래프이다.
도 6은 소변 시료 분석용 시약의 일례를 나타내는 도이다.
도 7은 소변 시료 분석용 시약 키트의 일례를 나타내는 도이다.
도 2는 적혈구를 포함하는 소변 시료를 여러 가지 농도의 양이온성 계면활성제의 존재 하에서 처리해 얻은 측정 시료로부터 검출된 적혈구의 수를 나타내는 그래프이다.
도 3은 적혈구를 포함하는 소변 시료를 여러 가지 농도의 비이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제의 존재 하에서 처리해 얻은 측정 시료로부터 검출된 적혈구의 수를 나타내는 그래프이다.
도 4는 원주를 포함하지 않지만 원주와 유사한 불순물을 포함하는 소변 시료를, 여러 가지 농도의 양이온성 계면활성제의 존재 하에서 처리해 얻은 측정 시료로부터 검출된 불순물의 수를 나타내는 그래프이다.
도 5는 원주를 포함하지 않지만 원주와 유사한 불순물을 포함하는 소변 시료를, 여러 가지 농도의 비이온성 계면활성제 또는 양이온성 계면활성제의 존재 하에서 처리해 얻은 측정 시료로부터 검출된 불순물의 수를 나타내는 그래프이다.
도 6은 소변 시료 분석용 시약의 일례를 나타내는 도이다.
도 7은 소변 시료 분석용 시약 키트의 일례를 나타내는 도이다.
[소변 시료 분석 방법]
본 실시 형태의 소변 시료 분석 방법(이하, 단순히 「방법」이라고도 함)은 소변 중 유형 성분 중 적혈구, 원주, 결정 성분 및 점액사를 분석 대상으로 하고, 특히 원주 및 적혈구의 분석에 적합하다.
원주에는 다양한 종류가 있고, 상기의 기질만으로 이루어지는 초자 원주, 요세관 상피 세포가 봉입된 상피 원주, 적혈구가 봉입된 적혈구 원주, 백혈구가 봉입된 백혈구 원주, 지방 과립이 봉입된 지방 원주, 과립 성분(주로 변성된 상피 세포)이 봉입된 과립 원주, 원주의 전체 또는 일부가 균질하고 왁스(蠟)와 같이 변성된 왁스 모양 원주가 알려져 있다. 본 실시 형태에서, 원주의 종류는 특별히 한정되지 않는다.
본 실시 형태에서, 적혈구의 종류는 특별히 한정되지 않고, 정상 적혈구 및 이상 적혈구 중 어느 하나여도 된다.
본 실시 형태의 방법에서는 우선 소변 시료와, 계면활성제를 포함하는 시약(이하, 「제1 시약」이라고도 함)을 혼합하여 측정 시료를 조제하는 공정이 실시된다. 이 공정에서는 얻어진 측정 시료 중의 계면활성제의 농도(최종 농도)가 2mg/L 이상 30mg/L 이하가 되도록 소변 시료와 제1 시약의 혼합을 실시한다. 바람직하게는 측정 시료 중의 계면활성제의 농도가 4mg/L 이상 22mg/L 이하가 되도록 혼합한다.
본 실시 형태에서는 소변 시료는 소변 중 유형 성분을 포함하는 액체 시료이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 피험자로부터 채취한 소변이다. 또한 피험자로부터 채취한 소변을 시료로서 이용하는 경우, 시간 경과에 의해 소변 중 유형 성분이 열화될 우려가 있으므로, 채취 후 24시간 이내, 특히 3~12시간 이내에 소변 시료를 본 실시 형태의 방법에 이용하는 것이 바람직하다.
본 실시 형태의 방법에서는 측정 시료 중의 계면활성제의 농도는 2mg/L 이상 30mg/L 이하로 매우 낮지만, 계면활성제의 작용에 의해, 원주의 정확한 검출을 저해하는 세균이나 염류 등의 불순물의 응집체를 분산시켜 제거할 수 있다.
제1 시약은 계면활성제를 적절한 용매에 용해시킴으로써 얻을 수 있다. 용매는 계면활성제를 용해시킬 수 있으면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 물, 수용성 유기 용매, 및 이들 혼합물을 들 수 있다. 수용성 유기 용매로서는, 예를 들면 탄소수 1~3의 저급 알코올, 에틸렌글리콜, 디메틸설폭사이드(DMSO) 등을 들 수 있다. 본 실시 형태에서는 물이 특히 바람직하다.
제1 시약에 이용되는 계면활성제의 종류는 특별히 한정되지 않고, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 및 양성 계면활성제로부터 적절히 선택할 수 있다. 제1 시약에 이용되는 계면활성제는 양이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제로부터 선택하는 것이 바람직하고, 양이온성 계면활성제가 특히 바람직하다. 제1 시약에 포함되는 계면활성제는 1 종류여도 되고, 2 종류 이상이어도 된다. 2 종류 이상의 계면활성제를 포함하는 경우, 그 조합은 임의로 선택할 수 있다.
본 실시 형태에서는 양이온성 계면활성제로서 제4급 암모늄염형 계면활성제 및 피리디늄염형 계면활성제로부터 선택되는 적어도 1종을 이용할 수 있다. 제4급 암모늄염형 계면활성제로서는, 예를 들면 이하의 식(I)으로 나타내는 전체 탄소수가 4~38인 계면활성제를 들 수 있다.
[화 1]
상기의 식(I) 중, R1은 탄소수 1~18의 알킬기 또는 알케닐기이며; R2 및 R3은 서로 동일 또는 상이하고, 탄소수 1~4의 알킬기 또는 알케닐기이며; R4는 탄소수 1~12의 알킬기 혹은 알케닐기, 또는 벤질기이며; X-는 할로겐 이온 또는 히드록시 이온이다.
상기의 식(I) 중, R1으로서는 탄소수가 6, 8, 10, 12 및 14인 알킬기 또는 알케닐기가 바람직하고, 특히 직쇄의 알킬기가 바람직하다. 보다 구체적인 R1으로서는 옥틸기, 데실기 및 도데실기를 들 수 있다. R2 및 R3으로서는 메틸기, 에틸기 및 프로필기가 바람직하다. R4로서는 메틸기, 에틸기 및 프로필기가 바람직하다. 보다 바람직하게는 R2, R3 및 R4의 각각이 메틸기이다. 상기의 식(I) 중, X-는 할로겐 이온이 바람직하고, 예를 들면 브롬화물 이온, 염화물 이온 및 요오드화물 이온을 들 수 있다.
피리디늄염형 계면활성제로서는, 예를 들면 이하의 식(Ⅱ)으로 나타내는 계면활성제를 들 수 있다.
[화 2]
상기의 식(Ⅱ) 중, R1은 탄소수 6~18의 알킬기 또는 알케닐기이며; X-는 할로겐 이온이다.
상기의 식(Ⅱ) 중, R1으로서는 탄소수가 6, 8, 10, 12 및 14인 알킬기 또는 알케닐기가 바람직하고, 특히 직쇄의 알킬기가 바람직하다. 보다 구체적인 R1으로서는 옥틸기, 데실기 및 도데실기를 들 수 있다.
상기의 양이온성 계면활성제의 구체예로서는 트리에틸메틸암모늄클로라이드, 디데실디메틸암모늄브로마이드, 디데실디메틸암모늄클로라이드, 디도데실디메틸암모늄브로마이드, 디도데실디메틸암모늄클로라이드, 에틸헥사데실디메틸암모늄브로마이드, 에틸트리메틸암모늄요오드, 도데실트리메틸암모늄브로마이드, 데실트리메틸암모늄브로마이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드, 옥틸트리메틸암모늄브로마이드, 옥틸트리메틸암모늄클로라이드, 테트라데실트리메틸암모늄클로라이드, 트리메틸헵타데실암모늄브로마이드, 헥사데실트리메틸암모늄브로마이드, 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드, 헥사데실트리메틸암모늄히드록시드, 헥실트리메틸암모늄브로마이드, 트리메틸노닐암모늄브로마이드, 트리메틸스테아릴암모늄브로마이드, 트리메틸스테아릴암모늄클로라이드, 도데실피리디늄클로라이드, 테트라데실트리메틸암모늄브로마이드 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 도데실트리메틸암모늄브로마이드(DTAB), 도데실트리메틸암모늄클로라이드(DTAC), 옥틸트리메틸암모늄브로마이드(OTAB), 및 테트라데실트리메틸암모늄브로마이드(MTAB)가 바람직하고, DTAB가 특히 바람직하다.
본 실시 형태에서는 비이온성 계면활성제로서 이하의 식(Ⅲ)으로 나타내는 폴리옥시에틸렌계 비이온 계면활성제가 적합하게 이용된다.
R1-R2-(CH2CH2O)n-H (Ⅲ)
상기의 식(Ⅲ) 중, R1은 탄소수 8~25의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기이며; R2는 -O-, -COO- 또는
[화 3]
이며; n은 10~50의 정수이다.
상기의 비이온성 계면활성제의 구체예로서는 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌스테롤, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌알킬아민, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 폴리옥시에틸렌알킬에테르가 바람직하고, 구체적으로는 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌세틸에테르, 폴리옥시에틸렌스테아릴에테르, 폴리옥시에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌베헤닐에테르가 특히 바람직하다.
본 실시 형태에서는 음이온성 계면활성제로서 카르복시산염형 계면활성제, 설폰산염형 계면활성제 및 황산에스테르염형 계면활성제로부터 선택되는 적어도 1종을 이용할 수 있다. 카르복시산염형 계면활성제로서는, 예를 들면 이하의 식(IV)으로 나타내는 계면활성제를 들 수 있다.
R1-COO- Y+ (IV)
상기의 식(IV) 중, R1은 탄소수 8~25의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기이며; Y+는 알칼리 금속 이온이다.
상기의 식(IV) 중, R1으로서는 탄소수가 12~18인 직쇄의 알킬기가 바람직하다. 상기의 카르복시산염형 계면활성제는 상기 기술에서는 비누로서 알려지고, 예를 들면 라우르산나트륨, 스테아르산나트륨, 올레인산나트륨 등을 들 수 있다.
설폰산염형 계면활성제로서는, 예를 들면 이하의 식(V)으로 나타내는 계면활성제를 들 수 있다.
[화 4]
상기의 식(V) 중, m 및 n은 0 이상의 정수로서, m과 n의 합이 8~25이며; Y+는 알칼리 금속 이온이다.
상기의 식(V) 중, m과 n의 합이 9~18인 것이 바람직하다. 상기의 식(V)으로 나타내는 설폰산염형 계면활성제는 상기 기술에서는 알킬벤젠설폰산염으로서 알려지고, 예를 들면 직쇄 데실벤젠황산나트륨, 직쇄 운데실벤젠황산나트륨, 직쇄 도데실벤젠황산나트륨, 직쇄 트리데실벤젠황산나트륨 및 직쇄 테트라데실벤젠황산나트륨 등을 들 수 있다.
또, 설폰산염형 계면활성제로서 이하의 식(VI) 및 (VⅡ)의 각각으로 나타내는 계면활성제의 혼합물을 이용해도 된다.
CH3(CH2)j-CH=CH-(CH2)k-SO3 - Y+ (VI)
상기의 식(VI) 중, j 및 k는 0 이상의 정수로서, j와 k의 합이 10~25의 정수이며; Y+는 알칼리 금속 이온이다.
CH3(CH2)m-CH(-OH)-(CH2)n-SO3 - Y+ (VⅡ)
상기의 식(VⅡ) 중, m 및 n은 0 이상의 정수로서, m과 n의 합이 10~25의 정수이며; Y+는 알칼리 금속 이온이다.
상기의 식(VI) 중, j와 k의 합이 11~15의 정수로서, 상기의 식(VⅡ) 중, m과 n의 합이 12~16의 정수인 것이 바람직하다. 상기의 식(VI) 및 (VⅡ)으로 각각 나타내는 계면활성제는 상기 기술에서는 α-올레핀설폰산염으로서 알려지고, 예를 들면 1-테트라데센설폰산나트륨, 헥사데센설폰산나트륨, 3-히드록시헥사데실-1-설폰산나트륨, 옥타데센-1-설폰산나트륨 및 3-히드록시-1-옥타데칸설폰산나트륨 등을 들 수 있다.
황산에스테르염형 계면활성제로서는, 예를 들면 이하의 식(VⅢ)으로 나타내는 계면활성제를 들 수 있다.
R1-O-SO3 - Y+ (VⅢ)
상기의 식(VⅢ) 중, R1은 탄소수 10~25의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기이며; Y+는 알칼리 금속 이온이다.
상기의 식(VⅢ) 중, R1으로서는 탄소수가 10~18인 직쇄의 알킬기가 바람직하고, 특히 탄소수가 12인 직쇄의 알킬기가 바람직하다. 상기의 식(VⅢ)으로 나타내는 황산에스테르염형 계면활성제는 상기 기술에서는 고급 알코올황산에스테르염으로서 알려지고, 예를 들면 데실황산나트륨, 운데실황산나트륨, 도데실황산나트륨, 트리데실황산나트륨 및 테트라데실황산나트륨 등을 들 수 있다.
또, 황산에스테르염형 계면활성제로서 이하의 식(IX)으로 나타내는 계면활성제를 이용해도 된다.
R1-O-(CH2CH2O)n-SO3 - Y+ (IX)
상기의 식(IX) 중, R1은 탄소수 10~25의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기이며; n은 1~8의 정수이고; Y+는 알칼리 금속 이온 또는 암모늄 이온이다.
상기의 식(IX) 중, R1으로서는 탄소수가 12~18인 직쇄의 알킬기가 바람직하고, 특히 탄소수가 12인 직쇄의 알킬기가 바람직하다. 상기의 식(IX)으로 나타내는 황산에스테르염형 계면활성제는 상기 기술에서는 폴리옥시에틸렌알킬황산에스테르염으로서 알려지고, 예를 들면 도데실에테르황산에스테르나트륨 등을 들 수 있다.
또, 황산에스테르염형 계면활성제로서 이하의 식(X)으로 나타내는 계면활성제를 이용해도 된다.
R1-CH(-SO3 -)-COOCH3 Y+ (X)
상기의 식(X) 중, R1은 탄소수 8~25의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기이며; Y+는 알칼리 금속 이온이다.
상기의 식(X) 중, R1으로서는 탄소수가 10~18인 직쇄의 알킬기가 바람직하고, 특히 탄소수가 12인 직쇄의 알킬기가 바람직하다. 상기의 식(X)으로 나타내는 황산에스테르염형 계면활성제는 상기 기술에서는 α-설포지방산에스테르로서 알려지고, 예를 들면 2-설포테트라데칸산-1-메틸에스테르나트륨염 및 2-설포헥사데칸산-1-메틸에스테르나트륨염 등을 들 수 있다.
본 실시 형태에서, 양성 계면활성제로서 아미노산형 양성 계면활성제 및 베타인형 양성 계면활성제로부터 선택되는 적어도 1종을 이용할 수 있다. 아미노산형 양성 계면활성제로서는, 예를 들면 이하의 식(XI)으로 나타내는 계면활성제를 들 수 있다.
R1-N+H2-CH2CH2COO- (XI)
상기의 식(XI) 중, R1은 탄소수 8~25의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기이다.
상기의 식(XI) 중, R1으로서는 탄소수가 12~18인 직쇄의 알킬기가 바람직하다. 상기의 아미노산형 양성 계면활성제로서는, 예를 들면 3-(도데실아미노)프로판산 및 3-(테트라데카-1-일아미노)프로판산 등을 들 수 있다.
베타인형 양성 계면활성제로서는, 예를 들면 이하의 식(XⅡ)으로 나타내는 계면활성제를 들 수 있다.
[화 5]
상기의 식(XⅡ) 중, R1은 탄소수 6~18의 알킬기 또는 알케닐기이며; R2는 탄소수 1~4의 알킬기 또는 알케닐기이며; R3은 탄소수 1~4의 알킬기 혹은 알케닐기, 또는 벤질기이며; n은 1 또는 2이다.
베타인형 양성 계면활성제로서는, 예를 들면 도데실디메틸아미노아세트산베타인 및 스테아릴디메틸아미노아세트산베타인 등을 들 수 있다.
제1 시약 중의 계면활성제의 농도는 조제한 측정 시료 중의 상기 계면활성제의 농도를 2mg/L 이상 30mg/L 이하, 바람직하게는 4mg/L 이상 22mg/L 이하로 하는 것이 가능한 농도이면 특별히 한정되지 않는다.
본 실시 형태에서는 pH 변화에 의한 적혈구의 용혈을 방지하기 위해서, 제1 시약의 pH를 5 이상 9 이하, 바람직하게는 6.5 이상 8.6 이하, 보다 바람직하게는 7.0 이상 7.8 이하의 범위로 할 수 있다. 따라서, 제1 시약은 pH를 일정하게 유지하기 위해서 완충제를 포함하고 있어도 된다. 그와 같은 완충제로서는 상기의 pH 범위에서 완충 작용을 가지는 완충제이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 Tris, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPS, MOPSO, BES, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS 등의 굿스 완충제 등을 들 수 있다.
소변 시료에는 인산암모늄, 인산마그네슘, 탄산칼슘 등의 무정성 염류가 포함되어 있는 경우가 있다. 본 실시 형태에서는 이들 무정성 염류의 영향을 저감시키기 위해서, 제1 시약은 킬레이트제를 포함하고 있어도 된다. 킬레이트제는 무정성 염류를 제거 가능한 킬레이트제이면 특별히 한정되지 않고, 상기 기술에서 공지된 탈칼슘제, 탈마그네슘제 등으로부터 적절히 선택할 수 있다. 구체적으로는 에틸렌디아민4아세트산염(EDTA염), CyDTA, DHEG, DPTA-OH, EDDA, EDDP, GEDTA, HDTA, HIDA, Methyl-EDTA, NTA, NTP, NTPO, EDDPO 등을 들 수 있고, 이들 중에서도 EDTA염이 특히 바람직하다.
제1 시약 중의 킬레이트제의 농도는 상기와 같이 하여 조제한 측정 시료 중에서, 무정성 염류의 영향을 저감할 수 있는 최종 농도로 상기 킬레이트제가 포함되도록 설정하는 것이 바람직하다. 측정 시료 중의 최종 농도는 상기의 킬레이트제의 종류에 따라 적절히 설정된다. 예를 들면, 킬레이트제로서 EDTA2 칼륨(EDTA-2K)을 이용하는 경우, 측정 시료 중의 최종 농도는 0.1mM 이상 500mM 이하, 바람직하게는 1mM 이상 100mM 이하이다.
소변 중에 효모상 진균 및 적혈구가 존재하는 경우, 플로우 사이토미터에 의한 분석에서는 효모상 진균과 적혈구의 분획이 별로 양호하지 않은 경우가 있는 것이 알려져 있다. 따라서, 제1 시약은 효모상 진균의 세포막을 손상시키는 물질을 포함하고 있어도 된다. 그와 같은 물질로서는 2-페녹시에탄올, 벤질알코올, 페네틸알콜, 1-페녹시-2-프로판올, 페놀, 아세트산페닐, 벤조티아졸 등을 들 수 있고, 이들 중에서도 2-페녹시에탄올이 특히 바람직하다. 이와 같은 물질을 포함하는 제1 시약을 이용함으로써, 효모상 진균의 염색성이 변화하고, 적혈구와 효모상 진균의 분획이 개선된다.
소변의 침투압은 50~1300mOsm/kg로 광범위하게 분포하고 있는 것이 알려져 있지만, 측정 시료에서 침투압이 너무 낮거나 또는 너무 높은 경우, 적혈구가 손상될 우려가 있다. 측정 시료에서의 적절한 침투압은 100mOsm/kg 이상 600mOsm/kg 이하, 바람직하게는 150mOsm/kg 이상 500mOsm/kg 이하이다. 소변의 침투압이 너무 높은 경우에는 물 또는 제1 시약으로 희석함으로써 침투압을 적절히 조절할 수 있다. 반대로, 소변의 침투압이 너무 낮은 경우에는 제1 시약은 침투압 보상제를 포함하고 있어도 된다. 그와 같은 침투압 보상제로서는 무기 염류, 유기 염류, 당류 등을 들 수 있다. 무기 염류로서는 염화나트륨, 브롬화나트륨 등을 들 수 있다. 유기 염류로서는 프로피온산나트륨, 프로피온산칼륨, 프로피온산암모늄옥살산염 등을 들 수 있다. 당류로서는 소르비톨, 글루코오스, 만니톨 등을 들 수 있다.
본 실시 형태에서는 조제 공정에서, 원주 및 적혈구를 염색하기 위한 형광 색소를 포함하는 시약(이하, 「제2 시약」이라고도 함)을 추가로 혼합하는 것이 바람직하다. 제2 시약에 포함되는 형광 색소는 적어도 세포막, 바람직하게는 단백질 및 적혈구의 세포막을 염색할 수 있는 형광 색소가 바람직하다. 제2 시약에 이용할 수 있는 형광 색소로서는 축합 벤젠 유도체를 들 수 있고, 상기 유도체 중에서도 시아닌계 형광 색소가 특히 바람직하다. 시아닌계 형광 색소로서는, 예를 들면 3,3'-디에틸옥사카보시아닌아이오다이드(DiOC2(3)), 3,3-디프로필옥사카보시아닌아이오다이드(DiOC3(3)), 3,3'-디부틸옥사시아닌아이오다이드(DiOC4(3)) 및 3,3-디펜틸옥사카보시아닌아이오다이드(DiOC5(3))를 들 수 있다.
제2 시약 중의 형광 색소는 1 종류여도 되고, 2 종류 이상이어도 된다. 제2 시약 중의 형광 색소의 농도는 조제한 측정 시료 중에서, 적어도 원주 및 적혈구를 적절히 염색할 수 있는 최종 농도로 상기 형광 색소가 포함되도록 설정하는 것이 바람직하다. 측정 시료 중의 최종 농도는 상기의 형광 색소의 종류에 따라 적절히 설정된다. 예를 들면, 형광 색소로서 DiOC3(3)를 이용하는 경우, 측정 시료 중의 최종 농도는 0.1㎍/mL 이상 200㎍/mL 이하, 바람직하게는 1㎍/mL 이상 20㎍/mL 이하이다.
제2 시약은 상기의 형광 색소를 적절한 용매에 용해시킴으로써 얻을 수 있다. 용매는 상기의 형광 색소를 용해시킬 수 있는 수성 용매이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 물, 수용성 유기 용매, 및 이들 혼합물을 들 수 있다. 이들 중에서도, 수용성 유기 용매가 특히 바람직하다. 수용성 유기 용매로서는, 예를 들면 탄소수 1~3의 저급 알코올, 에틸렌글리콜, DMSO 등을 들 수 있다.
본 실시 형태에서는 소변 시료와, 제1 시약과, 제2 시약을 혼합하는 순서는 특별히 한정되지 않고, 이들을 동시에 혼합할 수도 있다. 바람직하게는 소변 시료와 제2 시약을 먼저 혼합하고, 여기에 제1 시약을 추가로 혼합한다. 혹은 제1 시약과 제2 시약을 먼저 혼합하고, 여기에 소변 시료를 추가로 혼합하여도 된다.
본 실시 형태에서, 소변 시료와, 제1 시약과, 제2 시약의 혼합 비율은 특별히 한정되지 않고, 각 시약에 포함되는 성분 농도에 따라 적절히 결정하면 된다. 예를 들면, 소변 시료와 제1 시약의 혼합 비율은 체적비로 1:0.5~10의 범위로부터 결정할 수 있다. 또, 소변 시료와 제2 시약의 혼합 비율은 체적비로 1:0.01~1의 범위로부터 결정할 수 있다. 또한 소변 시료의 양은 제1 시약과 제2 시약에 따라 적절히 결정하면 된다. 소변 시료의 양은 측정 시간이 너무 길어지지 않게 하는 관점에서 1000μL 이하가 바람직하다. 소변 시료의 양은 10~1000μL 정도로 측정에 충분하다.
조제 공정에서의 온도 조건은 10~60℃, 바람직하게는 35~45℃이다. 각 시약을 미리 이들 온도가 되도록 가온하고 있어도 된다. 또, 소변 시료와, 제1 시약 및/또는 제2 시약을 혼합한 후, 1초~5분간, 바람직하게는 5~60초간 인큐베이션해도 된다.
본 실시 형태의 방법에서는 상기의 조제 공정에서 얻어진 측정 시료에 포함되는 소변 중 유형 성분으로서 적어도 원주 및 적혈구를 검출하는 공정이 실시된다.
조제 공정에서 제2 시약을 이용하지 않았던 경우에는 광학 현미경을 이용하여 측정 시료 중의 각 성분의 형상이나 내부 구조 등을 관찰함으로써, 원주 및 적혈구를 포함하는 유형 성분을 검출할 수 있다. 또, 제2 시약에 의해 소변 시료 중의 유형 성분을 염색한 경우에는 형광 현미경을 이용하여 측정 시료 중의 각 유형 성분의 형상 및 염색의 정도 등을 관찰함으로써 유형 성분을 검출할 수 있다.
바람직한 실시 형태에서는 상기의 검출 공정의 전에, 측정 시료에 포함되는 소변 중 유형 성분에 광을 조사하여 광학적 정보를 취득하는 공정을 추가로 실시한다. 이 광학적 정보의 취득 공정은 플로우 사이토미터에 의해 실시되는 것이 바람직하다. 플로우 사이토미터에 의한 측정에서는 염색된 소변 중 유형 성분이 플로우 셀을 통과할 때에 상기 유형 성분에 광을 조사함으로써, 상기 유형 성분으로부터 발생되는 시그널로서 광학적 정보를 얻을 수 있다. 취득한 광학적 정보는 적어도 산란광 정보를 포함하는 것이 바람직하다. 제2 시약을 이용해 측정 시료를 조제한 경우에는 광학적 정보로서 산란광 정보 및 형광 정보를 취득하는 것이 바람직하다.
산란광 정보는 일반적으로 시판되는 플로우 사이토미터로 측정할 수 있는 산란광 정보이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 전방 산란광(예를 들면, 수광 각도 0~20도 부근)이나 측방 산란광(수광 각도 90도 부근) 등의 산란광의 강도 및 파형 정보 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 산란광 정보로서 산란광 강도, 산란광 펄스 폭 및 산란광 적분값 등을 들 수 있다. 상기 기술에서는 측방 산란광은 세포의 핵이나 과립 등의 내부 정보를 반영하고, 전방 산란광은 세포의 크기의 정보를 반영하는 것이 알려져 있다. 실시 형태에서는 전방 산란광의 정보를 이용하는 것이 바람직하다.
형광 정보는 적절한 파장의 여기광(勵起光)을 염색된 소변 중 유형 성분에 조사하여, 여기된 형광을 측정해 얻어지는 정보이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 형광의 강도 및 파형 정보를 들 수 있다. 보다 구체적으로는 형광 정보로서 형광 강도, 형광 펄스 폭 및 형광 적분값 등을 들 수 있다. 또한 형광은 제2 시약에 포함되는 형광 색소에 의해서 염색된 유형 성분 내의 핵산 등으로부터 발생된다. 또, 수광 파장은 제2 시약에 포함되는 형광 색소에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 실시 형태에서는 플로우 사이토미터의 광원은 특별히 한정되지 않고, 형광 색소의 여기에 적합한 파장의 광원을 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 적색 반도체 레이저, 청색 반도체 레이저, 아르곤 레이저, He-Ne 레이저, 수은 아크 램프 등이 사용된다. 특히 반도체 레이저는 기체 레이저에 비해 매우 염가이므로 적합하다.
본 실시 형태의 방법에서 상기의 취득 공정을 실시하는 경우, 검출 공정에서는 상기 취득 공정에서 얻어진 광학적 정보에 근거하여 소변 중 유형 성분으로서 적어도 원주 및 적혈구를 검출한다. 또한 「검출」에는 측정 시료 중에 소변 중 유형 성분의 존재를 알아내는 것만 아니라, 소변 중 유형 성분을 분류 및 계수하는 경우도 포함된다.
본 실시 형태에서, 소변 중 유형 성분의 검출은 산란광 정보와 형광 정보를 2축으로 하는 스캐터그램을 작성하고, 얻어진 스캐터그램을 적절한 해석 소프트를 이용해 해석함으로써 실시되는 것이 바람직하다. 예를 들면, X축을 형광 강도로 하고, Y축을 전방 산란광 강도로서 스캐터그램을 그린 경우, 각 소변 중 유형 성분의 입자 사이즈 및 염색성(핵산 함유량)에 따라 각각의 집단(클러스터)이 스캐터그램 상에 출현한다. 본 실시 형태의 방법에서는 적어도 원주 및 적혈구를, 각각 상이한 영역에 출현하는 2 종류의 집단으로서 검출할 수 있다. 또, 해석 소프트에 의해서, 스캐터그램 상에서 각 집단을 둘러싸는 윈도우를 마련해 각 윈도우 중의 입자 수를 계수할 수 있다.
[소변 시료 분석용 시약]
본 실시 형태의 소변 시료 분석용 시약(이하, 단순히 「시약」이라고도 함)은 소변 시료 중의 유형 성분으로서 적어도 원주 및 적혈구를 검출하기 위한 시약이다. 본 실시 형태의 시약은 4mg/L 이상 50mg/L 이하의 농도로 계면활성제를 포함한다. 본 실시 형태의 시약은 소변 시료와 상기 시약을 혼합하여 조제된 측정 시료 중의 계면활성제의 농도(최종 농도)가 2mg/L 이상 30mg/L 이하, 바람직하게는 4mg/L 이상 22mg/L 이하가 되도록, 소변 시료와의 혼합이 실시되는 시약이다. 또한 본 실시 형태의 시약에 대해서는 본 실시 형태의 소변 시료 분석 방법에 이용한 제1 시약에 대해 서술한 것과 동일하다. 도 6에 본 실시 형태의 시약 11의 일례를 나타낸다.
본 발명의 범위에는 소변 시료 중의 유형 성분으로서 적어도 원주 및 적혈구를 검출하기 위한, 4mg/L 이상 50mg/L 이하의 계면활성제를 포함하는 시약의 사용도 포함된다.
[소변 시료 분석용 시약 키트]
본 실시 형태의 소변 시료 분석용 시약 키트(이하, 단순히 「시약 키트」라고도 함)은 소변 시료 중의 유형 성분으로서 적어도 원주 및 적혈구를 검출하기 위한 시약 키트이다. 본 실시 형태의 시약 키트는 4mg/L 이상 50mg/L 이하의 계면활성제를 포함하는 제1 시약과, 원주 및 적혈구를 염색하기 위한 형광 색소를 포함하는 제2 시약을 포함한다. 본 실시 형태의 시약 키트는 소변 시료, 제1 시약, 및 제2 시약을 혼합하여 조제된 측정 시료 중의 계면활성제의 농도(최종 농도)가 2mg/L 이상 30mg/L 이하, 바람직하게는 4mg/L 이상 22mg/L 이하가 되도록, 소변 시료와의 혼합이 실시되는 시약 키트이다.
본 실시 형태의 시약 키트에 포함되는 제1 시약 및 제2 시약에 대해서는 본 실시 형태의 소변 시료 분석 방법에 이용한 제1 시약 및 제2 시약에 대해 서술한 것과 동일하다.
본 실시 형태에서는 제1 시약과 제2 시약을 다른 용기에 수용하고, 이들을 구비한 2 시약형의 시약 키트로 하는 것이 바람직하다. 도 7에, 용기에 수용된 제1 시약(22) 및 용기에 수용된 제2 시약(33)을 포함하는 본 실시 형태의 시약 키트의 일례를 나타낸다.
본 발명의 범위에는 소변 시료 중의 유형 성분으로서 적어도 원주 및 적혈구를 검출하기 위한, 4mg/L 이상 50mg/L 이하의 계면활성제를 포함하는 제1 시약과, 원주 및 적혈구를 염색하기 위한 형광 색소를 포함하는 제2 시약을 포함하는 시약 키트의 사용도 포함된다.
이하에, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
실시예 1에서는 소변 시료로부터 조제한 측정 시료 중의 계면활성제의 농도와, 소변 중 적혈구에 미치는 영향의 관계를 검토했다.
(1) 소변 시료
소변 시료로서 소변의 침전 잔사 검사에서 적혈구를 확인한 임상 검체를 이용했다.
(2) 시약
·희석용 시약
희석용 시약으로서 하기의 조성의 희석액 1 및 2를 조제했다. 또한 희석액 1 및 2에는 역침투막으로 여과한 물을 용매로서 이용했다.
희석액 1: HEPES-OH(100mM, pH7)(주식회사 도진카가쿠 연구소), EDTA-2K(25mM)(츄부키레스토 주식회사) 및 DTAB(50mg/L)(도쿄카세이 공업주식회사)
희석액 2: HEPES-OH(100mM, pH7), EDTA-2K(25mM) 및 DTAB(10mg/L)
·염색용 시약
시아닌계 형광 색소의 DioC3(3)(주식회사 하야시바라 생물화학 연구소)를 1 mg/mL의 농도가 되도록 에틸렌글리콜(나카라이테스크 주식회사)에 용해하여 염색용 시약을 조제했다.
(3) 측정 및 결과
시료의 측정은 플로우 사이토미터 UF-1000i(시스멕스 주식회사 제)를 이용해서 실시했다. 이 플로우 사이토미터에 의한 측정의 구체적인 공정은 다음과 같다. 우선, 소변 시료(200μL)와, 희석용 시약(580μL)과, 염색용 시약(20μL)을 혼합하여 40℃에서 10초간 반응시켜 측정 시료를 조제했다. 측정 시료 중의 DTAB의 농도(DTAB종 농도)는 희석액 1을 이용한 경우에는 36.25mg/L이며, 희석액 2를 이용한 경우에는 7.25mg/L였다. 그리고, 측정 시료에 광을 조사하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 취득했다. 또한 플로우 사이토미터의 광원으로서, 여기 파장 488nm의 반도체 레이저를 이용했다. 이들 측정값에 근거하여 측정 시료 중의 적혈구 수를 카운트했다. 결과를, 시약에 의한 처리를 하고 있지 않는 소변 시료에 포함되는 적혈구 수에 대한 측정 시료 중의 적혈구 수의 비율(%)로서 도 1에 나타낸다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 측정 시료 중의 DTAB의 최종 농도가 36.25mg/L가 되는 희석액 1을 이용한 경우, 측정 시료 중의 적혈구의 수가 현저하게 감소되어 있었다. 따라서, DTAB의 최종 농도가 36.25mg/L가 되는 조건에서는 소변 시료 중의 적혈구를 정확하게 계수하는 것은 어렵다. 이것에 비해서, 측정 시료 중의 DTAB의 최종 농도가 7.25mg/L가 되는 희석액 1을 이용한 경우에는 적혈구에 미치는 영향이 매우 작았다. 따라서, DTAB의 최종 농도가 7.25mg/L가 되는 조건은 소변 시료 중의 적혈구의 측정에 적합하다는 것을 알 수 있다.
실시예 2
실시예 2에서는 플로우 사이토미터를 이용하는 본 실시 형태의 소변 시료 분석 방법에 의한, 원주와 유사한 소변 중 유형 성분인 점액사와, 원주의 변별 성능을 검토했다.
(1) 소변 시료
소변 시료로서 점액사를 포함하는 소변(소변의 침전 잔사 검사에서 점액사를 확인한 임상 검체. 이하, 「위양성 검체」라고도 함)과, 원주 및 점액사를 포함하는 소변(소변의 침전 잔사 검사에서 원주 및 점액사를 확인한 임상 검체. 이하, 「원주 검체」라고도 함)를 이용했다.
(2) 시약
·희석용 시약
희석용 시약으로서 하기 조성의 희석액 3 및 4를 조제했다. 또한 희석액 3 및 4에는 역침투막으로 여과한 물을 용매로서 이용했다.
희석액 3: HEPES-OH(100mM, pH7) 및 EDTA-2K(25mM)
희석액 4: HEPES-OH(100mM, pH7), EDTA-2K(25mM) 및 DTAB(10mg/L)
·염색용 시약
염색용 시약으로서 실시예 1과 동일한 염색용 시약을 이용했다.
(3) 측정 및 결과
소변 시료(200μL)와, 희석용 시약(580μL)과, 염색용 시약(20μL)을 혼합하여 40℃에서 10초간 반응시켜 측정 시료를 조제했다. 그리고, 얻어진 측정 시료를 형광 현미경 BX51(Olympus 주식회사)로 육안 관찰해 원주를 계수했다. 또, 동일하게 하여 측정 시료를 조제하고, 얻어진 측정 시료를 플로우 사이토미터 UF-1000i(시스멕스 주식회사 제)로도 측정했다. 구체적으로는 측정 시료에 광을 조사하여 전방 산란광 강도, 측방 산란광 강도 및 형광 강도를 취득했다. 또한 플로우 사이토미터의 광원으로서 여기 파장 488nm의 반도체 레이저를 이용했다. 이들 측정값에 근거하여 측정 시료 중의 원주의 수를 산출했다. 결과를 표 1에 나타낸다. 또한 형광 현미경으로의 육안에 의한 결과는 희석액 3으로 처리한 시료의 원주의 수이다.
|
원주 수(입자/㎕) | ||
육안 | FCM, 희석액 3 (DTAB 최종 농도 0㎎/L) |
FCM, 희석액 4 (DTAB 최종 농도 7.25㎎/L) |
|
위양성 검체 | 0.4 | 2.8 | 0.5 |
원주 검체 | 10 | 14.5 | 9.4 |
표 1에 나타낸 바와 같이, DTAB를 포함하지 않는 희석액 3으로 처리한 소변 시료에서는 플로우 사이토미터(FCM)에 의한 측정에서는 원주의 산출 수가 육안에 의한 카운트 수보다 많았다. 이것은 시료 중의 점액사 응집 등의 원주와 유사한 불순물을 원주로서 카운트해 버린 것에 의한 것으로 생각된다. 한편, DTAB를 포함하는 희석액 4로 처리한 소변 시료에서는 육안에 의한 결과와 FCM의 측정 결과가 근사한 것이 분명해졌다. 이것은 DTAB의 작용에 의해, 원주와 유사한 불순물이 저감된 것에 의한 것으로 생각된다.
실시예 3
실시예 3에서는 플로우 사이토미터를 이용하는 본 실시 형태의 소변 시료 분석 방법의 임상 성능을 육안 검사의 결과와 비교해 평가했다.
(1) 소변 시료
소변 시료로서 현미경 관찰에 의해 원주가 출현하고 있지 않다고 판단된 음음성 소변 검체(42 검체)를 이용했다.
(2) 시약
희석용 시약으로서 실시예 2와 동일한 희석액 3 및 4를 이용했다. 염색용 시약으로서 실시예 1과 동일한 염색용 시약을 이용했다.
(3) 측정 및 결과
시료의 측정은 플로우 사이토미터 UF-1000i(시스멕스 주식회사 제)를 이용해서 실시했다. 이 플로우 사이토미터에 의한 측정의 구체적인 공정은 다음과 같다. 우선 시료(200μL)와, 희석용 시약(580μL)과, 각 염색액(20μL)을 혼합하여 40℃에서 10초간 반응시켜 측정 시료를 조제했다. 그리고, 얻어진 측정 시료에 광을 조사하여 전방 산란광 강도, 측방 산란광 강도 및 형광 강도를 취득했다. 또한 플로우 사이토미터의 광원으로서 여기 파장 488nm의 반도체 레이저를 이용했다. 이들 측정값에 근거해 측정 시료 중의 원주의 수를 산출하여 플로우 사이토미터(FCM)에 의해 음성이라고 판단된 검체 수를 구했다. 또, 육안(현미경 관찰)에 의한 음성 검체 수를 레퍼런스로서 FCM에 의한 원주의 분석의 특이도를 구했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
희석액 3 (DTAB 최종 농도 0㎎/L) |
희석액 4 (DTAB 최종 농도 7.25㎎/L) |
|
육안에 의한 음성 검체 수 | 42 | 42 |
FCM에 의한 음성 검체 수 | 30 | 36 |
특이도(%) | 71.4 | 85.7 |
표 2에 나타낸 바와 같이, 시아닌계 형광 색소를 포함하는 염색용 시약과, 분산제를 포함하지 않는 희석액을 이용해 소변 시료를 처리한 경우, FCM 측정에 의한 분석의 특이도는 71.4%였다. 이것에 비해서, 분산제로서 양이온성 계면활성제의 DTAB를 포함하는 희석액으로 소변 시료를 처리함으로써, 분석의 특이도가 향상되었다. 이것은 DTAB의 작용에 의해, 원주와 유사한 불순물이 저감된 것에 의한 것으로 생각된다.
실시예 4
실시예 4에서는 소변 시료로부터 조제한 측정 시료 중의 계면활성제의 농도와, 소변 중 적혈구에 미치는 영향의 관계를 검토했다.
(1) 소변 시료
소변 시료로서 소변의 침전 잔사 검사에서 적혈구를 확인한 임상 검체를 이용했다.
(2) 시약
·희석용 시약
희석용 시약으로서 각종 계면활성제를 다양한 농도로 포함하는 희석액의 시리즈를 조제했다. 조성은 이하와 같다. 또한 각 희석액에는 역침투막으로 여과한 물을 용매로서 이용했다.
(i) 하기의 양이온성 계면활성제를 1종 포함하는 희석액의 시리즈: HEPES-OH(50mM, pH7)(주식회사 도진카가쿠 연구소), EDTA-2K(25mM)(츄부키레스토 주식회사) 및 양이온성 계면활성제(0, 5, 10, 15, 20 또는 30mg/L)
* 양이온성 계면활성제
옥틸트리메틸암모늄브로마이드(OTAB)(도쿄카세이 공업)
도데실트리메틸암모늄브로마이드(DTAB)(도쿄카세이 공업)
테트라데실트리메틸암모늄브로마이드(MTAB)(도쿄카세이 공업)
도데실트리메틸암모늄클로라이드(DTAC)(도쿄카세이 공업)
(ⅱ) 하기의 비이온성 계면활성제를 1종 포함하는 희석액의 시리즈: HEPES-OH(50mM, pH7), EDTA-2K(25mM), 및 비이온성 계면활성제(0, 5, 10, 15, 20 또는 30mg/L)
* 비이온성 계면활성제
폴리옥시에틸렌세틸에테르(BC-7(닛코 케미칼즈))
·염색용 시약
시아닌계 형광 색소의 DiOC3(3)(주식회사 하야시바루 생물화학 연구소)를, 1 mg/mL의 농도가 되도록 에틸렌글리콜(나카라이테스크 주식회사)에 용해하여 염색용 시약을 조제했다.
(3) 측정 및 결과
(3-1) 양이온성 계면활성제를 1종 포함하는 희석액에 대해
시료의 측정은 플로우 사이토미터 UF-1000i(시스멕스 주식회사 제)를 이용해서 실시했다. 이 플로우 사이토미터에 의한 측정의 구체적인 공정은 다음과 같다. 우선 소변 시료(200μL)와, 희석용 시약(580μL)과, 염색용 시약(20μL)을 혼합하여 40℃에서 10초간 반응시켜 측정 시료를 조제했다. 측정 시료 중의 계면활성제의 농도(최종 농도)는 0, 3.6, 7.3, 10.9, 14.5 및 21.8mg/L였다. 그리고, 측정 시료에 광을 조사하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 취득했다. 또한 플로우 사이토미터의 광원으로서 여기 파장 488nm의 반도체 레이저를 이용했다. 이들 측정값에 근거하여 측정 시료 중의 적혈구 수를 카운트했다. 결과를 도 2에 나타낸다.
(3-2) 비이온성 계면활성제를 1종 포함하는 희석액에 대해
희석용 시약으로서 BC-7을 포함하는 희석액의 시리즈를 이용한 것 이외에는 상기와 동일하게 하여 측정 시료를 조제했다. 측정 시료 중의 계면활성제의 농도(최종 농도)는 0, 3.6, 7.3, 10.9, 14.5 및 21.8mg/L였다. 이들 시료를 상기와 동일하게 하여 측정했다. 또, 비교를 위해 DTAB를 포함하는 희석액의 시리즈를 이용하여 동일하게 측정 시료를 측정했다. 그리고, 얻어진 측정값에 근거하여 측정 시료 중의 적혈구 수를 카운트했다. 결과를 도 3에 나타낸다.
도 2에 나타낸 바와 같이, DTAB 이외의 양이온성 계면활성제를 이용한 경우에도, 측정 시료 중의 적혈구 수는 감소하지 않고, 정확하게 측정할 수 있는 것을 알 수 있다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 비이온 계면활성제를 이용한 경우에도, DTAB를 이용한 경우와 동일하게, 측정 시료 중의 적혈구 수는 감소하지 않고, 정확하게 측정할 수 있는 것을 알 수 있다.
실시예 5
실시예 5에서는 소변 시료로부터 조제한 측정 시료 중의 계면활성제의 농도와, 원주와 유사한 불순물을 저감하는 효과의 관계를 검토했다.
(1) 소변 시료
소변 시료로서 원주를 포함하지 않지만 원주와 유사한 불순물을 포함하는 정상 검체를 이용했다.
(2) 시약
·희석용 시약
희석용 시약으로서 각종 계면활성제를 다양한 농도로 포함하는 희석액의 시리즈를 조제했다. 조성은 이하와 같다. 또한 각 희석액에는 역침투막으로 여과한 물을 용매로서 이용했다.
(ⅲ) 하기의 양이온성 계면활성제를 1종 포함하는 희석액의 시리즈: HEPES-OH(50mM, pH7)(주식회사 도진카가쿠 연구소), EDTA-2K(25mM)(츄부키레스토 주식회사) 및 양이온성 계면활성제(0, 1, 3, 5, 8, 10, 20 또는 50mg/L)
* 양이온성 계면활성제
옥틸트리메틸암모늄브로마이드(OTAB)(도쿄카세이 공업)
도데실트리메틸암모늄브로마이드(DTAB)(도쿄카세이 공업)
테트라데실트리메틸암모늄브로마이드(MTAB)(도쿄카세이 공업)
도데실트리메틸암모늄클로라이드(DTAC)(도쿄카세이 공업)
(iv) 하기의 비이온성 계면활성제를 1종 포함하는 희석액의 시리즈: HEPES-OH(50mM, pH7), EDTA-2K(25mM), 및 비이온성 계면활성제(0, 1, 3, 5, 8, 10, 20 또는 50mg/L)
* 비이온성 계면활성제
폴리옥시에틸렌세틸에테르(BC-7(닛코 케미칼즈))
·염색용 시약
염색용 시약으로서 실시예 4와 동일한 염색용 시약을 이용했다.
(3) 측정 및 결과
(3-1) 양이온성 계면활성제를 1종 포함하는 희석액에 대해
시료의 측정은 플로우 사이토미터 UF-1000i(시스멕스 주식회사 제)를 이용해서 실시했다. 이 플로우 사이토미터에 의한 측정의 구체적인 공정은 다음과 같다. 우선 소변 시료(200μL)와, 희석용 시약(580μL)과, 염색용 시약(20μL)을 혼합하여 40℃에서 10초간 반응시켜 측정 시료를 조제했다. 측정 시료 중의 계면활성제의 농도(최종 농도)는 0, 0.7, 2.2, 3.6, 5.8, 7.3, 14.5 및 36.3mg/L였다. 그리고, 측정 시료에 광을 조사하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 취득했다. 또한 플로우 사이토미터의 광원으로서 여기 파장 488nm의 반도체 레이저를 이용했다. 이들 측정값에 근거하여 측정 시료 중의 원주 유사 불순물의 수를 카운트했다. 결과를 도 4에 나타낸다.
(3-2) 비이온성 계면활성제를 1종 포함하는 희석액에 대해
희석용 시약으로서 BC-7을 포함하는 희석액의 시리즈를 이용한 것 이외에는 상기와 동일하게 하여 측정 시료를 조제했다. 측정 시료 중의 계면활성제의 농도(최종 농도)는 0, 0.7, 2.2, 3.6, 5.8, 7.3, 14.5 및 36.3mg/L였다. 이들 시료를 상기와 동일하게 하여 측정했다. 또, 비교를 위해 DTAB를 포함하는 희석액의 시리즈를 이용하여 동일하게 측정 시료를 측정했다. 그리고, 얻어진 측정값에 근거하여 측정 시료 중의 원주 유사 불순물의 수를 카운트했다. 결과를 도 5에 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 측정 시료 중의 양이온성 계면활성제의 농도가 2.2mg/L 이상일 때, 0 및 0.7mg/L의 경우에 비해, 검출되는 불순물의 수가 감소했다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 비이온성 계면활성제 BC-7을 이용한 경우에도, DTAB를 이용한 경우와 동일하게, 측정 시료 중의 계면활성제의 농도가 2.2mg/L 이상일 때, 검출되는 불순물의 수가 감소했다. 이들 결과로부터, 측정 시료 중의 계면활성제의 농도를 2.2mg/L 이상으로 함으로써, 잘못하여 원주로서 검출될 우려가 있는 불순물을 저감할 수 있는 것을 알 수 있다.
본 출원은 2014년 2월 28일에 출원된 일본 특허 출원 특원 2014-039282호에 관한 것이며, 이들 특허 청구의 범위, 명세서 및 요약서의 모두는 본 명세서 중에 참조로서 포함된다.
11 소변 시료 분석용 시약
22 제1 시약
33 제2 시약
22 제1 시약
33 제2 시약
Claims (24)
- 소변 시료와, 계면활성제를 포함하는 시약을 혼합하여 측정 시료를 조제하는 공정과,
조제 공정에서 얻어진 측정 시료에 포함되는 소변 중 유형 성분으로서 적어도 원주(圓柱) 및 적혈구를 검출하는 공정
을 포함하며,
조제 공정에서 얻어진 측정 시료 중의 계면활성제의 농도가 2mg/L 이상 30mg/L 이하이고,
상기 계면활성제가 4급 암모늄염형 계면활성제 및 피리디늄염형 계면활성제인 양이온성 계면활성제, 및 폴리옥시에틸렌알킬에테르로부터 선택되는 적어도 하나인 소변 시료 분석 방법. - 청구항 1에 있어서,
조제 공정에서 얻어진 측정 시료 중의 계면활성제의 농도가 2.2mg/L 이상인 소변 시료 분석 방법. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
조제 공정에서 얻어진 측정 시료 중의 계면활성제의 농도가 4mg/L 이상인 소변 시료 분석 방법. - 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
조제 공정에서 얻어진 측정 시료 중의 계면활성제의 농도가 22mg/L 이하인 소변 시료 분석 방법. - 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
조제 공정에서 얻어진 측정 시료 중의 계면활성제의 농도가 21.8mg/L 이하인 소변 시료 분석 방법. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양이온성 계면활성제가 4급 암모늄염형 계면활성제인 소변 시료 분석 방법. - 청구항 7에서 있어서,
상기 식(I)에서, R2, R3 및 R4의 각각이 메틸기인 소변 시료 분석 방법. - 청구항 7 또는 청구항 8에 있어서,
상기 식(I)에서, X-가 할로겐 이온이며, 브롬화물 이온, 염화물 이온 및 요오드화물 이온으로부터 선택되는 적어도 1개인 소변 시료 분석 방법. - 청구항 6 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 4급 암모늄염형 계면활성제가 도데실트리메틸암모늄브로마이드, 옥틸트리메틸암모늄브로마이드, 테트라데실트리메틸암모늄브로마이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드, 옥틸트리메틸암모늄클로라이드, 및 테트라데실트리메틸암모늄클로라이드로부터 선택되는 적어도 1개인 소변 시료 분석 방법. - 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
조제 공정에서, 원주 및 적혈구를 염색하기 위한 형광 색소를 포함하는 시약을 추가로 혼합하는 소변 시료 분석 방법. - 청구항 11에 있어서,
원주 및 적혈구를 염색하기 위한 형광 색소가 시아닌계 형광 색소인 소변 시료 분석 방법. - 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
조제 공정에서 얻어진 측정 시료에 포함되는 소변 중 유형 성분에 광을 조사하여 광학적 정보를 취득하는 공정을 추가로 포함하고,
검출 공정이 취득한 광학적 정보에 근거하여 소변 중 유형 성분으로서 적어도 원주 및 적혈구를 검출하는 공정인 소변 시료 분석 방법. - 청구항 13에 있어서,
상기 광학적 정보가 적어도 산란광 정보를 포함하는 소변 시료 분석 방법. - 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
계면활성제를 포함하는 시약이 킬레이트제를 추가로 포함하는 소변 시료 분석 방법. - 청구항 15에 있어서,
상기 킬레이트제가 에틸렌디아민4아세트산염(EDTA염)인 소변 시료 분석 방법. - 4mg/L 이상 50mg/L 이하의 계면활성제를 포함하고,
상기 계면활성제가 4급 암모늄염형 계면활성제 및 피리디늄염형 계면활성제인 양이온성 계면활성제, 및 폴리옥시에틸렌알킬에테르로부터 선택되는 적어도 하나인, 소변 중 유형 성분으로서 적어도 원주 및 적혈구를 검출하기 위한 소변 시료 분석용 시약. - 청구항 17에 있어서,
상기 소변 시료 분석용 시약 중의 계면활성제의 농도가 4.4mg/L 이상 43.6mg/L 이하인 소변 시료 분석용 시약. - 4mg/L 이상 50mg/L 이하의 계면활성제를 포함하는 제1 시약과,
원주 및 적혈구를 염색하기 위한 형광 색소를 포함하는 제2 시약
을 포함하고,
상기 계면활성제가 4급 암모늄염형 계면활성제 및 피리디늄염형 계면활성제인 양이온성 계면활성제, 및 폴리옥시에틸렌알킬에테르로부터 선택되는 적어도 하나인, 소변 중 유형 성분으로서 적어도 원주 및 적혈구를 검출하기 위한 소변 시료 분석용 시약 키트. - 청구항 19에 있어서
상기 제1 시약 중의 계면활성제의 농도가 4.4mg/L 이상 43.6mg/L 이하인 소변 시료 분석용 시약 키트. - 청구항 11 또는 청구항 12에 기재된 소변 시료 분석 방법에 이용되어 원주 및 적혈구를 염색하기 위한 형광 색소, 및 상기 형광 색소를 용해시키기 위한 용매를 포함하는 시약.
- 청구항 21에 있어서,
상기 용매가 물, 수용성 유기용매 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나인 시약. - 청구항 22에 있어서,
상기 수용성 유기용매가 탄소수 1~3의 저급 알코올, 에틸렌글리콜 및 디메틸설폭사이드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나인 시약. - 청구항 21에 있어서,
상기 용매가 에틸렌글리콜인 시약.
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