DE69434942T2

DE69434942T2 - Mehrzweckreagenzsystem zur schnellen lysierung von vollblutproben

Info

Publication number: DE69434942T2
Application number: DE69434942T
Authority: DE
Inventors: Young Ran Sunnyvale KIM; Joanna Mountain View KANTOR
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1993-02-25
Filing date: 1994-02-03
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2014-02-04
Also published as: AU6235994A; US5648225A; CA2156752A1; JPH08507147A; CA2156752C; WO1994018828A1; EP0685994B1; US5516695A; ES2284160T3; JP2716267B2; DE69434942D1; EP0685994A4; EP0685994A1

Description

Hintergrund
Diese Erfindung betrifft ein Mehrzweckreagenzsystem und ein Verfahren für eine schnelle Analyse von Vollblutproben. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung ein Mehrzweckreagenzsystem, das in der Lage ist, rote Blutkörperchen schnell zu lysieren und gleichzeitig weiße Blutkörperchen zu fixieren, nützlich zur Durchführung von Differenzialanalysen weißer Blutkörperchen und quantitativer Analysen von nukleierten roten Blutkörperchen oder einer Lymphozytensubklassifikation unter Verwendung von immunophänotypisierender Techniken auf einem automatisierten klinischen Hämatologieanalysator oder Durchflußzytometer.
Das periphere Blut einer normalen Person enthält rote Blutkörperchen, auch bekannt als Erythrozyten, und fünf Hauptklassen von reifen weißen Blutkörperchen, auch bekannt als Leukozyten. Es gibt mindestens fünf Klassen von Leukozyten, bekannt als Neutrophile, Eosinophile, Monozyten, Lymphozyten und Basophile. Jeder Typ von reifen Blutkörperchen übernimmt spezialisierte Funktionen, die notwendig sind bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Wirts. Die Konzentration von jeder Klasse von peripheren Blutkörperchen wird straff reguliert und überwacht durch einen dynamischen Prozess, der eine Vielzahl von Faktoren einschließt, die in der Mikroumgebung des Knochenmarks vorhanden sind. Unter bestimmten Krankheitszuständen kann das Knochenmark entweder eine erhöhte oder eine verminderte Anzahl von bestimmten Klassen von weißen Blutkörperchen freisetzen. In anderen Zuständen ist die gesamte Regulation der Anzahl von peripheren Blutkörperchen, die aus dem Knochenmark freigesetzt werden, gestört, und eine unkontrollierte Anzahl von unreifen weißen oder roten Blutkörperchen wird in das periphere Blut freigesetzt.
Deshalb ist die Überwachung der Konzentration der fünf normalen Klassen von Leukozyten und die Identifizierung des Vorhandenseins von unreifen Erythrozyten und Leukozyten in dem peripheren Blut ein wichtiges diagnostisches Werkzeug für Ärzte. Typischerweise wurden diese Funktionen durchgeführt durch Differentialzählungen von weißen Blutkörperchen, wodurch die relativen Proportionen der fünf normalen Klassen von Leukozyten und jeglichen abnormalen Zellen mikroskopisch bestimmt werden. Die manuelle Prozedur ist sehr zeitraubend, subjektiv und arbeitsintensiv.
In jüngster Zeit wurden automatisierte Verfahren und automatisierte Durchflußsystemapparate entwickelt, um die Last der Differenzialanalyse von weißen Blutkörperchen zu erleichtern. Verschiedene dieser Systeme sind beschrieben in U.S. Patent Nummern 4,099,917; 4,617,275; 4,521,518; und 4,801,549. Einige dieser Systeme basieren auf zytochemischen Verfahren, um einzelne Zelltypen spezifisch zu identifizieren; einige dieser Systeme unterscheiden drei Leukozytentypen durch elektronische Impedanzmessungen des Zellvolumens; und andere Verfahren verwenden eine Kombination aus optischen und elektronischen Impedanzmessungen, um die fünf Klassen von peripheren weißen Blutkörperchen zu unterscheiden.
Jüngste Fortschritte in der Zellimmunologie und der Durchflußzytometrie wurden verwendet, um Lymphozytenunterklassen wie zum Beispiel Helfer T-Zellen zu identifizieren und zu quantifizieren. Die Lymphozytensubklassifikation wurde ein wichtiges diagnostisches Werkzeug, insbesondere hinsichtlich der wachsenden AIDS Epidemie. Die konventionelle Lymphozytensubklassifikation involviert die folgenden Schritte:
(1) die Trennung der Lymphozyten von anderen peripheren Blutkörperchen durch Dichtegradientenzentrifugation; (2) die Reaktion der Lymphozyten mit Fluorochrom-markierten monoklonalen Antikörpern, die auf spezifische Lymphozyten-Oberflächenantigene gerichtet sind; und (3) die Analyse von Lymphozyten-Antikörperreaktionsprodukten unter Verwendung der Durchflußzytometrie. Derzeit richtet sich ein großer Fortschritt auf die Entwicklung von Vollblutmethoden, die die Notwendigkeit der Dichtegradientenzentrifugation umgehen. Die in jüngster Zeit entwickelten Vollblutmethoden für die Lymphozytensubklassifikation umfassen das Lysieren der roten Blutkörperchen, das Entfernen von Spuren roter Blutkörperchen und von Zelldebris durch Zentrifugation, und das Erhalten der Morphologie der restlichen weißen Blutkörperchen durch Suspendieren der weißen Blutkörperchen in einer isotonischen Salzlösung, die geeignete Fixiermittel enthält. Obwohl diese Methodiken die Notwendigkeit der Dichtegradientenzentrifugation vermeiden, sind sie immer noch inkompatibel mit verfügbaren automatisierten klinischen Hämatologieanalysatoren, da sie immer noch einen Zentrifugationsschritt erfordern.
Allgemein gesprochen sind die Reagenzsysteme, die für die Verwendung während der Analyse von nukleierten roten Blutkörperchen (NRBC) erhältlich sind, bisher nicht in der Lage, eine Differenzierung und Zählung von NRBC Signalen aus roten Blutkörperchen-Stroma oder großen Plättchen zu erlauben, und sie erlauben dem Instrument lediglich mögliche NRBC Signale zu markieren.
Es ist unerlässlich in Leukozytenanalysen, daß alle der roten Blutkörperchen vollständig lysiert werden. Da rote Blutkörperchen den weißen Blutkörperchen zahlenmäßig um ungefähr 700 zu 1 überlegen sind, können sogar ein Prozent an unlysierten roten Blutkörperchen die Zählungen der weißen Blutkörperchen verzerren. Einige Reagenzien, die verwendet werden, um rote Blutkörperchen zu Lysieren, erfordern einen zu langen Inkubationszeitraum, um in einem automatisierten klinischen Analysator praktikabel zu sein. Zum Beispiel braucht die Trisgepufferte Ammoniumchloridlösung, die von K.A. Murihead in Clinical Cytometry, Ann. N.Y. Acd. Sci., Band 468, Seiten 113-127 (1986) empfohlen wird, 5 bis 10 Minuten, um rote Blutkörperchen zu lysieren, was für eine Automatisierung zu unpraktisch ist.
Desweiteren kann eine unvollständige Hämolyse mit bestimmten lytischen Reagenzien zu roten Blutkörperchen-Stroma führen, welche ausreichend Hämoglobin zurückhalten, um hohe Hintergrundzählungen in automatisierten klinischen elektrooptischen Systemen zu erzeugen. Deshalb müssen die weißen Blutkörperchen, die analysiert werden sollen, zuerst aus dem roten Blutkörperchen-Stroma durch Zentrifugation entfernt werden, eine Prozedur, die ein begrenzender Faktor ist, wenn ein Reagenzsystem für die Automatisierung angepaßt wird.
Andere Reagenzsysteme, wie zum Beispiel diejenigen, die in U.S. Patent Nummern 4,902,613 und 4,654,312 beschrieben sind, welche verwendet werden, um rote Blutkörperchen zu lysieren, enthalten Lösungsmittel mit hohem Brechungsindex. Ein Zellsuspendierendes Medium, welches einen hohen Brechungsindex hat, hat zwei Nachteile: (1) der Brechungsindex kann zu hoch sein für eine gemeinsame Durchflußzellensalzlösunghülle; und (2) der hohe Brechungsindex des Suspendiermediums kann Signale von kleinen zellulären Komponenten, wie zum Beispiel kleinen Lymphozyten und Cytoplasma-lysierten nukleierten roten Blutkörperchen maskieren. Somit müssen, bevor die Zellen in einer Durchflußzelle analysiert werden können, die Zellen aus dem Medium mit hohem Brechungsindex durch Zentrifugation entfernt werden und in einer isotonischen Lösung resuspendiert werden. Solche manuellen Prozeduren sind nicht wünschenswert oder anpassbar für die Verwendung auf einem vollautomatisierten klinischen Analysator.
Zusätzlich sind lytische Reagenzien, wie zum Beispiel diejenigen, die in U.S. Patent Nummer 5,155,044 beschrieben sind, zu hypoton und/oder sauer. Solche lysierenden Reagenzien erfordern die schnelle "nach-" Zugabe einer Lösung mit hohem Salzgehalt und/oder einer alkalischen Salzlösung, um die Morphologie der weißen Blutkörperchen für die Analyse zu bewahren. In ähnlicher Weise werden lytische Reagenzien, wie zum Beispiel diejenigen, die in U.S. Patent Nummer 4,751,179 beschrieben sind, nicht nur rote Blutkörperchen lysieren, sondern werden auch weiße Blutkörperchen lysieren, so lange nicht ein separates Fixiermittel zu der geeigneten Zeit und in der geeigneten Konzentration hinzugefügt wird, um die Lyse der weißen Blutkörperchen zu verhindern. Diese Reagenzien eröffnen das Potential der Schädigung der weißen Blutkörperchen, insbesondere in abnormalen Blutproben, die fragile weiße Blutkörperchen enthalten (wie zum Beispiel in Blutproben von Patienten mit chronischer lymphozytischer Leukämie [CCL]).
Desweiteren erfordern Reagenzsysteme, wie zum Beispiel diejenigen, die in U. S. Patent Nummern 4, 099, 914, 4, 801, 549 und 4,978,624 beschrieben sind, Inkubationen bei hohen Temperaturen, zum Beispiel über 50°C, um die roten Blutkörperchen vollständig zu lysieren. Temperaturen über 45°C werden im allgemeinen beginnen, die meisten Zelloberflächenantigene zu denaturieren und werden die Hämoglobinverklumpung in dem Verfahren bewirken. Obwohl diese Systeme verwendet werden können, um Differenzialanalysen von weißen Blutkörperchen durchzuführen, zerstören sie das Mittel zur Differenzierung von Subpopulationen von Lymphozyten und können nicht für die immunophänotypische Lymphozytenklassifikation verwendet werden.
Viele der derzeit verwendeten Reagenzsysteme erfordern die cytochemische Anfärbung von fixierten weißen Blutkörperchen, bevor sie der Differentialanalyse unterworfen werden. Diese Systeme erfordern die zeitlich abgestimmte Zugabe von vielfachen Reagenzien und Inkubationszeiträumen und sind im allgemeinen nicht anpassbar für die Quantifizierung von nukleierten roten Blutkörperchen oder für die immunophänotypische Lymphozytenklassifikation. Desweiteren vermindert jeder Schritt der Reagenzienzugabe oder der anderen Manipulation einer Blutprobe die Präzision der endgültigen Zählungen, die aus der Probe erhalten werden.
Basierend auf dem vorhergehenden ist ein Bedürfnis nach einem Mehrzweckreagenzsystem entstanden, welches rote Blutkörperchen schnell und vollständig lysieren kann, während gleichzeitig die Morphologie der weißen Blutkörperchen und die Lymphozytenzelloberflächenantigene erhalten bleiben.
EP-A-0 430 750 offenbart ein Reagenz, das ein ternäres oder quaternäres Ammoniumsalz, Glutaraldehyd oder Formaldehyd, einen physiologischen Puffer, Saponin, SDS, umfaßt. Der lysierende Wirkstoff ist Saponin und/oder Dodecylnatriumsulfat. Das Reagenz enthält weiterhin ein physiologisches Salz oder eine Kombination von Salzen.
ZUSAMMENFASSUNG
Die oben diskutierten Probleme wurden in der vorliegenden Erfindung gelöst.
Dementsprechend ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Mehrzweckreagenzsystem oder Blutverdünnungsmittel bereitzustellen, das rote Blutkörperchen schnell und vollständig lysiert, während gleichzeitig die Morphologie der weißen Blutkörperchen und die Lymphozytenzelloberflächenantigene für die automatisierten elektro-optischen Analysen von peripheren Vollblutzellen erhalten bleiben.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Mehrzweckreagenzsystem bereitzustellen, das die schnelle Differenzierung von weißen Blutkörperchen auf einem automatisierten klinischen hämatologischen Analysator erlaubt.
Wiederum eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Mehrzweckreagenzsystem bereitzustellen, welches die Identifizierung und Quantifizierung von nukleierten roten Blutkörperchen (NRBCs) auf einem automatisierten klinischen hämatologischen Analysator erlaubt.
Wiederum eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Mehrzweckreagenzsystem bereitzustellen, das die Notwendigkeit der Zentrifugation von Lymphozyten-Antikörper-Reaktionsprodukten vor der Zählung der Fluorochrom-konjugierten Antikörper gebundenen Lymphozytensubklassen auf einem automatisierten klinischen Durchflußzytometer eliminiert.
Das Mehrzweckreagenzsystem der vorliegenden Erfindung umfaßt ein nicht-quaternäres Ammoniumsalz, ein aliphatisches Aldehyd mit eins bis vier Kohlenstoffen, einen nicht-Phosphatpuffer, der im wesentlichen inert ist gegenüber dem aliphatischen Aldehyd, und Wasser, um einen effektiven pH von zwischen ungefähr 5,5 und ungefähr 7,5, und eine Osmolarität von zwischen ungefähr 160 bis ungefähr 310 mOsm/L (Milliosmol pro Liter) zu ergeben. Verschiedene optionale Reagenzien für die vorliegende Erfindung schließen einen oberflächenaktiven Wirkstoff, wie zum Beispiel Saponin, ein Antikoagulans, ein Alkalisalz von Bicarbonat, ein nukleares Färbemittel oder einen Antikörper, der gegen spezifische Zelloberflächenantigene gerichtet ist, ein.
Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt die Herstellung eines Mehrzweckreagenzsystems, Mischen des Mehrzweckreagenzsystems mit einer Vollblutprobe, Inkubieren der Reagenzsystem-Blutmischung für mindestens 10 Sekunden, und Analysieren der Blutprobe auf einem automatisierten Hämatologieanalysator.
Ein Merkmal und ein technischer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß das offenbarte Mehrzweckreagenzsystem schnell und vollständig rote Blutkörperchen lysieren kann, während gleichzeitig die Morphologie der weißen Blutkörperchen bewahrt wird, während die Notwendigkeit für die Zugabe eines zweiten Reagenzes oder Fixiermittels eliminiert wird. Das offenbarte Verfahren der Lyse von roten Blutkörperchen kann in weniger als 20 Sekunden stattfinden.
Ein anderes Merkmal und ein technischer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß das offenbarte Mehrzweckreagenzsystem weiße Blutkörperchen adäquat fixiert und fragile Lymphozyten, wie zum Beispiel CLL Lymphozyten nicht lysieren wird. Desweiteren hat das Mehrzweckreagenzsystem gezeigt, daß es weiße Blutkörperchen, die dem Reagenz über verlängerte Zeiträume ausgesetzt sind, stabilisiert.
Wiederum ein anderes Merkmal und ein anderer technischer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß das offenbarte Mehrzweckreagenzsystem einen Brechungsindex ähnlich zu dem von isotonischer Salzlösung, welche in anderen hämatologischen Messungen verwendet wird, hat.
Ein anderes Merkmal und ein anderer technischer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die Lyse-Kraft des offenbarten Mehrzweckreagenzsystems stark genug ist, um rote Blutkörperchen in einer so gering wie 16 mal verdünnten Vollblutprobe vollständig und schnell zu lysieren, womit eine ausreichende Dichte an weißen Blutkörperchen erhalten wird, um eine genaue und schnelle Zellanalyse zu erlauben. Dies erlaubt eine automatisierte Analyse in einem klinischen Multiparameterinstrument.
Wiederum ein anderes Merkmal und ein anderer technischer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß das offenbarte Mehrzweckreagenzsystem Lymphozytenzelloberflächenantigene, zum Beispiel CD3, CD4, CD8 und CD19 bewahrt.
Wiederum ein anderes Merkmal und ein anderer technischer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß das offenbarte Verfahren rote Blutkörperchen so gründlich lysiert, daß Signale von roten Blutkörperchenschatten ausreichend klein sind, um klar von denjenigen der Lymphozyten abgetrennt zu werden, ohne Auswaschen oder anderweitiges Entfernen der roten Blutkörperchen-Stroma, während immer noch eine verbesserte Abtrennung der Subpopulation bereitgestellt wird.
Wiederum ein anderes Merkmal und ein anderer technischer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß das offenbarte Verfahren der peripheren Blutanalyse die Notwendigkeit für entweder konventionelle oder Dichtegradienten-Zentrifugationsschritte umgeht.
Wiederum ein anderes Merkmal und ein anderer technischer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß das offenbarte Verfahren die Quantifizierung von nukleierten roten Blutkörperchen auf einem klinischen Durchflußcytometer erlaubt.
Ein weiteres Merkmal und ein weiterer technischer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß das offenbarte Mehrzweckreagenzsystem eine schnelle, Ein-Reagenz, Ein-Röhrchen, automatisierte Differenzialanalyse von peripheren weißen Blutkörperchen ermöglicht.
Ein zusätzliches Merkmal und ein zusätzlicher technischer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß das Verfahren eine schnelle Differenzialanalyse von Lymphozyten-Unterklassen auf einem automatisierten Durchflußzytometer erlaubt.
Diese und weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen ersichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Für ein vollständigeres Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer Vorteile wird nun auf die folgenden Beschreibungen Bezug genommen, die zu den begleitenden Zeichnungen gemacht werden, worin:
1 die Verteilung der weißen Blutkörperchen einer normalen Blutprobe zeigt, verarbeitet wie in Beispiel 1 beschrieben. Die hergestellte Zellsuspension wurde direkt durch ein CD3500^TM Analysator optisches System geführt, wobei die Hydraulik des Systems umgangen wurde.
2 zeigt die Verteilung der weißen Blutkörperchen einer normalen Blutprobe, verarbeitet wie in Beispiel 12 beschrieben. Die verarbeitete Zellsuspension wurde direkt durch ein CD3500^TM Analysator optisches System geführt, wobei die Hydraulik des Systems umgangen wurde. Jeder Cluster repräsentiert eine Subpopulation der weißen Blutkörperchen, wie markiert;
3a zeigt einen FACScan^TM Displayausdruck einer normalen Blutprobe, verarbeitet wie in Beispiel 5 beschrieben, mit einer nuklearen Färbung, aber ohne Hühnererythrozytennuklei (CEN);
3b zeigt einen FACScan^TM Displayausdruck einer normalen Blutprobe, ergänzt mit Hühnererythrozytennuklei, die wie in Beispiel 5 beschrieben mit einer nuklearen Färbung verarbeitet war. Eine FL3 gefärbte CEN Population erscheint an der oberen linken Ecke;
4a, 4b, 4c und 4d zeigen FACScan^TM Displayausdrucke einer normalen Blutprobe, die wie in Beispielen 2, 3 und 4 verarbeitet wurde.
5b, 5d, 5f und 5h zeigen FACScan^TM Displayausdrucke einer normalen Blutprobe, die wie in Beispielen 2, 3 und 4 für die immuno-Phänotypisierung verarbeitet wurde, und 5a, 5c, 5e und 5g zeigen FACScanTM Displayausdrucke derselben Probe, hergestellt in derselben Weise, aber lysiert mit Becton Dickinson FacsLyse^TM.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Im weiteren Sinne betrifft die vorliegende Erfindung ein Mehrzweckreagenzsystem, oder ein Blutverdünnungsmittel, das geeignet ist für die schnelle Analyse von nukleierten peripheren Blutkörperchen. Das Mehrzweckreagenzsystem kann rote Blutkörperchen vollständig und schnell lysieren, während gleichzeitig die Morphologie der weißen Blutkörperchen und die Antigenität von Lymphozytenoberflächenantigenen bewahrt wird.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Mehrzweckreagenzsystem, umfassend von ungefähr 3 bis ungefähr 7 Gramm pro Liter eines nicht-quaternären Ammoniumsalzes, von ungefähr 0,04 bis ungefähr 0,1 Volumenprozent (d.h. Gramm pro 100 ml) eines aliphatischen Aldehyds mit eins bis vier Kohlenstoffen, von ungefähr 10 bis ungefähr 20 mM eines nicht Phosphatpuffers, welcher im wesentlichen inert ist gegenüber dem aliphatischen Aldehyd und Wasser. Der pH des Reagenzsystems liegt innerhalb eines pH Bereichs von ungefähr 5,5 bis ungefähr 7,5, und die Osmolalität des Reagenzsystems ist zwischen ungefähr 160 bis 310 mOsm/L. Der Brechungsindex des Reagenzsystems kann ähnlich sein zu dem einer Salzlösung und wäre innerhalb des Bereiches von ungefähr 1,333 bis ungefähr 1,336. Der nicht Phosphatpuffer, welcher keine primäre Aminogruppe enthält, ist gegenüber dem aliphatischen Aldehyd inert. Somit sollte im allgemeinen der nicht Phosphatpuffer keine primäre Aminogruppe enthalten.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet ein Mehrzweckreagenzsystem, das ungefähr 95 mM Ammoniumchlorid (5g/l), ungefähr 0,075 Volumenprozent Formaldehyd von ungefähr 10 mM bis ungefähr 20 mM Acetadpuffer, ungefähr 10 mM Kaliumbicarbonat, und ungefähr 0,01 pro Gewicht Volumen (d.h., Gramm pro 100 ml) Saponin umfaßt. Der pH des Reagenzsystems wird auf einen Bereich von ungefähr 6,2 bis ungefähr 6,5 eingestellt, und die Osmolalität des Reagenzsystems ist von ungefähr 215 bis ungefähr 270 mOsm/L.
Die Osmolalität ist definiert als die Anzahl an gelösten Partikeln in einem Einheitsvolumen einer wässerigen Lösung. Die Osmolarität ist definiert als die Anzahl von gelösten Partikeln in einem Einheitsgewicht einer Wasserlösung. In der Praxis haben Osmolalität und Osmolarität numerische Werte, welche sehr nahe sind in den Bereichen, die in die vorliegende Erfindung involviert sind. Eine Lösung, die 1/1000 eines Osmols aufgelöst pro Kilogramm hat, hat eine Konzentration von 1 Milliosmol ("mOs") pro Kilogramm. Ein Osmol ist die Anzahl von Partikeln in 1 Gramm Molekulargewicht von undissoziiertem gelösten Stoff. Die Tonizität ist ein Maß des osmotischen Drucks einer Lösung relativ zu dem osmotischen Druck der Blutflüssigkeiten. Eine hypotone Lösung ist eine Lösung mit niedrigerem osmotischem Druck der Tonizität als dem von Blut. Die Osmolalität einer hypotonen Lösung ist üblicherweise in dem Bereich von ungefähr 80-250 mOs/l. Eine isotonische Lösung hat dieselbe Tonizität wie Blut. Hier liegt die Osmolalität üblicherweise in Bereichen von ungefähr 280 bis ungefähr 310 mOs/l. Eine hypertone Lösung ist eine Lösung mit größerer Tonizität als Blut, welche normalerweise einen Osmolalitätsbereich von ungefähr 310-440 mOs/l hat. Wasser hat die Osmolalität von ungefähr 10-20 mOs/l.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des Mehrzweckreagenzsystems in der automatisierten Bestimmung von Differenzialzählungen weißer Blutkörperchen, nukleierter roter Blutkörperchen, und der Lymphozytenphänotypisierung. Das Verfahren für die schnelle Analyse von peripheren nukleierten Vollblutzellen schließt die folgenden Schritte ein: Mischen des Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung mit einer antikoagulierten Vollblutprobe (wobei das Blut 16- bis 100-fach verdünnt ist), Inkubieren der Verdünnungsmittel-Blutmischung bei Temperaturen von ungefähr 25°C bis 46°C für mindestens 10 Sekunden, und Analysieren der peripheren nukleierten Blutzellen mit einem automatisierten Hämatologieinstrument.
Das Verfahren unter Verwendung des Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung in der Differenzialanalyse von peripheren weißen Blutkörperchen ist ein schnelles, Ein-Reagenz-Verfahren der gleichzeitigen Lysierung von roten Blutkörperchen und der Fixierung von weißen Blutkörperchen, worin die weißen Blutkörperchen ihre lichtstreuenden Charakteristika behalten. Beispiel 1 veranschaulicht die Anwendung einer bevorzugten Ausführungsform des offenbarten Mehrzweckreagenzsystems in einem schnellen Verfahren für die Differenzialanalyse von weißen Blutkörperchen. 1 zeigt die Differenzialanalyse von weißen Blutkörperchen in einer normalen Blutprobe (verarbeitet wie in Beispiel 1 beschrieben) durch Lichtstreuung. Im allgemeinen fließen die Zellen durch eine optische Sichtkammer, wo ein photoelektrischer Meßprozess das absorbierte Licht oder die Art von Licht, die durch jede Zelle bei ausgewählten Winkeln gestreut wird, aufzeichnet. Elektronische Signale, gesammelt von gestreutem Licht bei unterschiedlichen Winkeln, werden als zweidimensionale Punktplots wie in 1 gezeigt, graphisch dargestellt. Granulozyten werden zuerst auf dem Zytogramm identifiziert, 10 deg vs 90 deg Streuungsplot durch Ziehen der Schwelle zwischen den Granulozyten und dem Rest der weißen Blutkörperchenpopulation, wie in 1c gezeigt. Eosinophile werden als nächstes auf dem ORTHOGONAL vs DEPOL Zytogramm identifiziert, wie in 1b gezeigt. Dann werden Monozyten und Lymphozyten auf dem SIZE vs COMPLEXITY Zytogramm (1a) entlang der Y Achse identifiziert, weil Monozyten größer als Lymphozyten sind. Die Signale, die zwischen Lymphozyten und Granulozyten entlang der X Achse (COMPLEXITY) fallen, und die geringer sind als die der Monozyten entlang der Y Achse, die nicht zu irgendeiner der bereits identifizierten Populationen gehören (Neutrophile und Eosinophile), sind Basophile, wie markiert (1a).
Ein erster Inhaltsstoff des Mehrzweckreagenzsystems ist ein nicht quaternäres Ammoniumsalz. Vorzugsweise sollten weder di-noch tri-Ammoniumsalze verwendet werden. Eine Vielfalt von mono-Ammoniumsalzen, insbesondere die halogenierten Salze, können von ungefähr drei bis ungefähr sieben Gramm pro Liter und vorzugsweise bei 5 Gramm pro Liter verwendet werden. Beispiele für solche nicht quaternären Ammoniumsalze schließen NH₄X ein, worin X ein Halogen ist. Vorzugsweise ist ein solches nicht- quaternäres Ammoniumsalz NH₄Cl.
Ein zweiter Inhaltsstoff des Mehrzweckreagenzsystems ist ein kurzkettiges aliphatisches Aldehyd. Vorzugsweise haben solche aliphatischen Aldehyde von eins bis vier Kohlenstoffe. Beispielhafte Aldehyde schließen Formaldehyd und das Polymer, Paraformaldehyd, ein. In den richtigen Verhältnissen und Konzentrationen wird das Aldehyd, im Zusammenhang mit dem nicht-quaternären mono-Ammoniumsalz, und dem Puffer, die roten Blutkörperchen schnell und vollständig lysieren. Zusätzlich wird das Aldehyd weiße Blutkörperchen fixieren und ihre Membranintegrität bewahren. Formaldehyd oder ein vergleichbares Aldehyd, wird in der vorliegenden Erfindung in Mengen von ungefähr 0,04 Volumenprozent bis ungefähr 0,10 Volumenprozent, und vorzugsweise von ungefähr 0,08 Volumenprozent bis ungefähr 0,1 Volumenprozent vorhanden sein.
Ein dritter Inhaltsstoff des Mehrzweckreagenzsystems ist ein nicht-Phosphatpuffer, der im wesentlichen inert ist gegenüber der Aldehydkomponente des Reagenzsystems. Somit darf der Puffer keine primäre Amminogruppe enthalten. Der Puffer sollte auch eine effektive Pufferkapazität zwischen pH Werten von ungefähr 5,5 und ungefähr 7,5 haben. Beispiele für effektive organische Puffer sind Acetatpuffer, Succinatpuffer, Maleatpuffer und Citratpuffer. Beispiele für effektive biologische Puffer sind 2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure (MES) Puffer, 3-(N-Morpholin)propansulfonsäure (MOPS) und N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) (HEPES) Puffer. Ein Acetat, oder ein anderer geeigneter Puffer wird in der vorliegenden Erfindung in Mengen von ungefähr 10 mM bis ungefähr 20 mM Konzentrationen, und vorzugsweise bei einer ungefähr 20 mM Konzentration vorhanden sein. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von MES Puffer, MOPS Puffer und HEPES Puffer sind in Beispielen 6, 7 bzw. 8 beschrieben.
Eine optionale Komponente des Mehrzweckblutverdünnungsmittels ist ein oberflächenaktives Reagenz. Der bevorzugte oberflächenaktive Wirkstoff ist Saponin, ein Pflanzenextrakt der in einem Pulver von handelsüblicher Qualität, isoliert aus Qullaja Baumrinde, ebenso wie aus anderen Quellen erhältlich ist. Obwohl die chemische Reinheit von kommerziellen Saponin von Charge zu Charge variiert, ist es selektiver gegenüber roten Blutkörperchen als die quaternären Ammoniumsalze. Saponin, oder ein anderes oberflächenaktives Reagenz, ist in der vorliegenden Erfindung in Mengen von ungefähr 10 bis ungefähr 200 mg/l, und vorzugsweise bei ungefähr 100 mg/l vorhanden. Saponin lysiert gemeinsam mit den anderen Inhaltsstoffen des Mehrzweckreagenzsystems die roten Blutkörperchen, die in Vollblut vorhanden sind, vollständig. Die Erythrozytenfraktion (d.h. die roten Blutkörperchen) von normalen Blutproben werden innerhalb von 20 Sekunden bei Raumtemperatur lysiert. Jedoch erfordern schwierig zu lysierende Blutproben (wie zum Beispiel Blutproben von Babys, Nierendialysepatienten, Multiple Myloma Patienten, Diabetikern oder Patienten mit Uraemie), die Inkubation des Blutes mit dem Reagenzsystem bei Temperaturen von ungefähr 38°C bis ungefähr 43°C für bis zu 20 Sekunden für eine vollständige Erythrozytenlyse. Die Inkubation von Blutproben mit dem Mehrzweckreagenzsystem, sogar bei diesen leicht erhöhten Temperaturen, bewahrt effektiv die Membranintegrität der weißen Blutkörperchen und erhält die Antigenität der Lymphozytenoberflächenantigene. Im Gegensatz dazu muß, wenn Saponin selbst verwendet wird, um die roten Blutkörperchen zu lysieren, es bei einer Konzentration 10 bis 20 mal höher als diejenige, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verwendet werden. Solche Konzentrationen sind extrem schädlich für die Integrität der weißen Blutkörperchen und erfordern ein schnelles Ablöschen der lytischen Aktivität des Reagenzes, um die Morphologie der weißen Zellen zu bewahren. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die kombinierten Bestandteile des Mehrzweckreagenzsystems dazu dienen, um die weißen Blutkörperchen zur selben Zeit vorsichtig zu fixieren, während welcher die roten Blutkörperchen lysiert werden. Deshalb wird die Integrität der weißen Blutkörperchen sogar bei relativ langen Inkubationsperioden bewahrt. Tatsächlich werden sogar fragile weiße Blutkörperchen wie zum Beispiel diejenigen, die in chronischer lymphozytischer Leukämie beobachtet werden, in dem Mehrzweckreagenzsystem der vorliegenden Erfindung für Inkubationszeiträume von bis zu 20 Minuten stabilisiert.
2 zeigt die Verteilung von weißen Blutkörperchen in einer normalen Blutprobe, verarbeitet wie in Beispiel 12 beschrieben, und laufen gelassen auf dem CD3500^TM Analysator (Abbott Diagnostic, Mountain View, CA) System, direkt durch sein optisches System, aber unter Umgehung der Systemhydraulik. Granulozyten werden zuerst aus dem Rest der weißen Blutkörperchenpopulationen identifiziert, wie auf dem 10 deg vs 90 deg Streuungsdiagramm markiert, durch Setzen der Schwelle wie in 2c gezeigt. Eosinophile werden als nächstes auf dem ORTHOGONAL vs DEPOL Streuungsdiagramm (2b) identifiziert, wie markiert, durch Setzen der Schwelle zwischen Eosinophilen und Neutrophilen wie in 1b gezeigt. Dann werden Monozyten und Lymphozyten auf dem COMPLEXITY vs SIZE Streuungsdiagramm identifiziert, wie markiert (2a). Die Signale, die zwischen Lymphozyten und Granulozyten entlang der X Achse (COMPLEXITY) fallen und welche geringer sind als diejenigen der Monozyten entlang der Y Achse, die nicht zu irgendeiner der bereits identifizierten Populationen gehören (Neutrophile und Eosinophile) sind Basophile, wie markiert (2a).
Ein bevorzugter, aber optionaler Inhaltsstoff des Mehrzweckreagenzsystems gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Alkalisalz, vorzugsweise ein monovalentes Alkalisalz von Bicarbonat. Obwohl ein monovalentes Alkalisalz von Bicarbonat keine wesentliche Komponente des Verdünnungsmittels ist, kann es zu dem Verdünnungsmittel hinzugefügt werden, um seine Osmolalität zu erhöhen, ohne die Lysierfähigkeit der roten Blutkörperchen des Reagenzsystems zu reduzieren. Viele andere Verbindungen, wie zum Beispiel Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Phosphatpuffer werden die Lysierfähigkeit des Reagenzsystems vermindern, wenn sie dazu verwendet werden, um die Osmolalität des Reagenzsystems zu erhöhen. Beispielhafte monovalente Alkalisalze von Bicarbonat sind Kaliumbicarbonat, Natriumbicarbonat oder Lithiumbicarbonat. Kaliumbicarbonat oder ein anderes Alkalibicarbonatsalz kann in der vorliegenden Erfindung in Mengen von ungefähr 0,005% bis ungefähr 0,15% Gewicht/Volumen (d.h. Milligramm pro 100 ml) und vorzugsweise bei ungefähr 0,01% Gewicht/Volumen vorhanden sein.
Ein weiterer optionaler Inhaltsstoff des Mehrzweckreagenzsystems gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Plättchen-Anti-Verklumpungsmittel. Zum Beispiel kann ein Ethylendiamintetraacetat (EDTA)-Salz zu dem Reagenzsystem hinzugefügt werden, um die Plättchenaggregation in der Probe/der Reagenzmischung zu verhindern. Tetranatrium EDTA oder andere EDTA Salze werden in der vorliegenden Erfindung in Mengen von ungefähr 20 bis ungefähr 200 mgs pro Liter, und vorzugsweise bei 100 mgs pro Liter vorhanden sein.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erlaubt die quantitative Analyse von nukleierten roten Blutkörperchen auf automatisierten Hämatologieanalysatoren. Um den Prozentsatz von nukleierten roten Blutkörperchen zu analysieren, die in einer Vollblutprobe vorhanden sind, wird ein Nuklearfarbstoff, zum Beispiel Ethidiumhomidimer, zu dem Mehrzweckreagenzsystem hinzugefügt, bevor es zu der Blutprobe hinzugegeben wird. In dieser Ausführungsform wird der Nuklearfarbstoff zu dem Reagenzsystem hinzugefügt in einer Menge von zwischen ungefähr 0,05 mg% bis ungefähr 0,15 mg% Gewicht/Volumen (d.h. Milligramm pro 100 ml) und vorzugsweise bei 0,1 mg% Gewicht/Volumen. Das Reagenzsystem lysiert die roten Blutkörperchen vollständig. Während es gleichzeitig die Integrität der Membranen der weißen Blutkörperchen bewahrt. In dem Mehrzweckreagenzsystem reagiert der hinzugefügte Nuklearfarbstoff mit den exponierten Nuklei von unreifen roten Zellen, der kann jedoch intakte weiße Blutkörperchen nicht durchdringen. Da das einzige nukleare Material, das erhältlich ist, um mit dem Nuklearfarbstoff wechselzuwirken, das von den nukleierten roten Blutkörperchen ist, ist das gefärbte nukleare Material proportional zu der nukleierten Erythrozytenfraktion der Blutprobe und kann auf einem automatisierten elektrooptischen Analysator quantitativ bestimmt werden. Dieser Ein-REagenzprozess der vorliegenden Erfindung erlaubt es jemandem, die verschiedenen Leukozytenpopulationen von nukleierten Erythrozyten schnell zu unterscheiden, und es ist insbesondere nützlich für bestimmte Veterinäranwendungen.
3a und 3b zeigen einen FACScan^TM Display einer normalen Blutprobe mit Hühnererythrozytennuklei (CEN), verarbeitet wie in Beispiel 5 beschrieben. Die Probe, die in 3a gezeigt ist, wurde mit einem Nuklearfarbstoff verarbeitet, aber ohne CEN und die Probe, die in 3b gezeigt ist, wurde in der Anwesenheit von sowohl einem Nuklearfarbstoff als auch CEN verarbeitet. Die zweidimensionalen Punktplots links haben eine geplotete Seitenstreuung (SSC) versus einer Vorwärtsstreung (FSC). Die zweidimensionalen Punktplots rechts haben SSC Signale, geplottet versus roter Fluoreszenz (FL3) von allen den Zellen in der Probe. Siehe das Erscheinen einer FL3 gefärbten CEN Population in 3b in der oberen linken Ecke.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erlaubt die quantitative Analyse von Lymphozytensubpopulationen. Lymphozytensubklassifikation wird erreicht durch Mischen von Fluorochrom-konjugierten monoklonalen Antikörpern, gerichtet auf spezifische Lymphozytenoberflächenantigene, mit Vollblutproben bevor das Mehrzweckreagenzsystem oder das Blutverdünnungsmittel hinzugefügt wird. Die Konzentration von markierten Antikörperfraktionen, die zu einer Blutprobe hinzugefügt werden, wird von der individuellen Antikörperzubereitung abhängen, ist aber im allgemeinen ungefähr die Hälfte bis ein Zehntel des Volumens des Blutes für kommerzielle Antikörperzubereitungen. Nachdem das Reagenzsystem hinzugefügt wurde und die roten Blutkörperchen lysiert sind, können die Lymphozyten-Antikörperreaktionsprodukte auf einem automatisierten zytometrischen Durchflußsystem analysiert werden. Das offenbarte Reagenzsystem "löscht" die Fluoreszenzmarker nicht, wie zum Beispiel Fluoresceinisotiocyanat (FITC) oder Phycoerythrerin (PE), welche häufig verwendet werden, um Antikörperfluorochrom zu markieren. Die Lymphozytenklassifikation wurde mit dem Aufkommen der AIDS Epidemie zunehmend wichtig als ein diagnostisches Werkzeug. Die Fähigkeit, Oberflächenmarker auf Blutzellpopulationen zu identifizieren, wird wahrscheinlich zunehmend wichtig über die Jahre, wenn die Forscher ihr Wissen über Oberflächenkomponenten und Charakteristika von Subpopulationen von Lymphozyten und anderen Fraktionen von weißen Blutkörperchen wie zum Beispiel Monozyten und Neutrophilen erhöhen.
4a, 4b, 4c und 4d zeigen FACScan^TM Displays einer normalen Blutprobe, verarbeitet wie in Beispielen 2, 3 und 4 beschrieben. 4a wurde ohne die Zugabe von irgendeinem Antikörper als eine negative Kontrolle der Donorprobe verarbeitet; 4b wurde wie in Beispiel 4 beschrieben, verarbeitet, um Platte B Zellen (CD19+ Lymphozyten) und Platte T Zellen (CD3+ Lymphozyten) zu identifizieren. Die Lymphozytenpopulation wurde zuerst auf dem Vorwärtsstreungs-(FSC) vs Seitenstreuungs-(SSC) Plot geführt und wieder analysiert in den grüne Fluoreszenz (FL1) vs orange Fluoreszenz (FL2)-Kanälen. Wie in 4a, 4b, 4c und 4d gesehen werden kann, waren unmarkierte Lymphozyten alle in dem unteren linken Quadranten, während die CD3-FITC Antikörper markierten Platte T Zellen aus dem unteren rechten Quadranten herauswanderten und die CD19-PE markierten Platte B Zellen wanderten hoch zu dem oberen linken Quadranten. Die 4c Probe wurde wie in Beispiel 2 beschrieben verarbeitet, um Helfer T Zellen (CD4+ Lymphozyten) zu identifizieren. Helfer T Zellen sind eine Subpopulation von T Lymphozyten und haben sowohl CD3 als auch CD4 Antigene auf der Zelloberfläche und sie bewegten sich deshalb nach rechts hinaus, aufgrund der FITC Markierung auf dem CD3 Antikörper und sie bewegten sich nach oben zu dem oberen rechten Quadranten aufgrund der PE Markierung auf dem anti-CD4 Antikörper. Die 4d Probe wurde wie in Beispiel 3 beschrieben verarbeitet, um die Suppressor T Zellen (CD8+ Lymphozyten) zu identifizieren. Suppressor T Zellen sind auch eine Subpopulation von T Lymphozyten und haben sowohl CD3 als auch CD8 Antigene. Deshalb wurden die Zellen mit beiden Antikörpern markiert und fielen in den oberen rechten Quadranten.
5b, 5d, 5f und 5h repräsentieren FACScan^TM Displayausdrucke einer normalen Blutprobe, verarbeitet wie in Beispielen 2, 3 und 4 beschrieben. 5a, 5c, 5e und 5g repräsentieren dieselbe Probe, verarbeitet wie in den gleichen Beispielen oben beschrieben, außer daß die roten Blutkörperchen mit einer kommerziellen Lyselösung, Becton Dickinson's Facscan^TM wie in Beispiel 11 beschrieben lysiert wurden. Säulen 1 und 3 sind FSC vs SSC Zytogramme, und Säulen 2 und 4 sind FL1 vs FL2 zweidimensionale Punktplots der geführten Lymphozyten. Dieselben FSC, SSC, FL1 und FL2 Zunahmen wurden für die Analyse beider Proben zum Vergleich verwendet.
Wie in den FSC vs SSC Zytogrammen gesehen werden kann, zeigen die rechten wie in den FSC, SSC, Zytogrammen gesehen werden kann, zeigen die Zytogramme der rechten Spalte gut definiert Cluster von neutrophieln, Enosinophilen, Monozyten und Lymphozyten, welche alle gut abgetrennt sind, vom Geräusch (den Signalen, meistens von Stroma roter Blutkörperchen), was anzeigt, daß die weißen Blutkörperchen in dem Mehrzweckblutverdünnungsmittel gut erhalten waren. Dies erlaubt eine genauere Lymphozytenführung. Im Vergleich dazu sind die Zellcluster der Zytogramme der linken Spalte weniger gut definiert. Die Auflösung von jeden Zellcluster ist weniger klar und die Signale der Granulozyten sind viel geringer als diejenige der rechten Spalte, was eine Änderung im Brechungsindex dieser Zellen nahe legt, welche aus dem Verlust von einigen Proteinkomponenten herrühren könnte. Die Qualität der zweidimensionalen FL1 vs FL2 Dotplots der geführten Lymphozyten der letzten Spalte ist im wesentlichen äquivalent zu der der entsprechenden Dotplots der zweiten Spalte deren rote Blutkörperchen mit FacsLyse^TM lysiert wurden.
5a ist eine negative Kontrolle eines normalen Blutes, verarbeitet wie in Beispiel 2 beschrieben, aber nicht mit irgendeinem Antikörper reagiert, lysiert mit FacsLyse^TM; 5b ist auch eine negative Kontrolle der gleichen Probe, aber rote Blutkörperchen wurden mit dem Mehrzweckverdünnungsmittel einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung lysiert. 5c, e und g stellen dieselbe Probe dar, verarbeitet wie in Beispielen 2, 3 und 4 beschrieben, aber die roten Blutkörperchen wurden mit FacsLyse^TM wie in Beispiel 11 beschrieben lysiert. 5d, f und h sind dieselbe Probe, verarbeitet wie in Beispielen 2, 3 und 4 beschrieben, in welchen rot_e Blutkörperchen mit dem Mehrzweckverdünnungsmittel von einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung lysiert wurden.
Die Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele definiert, welche veranschaulichend und nicht einschränkend sein sollen.
BEISPIEL 1
WEISSE BLUTKÖRPERCHEN DIFFERENZIALANALYSE
Fünfzig Mikroliter einer EDTA-antikoagulierten normalen Blutprobe wurden mit 1 ml des Mehrzweckreagenzsystems gemischt, vorgewärmt auf 40°C, gemischt und bei Raumtemperatur für 16 Sekunden inkubiert. Das Reagenzsystem enthielt 0,5% Gewicht/Volumen Ammoniumchlorid 0,08% Gewicht/Vol_umen Formaldehyd, 0,01% Gewicht/Volumen Saponin, 0,1% Gewicht/Volumen Kaliumbicarbonat und 20 mM Acetatpuffer. Das Reagenzsystem hatte einen pH von ungefähr 6,2 und eine Osmolalität von 267 mOsm/L. Diese Mischung wurde bei 38±2°C für 16 Sekunden inkubiert und auf dem CD3500^TM System direkt durch das optische System unter Umgehung der Systemhydraulik laufen gelassen. Die Zytogramme der Probe sind in 1 dargestellt.
BEISPIEL 2
LYMPHOZYTEN IMMUNOPHÄNOTYPISIERUNG
Fünfzig Mikroliter von EDTA-anti-coaguliertem Vollblut wurden mit 10 Mikrolitern von monoklonaler Antikörperlösung, die anti-CD3-FITC und anti-CD4-PE enthielt, in einem Teströhrchen gemischt.
Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert, bevor 1,0 Milliliter des Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung hinzugefügt wurden, welches 0,5% Gewicht/Volumen von Ammoniumchlorid, 0,02% Gewicht/Volumen von Tetranatrium EDTA, 0,1% Volumen Formaldehyd, 0,0075% Gewicht/Volumen Saponin, 0,01% Gewicht/Volumen von Kaliumbicarbonat und 20 mM Acetatpuffer enthielt. Das Reagenzsystem hatte einen pH von ungefähr 6,2 und eine Osmolalität von 270 mOsm pro Liter, während die Reagenzsystem-Blutlösung einen pH um 7,0 hatte.
Die Reagenzsystem-Blutlösung wurde von 20 Sekunden bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Variation in der akzeptablen Inkubationszeit erlaubte die Analyse von vielfachen Proben.
Der Prozentsatz von CD3+ und CD4+ Lymphozytensubpopulationen wurde auf dem FACScan^TM Durchflußzytometer, wie in 4a veranschaulicht, bestimmt.
BEISPIEL 3
LYMPHOZYTEN IMMUNOPHÄNOTYPISIERUNG
Fünfzig Mikroliter von EDTA-antikoaguliertem Vollblut wurden mit 10 Mikrolitern monoklonaler Antikörperlösung, die anti-CD3-FITC und anti-CD8-PE enthielt, in einem Teströhrchen gemischt.
Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert, bevor 1,0 Milliliter des Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung hinzugefügt wurden, welches 0,5% Gewicht/Volumen von Ammoniumchlorid, 0,02% Gewicht/Volumen von Tetranatrium EDTA, 0,1% Volumen Formaldehyd, 0,075% Gewicht/Volumen von Saponin, 0,01% Gewicht/Volumen von Kaliumbicarbonat, und 20 mM Acetatpuffer enthielt. Das Reagenzsystem, beschrieben in Beispiel 1, hatte einen pH von ungefähr 6,2 und eine Osmolalität von 270 mOsm pro Liter.
Die Vollblut-Reagenzsystemlösung könnte irgendwo von 20 Sekunden bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden, was die Analyse von vielfachen Proben erlaubte.
Der Prozentsatz von CD3+ und CD8+ Lymphozytensubpopulationen wurde unter Verwendung des FACScan^TM Durchflußzytometers bestimmt.
BEISPIEL 4
LYMPHOZYTEN IMMUNOPHÄNOTYPISIERUNG
Fünfzig Mikroliter von EDTA-antikoaguliertem Vollblut wurden mit 10 Mikrolitern monoklonaler Antikörperlösung, die anti-CD3-FITC und anti-CD19-PE enthielt, in einem Teströhrchen gemischt.
Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert, bevor 1,0 Milliliter eines Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung hinzugefügt wurden, welches 0,5% Gewicht/Volumen von Ammoniumchlorid, 0,02% Gewicht/Volumen _von Tetranatrium EDTA, 0,1% Volumen von Formaldehyd, 0,0075% Gewicht/Volumen von Saponin, 0,01% Gewicht/Volumen von Kaliumbicarbonat und 20 mM Acetatpuffer enthielt. Das Mehrzweckreagenzsystems, wie in Beispiel 1 beschrieben, hatte einen pH von ungefähr 6,2 und eine Osmolalität von 270 mOsm pro Liter.
Die Vollblut-Reagenzsystemlösung konnte von 20 Sekunden bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden. Diese Variation in der Inkubationszeit erlaubt die Analyse von vielfachen Proben.
Der Prozentsatz von CD3+ und CD19+ Lymphozytensubpopulationen wurde bestimmt unter Verwendung eines FACScan^TM Durchflußcytometers wie in 4b veranschaulicht.
BEISPIEL 5
BESTIMMUNG VON NUKLEIERTEN ROTEN BLUTKÖRPERCHEN
Fünfzig Mikroliter einer EDTA-antikoagulierten Vollblutprobe mit und ohne Hühnernuclei wurde mit 950 Mikrolitern des Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung gemischt, das 0,1 mg% Gewicht/Volumen eines Nuklearfarbstoffs, 0,5% Gewicht/Volumen von Ammoniumchlorid, 0,075% Volumen von Formaldehyd, 0,01% Gewicht/Volumen von Saponin, 0,01% Gewicht/Volumen von Kaliumbicarbonat, und 20 mM Acetatpuffer enthielt. Das Mehrzweckreagenzsystem hatte einen pH von ungefähr 6,0 und eine Osmolalität von 270 mOsm pro Liter.
Die ganze Blut-Reagenzsystemlösung wurde bei 38±2°C für 20 Sekunden inkubiert.
Der Prozentsatz an nukleierten roten Blutkörperchen in der Vollblutprobe wurde auf einem FACScan^TM Durchflußcytometer wie in 3a und 3b veranschaulicht, bestimmt.
BEISPIEL 6
DIFFERENZIALANALYSE WEISSER BLUTKÖRPERCHEN
Fünfzig Mikroliter von EDTA-anti-coaguliertem Vollblut wurden mit 950 Mikrolitern des Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung gemischt, das 20 mM MES Puffer, 0,5% Gewicht/Volumen von Ammoniumfluorid 0,08% Volumen von Formaldehyd und 0,01% Gewicht/Volumen von Saponin enthielt. Das Reagenzsystem hatte einen pH von ungefähr 6,2 und eine Osmolalität von 280 mOsm pro Liter.
Die Vollblut-Reagenzsystemlösung wurde bei 40°C für 20 Sekunden inkubiert.
Eine Differenzialanalyse der weißen Blutkörperchen wurde auf einem experimentellen klinischen Durchflußcytometer durchgeführt.
BEISPIEL 7
DIFFERENZIALANALYSE WEISSER BLUTKÖRPERCHEN
Fünfzig Mirkoliter von EDTA-antikoaguliertem Vollblut wurden mit 1,0 Milliliter des Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung gemischt, das 20 mM MOPS Puffer, 0,5% Gewicht/Volumen von Ammoniumchlorid, 0,1% Volumen von Formaldehyd, 0,012% Gewicht/Volumen von Saponin und 0,01% Gewicht/Volumen von Tetranatrium EDTA enthielt. Das Mehrzweckreagenzsystem hatte einen pH von ungefähr 7,0 und eine Osmolalität von 280 mOSm pro Liter.
Die ganze Blut-Reagenzsystemlösung wurde bei 42°C für 20 Sekunden inkubiert.
Eine Differenzialanalyse der weißen Blutkörperchen wurde auf einem experimentellen klinischen Durchflußcytometer durchgeführt.
BEISPIEL 8
DIFFERENZIALANALYSE WEISSER BLUTKÖRPERCHEN
Fünfzig Mikroliter von EDTA-antikoaguliertem Vollblut wurden mit 1,0 Millilitern des Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung gemischt, das 20 mM HEPES Puffer, 0,4% Gewicht/Volumen von Ammoniumfluorid, 0,08% Volumen von Formaldehyd, 0,01% Gewicht/Volumen von Saponin, und 0,1% Gewicht/Volumen von Kaliumbicarbonat enthielt. Das Reagenzsystem hatte einen pH von ungefähr 7,0 und eine Osmolalität von 270 mOsm pro Liter.
Die ganze Blut-Reagenzsystemlösung wurde bei 40°C für ungefähr 20 Sekunden gemischt.
Eine Differenzialanalyse der weißen Blutkörperchen wurde auf einem experimentellen klinischen Durchflußcytometer durchgeführt.
BEISPIEL 9
DIFFERENZIALINKUBATIONSZEITEN FÜR BESTIMMUNGEN DER WEISSEN BLUTKÖRPERCHEN
Fünfzig Mikroliter von EDTA-antikoaguliertem Vollblut wurden mit 950 Mikrolitern des Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung bei 38±2°C gemischt. Das Reagenzsystem enthielt 0,5% Gewicht/Volumen von Ammoniumchlorid, 0,08% Volumen von Formaldehyd, 0,01% Gewicht/Volumen von Saponin, 0,01% Gewicht/Volumen von Kaliumbicarbonat, und 20 mM Acetatpuffer. Das Reagenzsystem hatte einen pH von ungefähr 6,2 und eine Osmolalität von 267 mOsm pro Liter.
Die Mischung wurde bei 38±2°C inkubiert und serielle Aliquote der Mischung wurden bei 14 Sekunden, 2 Minuten, 4 Minuten, 6 Minuten, 8 Minuten und 10 Minuten entnommen.
Eine fünfteilige Differenzialanalyse der weißen Blutkörperchen wurde an jedem Aliquot auf einem experimentellen klinischen Durchflußcytometer, der mit einem Argon-Ionenlaser ausgestattet war, durchgeführt.
BEISPIEL 10
VARIATIONEN IN DER INKUBATIONSZEIT UND DER TEMPERATUR FÜR BESTIMMUNGEN VON WEISSEN BLUTKÖRPERCHEN
Fünfzig Mikroliter von EDTA-anti-coaguliertem Vollblut wurden mit 950 Mikrolitern des Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung gemischt, das 0,5% Gewicht/Volumen von Ammoniumchlorid, 0,08% Volumen von Formaldehyd, 0,01% Gewicht/Volumen von Saponin, 0,01% Gewicht/Volumen von Kaliumbicarbonat und 20 mM Acetatpuffer enthielt. Das Reagenzsystem hatte einen pH von ungefähr 6,2 und eine Osmolalität von 267 mOsm/l.
Aliquote der resultierenden Mischung wurden bei 36°C, 38°C, 40°C, 42°C, 45°C bzw. 46°C für verschiedene Zeitintervalle bis zu 10 Minuten inkubiert.
Eine fünfteilige Differenzialanalyse von weißen Blutkörperchen wurde an Proben von jedem Aliquot unter Verwendung eines automatisierten elektrischen optischen Systems bestimmt.
BEISPIEL 11
VERGLEICHSSTUDIEN EINER KOMMERZIELLEN LYSELÖSUNG UND DES MEHRZWECKREAGENZSYSTEMS DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Eine kommerzielle Lyselösung von Becton Dickinson (FacsLyse^TM) wurde mit einer Ausführungsform des Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung (das "Mehrzweckverdünnungsmittel") in einem Immunophänotypisierungsexperiment verglichen. Die Proben wurden verarbeitet, wie in Beispielen 2, 3 und 4 beschrieben, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
In dem Fall der kommerziellen FacsLyse^TM, wurde die Mischung der Testprobe und der FacsLyse^TM zuerst in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Danach wurde die resultierende Mischung für 5 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgetrennt und der Zellknopf wurde dann mit 1 ml von Phosphat gepufferter Salzlösung gewaschen. Die Zellsuspension wurde wiederum für 5 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Danach wurde der Zellknopf in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung, die 1 Gewichtsprozent Paraformaldehyd enthielt, resuspendiert. Der Assay wurde dann auf einem FACScan^TM durchgeführt.
Im Gegensatz zu dem umständlichen und langwierigen Lyseverfahren roter Blutkörperchen wie oben beschrieben, wurde in dem Fall einer Ausführungsform des Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung (des "Mehrzweckverdünnungsmittel") das gesamte Assayverfahren in ungefähr 20 Sekunden vervollständigt. Es war kein Waschschritt erforderlich.
Die Vergleichsdaten sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Wie aus dieser Tabelle gesehen werden kann, sind die Ergebnisse, die von dem Verfahren unter Verwendung einer kommerziellen Lyselösung erhalten werden, und diejenigen, die von dem Verfahren unter Verwendung des Mehrzweckreagenzsystems der vorliegenden Erfindung erhalten werden, im wesentlichen äquivalent.
BEISPIEL 12
DIFFERENZIALANALYSE WEISSER BLUTKÖRPERCHEN
Fünfzig Mikroliter einer EDTA-antikoagulierten normalen Blutprobe wurden mit 1 ml des Mehrzweckreagenzsystems gemischt, vorgewärmt auf 40°C, gemischt und bei Raumtemperatur für 16 Sekunden inkubiert. Das Reagenzsystem enthielt 0,5% Gewicht/Volumen von Ammoniumchlorid, 0,08% Volumen von Formaldehyd, 0,01% Gewicht/Volumen von Saponin, 0,1% Gewicht/Volumen von Kaliumbicarbonat, und 10 mM Acetatpuffer. Das Reagenzsystem hatte einen pH von ungefähr 6,2 und eine Osmolalität von 225 mOsm/l. Diese Mischung wurde bei 38±2°C für 16 Sekunden inkubiert und auf dem CD3500^TM Analysatorsystem direkt durch das optische System, aber unter Umgehung der Systemhydraulik, laufen gelassen. Die Zytogramme der Probe sind in 2 dargestellt.
TABELLE 1. VERGLEICH VON LYMPHOZYTEN SUB-TYPISIERUNGSERGEBNISSEN FACS LYSE^TM VS OFFENBARTEM MEHRZWECKBLUTVERDÜNNUNGSMITTEL

Claims

Ein Mehrzweckreagenzsystem, das geeignet ist zum gleichzeitigen Lysieren von roten Blutkörperchen und Fixieren von weißen Blutkörperchen aus einer Vollblutprobe für die Bestimmung von nukleierten Blutkörperchen, wobei das Mehrzweckreagenzsystem folgendes umfaßt: von ungefähr 3 bis ungefähr 7 g/L eines nicht-quaternären Ammoniumsalzes; von ungefähr 0,04 bis ungefähr 0,10 Volumenprozent eines kurzkettigen aliphatischen Aldehyds; von ungefähr 10 bis ungefähr 20 mM eines nicht-Phosphat-Puffers, wobei der nicht-Phosphat-Puffer gekennzeichnet ist als im wesentlichen inert gegenüber dem aliphatischen Aldehyd, wobei der nicht-Phosphat-Puffer weiterhin keine primäre Aminogruppe enthält; von ungefähr 10 bis ungefähr 200 mg/l eines oberflächenaktiven Stoffs; und Wasser, so daß das Mehrzweckreagenzsystem bei einem pH zwischen ungefähr 5,5 bis ungefähr 7,5 und einer Osmolalität zwischen ungefähr 160 bis ungefähr 310 mOsm pro Liter gehalten wird.
Das Mehrzweckreagenzsystem gemäß Anspruch 1, worin das nicht-quaternäre Ammoniumsalz ein mono-Ammoniumsalz umfaßt, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ammoniumchlorid und Ammoniumfluorid.
Das Mehrzweckreagenzsystem gemäß Anspruch 1, worin das kurzkettige aliphatische Aldehyd ein aliphatisches Aldehyd mit eins bis vier Kohlenstoffen umfaßt.
Das Mehrzweckreagenzsystem gemäß Anspruch 3, worin das kurzkettige aliphatische Aldehyd gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Formaldehyd und Paraformaldehyd.
Das Mehrzweckreagenzsystem gemäß Anspruch 1, worin das oberflächenaktive Reagenz Saponin umfaßt.
Das Mehrzweckreagenzsystem gemäß Anspruch 1, das weiterhin von ungefähr 0,05 mg Gewichtsprozent bis ungefähr 0,015 mg Gewichtsprozent Volumen an nuklearem Farbstoff umfaßt.
Ein Mehrzweckreagenzsystem, das geeignet ist zum gleichzeitigen Lysieren von roten Blutkörperchen und Fixieren von weißen Blutkörperchen aus einer Vollblutprobe für die Bestimmung von nukleierten Blutkörperchen, wobei das Mehrzweckreagenzsystem folgendes umfaßt: ungefähr 5 g/L eines nicht-quaternären Ammoniumsalzes; ungefähr 0,075 Volumenprozent eines kurzkettigen aliphatischen Aldehyds; von ungefähr 10 mM bis ungefähr 20 mM Acetatpuffer; ungefähr 100 mg/L Saponin; ungefähr 10 mM Kaliumbicarbonat; und Wasser, so daß das Mehrzweckreagenzsystem bei einem pH im Bereich von ungefähr 6,2 bis ungefähr 6,5 und einer Osmolalität zwischen ungefähr 215 und 270 mOsm/L gehalten wird.
Ein diagnostischer Reaktionskit, der nützlich ist für die Bestimmung von immunophenotypischen Lymphocytensubpopulationen, das folgendes umfaßt: eine Lösung, die von ungefähr 10 mM bis ungefähr 20 mM Acetatpuffer und ungefähr 0,075 Volumenprozent Formaldehyd umfaßt, worin die Lösung einen pH von ungefähr 5,5 bis ungefähr 7,5 hat; und eine Zusammensetzung, die ungefähr 0,5 g Ammoniumchlorid, ungefähr 0,1 g Kaliumbicarbonat, und ungefähr 10 mg Saponin pro 100 ml der Pufferlösung umfaßt.
Ein diagnostischer Kit, der nützlich ist für die Bestimmung der nukleierten Erythrocyten, der folgendes umfaßt: das Mehrzweckreagenzsystem gemäß Anspruch 7, und eine Lösung von nuklearem Farbstoff.
Ein Verfahren für die schnelle Analyse von nukleierten peripheren Blutkörperchen aus einem Vollblut, das die folgenden Schritte umfaßt: Bilden einer Mischung durch Mischen von Vollblut und eines Mehrzweckreagenzsystems in dem Verhältnis von ungefähr einem Teil bis zu einem Bereich von ungefähr 16 bis ungefähr 100 Teilen, worin das Reagenzsystem von ungefähr 3 bis ungefähr 7 g/L eines nicht-quaternären Ammoniumsalzes, von ungefähr 0,04 bis ungefähr 0,1 Volumenprozent eines kurzkettigen aliphatischen Aldehyds, von ungefähr 10 bis ungefähr 20 mM eines nicht-Phosphat-Puffers, wobei der nicht-Phosphat-Puffer gekennzeichnet ist als im wesentlichen inert gegenüber dem aliphatischen Aldehyd, und Wasser umfaßt, so daß das Mehrzweckreagenzsystem bei einem pH zwischen ungefähr 5,5 bis ungefähr 7,5 und einer Osmolalität zwischen ungefähr 160 bis ungefähr 310 mOsm pro Liter gehalten wird; Inkubieren der Mischung bei Temperaturen von ungefähr 25°C bis ungefähr 46°C für mindestens ungefähr 10 Sekunden; und Bestimmen der nukleierten peripheren Blutkörperchen mit einer automatisieren elektro-optischen Hämatologieinstrumentenausrüstung.
Das Verfahren gemäß Anspruch 10, das weiterhin den Schritt Hinzufügen von Antikörpern zu der Vollblutprobe, die gegen Zelloberflächenmarker gerichtet sind, umfaßt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 10, worin die Bestimmung von nukleierten peripheren Blutkörperchen die Bestimmung von mindestens fünf Klassen von Leukocyten umfaßt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 10, worin die Bestimmung von nukleierten peripheren Blutkörperchen die Bestimmung von nukleierten Erythrocyten umfaßt.