CN101464454B - 白细胞分类试剂及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种白细胞四分类试剂，所述试剂的渗透压低于50mOsm/kg H2O。本发明还公开了利用所述试剂对白细胞进行分类的方法。本发明可实现对红细胞的快速溶解，同时对白细胞进行四分类；本发明试剂成分简单，表面活性剂不是必要条件；对于pH值有很宽的选择范围。

Description

白细胞分类试剂及方法
技术领域
本发明涉及一种细胞分类试剂及对细胞进行分类的方法，特别是涉及一种用于对血液中白细胞进行四分类的试剂以及利用该试剂对血液中白细胞进行分类检测的方法。
背景技术
在临床检验领域中，对人全血样本进行细胞分类检验和计数，在临床检验和诊断上有很重要的意义。其中涉及白细胞分类的现有技术包括以下：
现有技术一介绍了一种分离、鉴定和/或分析全血样品中的白细胞种群的试剂系统，该系统包括一种稀释剂和一种水溶性化合物组成的溶解剂，在水中至少部分解离，从而产生游离质子和平衡离子，pH值范围在2.6至4.0内，快速溶解红细胞同时能够保持白细胞的天然的生理状态和/或免疫化学状态，加入抑制剂后对白细胞进行分类。
现有技术二公开了使用白细胞四分类测定用试剂和嗜碱性粒细胞测定用试剂，将白细胞五分类的方法。白细胞四分类测定用试剂包括至少一种离子表面活性剂、至少一种带阴离子基团的有机化合物、一种非离子表面活性剂和缓冲剂，其与血样作用，将血细胞分成淋巴细胞、单核细胞、嗜酸细胞和嗜碱细胞加中性粒细胞四类。检测方法为两角度激光散射法。
现有技术三介绍了对白细胞进行四分类的检测方法和试剂。试剂含有皂角苷作为裂解剂和快速交联试剂如戊二醛作为固定剂，溶解红细胞并且对白细胞进行四分类。
现有技术四提出了通过两角度光散射使用白细胞四分类试剂和嗜碱细胞测定试剂将白细胞五分类和计数的方法。四分类试剂包括至少一种离子表面活性剂用以溶解红细胞和损伤白细胞膜，同时还有至少一种带负电的有机化合物用以与白细胞中带正电荷的物质结合使白细胞形态发生变化，一种非离子表面活性剂和用以调节pH值的缓冲液。
现有技术五介绍了一种白细胞四分类的试剂。这种试剂包括至少一种离子表面活性剂，可以是阳离子或两性表面活性剂中的一种，用来溶解红细胞并且部分损伤白细胞膜；同时含有至少一种带阴离子的有机化合物，通过与白细胞上带正电荷的组分结合使各类白细胞形态差异显现；含有一种非离子表面活性剂和用来调整pH值的缓冲剂。检测方法采用两角度激光散射法。
现有技术六同样是关于白细胞四分类的试剂。该试剂含至少一种阴离子或两性表面活性剂，可以在短时间内溶解红细胞，同时维持白细胞在一定时间内保持或接近原始状态，并通过收集前角光散射和侧向光散射信号对白细胞进行四分类。
现有技术七提出了一种从全血样本中快速分离、分析白细胞的方法和试剂系统。该项技术中的溶血剂系统由第一试剂选自甲酸、乙酸及两者的混合物和第二试剂抑制剂组成。试剂使红细胞溶解并使白细胞发生微小改变以使可通过仪器对细胞进行五分类。其优点和独特性在于其惊人的溶血速度并能对白细胞进行进一步修饰。溶血后加入抑制剂，防止进一步的溶血及白细胞明显的变化。血样经过处理后能保持细胞的免疫化学特性。检测方法可为两角度光散射法，或直流阻抗和射频阻抗法，或直流阻抗和光散射法。
现有技术八介绍了一种多用途的试剂用于快速分析全血样品。该试剂裂解红细胞迅速，同时能够固定白细胞，还可以保持淋巴细胞得表面抗原。其试剂含有非季铵盐，短链脂肪醛，非磷酸缓冲液，pH值范围为5.5-7.5，渗透度为160-310mOsm/kgH2O。
但是，以上现有技术中还有很多不足之处。
比如，现有技术一的试剂系统含有至少一种酸性物质，pH值选择范围较窄，在2.6至4.0之间。现有技术七中的试剂系统包括含有第一种酸性化合物的第一试剂和含有抑制剂的第二试剂组成，其试剂pH值也在酸性范围内，且必须使用两种试剂。现有技术八的试剂含有非季铵盐，短链脂肪醛，非磷酸缓冲液，pH值范围5.5-7.5，不但试剂成分复杂，而且pH值范围较窄。
现有技术三所公开的试剂体系含有毒性较大的醛类。
现有技术二的四分类试剂系统中必须使用至少一种离子表面活性剂、至少一种带阴离子基团的有机化合物、一种非离子表面活性剂。现有技术四的四分类试剂包括至少一种离子表面活性剂，至少一种带负电的有机化合物，一种非离子表面活性剂和用以调pH的缓冲液。现有技术五的四分类试剂包括至少一种离子表面活性剂，可以是阳离子或两性表面活性剂中一种，至少含一种带阴离子的有机化合物，一种非离子表面活性剂和用来调整pH值的缓冲剂。现有技术六的试剂中含有至少一种阴离子或两性表面活性剂短时间内溶解红细胞。这些试剂系统都必须使用表面活性剂，试剂成分复杂，增加了试剂成本，而且对白细胞形态进行了一定程度的改变(皱缩或膨胀)，一定程度上改变了白细胞的天然的生理状态和/或免疫化学状态。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够快速溶解红细胞、有较宽pH值选择范围、成分简单且能够实现在一个通道内对白细胞进行四分类的试剂系统。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述试剂系统对全血中的白细胞进行分类检测的方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种白细胞分类试剂，所述白细胞分类试剂是指将白细胞分成淋巴细胞、单核细胞及嗜酸粒细胞相对应的3个集团以及中性粒细胞和嗜碱粒细胞相对应的1个集团共4个集团的四分类试剂，所述试剂的渗透压低于50mOsm/kgH2O。
进一步地，所述试剂的pH值为4～12。
在本发明具体的实施方式中，所述白细胞分类试剂由溶剂水以及选自以下的至少一种物质组成：i.无机盐、ii.表面活性剂、iii.带疏水基团及阴离子基团的有机化合物、iv.缓冲剂。
优选的，所述无机盐选自NaCl，KCl，LiCl，Na2SO4或K2SO4等中的至少一种。
所述表面活性剂可以溶解红细胞，并且使白细胞的细胞膜部分损伤，所述表面活性剂为阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性表面活性剂。
所述有机物可以与白细胞内阳离子结合，使白细胞之间产生形态差异，所述有机化合物的疏水基团选自芳香族组成的基团、C原子数6以上的烃基形成的基团或者C原子数大于6的杂环，所述有机化合物的阴离子基团为羧基或磺酸基。
在本发明的具体的实施方式中，所述有机化合物为酸性色素，或者所述有机化合物为对苯二甲酸、邻苯二甲酸、铬变酸、萘磺酸或它们的衍生物或盐类。
本发明还公开了一种对全血中白细胞进行分类的方法，所述方法包括将上述白细胞分类试剂与全血样本混合后测定细胞的大小和形态信息。
具体地，所述方法包括在常温至40度的温度条件下，将所述白细胞分类试剂与全血样本按50∶1至200∶1的比例混合10～20s后，通过低角度和高角度两种散射光分别测定细胞的大小和形态信息，所述低角度散射光的测定角度为2～5度，高角度散射光的测定角度为8～20度。散射光的检测可以由一个光电二极管传感器完成。
由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：
本发明利用了低渗试剂的作用来实现对红细胞的快速溶解，同时对白细胞进行四分类；本发明试剂系统的成分简单，表面活性剂不是必要条件，可不使用或使用少量表面活性剂，并且可用的表面活性剂种类不受限制，可选择范围较宽，可以是阳离子表面活性、阴离子表面活性剂、两性表面活性剂，或其任意组合；本发明的试剂系统对于pH值有很宽的选择范围，在pH值4～12范围内均能准确实现白细胞的四分类；本发明试剂系统能够很大程度上保持白细胞亚群天然的生理状态和/或免疫化学状态，能够通过简单的两角度散射光法对白细胞进行四分类检测；利用本发明的试剂进行白细胞分类检测时，不仅能够在常温下进行，也能在常温至40度的高温下进行，而高温下反应有利于消除环境温度对反应的影响，增加结果的可靠性和稳定性。
附图说明
图1是本发明的一种白细胞分类试剂进行白细胞分类检测的结果图；
图2是本发明的另一种白细胞分类试剂进行白细胞分类检测的结果图；
图3是本发明的又一种白细胞分类试剂进行白细胞分类检测的结果图。
具体实施方式
本发明的白细胞分类试剂及方法主要利用了试剂低渗的物理性质以达到对红细胞溶解和白细胞分类的目的。本发明试剂需满足的基本条件是渗透压低于50mOsm/kgH2O，并且pH值范围在4～12之间。本发明试剂的渗透压没有下限值的限制，只需低于50mOsm/kgH2O即可用于本发明。将本发明的试剂加入全血样本中，通过测定细胞大小和形态信息，可以将白细胞分成淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞加中性粒细胞四类。
可用于本发明来调整溶液渗透压的物质有很多种，常用的可调节渗透压至合适范围(低于50mOsm/kgH2O)的物质均适用于本发明，一般常使用NaCl，KCl，LiCl，Na2SO4，K2SO4等等盐类，同时可加入体系中的缓冲成分、表面活性剂或含阴离子基团的有机化合物等等同时也会参与试剂的渗透压组成。
本发明试剂系统可以选择性地加入表面活性剂，本发明对可以含有的表面活性剂品种不作要求，可以是阳离子表面活性剂，阴离子表面活性剂，也可以是两性表面活性剂，或者是它们的任意组合。可含有的表面活性剂可用于溶解红细胞，并且能够使白细胞的细胞膜部分损伤。
上述离子表面活性剂，选择性地加入本发明的低渗试剂系统中以辅助溶血，其用量应能够辅助溶解红细胞，并能造成白细胞的细胞膜部分损伤，常规用量为50～2000mg/L，优选200～1500mg/L，最优选500～1000mg/L，所用量也可以根据使用的表面活性剂的种类作适当调整。表面活性剂的溶血效果和碳链长度是成正比的，C原子数越多，溶血能力越强，相应用量应减少。但无论使用哪一种表面活性剂或者表面活性剂的组合，其使用量应远远少于使细胞完全裸核时的用量。
本发明的试剂系统中，也可以选择性地含有一种或多种带阴离子基团的有机化合物，其可以和白细胞内阳离子结合，使白细胞之间产生形态差异。这种化合物，带有疏水基团(如由芳香族组成的基团、由C原子数6个以上的烃基形成的基团以及C原子数大于6的杂环等)及阴离子基团(如羧基、磺酸基等)，在水中带负电荷，能与白细胞结合使白细胞形态发生改变。几乎所有酸性色素如：酸性蓝系列、直接蓝、酸性绿、溴甲酚绿、酸性黄、酸性橙、甲基红、甲基橙、苯胺蓝、茜素黄等都可以满足要求。色素以外的化合物有对苯二甲酸、邻苯二甲酸、铬变酸、萘磺酸及其衍生物和盐类等。使用量为50～3000mg/L，优选500～2000mg/L。这种化合物的加入有助于嗜酸细胞从大小和形态上和其它粒细胞分离。
本发明的试剂系统中，也可以含有调整pH用的缓冲剂。对于缓冲剂没有特定的要求，可以为常用缓冲体系如甲酸、乙酸、硼酸、柠檬酸、琥珀酸、MES、TRIS、HEPES、碳酸等。本发明中试剂pH值范围在4～12以内对白细胞四分类没有绝对影响，缓冲剂的使用量通常为10～100mM。
实际上，本发明的试剂及方法主要利用了试剂低渗的物理性质以达到对红细胞溶解和白细胞分类的目的。只要满足渗透压低于50mOsm/kgH2O，并且pH值范围在4～12之间的试剂，即可用于本发明。以上所述的无机盐类、表面活性剂、带疏水基团及阴离子基团的有机化合物以及缓冲剂等四类物质，均可参与组成本发明试剂的渗透压。在满足渗透压低于50mOsm/kgH2O，pH值为4～12的情况下，除溶剂水以外，本发明的试剂可以只包含以上四类物质中的任意一类，也可以包含其中的多类。比如，在仅含有缓冲剂的试剂系统中，若该试剂系统渗透压低于50mOsm/kgH2O、pH值为4～12，则该试剂系统就能实现本发明的目的。同样，常用的NaCl，KCl，LiCl，Na2SO4或K2SO4等无机盐的水溶液，只要满足上述渗透压与pH值条件，就能用于白细胞四分类并达到所需的效果。
将本发明的上述试剂与全血样本以50∶1至200∶1的比例混合，作用时间10～20s后，通过测定细胞大小和形态信息，可以将白细胞分成淋巴细胞、单核细胞及嗜酸粒细胞相对应的3个集团与中性粒细胞和嗜碱粒细胞相对应的1个集团共4个集团，并可进行分类计数。细胞大小和形态信息的测定方法，通过低角度和高角度两种散射光完成。低角度散射光反应细胞大小的信息，测定角度为2～5度；高角度散射光反应形态的信息，测定角度为8～20度。散射光的检测可由一个光电二极管传感器完成。因此，利用本发明的试剂通过一种最简单的光学组合就可以完成白细胞的四分类检测。
本发明的试剂与全血样本混合时的反应温度可以是常温(25度)，也可以是高温(40度)，或是常温至高温(40度)的任一固定温度，通常优选在37度条件下反应。由于在实际操作中能够在高于室温的温度条件下反应，因此可以只需加热装置就可以实现恒温，而不必增加制冷装置，大大节约了仪器成本，而实现恒温有利于消除环境温度对反应的影响，增加结果的可靠性和稳定性。
下面通过具体的实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例1
一种用于白细胞四分类试剂，该试剂由以下成分组成：
氯化钠1g
补水到1L
pH5.3
渗透压34mOsm/kgH2O
以上成分中，氯化钠用于调节渗透压。
将10μl全血血样加入到0.8ml的上述试剂中，37度作用10s，之后通过低角度和高角度两个角度的散射光进行白细胞分类检测，低角度散射光测定角度为2～5度；高角度散射光测定角度为8～20度。结果如图1所示。
实例2：
一种用于白细胞四分类试剂，该试剂由以下成分组成：
HEPES2.38g
溴甲酚绿0.5g
补水到1L
pH7.0
渗透压15
以上成分中，HEPES为缓冲剂，溴甲酚绿为带阴离子基团的有机化合物。
将10μl全血血样加入到1ml的上述试剂中，37度作用10s，之后通过低角度和高角度两个角度的散射光进行白细胞分类检测，低角度散射光测定角度为2～5度；高角度散射光测定角度为8～20度。结果如图2所示。
实例3：
一种用于白细胞四分类试剂，该试剂由以下成分组成：
碳酸钠2.38g
癸基三甲基氯化铵0.5g
补水到1L
pH9.0
渗透压30
以上成分中，碳酸钠为缓冲剂，癸基三甲基氯化铵为表面活性剂。
将10μl全血血样加入到1.5ml的上述试剂中，37度作用10s，之后通过低角度和高角度两个角度的散射光进行白细胞分类检测，低角度散射光测定角度为2～5度；高角度散射光测定角度为8～20度。结果如图3所示。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.由以下成分组成的溶液作为白细胞分类试剂的用途：氯化钠，水，缓冲剂，pH5.3，渗透压34mOsm/kgH2O，以上成分中氯化钠用于调节渗透压。
2.一种对白细胞进行分类的方法，所述方法包括将一种白细胞分类试剂与全血样本混合后测定细胞的大小和形态信息，其中所述白细胞分类试剂由以下成分组成：氯化钠，水，缓冲剂，pH5.3，渗透压34mOsm/kgH2O，以上成分中氯化钠用于调节渗透压；所述方法包括在常温至40度的温度条件下，将所述白细胞分类试剂与所述全血样本按50:1至200:1的比例混合10~20s后，通过低角度和高角度两种散射光分别测定细胞的大小和形态信息，所述低角度散射光的测定角度为2~5度，高角度散射光的测定角度为8~20度。
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