CN110231469A - 一种白细胞三分类溶血剂 - Google Patents

一种白细胞三分类溶血剂 Download PDF

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李春晖
钱婷
余晓尘
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Abstract

本发明涉及一种白细胞三分类的溶血剂，每1L所述溶血剂中含有至少一种两性表面活性剂1g～10g、至少一种阳离子表面活性剂5g～40g以及至少一种潜溶剂5ml‑30ml。本发明的白细胞三分类溶血剂在较宽环境温度范围内仍能将白细胞分成三分群,同时保持较高的准确性及重复性,不受温度变化影响，并且试剂不含氰化物、叠氮化物等有毒成分，试剂的原料成本低，不含氰化物、叠氮化物等有毒物质，对环境友好无污染。

Description

一种白细胞三分类溶血剂
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂的技术领域，更具体地说，涉及一种白细胞三分类溶血剂。
背景技术
白细胞是血液中的一类细胞，呈无色球形状，故也称之为白血球。白细胞有细胞核，体积比红细胞大，直径在7～20μm之间，具有免疫作用。人身体有不适时，经常会通过白细胞数量的显著变化而表现出来。白细胞病理性增高非常重要，例如急性细菌性感染白细胞会迅速升高，而且和感染程度呈正比，医生多通过白细胞数量的变化初步判断是否因细菌性感染而造成以上的临床症状。白细胞升高往往意味着患者症状因细菌性感染而导致各身体器官或组织的急性或慢性的感染、炎症、组织损伤等情况。人体发生感染而白细胞不升高往往被看作是病毒入侵导致的感染，白细胞升高呈幅度较小、缓慢的状态。白细胞数量减少也是不可忽视的问题，例如长期接触放射线、各种理化因素导致的中毒、肿瘤的化疗和放疗、脾功能亢进、自身免疫病、再生障碍性贫血、造血功能障碍等都会导致白细胞，特别是中性粒细胞的减少。
溶血剂是血细胞分析仪最常用的试剂之一，在稀释液的共同作用下使红细胞迅速溶解，释放血红蛋白与溶血剂结合形成稳定的血红蛋白衍生物，同时维持白细胞的形态，并保持一定的体积，血细胞分析仪通过白细胞的体积大小将白细胞进行三分群：淋巴细胞(LYM％)、中间细胞(MID％)及中性粒细胞(GRAN％)，同时进行白细胞(WBC)计数。
目前存在的三分类试剂在将白细胞三分群时，在低温或高温环境下存在分类间距较窄，中间细胞(MID％)常常计数不准确，并且重复性较低。
专利CN 1101980A公开了一种白血球3分类用试剂，其中加入的组份有十二烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵以及氯化物。该方法使用了两种季铵盐类阳离子表面活性剂，可以将白细胞分为三个亚群，但在较高或较低温度测量样本时较容易受到温度的干扰，稳定性不强。
专利CN 1247982A公开了一种白细胞的测定试剂，含阳离子型去污剂、皂苷、甘露糖醇等组份。淋巴细胞群和中性粒细胞群分布靠近，容易造成中间细胞群的误识别。同时皂苷、甘露糖醇等物料价格较昂贵，试剂成本较高，不宜推广。
专利CN 103323581A公开了一种白血球三分群的溶血剂方法，其中加入的物质组份有季铵盐类阳离子表面活性剂，碱金属氯化物，乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸衍生物、蚁酸、醋酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、苯甲酸或马来酸等无机酸中的一种或几种，pH调节剂为盐酸、硫酸、磷酸等，该方法淋巴细胞群和中性粒细胞群分布也较窄，不利于白细胞分类的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白细胞三分类溶血剂，解决了现有技术中的白细胞分类溶血剂在低温或高温环境下存在分类间距较窄、重复性差以及分类准确性差的问题。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种白细胞三分类的溶血剂，每1L所述溶血剂中含有两性表面活性剂1g～10g、阳离子表面活性剂5g～40g以及潜溶剂5ml-30ml；
所述两性表面活性剂选自甜菜碱型两性表面活性剂、咪唑啉型两性表面活性剂中的至少一种；
所述甜菜碱型两性表面活性剂为式I所示化合物：
其中，R1是表示碳原子数为12～18的长链烷基、烯基或炔基，X—是表示羧酸基、磺基、磷酸脂基或类似的阴离子基团；
所述咪唑啉型两性表面活性剂为式II或式III所示的化合物：
其中，R1是表示氢原子或碳原子数为12～18的长链烷基、烯基或炔基，R2是表示碳原子数为1～8的短链烷基、烯基或炔基，X—是表示羧酸基、磺基或磷酸脂基。
在本发明的白细胞三分类的溶血剂中，每1L所述溶血剂中含有两性表面活性剂1g～6g、阳离子表面活性剂5g～25g以及潜溶剂5ml-20ml。
在本发明的白细胞三分类的溶血剂中，所述阳离子表面活性剂为季铵盐阳离子表面活性剂。
在本发明的白细胞三分类的溶血剂中，所述季铵盐阳离子表面活性剂为式IV所示的化合物：
其中，R5是表示碳原子数为10～18的长链烷基、烯基或炔基，R3、R4、R6分别是表示氢原子或碳原子数为1～4的短链烷基、烯基或炔基，Y—是表示卤素阴离子或酸根离子。
在本发明的白细胞三分类的溶血剂中，所述潜溶剂选自烷基醇、苯基取代醇中的至少一种；
所述烷基醇选自乙二醇、丙三醇、异丙醇、正己醇中的至少一种；所述苯基取代醇选自苯甲醇、苯氧乙醇中的至少一种。
在本发明的白细胞三分类的溶血剂中，每1L所述溶血剂中还含有至少一种稳定剂0.05g～10g。
在本发明的白细胞三分类的溶血剂中，所述稳定剂选自酰胺类化合物、氯代烃类化合物中的至少一种；
其中，酰胺类化合物为式V所示的化合物：
V，其中R7和R8分别表示氢原子或烃基。
在本发明的白细胞三分类的溶血剂中，所述溶血剂还包含有pH调节剂，且所述溶血剂通过所述pH调节剂调节至pH＝3～6。
在本发明的白细胞三分类的溶血剂中，所述pH调节剂选自无机酸、有机酸、缓冲对、碱中的至少一种。
实施本发明的白细胞三分类溶血剂，具有以下有益效果：本发明的白细胞三分类溶血剂在较宽环境温度范围内仍能将白细胞分成三分群,同时保持较高的准确性及重复性,不受温度变化影响，并且试剂不含氰化物、叠氮化物等有毒成分，试剂的原料成本低，不含氰化物、叠氮化物等有毒物质，对环境友好无污染。
附图说明
图1是本发明实施例1中的溶血剂在帝迈公司生产的DH36系列血细胞分析仪上得到的白细胞直方图；
图2是本发明实施例2中的溶血剂在帝迈公司生产的DH36系列血细胞分析仪上得到的白细胞直方图；
图3是本发明实施例3中的溶血剂在帝迈公司生产的DH36系列血细胞分析仪上得到的白细胞直方图；
图4是本发明的溶血剂(实施例1)在帝迈公司生产的DH36系列血细胞分析仪上10℃环境下测试得到的白细胞直方图；
图5是本发明的溶血剂(实施例1)在帝迈公司生产的DH36系列血细胞分析仪上常温环境下测试得到的白细胞直方图；
图6是本发明的溶血剂(实施例1)在帝迈公司生产的DH36系列血细胞分析仪在35℃环境下测试得到的白细胞直方图；
图7是其它品牌仪器及其试剂在10℃环境下测试得到的白细胞直方图；
图8其它品牌仪器及其试剂在常温环境下测试得到的白细胞直方图；
图9其它品牌仪器及其试剂在35℃环境下测试得到的白细胞直方图；
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的白细胞三分类溶血剂作进一步说明：
本发明提供一种在较大温度范围内仍能将白细胞分成三分群，同时保持较高的准确性及重复性，该三分群为淋巴细胞群、中性粒细胞群及其它白细胞组成的中间细胞群。
本发明中每1L溶血剂中含有：至少一种两性表面活性剂1g～10g、至少一种阳离子表面活性剂5g～40g以及至少一种潜溶剂5ml-30ml。进一步地，每1L溶血剂中含有：至少一种两性表面活性剂1g～6g、至少一种阳离子表面活性剂5g～25g以及至少一种潜溶剂5ml-20ml。
在一些实施方案中，每1L溶血剂中还含有至少一种稳定剂0.05g～10g。进一步地，每1L溶血剂中还含有至少一种稳定剂0.1g～5g。
在一些实施方案中，在溶血剂中还包含有pH调节剂，且通过该pH调节剂调节使溶血剂的pH＝3～6。进一步地，通过该pH调节剂调节使溶血剂的pH＝3.5～5。
需要说明的是，每1L溶血剂中其余量为水。
其中，两性表面活性剂选自甜菜碱型两性表面活性剂、咪唑啉型两性表面活性剂中的至少一种。其可以维持白细胞的形态，保持一定的白细胞体积，在一定的浓度范围内可将白细胞膜进行一定程度的破坏，不同白细胞的细胞膜被破坏程度不同，在一定渗透压环境下，可将白细胞分成三个分群。
甜菜碱型两性表面活性剂为式I所示化合物：
其中，R1是表示氢原子或碳原子数为12～18的长链烷基、烯基或炔基，X—是表示羧酸基、磺基、磷酸脂基或类似的阴离子基团；
咪唑啉型两性表面活性剂为式II或式III所示的化合物：
其中，R1是表示氢原子或碳原子数为12～18的长链烷基、烯基或炔基，R2是表示碳原子数为1～8的短链烷基、烯基或炔基，X—是表示羧酸基、磺基、磷酸脂基或类似的阴离子基团。
阳离子表面活性剂为季铵盐阳离子表面活性剂。该阳离子表面活性剂在一定浓度范围内，可快速溶解红细胞，排除计数时红细胞对白细胞的干扰，同时与血红蛋白结合形成络合物，根据比色原理测定血红蛋白的浓度。
季铵盐阳离子表面活性剂为式IV所示的化合物：
其中，R5是表示碳原子数为10～18的长链烷基、烯基或炔基，R3、R4、R6分别是表示氢原子或碳原子数为1～4的短链烷基、烯基或炔基，Y—是表示卤素阴离子(如F—、Cl—、Br—、I—)或酸根离子(如HSO4 -、羧酸根等)。
潜溶剂能与水任意比例混合，与水分子能形成氢键结合，能增加难溶性物的溶解，根据不同的溶剂对难溶性物分子的不同结构具有特殊亲和力的原理，能使在某一比例时达到最大溶解度，有助于不同表面活性剂间的互溶，如小分子醇类等。同时，潜溶剂本身还可以起到稳定溶血剂的作用。潜溶剂可以选自烷基醇、苯基取代醇中的至少一种。烷基醇选自乙二醇、丙三醇、异丙醇、正己醇中的至少一种；苯基取代醇选自苯甲醇、苯氧乙醇中的至少一种。
稳定剂选自酰胺类化合物、氯代烃类化合物中的至少一种，能增强溶血剂各组分间的化学稳定性，使溶血剂在较大温度范围内能保持稳定的溶血和分类效果，增大溶血剂作用的温度范围，增加溶血剂的使用期限。
其中，酰胺类化合物为式V所示的化合物：
V，其中R7和R8分别表示氢原子或烃基。
pH调节剂选自无机酸、有机酸、缓冲对、碱中的至少一种。如盐酸、磷酸等无机酸，甲酸、醋酸、柠檬酸等有机酸，磷酸盐、硼酸盐等缓冲对，氢氧化钠、氢氧化钾等碱。
本发明的溶血剂在白细胞三分群的基础上，拉大淋巴细胞群和中性粒细胞群的分布，提高分类的准确性与重复性，同时提高试剂在较宽温度范围内的稳定性，不受温度变化影响而对分类结果产生较大的干扰，以保证分类结果的准确性和重复性。同时试剂溶血剂中不含氰化物，对环境友好，无污染。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
十八烷基三甲基氯化铵10g；
十烷基三甲基氯化铵6.5g；
十二烷基二甲基磺乙基甜菜碱4.0g；
异丙醇10mL；
N,N-二甲基甲酰胺0.2g
柠檬酸/柠檬酸三钠调节pH至4.0。
将上述物料按比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用0.22μm滤膜进行过滤，在血细胞分析仪上进行测试，得到如图1所示分类的直方图，各细胞群所属的直方图波峰明显,并且淋巴细胞群与中性粒细胞群的直方图间距较大,拉得比较开,能更好的将白细胞进行三分群，提高了白细胞三分类的准确性和重复性。
实施例2：
十四烷基三甲基氯化铵18.5g；
十四烷基二甲基甜菜碱5.0g；
苯甲酰基甲磺酰胺0.08g
乙二醇7.5mL；
硼酸盐缓冲液调节pH值至4.2。
将上述物料按比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用0.22μm滤膜进行过滤，在血细胞分析仪上进行测试，得到如图2所示分类的直方图，各细胞群所属的直方图波峰明显,并且淋巴细胞群与中性粒细胞群的直方图间距较大,拉得比较开,能更好的将白细胞进行三分群，提高了白细胞三分类的准确性和重复性。
实施例3：
十二烷基三甲基溴化铵24.0g；
椰油基两性羧基甘氨酸盐4.5g；
对乙酰氨基苯磺酰胺0.15g
丙三醇5.0mL；
Tris/HCl缓冲液调节pH值至4.5。
将上述物料按比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用0.22μm滤膜进行过滤，在血细胞分析仪上进行测试，得到如图3所示分类的直方图，各细胞群所属的直方图波峰明显,并且淋巴细胞群与中性粒细胞群的直方图间距较大,拉得比较开,能更好的将白细胞进行三分群，提高了白细胞三分类的准确性和重复性。
实施例4：
十六烷基三甲基溴化铵40g；
十二烷基二甲基甜菜碱3.0g；
椰油基两性羧基甘氨酸盐2.5g
异丙醇25mL；
苯甲醇1.0g；
醋酸调节pH至3.5。
将上述物料按比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用0.22μm滤膜进行过滤，在血细胞分析仪上进行测试，结果(未有图显示)显示各细胞群波峰明显,并且淋巴细胞群与中性粒细胞群的直方图间距较大,拉得比较开,能更好的将白细胞进行三分群，提高了白细胞三分类的准确性和重复性。
实施例5：
十八烷基三甲基氯化铵5g；
十八烷基二甲基甜菜碱1.0g；
月桂酰两性基乙酸钠1.7g
苯氧乙醇5mL；
盐酸和碱调节pH至4.2。
将上述物料按比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用0.22μm滤膜进行过滤，在血细胞分析仪上进行测试，结果(未有图显示)显示各细胞群波峰明显,并且淋巴细胞群与中性粒细胞群的直方图间距较大,拉得比较开,能更好的将白细胞进行三分群，提高了白细胞三分类的准确性和重复性。
实施例6：
十八烷基三甲基氯化铵25g；
十烷基三甲基氯化铵15g；
式II所示的咪唑啉型两性表面活性剂10g；其中R1是十八烷基，R2是辛基：X—是磺基；
异丙醇30mL；
N,N-二甲基甲酰胺10g
柠檬酸/柠檬酸三钠调节pH至6.0。
将上述物料按比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用0.22μm滤膜进行过滤，在血细胞分析仪上进行测试，结果(未有图显示)显示各细胞群波峰明显,并且淋巴细胞群与中性粒细胞群的直方图间距较大,拉得比较开,能更好的将白细胞进行三分群，提高了白细胞三分类的准确性和重复性。
实施例7：
十四烷基三甲基氯化铵5g；
式III所示的咪唑啉型两性表面活性剂1g；其中R1是十二烷基，R2是甲基：X—是羧酸基；
苯甲酰基甲磺酰胺0.05g
乙二醇5mL；
硼酸盐缓冲液调节pH值至3.0。
将上述物料按比例混合，加去离子水至1L，室温下搅拌至溶解完全，用0.22μm滤膜进行过滤，在血细胞分析仪上进行测试，得到如图2所示分类的直方图，各细胞群所属的直方图波峰明显,并且淋巴细胞群与中性粒细胞群的直方图间距较大,拉得比较开,能更好的将白细胞进行三分群，提高了白细胞三分类的准确性和重复性。
将实施例1配置的溶血剂在帝迈公司生产的DH36系列血细胞分析仪上使用和其他品牌血细胞分析仪及其试剂对比测试，分别在常温、10℃环境、35℃环境中并分别得到如图4-9所示的白细胞直方图。由图中可以看出，本发明的溶血剂受温度变化影响小，在不同温度下，各细胞群所属的直方图仍波峰明显,并且淋巴细胞群与中性粒细胞群的直方图间距较大,拉得比较开，能很好的将白细胞进行三分群，也就是说在较大温度范围内仍能将白细胞分成三分群。
表1是实施例1中的溶血剂在帝迈公司生产的DH36系列血细胞分析仪在常温环境下得到的白细胞分类的重复性结果以及其他品牌仪器和试剂测试得到的白细胞分类的重复性结果对比。
表2是实施例1中的溶血剂在帝迈公司生产的DH36系列血细胞分析仪在10℃环境下得到的白细胞分类的重复性结果以及其他品牌仪器和试剂测试得到的白细胞分类的重复性结果对比。
表3是中的溶血剂在帝迈公司生产的DH36系列血细胞分析仪在35℃环境下得到的白细胞分类的重复性结果以及其他品牌仪器和试剂测试得到的白细胞分类的重复性结果对比。
表1：常温环境下两组试剂重复性对比结果
表2：10℃环境下两组试剂重复性对比结果
表3：35℃环境下两组试剂重复性对比结果
由上述3个表格综合结果可以看出，本发明的溶血剂不受温度变化影响，在不同环境温度下白细胞三分群结果仍能保持较高的重复性。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种白细胞三分类的溶血剂，其特征在于，每1L所述溶血剂中含有两性表面活性剂1g～10g、阳离子表面活性剂5g～40g以及潜溶剂5ml-30ml；
所述两性表面活性剂选自甜菜碱型两性表面活性剂、咪唑啉型两性表面活性剂中的至少一种；
所述甜菜碱型两性表面活性剂为式I所示化合物：
其中，R1是表示碳原子数为12～18的长链烷基、烯基或炔基，X—是表示羧酸基、磺基或磷酸脂基；
所述咪唑啉型两性表面活性剂为式II或式III所示的化合物：
其中，R1是表示氢原子或碳原子数为12～18的长链烷基、烯基或炔基，R2是表示碳原子数为1～8的短链烷基、烯基或炔基，X—是表示羧酸基、磺基或磷酸脂基。
2.根据权利要求1所述的白细胞三分类的溶血剂，其特征在于，每1L所述溶血剂中含有两性表面活性剂1g～6g、阳离子表面活性剂5g～25g以及潜溶剂5ml-20ml。
3.根据权利要求1或2所述的白细胞三分类的溶血剂，其特征在于，所述阳离子表面活性剂为季铵盐阳离子表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的白细胞三分类的溶血剂，其特征在于，所述季铵盐阳离子表面活性剂为式IV所示的化合物：
其中，R5是表示碳原子数为10～18的长链烷基、烯基或炔基，R3、R4、R6分别是表示氢原子或碳原子数为1～4的短链烷基、烯基或炔基，Y—是表示卤素阴离子或酸根离子。
5.根据权利要求1或2所述的白细胞三分类的溶血剂，其特征在于，所述潜溶剂选自烷基醇、苯基取代醇中的至少一种；
所述烷基醇选自乙二醇、丙三醇、异丙醇、正己醇中的至少一种；所述苯基取代醇选自苯甲醇、苯氧乙醇中的至少一种。
6.根据权利要求1或2所述的白细胞三分类的溶血剂，其特征在于，每1L所述溶血剂中还含有至少一种稳定剂0.05g～10g。
7.根据权利要求6所述的白细胞三分类的溶血剂，其特征在于，所述稳定剂选自酰胺类化合物、氯代烃类化合物中的至少一种；
其中，酰胺类化合物为式V所示的化合物：
其中R7和R8分别表示氢原子或烃基。
8.根据权利要求1或2所述的白细胞三分类的溶血剂，其特征在于，所述溶血剂还包含有pH调节剂，且所述溶血剂通过所述pH调节剂调节至pH＝3～6。
9.根据权利要求8所述的白细胞三分类的溶血剂，其特征在于，所述pH调节剂选自无机酸、有机酸、缓冲对、碱中的至少一种。
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