CN103575702A - 白细胞分类计数试剂和白细胞分类方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种白细胞分类计数试剂、对白细胞分类计数的方法和两性离子表面活性剂的应用。该白细胞分类计数试剂包含至少一种阳离子表面活性剂和至少一种两性离子表面活性剂以及pH缓冲剂。其中，该两性离子表面活性剂为文中通式I所示的结构的两性离子表面活性剂或为胆汁酸衍生物型两性表面活性剂。本发明白细胞分类计数试剂能对嗜酸性粒细胞进行特异性处理，增强了嗜酸性粒细胞与中性粒细胞之间的差异，以达到增强嗜酸性粒细胞分类作用，使老化血中各个白细胞亚类分类效果与新鲜血的分类效果之间差异在可接受的范围内。该对白细胞分类计数的方法快速，准确。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞分类试剂和对细胞分类的方法，具体的涉及一种白细胞分类计数试剂和利用该试剂对血液中白细胞分类的方法以及一种两性离子表面活性剂的用途。
背景技术
人体血液中的白细胞可以分为单核细胞、淋巴细胞和粒细胞（包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞）五个亚类。正常健康人血液中白细胞各个亚类的比例是相对恒定的，当人体出现某些疾病时，则会表现出某一类或几类白细胞数量的增多或减少。其中嗜酸性粒细胞是在人全血中占比例很少的一种粒细胞，健康人血液中占白细胞比例为0.5～5％，临床上出现过敏性疾病或寄生虫感染等疾病时，嗜酸性粒细胞的数量会出现明显的变化，因此在人全血检测中嗜酸性粒细胞的准确分类计数对这些疾病的正确诊断有直接的指导意义。
嗜酸性粒细胞大小与中性粒细胞接近，在非疾病人群的全血样本中，即正常成熟的嗜酸性粒细胞，细胞中的颗粒已经完全成熟，使其在前向高角度光散射的作用下，能够与中性粒细胞得以区分。而在疾病条件下，尤其是寄生虫感染的病人全血样本中，由于病理性作用，脊髓中大量不成熟嗜酸性粒细胞进入外周血中，使嗜酸性粒细胞在外周血中的所占比例急剧增加，并且不成熟嗜酸性粒细胞与中性粒细胞的区分程度也明显降低，应用现有技术的白细胞分类试剂不足以将不成熟嗜酸性粒细胞与中性粒细胞区分开，使得嗜酸性粒细胞的检测准确性明显减低。
在医院对病人血液样本进行分析处理时，从病人体内采集新鲜抗凝血样后，有时会放置一段时间后进行分析，或会对放置较长时间的病人血样进行复检（室温条件下存储48小时以内）。随着放置时间的延长，各种细胞经过新陈代谢，新鲜血样逐渐老化，而同一血样的新鲜血和老化血之间细胞形态会出现明显变化，往往会造成老化血的白细胞分类计数可信度降低，其中所占比例较少的嗜酸性粒细胞的分类准确性降低的尤为严重。
目前，国内外对白细胞分类相关内容进行了研究，也出现了一下研究成果。在国外公开了一种用于测量血红蛋白（HGB）和嗜酸性粒细胞（Eos）的试剂和方法。试剂含有聚氧乙烯结构为基础的非离子表面活性剂，pH范围3-11，通过阻抗法（DC）实现Eos分类计数。
国外还公开了一种用含有聚氧乙烯-9-月桂醚对血样进行处理后对白细胞进行分类的方法。这种方法在酸性介质下适于区分嗜碱性粒细胞，在碱性介质下适用于区分嗜酸性粒细胞。
上述两种现有技术均是从白细胞中单独分离出嗜酸性粒细胞，但不能同时对其他类型的白细胞进行分类。
另外，国外公开了一种白细胞分类的试剂，该试剂包括至少一种离子表面活性剂，可以是阳离子或两性表面活性剂中一种，至少含一种带阴离子的有机化合物，一种非离子表面活性剂和用来调整pH值的缓冲剂。检测方法为激光散射法。
国外还公开了一种白细胞五分类的试剂，通过两种试剂，第一试剂为稀释血样的高渗溶液，第二试剂为含阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂的溶液，检测方法为直流阻抗和射频法。
在国外另一专利中公开了一种白细胞五分类的方法和试剂系统。溶血剂由两种试剂组成，第一试剂含烷基磺酸的碱金属盐类、有机酸、无机酸或其混合物及非离子表面活性剂。第二试剂含聚氧乙烯或聚氧丙烯的共聚物类表面活性剂、十二烷基磺酸钠的高深碱性溶液。检测方法为直流阻抗和射频法。
在国内公开了一种通过两种试剂完成白细胞五分类的方法。该两种试剂除都含有非离子表面活性剂和缓冲液外，第一种试剂至少含有一种离子表面活性剂和一种带阴离子的有机化合物，将血细胞分为淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜碱性粒细胞和中性粒细胞四类，第二种试剂至少含有一种离子表面活性剂，将血细胞分成嗜碱性粒细胞和其他细胞类群。检测方法为激光散射法。国内还公开了一种白细胞分类计数试剂，该试剂包含阳离子、两性表面活性剂以及其组合，包含苯环或者杂环的有机化合物，调节pH值的缓冲液。检测方法为激光散射法。
以上现有技术的分类试剂以及方法中，溶血剂溶解全血样本中的红细胞，并对白细胞进行非特异性作用，结合检测方法通过各种类型白细胞的结构特点进行区分，其中嗜酸性粒细胞是作为其中一个类群进行分类和计数。由于现有技术并不含有针对嗜酸性粒细胞特异性处理的成分，因此对于含有高嗜酸的全血样本或老化血样中嗜酸性粒细胞的分类准确性不够理想。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能够快速溶解红细胞，能增强嗜酸性粒细胞分类作用，使新鲜全血样本和室温存储48小时的老化全血样本的白细胞分类结果更为准确的白细胞分类计数试剂。
本发明另一目的是提供一种方便、快捷，且能准确对新鲜全血样本和室温存储48小时以内的老化全血样本中的白细胞进行分类计数的方法。
本发明又一目的是提供一种两性离子表面活性剂在制备白细胞分类计数试剂中的用途。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种白细胞分类计数试剂，包括
（1）表面活性剂溶液，所述表面活性剂溶液能够溶解红细胞，使白细胞膜部分损伤，稳定嗜酸性粒细胞和老化细胞的细胞膜，所述表面活性剂溶液含有 至少一种阳离子表面活性剂和至少一种两性离子表面活性剂；
所述两性表面活性剂具有通式I所示的结构
式中R1为C8-18的烷基；R2和R3各自独立选自C1-3的烷基、C1-3烷氧基或C1-3烷羟基；a为0或1；n为0-6的整数；m为1-5的整数；X选自羧基或磺酸基；
或/和所述两性离子表面活性剂选自胆汁酸衍生物型两性表面活性剂；
（2）能够将pH值调整在4～6范围内的缓冲剂。
以及，一种对白细胞分类的方法，包括如下步骤：
一种对白细胞分类计数的方法，包括如下步骤：
将上述的白细胞分类计数试剂与待测血样混合反应，溶解红细胞和血小板，损伤白细胞；
检测所述白细胞的至少两种光信号，得到所述白细胞的形态和大小信息；
根据所述白细胞的形态和大小信息，将所述白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞相对应的3个集团以及与中性粒细胞和嗜碱性粒细胞相对应的1个集团共4个集团，并对所述各集团中所含细胞数目进行计数。
本发明还提供一种具有通式I所示结构的两性离子表面活性剂在制备白细胞分类计数试剂中的用途，
式中R1为C8-18的烷基；R2和R3各自独立选自C1-3的烷基、C1-3烷氧基或C1-3烷羟基；a为0或1；n为0-6的整数；m为1-5的整数；X选自羧基或磺酸基。
上述白细胞分类计数试剂中的阳离子表面活性剂组分起到溶血剂作用，能有效的溶解待测血样中红细胞和血小板，并对白细胞膜进行部分损伤；两性离子表面活性剂一方面能够起到溶血剂作用，协助溶解红细胞和血小板，另一方面，由于其同时带有正负两个离子集团，能够对白细胞膜起到稳定作用，尤其对嗜酸性粒细胞以及老化样本中的白细胞，能缓解阳离子表面活性剂等溶血剂组分对其的过度损伤。因此，上述白细胞分类计数试剂与待测血样接触后，能快速的溶解红细胞，对嗜酸性粒细胞进行特异性处理，增强了嗜酸性粒细胞与中性粒细胞之间的差异，以达到增强嗜酸性粒细胞分类作用，使老化血中各个白细胞亚类分类效果与新鲜血的分类效果之间差异在可接受的范围内，使得该试剂同时能够满足对新鲜全血和室温存储48小时以内的老化全血样本中白细胞准确分类。
上述对白细胞分类计数的方法能有效增强嗜酸性粒细胞与中性粒细胞之间的差异，可以使老化血中各个白细胞亚类分类效果与新鲜血的分类效果之间差异在可接受的范围内，使高嗜酸性粒细胞样本中的嗜酸性粒细胞更好地与中性粒细胞区分，增强了白细胞分类的方法准确度。同时，该方法能有效增强嗜酸性粒细胞与中性粒细胞之间的差异，对不同血液样本的适应性强。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是利用本发明实施例1的试剂对待测血样进行白细胞分类计数时的前向低角度和高角度散射光的散射图；
图2是利用本发明实施例2的试剂对待测血样进行白细胞分类计数时的前向低角度和高角度散射光的散射图；
图3是利用本发明实施例3的试剂对待测血样进行白细胞分类计数时的前向低角度和高角度散射光的散射图；
图4是利用本发明实施例4的试剂对待测血样进行白细胞分类计数时的前 向低角度和高角度散射光的散射图；
图5是利用本发明实施例5的试剂对待测血样进行白细胞分类计数时的前向低角度和高角度散射光的散射图；
图6是利用本发明实施例6的试剂对待测血样进行白细胞分类计数时的前向低角度和高角度散射光的散射图；
图7是利用本发明实施例7的试剂对待测血样进行白细胞分类计数时的前向低角度和高角度散射光的散射图；
图8是利用对比实例1的试剂A对待测血样进行白细胞分类计数时的前向低角度和高角度散射光的散射图；其中，图8-a是A血样检测图、图8-b是B血样检测图、图8-c是C血样检测图；
图9是利用本发明实施例8的试剂对待测血样进行白细胞分类计数时的前向低角度和高角度散射光的散射图；图9-a是A血样检测图、图9-b是B血样检测图、图9-c是C血样检测图；
图10是利用本发明实施例9的试剂对待测血样中四类群白细胞的分类与常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果的相关性关系图；其中，图10-a是淋巴细胞与常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果的相关性关系，图10-b是单核细胞与常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果的相关性关系，图10-c是中性粒细胞与常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果的相关性关系，图10-d是嗜酸性粒细胞与常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果的相关性关系；
图11是利用本发明实施例11的试剂对待测血样进行白细胞分类计数时的前向低角度和高角度散射光的散射图；
图12是利用本发明实施例12的试剂对待测血样进行白细胞分类计数时的前向低角度和高角度散射光的散射图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种具有通式I所示结构的两性离子表面活性剂在制备白细胞分类计数试剂中的用途，该通式I如下：
式中，R1为C8-18（即C原子数为8～18）的烷基；R2和R3各自独立选自C1-3的烷基、C1-3烷氧基或C1-3烷羟基；a为0或1；n为0-6的整数；m为1-5的整数；X选自羧基或磺酸基。
在优选实施例中，上述通式I中的R2和R3各自独立选自羟乙基、乙氧基、羟丙基；X为磺酸基，n为3，m为3。因此，在该优选实施例中，R1、R2、R3、n、m和X可以多种选择性组合。这样，上述通式I的两性表面活性剂至少有如下几种分子结构：
第一种：n为3，R2和R3各自独立选自C1-3的烷基、C1-3烷氧基或C1-3烷羟基，a为0或1，m为1-5的整数，X选自羧基或磺酸基；
第二种：R2和R3各自独立选自羟乙基或甲基，a为0或1，n为0-6的整数，m为1-5的整数，X选自羧基或磺酸基；
第三种：m为3，X为磺酸基，R1为C8-18的烷基；R2和R3各自独立选自C1-3的烷基、C1-3烷氧基或C1-3烷羟基，a为0或1，n为0-6的整数；
第四种：R2和R3为乙氧基，R1为C8-18的烷基，a为0或1，n为0-6的整数，m为1-5的整数，X选自羧基或磺酸基；
第五种：R2和R3为羟丙基，R1为C8-18的烷基，a为0或1，n为0-6的整数，m为1-5的整数，X选自羧基或磺酸基；
第六种：R2和R3各自独立选自羟丙基，n为3，X为磺酸基，R1为C8-18的烷基，a为0或1，m为1-5的整数。
具体地，上述通式I的两性表面活性剂可以是癸基酰胺丙基甜菜碱、月桂基酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、硬脂基酰胺丙基甜菜碱、月桂基二羟乙基甜菜碱、十四烷基二羟乙基甜菜碱、硬脂基二羟乙基甜菜碱、月桂基磺基甜菜碱、十四烷基磺基甜菜碱、十六烷基磺基甜菜碱、十八烷基磺基甜菜碱、十二烷基乙氧基磺基甜菜碱、十四烷基乙氧基磺基甜菜碱、十六烷基乙氧基磺基甜菜碱、十八烷基乙氧基磺基甜菜碱、十二烷基羟丙基磺基甜菜碱、十四烷基羟丙基磺基甜菜碱、十六烷基羟丙基磺基甜菜碱、十八烷基羟丙基磺基甜菜碱、月桂酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、椰油酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、十四烷基酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、十六烷基酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱或十八烷基酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱。
上述两性表面活性剂在白细胞分类计数试剂中应用时，其一方面能够起到溶血剂作用，协助阳离子表面活性剂溶解红细胞和血小板，另一方面，由于其同时带有正负两个离子集团，能够对白细胞膜尤其是对嗜酸性粒细胞以及老化血样本中的白细胞起到稳定作用，在一定程度上缓解阳离子表面活性剂等溶血剂组分对白细胞的过度损伤，达到显著增强嗜酸性粒细胞与中性粒细胞之间的差异，以便对白细胞的准确分类计数。
本发明实施例还提供了一种有效增强嗜酸性粒细胞与中性粒细胞之间的差异，能对新鲜全血样本和室温存储48小时以内的老化全血样本中的白细胞进行快速，准确分类计数的试剂。该白细胞分类计数试剂包括：
（1）表面活性剂溶液，所述表面活性剂溶液能够溶解红细胞，使白细胞膜部分损伤，稳定嗜酸性粒细胞和老化细胞的细胞膜，所述表面活性剂溶液含有至少一种阳离子表面活性剂和至少一种两性离子表面活性剂；
其中，该两性表面活性剂为上文所述的通式I所示结构两性表面活性剂或/和胆汁酸衍生物型两性表面活性剂；其中，通式I如下：
通式I中的R1为C8-18（即C原子数为8～18）的烷基；R2和R3各自独立选自C1-3的烷基、C1-3烷氧基或C1-3烷羟基；a为0或1；n为0-6的整数；m为1-5的整数；X选自羧基或磺酸基；
（2）能够将pH值调整在4～6范围内的缓冲剂。
具体地，当两性表面活性剂为上文所述的通式I所示结构两性表面活性剂时，在优选实施例中，上述通式I中的R2和R3各自独立选自羟乙基、乙氧基、羟丙基；X为磺酸基，n为3，m为3。因此，在该优选实施例中，R1、R2、R3、n、m和X可以多种选择性组合。这样，上述通式I的两性表面活性剂至少有如上文所述的几种分子结构，为了节约篇幅，在此不再赘述。
上述两性表面活性剂具体地可以选自癸基酰胺丙基甜菜碱、月桂基酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、硬脂基酰胺丙基甜菜碱、月桂基二羟乙基甜菜碱、十四烷基二羟乙基甜菜碱、硬脂基二羟乙基甜菜碱、月桂基磺基甜菜碱、十四烷基磺基甜菜碱、十六烷基磺基甜菜碱、十八烷基磺基甜菜碱、十二烷基乙氧基磺基甜菜碱、十四烷基乙氧基磺基甜菜碱、十六烷基乙氧基磺基甜菜碱、十八烷基乙氧基磺基甜菜碱、十二烷基羟丙基磺基甜菜碱、十四烷基羟丙基磺基甜菜碱、十六烷基羟丙基磺基甜菜碱、十八烷基羟丙基磺基甜菜碱、月桂酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、椰油酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、十四烷基酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、十六烷基酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、十八烷基酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱中的一种或两种以上互配。
当上述两性表面活性剂为胆汁酸衍生物型两性表面活性剂时，该胆汁酸衍生物型两性表面活性剂优选为3-[(3-胆烷酰胺丙基)-二甲基铵]-1-丙磺酸盐（CHAPS）、3-[(3-胆烷酰胺基丙基)-二甲基铵]-2-羟-1-丙磺酸盐（CHAPSO）中的一种或两种互配。
当然，上述两性表面活性剂还可以是上述的通式I所示的结构两性表面活性剂与胆汁酸衍生物型两性表面活性剂的复合物。此时，通式I所示的结构两性表面活性剂与胆汁酸衍生物型两性表面活性剂优选按质量比为10:1～1:10进行混合。
上述各实施例中的两性表面活性剂在上述白细胞分类计数试剂中的浓度为50～8000mg/L，优选为100～7000mg/L。
上述实施例中的两性表面活性剂一方面能够起到溶血剂作用，协助阳离子表面活性剂溶解红细胞和血小板，另一方面，由于其同时带有正负两个离子集团，能够对白细胞膜尤其是对嗜酸性粒细胞以及老化血样本中的白细胞起到稳定作用，在一定程度上缓解阳离子表面活性剂等溶血剂组分对白细胞的过度损伤，达到显著增强嗜酸性粒细胞与中性粒细胞之间的差异，以便对白细胞的准确分类计数。上述优选的两性表面活性剂含量和种类溶解红细胞和血小板的协助作用更好，更好的缓解对阳离子表面活性剂对白细胞的过度损伤，使得经阳离子表面活性剂损伤的白细胞更加稳定，进一步增强嗜酸性粒细胞与中性粒细胞之间的差异，使得各类白细胞从大小和形态上完全分离，以更加方便准确的对血样中的白细胞进行识别，并分类计数。
上述实施例中的阳离子表面活性剂主要起到溶血剂作用，用于溶解红细胞和血小板，并对白细胞膜进行部分损伤。为了使得该阳离子表面活性剂组分溶血效果更好，并对白细胞膜进行适度损伤，在优选实施例中，其选用具有通式II结构的季铵盐阳离子表面活性剂：
式II中的R4为C6-14的烷基或链烯基，优选辛基、癸基或月桂基；R5和R6各自独立选自C1-4的烷基或链烯基，优选甲基、乙基；R7为C1-4的烷基、链烯基或苄基；Y为卤素。
该阳离子表面活性剂在上述白细胞分类计数试剂中的浓度为10～5000mg，优选为50～3000mg/L。
上述将pH值调整在4～6范围内的缓冲剂能有效的调节和稳定上述实施例白细胞分类计数试剂的pH，以发挥该试剂中各组分作用以及组分之间协同作用。同时通过调整并稳定pH值可以满足增强嗜酸性粒细胞分类效果，使得该试剂准确对白细胞分类计数。为了更加准确的对白细胞，特别是对嗜酸性粒细胞分类并计数，在优选实施例中，采用pH调节缓冲剂将该试剂的pH调整4.5～5.5；同时，该pH调节缓冲剂选自甲酸、邻苯二甲酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、琥珀酸、2-吗啉乙磺酸（MES）、甘氨酸中的至少一种。当然，该pH调节缓冲剂还可以采用本领域常用的其他pH缓冲剂。也可以结合本领域常用的碱如NaOH共同作用，已达到将白细胞分类计数试剂的pH调整至适当的pH范围。
进一步优选地，在上述各实施例的基础上，上述白细胞分类计数试剂还包括带阴离子基团的有机化合物，该带阴离子基团的有机化合物选自8-苯胺基-1-萘磺酸、8-苯胺基-1-萘磺酸盐、6-(对甲苯胺基)-2-萘磺酸、6-(对甲苯胺基)-2-萘磺酸盐、铬变酸、萘磺酸中的至少一种。另外带阴离子基团的有机化合物在白细胞分类计数试剂中的浓度为100～6000mg/L，优选为500～4000mg/L。该带阴离子基团的有机化由于在水中带负电荷，能与白细胞结合（特别是被阳离子表面活性剂损伤后的白细胞），或进入白细胞内，与带正电的颗粒结合，有助于嗜酸性粒细胞从大小和形态上与其他粒细胞分离，增强嗜酸性粒细胞的分类准确性。
进一步优选地，在上述各实施例的基础上，上述白细胞分类计数试剂还包含助溶剂组分。该助溶剂组分能提高该试剂中各种组分的溶解性能，增强试剂稳定性，其选自但不限于醇、环糊精、环糊精衍生物中的至少一种。当助溶剂为醇溶剂时，该助溶剂在白细胞分类计数试剂中的浓度为5～100ml/L；当助溶剂为环糊精、环糊精衍生物中的至少一种时，该助溶剂的浓度为5～50g/L。
具体地，上述优选实施例中，醇优选选自甲醇、乙醇、乙二醇、丙三醇、苯氧乙醇、异丙醇中的至少一种，环糊精优选自α-环糊精、β-环糊精中的至少一种，环糊精衍生物优选自二甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精中的至少一种。
由上述可知，本发明实施例白细胞分类计数试剂中各组分发挥独自作用的基础上，各组分之间还发挥协同作用，使得上述白细胞分类计数试剂与待测血样接触后，能快速的溶解红细胞和血小板，并对嗜酸性粒细胞进行特异性处理，增强了嗜酸性粒细胞与中性粒细胞之间的差异，以达到增强嗜酸性粒细胞分类作用，并使老化血中各个白细胞亚类分类效果与新鲜血的分类效果之间差异在可接受的范围内，使得该试剂同时能够满足对新鲜全血和室温存储48小时以内的老化全血样本中白细胞准确分类。
本发明实施例进一步提供了一种方便、快捷，且能准确对新鲜全血样本和室温存储48小时以内的老化全血样本中的白细胞进行分类计数的方法。该对白细胞分类计数的方法包括如下步骤：
S01：将上述实施例中的白细胞分类计数试剂与待测血样混合反应，溶解红细胞和血小板，损伤白细胞；
S02：检测所述白细胞的至少两种光信号，得到所述白细胞的形态和大小信息；
S03：根据所述白细胞的形态和大小信息，将所述白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞相对应的3个集团以及与中性粒细胞和嗜碱性粒细胞相对应的1个集团共4个集团，并对所述各集团中所含细胞数目进行计数。
具体地，上述步骤S01中，白细胞分类计数试剂与待测血样优选按体积比10～200:1的比例混合进行反应10～40秒后，再进行下步的操作。其中，白细胞分类计数试剂如上文所述的白细胞分类计数试剂，为了节约篇幅，在此不再赘述；该待测血样可以是新鲜全血和室温存储48小时以内的老化全血样本。
上述步骤S02中，白细胞的大小信息优选采用测定角度为2～6度的低角 度散射光来测定获取，白细胞的形态信息优选采用测定角度为6～20度的高角度散射光测定获取。该散射光的检测可以通过常用的光电二极管传感器完成。
上述对白细胞分类计数的方法由于采用上文所述的白细胞分类计数试剂，因此能有效增强嗜酸性粒细胞与中性粒细胞之间的差异，可以使老化血中各个白细胞亚类分类效果与新鲜血的分类效果之间差异在可接受的范围内，使高嗜酸性粒细胞样本中的嗜酸性粒细胞更好地与中性粒细胞区分，增强了白细胞分类的方法准确度，提高了分类计数的效率。同时，该能有效增强嗜酸性粒细胞与中性粒细胞之间的差异，使得该对白细胞分类计数的方法对不同样本的适应行强。本发明实施例对白细胞分类计数的方法同样适用于采用两个以上检测角度的激光检测法。例如，在本发明实施例上增加荧光信号检测，获得三维散点图，进行白细胞分类计数。或者增加第三个角度的散射光信号检测，获得三维散点图，进行白细胞分类计数。
以下通过多个实施例来举例说明上述白细胞分类计数试剂和白细胞分类的方法，以及其性能等方面。
实施例1
一种白细胞分类计数试剂和对白细胞分类的方法：
白细胞分类计数试剂含有如下组分：
两性离子表面活性剂：癸基酰胺丙基甜菜碱7000mg/L
阴离子化合物：6-(对甲苯胺基)-2-萘磺酸1500mg/L
阳离子表面活性剂：辛基三甲基氯化铵50mg/L
助溶剂：乙二醇 10ml/L
pH调节缓冲剂：MES 20mM；
用NaOH将pH调节到5.0。
对白细胞分类的方法：
将取1ml本实施例白细胞分类计数试剂与20ul待测血液混合，20～30秒后用激光检测法检测白细胞。采用测定角度为2～6度的前向低角度散射光测定细胞 的大小信息，并采用测定角度为8～20度的前向高角度散射光测定细胞的形态信息。检测结果如图1所示，图1中，Neu表示中性粒细胞及嗜碱性粒细胞，Lym表示淋巴细胞，Mon表示单核细胞，Eos表示嗜酸性粒细胞。
实施例2
一种白细胞分类计数试剂和对白细胞分类的方法：
白细胞分类计数试剂含有的组分：将实施例1中的两性离子表面活性剂组分换成月桂基二羟乙基甜菜碱5000mg/L，其他组分和含量以及试剂pH不变。
对白细胞分类的方法：参照实施例1中的检测分类方法。检测结果如图2所示，图2中，Neu表示中性粒细胞及嗜碱性粒细胞，Lym表示淋巴细胞，Mon表示单核细胞，Eos表示嗜酸性粒细胞。
实施例3
一种白细胞分类计数试剂和对白细胞分类的方法：
白细胞分类计数试剂含有的组分：将实施例1中的两性离子表面活性剂组分换成十四烷基磺基甜菜碱1500mg/L，其他组分和含量以及试剂pH不变。
对白细胞分类的方法：参照实施例1中的检测分类方法。检测结果如图3所示，图3中，Neu表示中性粒细胞及嗜碱性粒细胞，Lym表示淋巴细胞，Mon表示单核细胞，Eos表示嗜酸性粒细胞。
实施例4
一种白细胞分类计数试剂和对白细胞分类的方法：
白细胞分类计数试剂含有的组分：将实施例1中的两性离子表面活性剂组分换成十二烷基乙氧基磺基甜菜碱2500mg/L，其他组分和含量以及试剂pH不变。
对白细胞分类的方法：参照实施例1中的检测分类方法。检测结果如图4所示，图4中，Neu表示中性粒细胞及嗜碱性粒细胞，Lym表示淋巴细胞，Mon表示单核细胞，Eos表示嗜酸性粒细胞。
实施例5
一种白细胞分类计数试剂和对白细胞分类的方法：
白细胞分类计数试剂含有的组分：将实施例1中的两性离子表面活性剂组分换成十四烷基羟丙基磺基甜菜碱800mg/L，其他组分和含量以及试剂pH不变。
对白细胞分类的方法：参照实施例1中的检测分类方法。检测结果如图5所示，图5中，Neu表示中性粒细胞及嗜碱性粒细胞，Lym表示淋巴细胞，Mon表示单核细胞，Eos表示嗜酸性粒细胞。
实施例6
一种白细胞分类计数试剂和对白细胞分类的方法：
白细胞分类计数试剂含有的组分：将实施例1中的两性离子表面活性剂组分换成月桂酰胺丙基羟磺基甜菜碱4000mg/L，其他组分和含量以及试剂pH不变。
对白细胞分类的方法：参照实施例1中的检测分类方法。检测结果如图6所示，图6中，Neu表示中性粒细胞及嗜碱性粒细胞，Lym表示淋巴细胞，Mon表示单核细胞，Eos表示嗜酸性粒细胞。
实施例7
一种白细胞分类计数试剂和对白细胞分类的方法：
白细胞分类计数试剂含有的组分：将实施例1中的两性离子表面活性剂组分换成CHAPS 500mg/L，其他组分和含量以及试剂pH不变。
对白细胞分类的方法：参照实施例1中的检测分类方法。检测结果如图7所示，图7中，Neu表示中性粒细胞及嗜碱性粒细胞，Lym表示淋巴细胞，Mon表示单核细胞，Eos表示嗜酸性粒细胞。
由上述实施例1～7以及图1～7可知，换成不同的两性离子表面活性剂都可以得到大致相同的散点图结果，均可以满足白细胞四分类。
对比实例1
试剂A，一种用于白细胞四分类的试剂，该试剂由以下成分组成：
用NaOH将pH调节到3.8。
利用对比试剂A对白细胞进行检测分类：
分别选取正常人抗凝全血样本A血样（镜检每100个白细胞中有3个嗜酸性粒细胞）、病人抗凝全血样本B血样（镜检每100个白细胞中有7个嗜酸性粒细胞）、患寄生虫感染病人抗凝全血样本C血样（镜检每100个白细胞中有65个嗜酸性粒细胞）各20ul，分别与1ml上述试剂混合，20～30秒后用激光检测法检测白细胞，采用测定角度为2～6度的前向低角度散射光测定细胞的大小信息，并采用测定角度为8～20度的前向高角度散射光测定细胞的形态信息。
检测结果如图8所示，其中，图8-a是A血样检测图、图8-b是B血样检测图、图8-c是C血样检测图。由图8-a可知，对于正常人样本，对比例试剂A能够很好的实现淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞四类的区分，并且四类细胞的散点图之间界很明显。由图8-b、图8-c可知，对于疾病患者的全血样本中的嗜酸性粒细胞，明显与中性粒细胞之间距离缩短（如图8-b），甚至混合在一起（如图8-c），未能实现四类细胞的正确分类。由此可知，对比试剂A不能很好对疾病患者的全血样本中的嗜酸性粒细胞进行分类计数。
实施例8
一种白细胞分类计数试剂和对白细胞分类的方法：
白细胞分类计数试剂含有如下组分：
用NaOH将pH调节到4.0。
对白细胞分类的方法：
选取与前述对比实例1中所用的A、B、C三份血样各20ul，分别与1ml的本实施例8中试剂混合，20～30秒后用激光检测法检测白细胞，采用测定角度为2～6度的前向低角度散射光测定细胞的大小信息，并采用测定角度为8～20度的前向高角度散射光测定细胞的形态信息。
检测结果如图9所示，其中，图9-a是A血样检测图、图9-b是B血样检测图、图9-c是C血样检测图。由图9可知，本实施例中的试剂能有效的将各个样本的白细胞均被分为淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞四类。并且四种类型均有各自独立的散点图区域，且位置固定，聚类性明显，其中嗜酸性粒细胞与中性粒细胞群区分明显，尤其是C血样，嗜酸性粒细胞与中性粒细胞有明显的界限，其Eos分类结果为60%，与镜检结果很接近。
实施例9
一种白细胞分类计数试剂和对白细胞分类的方法：
白细胞分类计数试剂含有如下组分：
用NaOH将pH调节到5.7。
对白细胞分类的方法：
随机选取125例临床抗凝全血样本，按照下述方法对其淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞进行分类计数。
每支血样中取20μl，分别与1ml的本实施例9中试剂混合，20～30秒后用激光检测法检测白细胞，采用测定角度有为2～6度的前向低角度散射光测定细胞的大小信息，并采用测定角度为8～20度的前向高角度散射光测定细胞的形态信息，获得淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞四类群的分类结果，并和常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果进行比较，做出相关性分析。
检测结果如图10所示，其中，图10-a是淋巴细胞与常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果的相关性关系，图10-b是单核细胞与常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果的相关性关系，图10-c是中性粒细胞与常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果的相关性关系，图10-d是嗜酸性粒细胞与常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果的相关性关系。由图10可知，采用本发明实施例白细胞分类计数试剂对淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及嗜碱性粒细胞四类群的分类结果与常规瑞氏-姬姆萨染色法的手工镜检计数结果有良好的相关性。
实施例10
一种白细胞分类计数试剂和对白细胞分类的方法：
白细胞分类计数试剂含有如下组分：
用NaOH将pH调节到6.0。
对白细胞分类的方法：
取10例抗凝全血样本，分别在离体第1天（24小时）内、离体第2天（48小时内）内，使用前述对比实例1中的试剂A和本实施例10试剂同时对血样进行测 试。测定结果见表1，其中第1天为全血样本离体1天内测试结果，第二天为离体2天内测试结果（48小时内）。其中，Neu%表示中性粒细胞及嗜碱性粒细胞所占比例、Lym%表示淋巴细胞所占比例、Mon%表示单核细胞所占比例、Eos%表示嗜酸性粒细胞所占比例。由表1中测定结果的对比可以明显看出，采用对比例试剂A进行测定时，随全血样本离体时间的延长，各个白细胞亚类，尤其是嗜酸性粒细胞的分类结果明显变化，偏差比较大。而当使用试剂10的进行测定时，随全血样本离体时间延长，各个白细胞亚类的分类结果均无太大的变化，可以满足临床上对全血白细胞分类准确性的要求。
表1
※注：第一天与前述新鲜全血样本同义
实施例11
一种白细胞分类计数试剂和对白细胞分类的方法：
白细胞分类计数试剂含有如下组分：
两性离子表面活性剂：癸基酰胺丙基甜菜碱5000mg/L
阳离子表面活性剂：辛基三甲基氯化铵50mg/L
助溶剂：乙二醇 10ml/L
pH调节缓冲剂：MES 20mM；
用NaOH将pH调节到5.0。
对白细胞分类的方法：
对白细胞分类的方法：参照实施例1中的检测分类方法。检测结果如图11所示。图11中，Neu表示中性粒细胞及嗜碱性粒细胞，Lym表示淋巴细胞，Mon表示单核细胞，Eos表示嗜酸性粒细胞。
实施例12
一种白细胞分类计数试剂和对白细胞分类的方法：
白细胞分类计数试剂含有如下组分：
两性离子表面活性剂：十四烷基磺基甜菜碱1000mg/L
阳离子表面活性剂：辛基三甲基氯化铵50mg/L
pH调节缓冲剂：MES 20mM；
用NaOH将pH调节到5.0。
对白细胞分类的方法：
对白细胞分类的方法：参照实施例1中的检测分类方法。检测结果如如图12所示。图12中，Neu表示中性粒细胞及嗜碱性粒细胞，Lym表示淋巴细胞，Mon表示单核细胞，Eos表示嗜酸性粒细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种白细胞分类计数试剂，包括
（1）表面活性剂溶液，所述表面活性剂溶液能够溶解红细胞，使白细胞膜部分损伤，稳定嗜酸性粒细胞和老化细胞的细胞膜，所述表面活性剂溶液含有至少一种阳离子表面活性剂和至少一种两性离子表面活性剂；
所述两性表面活性剂为具有通式I所示结构的两性表面活性剂，
式中R1为C8-18的烷基；R2和R3各自独立选自C1-3的烷基、C1-3烷氧基或C1-3烷羟基；a为0或1；n为0-6的整数；m为1-5的整数；X选自羧基或磺酸基；
或/和所述两性离子表面活性剂选自胆汁酸衍生物型两性表面活性剂；
（2）能够将pH值调整在4～6范围内的缓冲剂。
2.如权利要求1的白细胞分类计数试剂，其特征在于，所述n为3，和/或R2和R3各自独立选自羟乙基或甲基。
3.如权利要求1的白细胞分类计数试剂，其特征在于，所述m为3，和/或X为磺酸基。
4.如权利要求1的白细胞分类计数试剂，其特征在于，所述R2和R3为乙氧基，或所述R2和R3为羟丙基。
5.如权利要求1的白细胞分类计数试剂，其特征在于，所述n为3，所述X为磺酸基，所述R2和R3各自独立选自羟丙基。
6.如权利要求1的白细胞分类计数试剂，其特征在于，所述两性离子表面活性剂选自癸基酰胺丙基甜菜碱、月桂基酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、硬脂基酰胺丙基甜菜碱、月桂基二羟乙基甜菜碱、十四烷基二羟乙基甜菜碱、硬脂基二羟乙基甜菜碱、月桂基磺基甜菜碱、十四烷基磺基甜菜碱、十六烷基磺基甜菜碱、十八烷基磺基甜菜碱、十二烷基乙氧基磺基甜菜碱、十四烷基乙氧基磺基甜菜碱、十六烷基乙氧基磺基甜菜碱、十八烷基乙氧基磺基甜菜碱、十二烷基羟丙基磺基甜菜碱、十四烷基羟丙基磺基甜菜碱、十六烷基羟丙基磺基甜菜碱、十八烷基羟丙基磺基甜菜碱、月桂酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、椰油酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、十四烷基酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、十六烷基酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、十八烷基酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、3-[(3-胆烷酰胺丙基)-二甲基铵]-1-丙磺酸盐、3-[(3-胆烷酰胺基丙基)-二甲基铵]-2-羟-1-丙磺酸盐中的至少一种。
7.如权利要求1的白细胞分类计数试剂，其特征在于，所述阳离子表面活性剂为具有通式II结构的季铵盐阳离子表面活性剂：
其中R4为C6-14的烷基或链烯基，优选辛基、癸基或月桂基；R5和R6各自独立选自C1-4的烷基或链烯基，优选甲基、乙基；R7为C1-4的烷基、链烯基或苄基；Y为卤素。
8.如权利要求1的白细胞分类计数试剂，其特征在于，所述试剂还包括带阴离子基团的有机化合物，所述带阴离子基团的有机化合物优选8-苯胺基-1-萘磺酸、8-苯胺基-1-萘磺酸盐、6-(对甲苯胺基)-2-萘磺酸、6-(对甲苯胺基)-2-萘磺酸盐、铬变酸、萘磺酸中的至少一种。
9.如权利要求1的白细胞分类计数试剂，其特征在于，还包含助溶剂，所述助溶剂优选醇、环糊精、环糊精衍生物中的至少一种；所述醇优选甲醇、乙醇、乙二醇、丙三醇、苯氧乙醇、异丙醇中的至少一种；所述环糊精优选α-环糊精、β-环糊精中的至少一种；所述环糊精衍生物优选二甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精中的至少一种。
10.一种对白细胞分类计数的方法，包括如下步骤：
将权利要求1～9任一所述的白细胞分类计数试剂与待测血样混合反应，溶解红细胞和血小板，损伤白细胞；
检测所述白细胞的至少两种光信号，得到所述白细胞的形态和大小信息；
根据所述白细胞的形态和大小信息，将所述白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞相对应的3个集团以及与中性粒细胞和嗜碱性粒细胞相对应的1个集团共4个集团，并对所述各集团中所含细胞数目进行计数。
11.如权利要求10所述的用于白细胞分类的方法，其特征在于，采用测定角度为2～6度的低角度散射光来测定白细胞的大小信息，采用测定角度为6～20度的高角度散射光测定白细胞的形态信息。
12.一种具有通式I所示结构的两性离子表面活性剂在制备白细胞分类计数试剂中的用途，
式中R1为C8-18的烷基；R2和R3各自独立选自C1-3的烷基、C1-3烷氧基或C1-3烷羟基；a为0或1；n为0-6的整数；m为1-5的整数；X选自羧基或磺酸基。
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