KR100276145B1 - 세포 구형화시약 조성물 및 이를 사용한 세포분석방법 - Google Patents
세포 구형화시약 조성물 및 이를 사용한 세포분석방법 Download PDFInfo
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Abstract
배향 노이즈를 제거하기 위한, 세포의 구형화용 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 시약 조성물을 사용하는 혈액 샘플 제조방법. 세포의 아부류를 염색시키기 위한 염료를 포함하는 시약 조성물을 혈액 샘플과 반응시키고, 반응 혼합물을 유동 혈구계산기의 감지 영역에 통과시킬 경우, 염색된 세포를 비염색 세포와 구별할 수 있고, 각각 상기 세포가 망상적혈구와 성숙적혈구인 경우, 망상적혈구 또는 적혈구 각각의 용적 및 헤모글로빈 농도, 및 망상적혈구 또는 적혈구의 헤모글로빈 함량, 평균 세포 용적, 평균 구형 헤모글로빈 농도, 및 평균 세포 헤모글로빈 농도를 측정한 나란히 있는 세포 용적 및 헤모글로빈 농도로부터 계산한다.
Description
제1a도, 제1b도 및 제1c도는 본 발명의 원리를 실행하기 위한 산란/흡광 유동 혈구 계산기의 조명 광학장치, 탐지 광학장치 및 탐지 시그날 프로세싱 시스템 각각을 도식적으로 나타낸 것이며;
제2a(1)도 및 2b(1)도는 적색광 산란 대 적색광 흡수의 사이토그램(cytogram)이고,
제2a(2)도 및 2b(2)도는 옥사진 750 및 뉴 메틸렌 블루로 각각 염색된 부분적 구형의 적혈구 및 망상적혈구를 함유하는 전혈 샘플에 대한 적색 광낮은 각 산란 대 적색 광 높은 각 산란의 사이토그램을 나타낸 것이며;
제3a(1)도 및 3b(1)도는 적색광 산란 대 적색광 흡수의 사이토그램이며,
제3a(2)도 및 제3b(2)도는 옥사진 750 및 뉴 메틸렌 블루로 각각 염색된 완전 구형인 적혈구 및 망상적혈구를 함유하는 전혈 샘플에 대한 적색광 낮은 각 산란 대 적색 광 높은 각 산란의 사이토그램을 나타낸 것이며;
제4a도 및 제4b도는 실시예 4에 따라 옥사진 750으로 염색된 망상적혈구에 대한 MCV와 MCHC 데이타 사이의 상호관계를 보여주는 것이며;
제5a(1)도 및 제5b(1)도는 적색광 산란 대 적색광 흡수의 사이토그램이며,
제5a(2)도 및 제5b(2)도는 실시예 3에 따라 가성(pseudo)-흡광 보정법을 사용하여 옥사진 750 및 뉴 메틸렌 블루로 각각 염색된 완전 구형인 적혈구 및 망상적혈구를 함유하는 전혈 샘플에 대한 적색 광 낮은 각 산란 대 적색 광 높은 각 산란의 사이토그램을 나타낸 것이며;
제6도는 본 발명의 옥사진 750 함유 시약 및 실시예 3에 따른 NCCLS 참조방법을 사용하여 전혈 샘플중에서 탐지한 망상적혈구의 백분율의 비교를 나타낸 것이며;
제7도는 "+"로 동정되는 망상적혈구 및 "■"로 동정되는 적혈구를 사용하여 HC 대 V의 사이토그램을 나타낸 것이며;
제8a도 및 제8b도는 적색 광 산란 대 적색광 흡수의 사이토그램 및 비염색 구형이 아닌 적혈구에 대한 적색광 높은 각 산란 대 적색광 낮은 각 산란의 사이토그램을 각각 나타낸 것이며;
제8c도 및 제8d도는 비염색 구형의 적혈구 세포에 대한 유사한 사이토그램이며;
제8c도는 가성-흡광에 대해 보정된 것이다.
본 발명은 세포 분석에서의 시약 조성물 및 이의 용도에 관한 것이고, 더욱 상세하게는 광 산란 및 흡광 및/또는 형광 유동 혈구 계산 기술에 의해 수많은 세포의 용적 및/또는 단백질 농도, 단백질 함량 및/또는 핵산 함량을 전기광학적으로 측정하는 개선된 방법을 위해 전혈 샘플을 제조하는데 있어서의 시약 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
세포와 광선과의 상호반응을 측정하여 각각의 세포 특성을 정량적으로 측정하는 과학분야(통상적으로 다양한 종류의 현미경을 통해)인 혈구광측정 분야의 개발 초기에 카스퍼슨(참조: Caspersson T., Skand. Arch. Physiol., 1936, 73 Suppl. 8, 1-151)은 구형 세포의 중심에 광원을 촛점화함으로써 세포를 통과한 모든 광로는 세포의 직경과 정확히 동일하거나 유사하다고 확신할 수 있다는 것을 지적하였다. 원칙적으로, 이는 측정된 세포의 광밀도로부터 흡광 분자종의 농도의 정확한 측정을 가능케한다 [참조: Pollister, A.W. and Ornstein, L., "The Photometric Chemical Analysis of Cell", in Mellors, R.C., Ed., Analytical Cytology, 2nd Ed., McGraw-Hill, New York, 1959, 431-518]. 비-구형 세포를 완전 구형체로 조절-전환시킴으로써, 세포에 의한 광 산란치의 유동 혈구계산 데이타분석 결과가 크게 향상될 수 있다고 밝혀지기까지 약 50년이 지났다[참조: 김과 오른스타인 (Kim and Ornstein), 및 타이코(Tycko), 이후 기술]. 이제, 본 발명의 조절된 구형화에서의 추가의 개선은 조절된 세포 구형화의 유용성을 타이코 방법에 의한 세포 용적 및 세포 총 단백질 농도(또는 등가적으로, 굴절율, 밀도 또는 총 세포 고형분)의 정확한 동시 측정을 위한 용도 뿐만 아니라 흡광/산란 유동 혈구계산법에 의한 세포에서의 흡광 분자의 미소량의 민감한 측정을 위한 용도까지 확장시킨다.
모든 고등 동물에서, 혈액은 다양한 종류의 현탁된 소체(corpuscle)들(적혈구, 백혈구 및 혈소판)이 존재하는 액상 체액부(혈장)로 구성된다. 혈장은 대략 90%의 물, 9%의 단백질, 0.9%의 염 및 미량의 기타 물질(예:당, 요소, 요산 등)의 조성을 갖는다.
말초혈(즉, 골수밖의 혈액)의 세포 또는 소체는 두가지 주요 그룹, 즉 적혈구(최우선의 임무는 산소를 운반하는 것이다) 및 백혈구(최우선의 기능은 면역계와 관련되어 체내에 대한 외래 물질을 파괴시키는데 관여한다)로 나누어진다. 상기 두가지 주요 그룹이외에, 혈액은 또한 지혈에서 중요한 소위 혈소판을 함유한다.
적혈구 성숙의 최종 단계는 이들이 골수로부터 방출된 후 말초혈 중에서 순환하고 있는 동안 일어난다. 이러한 미숙한 적혈구 또는 "망상적혈구"는 핵을 소실하게 되어 분열할 수 없게 되거나 리보핵산(RNA)을 합성할 수 없게 된다. 이러한 작용이 멈추어도, 망상적혈구는 여전히 대사적으로 활성이며 한동안은 단백질을 합성할 수 있고 헴(heme)의 합성을 위해 철을 흡수할 수 있고, 에너지-풍부 상태를 유지하기 위해 요구되는 필수적인 대사적 반응을 수행할 수 있다. 이들 세포는 대개 이들을 양이온성 염료의 용액에 노출시켜 양이온성 염료와 망상적혈구내의 음이온성 RNA가 반응하여 망상적혈구내에 곱게 또는 거칠게 염색된 "망상질 (reticulum)"로 침전하게 함으로써(이러한 특성으로 망상적혈구라 명명됨) 성숙한 적혈구로부터 쉽게 구별된다.
망상적혈구는 정상적으로 총 적혈구 집단의 약 0.5 내지 2%를 차지하지만, 이러한 함량은 비정상적인 조건하에서 급격히 변할 수 있다. 예를 들어, 망상적혈구의 수는 혈액 질환(dyscrasias)을 연구하는데 있어서 진단 보조제로서, 출혈(hemorrhage)에 따른 적혈구 재생의 지표로서, 또한 특정 악성 질환의 화학요법에 초기 독성을 탐지하는데 있어서 다년간 사용되어 왔다.
핵산(RNA 및 DNA)은 실질적으로 양이온성 염료로 염색될 수 있는 다가 음이온이다. 망상적혈구내의 RNA는 단지 몇개의 양이온성 염료[브릴리언트 크레실 블루(Brilliant Cresyl Blue; BCG), 뉴 메틸렌 블루(New Methylene Blue; NMB), 아우라민 O (Auramine O; AuO), 아크리딘 오렌지(Acridine Orange; AO), 티아졸 오렌지(Thiazole Orange; TO) 및 피로닌 Y(Pyronine Y; PY)]로만 염색될 수 있다. 상기 염료중에서, 단지 서브-세트만이 세포로 급속히 투과(그럼으로써 염색되는)될 수 있다. 서브-세트는 NMB 및 AO를 포함한다. 망상적혈구의 염색 속도 및 정도는 염료의 세포외 농도, 망상적혈구 막을 통한 염료의 침투 속도, 및 양이온성 염료와 망상적혈구 RNA 사이의 특이 결합 상수의 크기에 따라 다르다. 후자의 두가지 특성은 상이하며 각 염료에 대해 용이하게 예측할 수 없으므로 시행착오는 유용한 망상적혈구 염색물을 찾기 위해서 필수적이다. 모든 양이온성 물질이 완전한 적혈구(및 망상적혈구)막을 침투할 수 있는 것은 아니며, 필수적으로 양이온을 동반하는 음이온의 성질은 양이온성 물질이 급속히 또는 느리게 투과 하거나 또는 전혀 투과되지 않거나 하는 여부에 영향을 미칠 수 있다. 소수성 분자는 일반적으로 친수성 분자보다 빨리 적혈구 막으로 침투하며 작은 분자는 일반적으로 큰 분자보다 빨리 막을 침투한다. 망상적혈구를 염색할 수 있는 상기 양이온성 염료와 혼합된 염 또는 완충액의 서브-세트만이 급속한 염색을 허용하는데, 즉, "부적당한(wrong)" 완충액과 함께 "적당한(right)"염료는 망상적혈구를 염색하기 위해 "영구한 시간(forever)"을 소모할 것이다. 또 다시, 시행착오가 망상적혈구를 염색하는 혼합물의 유용한 제제를 발견하기 위해 필요한 것이다. 따라서, 지침으로 이용될 수 있는 다양한 "법칙"에도 불구하고, 어떤 조건하에서 어떤 특수한 양이온성 염료가 급속히 투과되어 망상적혈구를 염색할 수 있는지를 사전에 예측하는 것은 아직까지 불가능하다.
유동 혈구계산법의 기본 개념은 필수적으로 한번에 하나씩 특정 감지 영역을 통해 세포들을 통과시키는 것이다. 전형적으로, 유체역학적 포커싱(focusing)을 이용하여, 단일 세포들은 산란광, 흡광 또는 형광성 광을 측정하기 위한 포커싱된 광원 및 탐지 시스템으로 구성된 감지 영역을 통해 통과된다.
광을 차단하는 입자의 광에 대한 효과는 여러방법으로 탐지될 수 있다. 일반적으로, 입자는 입자가 현탁되어 있는 매질의 굴절률과는 다른 굴절률을 갖는다. 그러므로, 입자는 굴절률 차이, 입자의 크기, 입자의 모양 및 굴절률 및 구조내에서의 내부 변이, 및 조명광의 파장에 따라, 다양한 강도로 각의 범위를 통해 조명되는 광을 산란시킬 것이다(동질성 구형을 위해서는 미 산란 이론(Mie Scattering Theory)이 산란광의 분포 및 강도에 대한 완전한 기술을 제공해 준다). 또한 입자는 특정 입사광을 흡수할 수 있다. 후자의 경우, 일부의 흡광은 흡광의 파장보다 더 긴 파장에서 전형적으로 형광성 광으로서 재방출될 수 있다.
상기 및 기타 효과는 산란광, 비산란광 및 형광성 광의 상이한 각 간격을 측정하도록 배열된 광 탐지기로 측정할 수 있다.
입자가 세포 만큼, 전형적으로 직경이 15㎛ 이하가 되는 정도로 작은 경우, 특히, 현탁 스트림의 조명 부위에 떨어지는 초당 광자수에 비교하여 고속(전형적으로, 초당 큰 세포 100 내지 1000개)에서의 통과의 의해 영향받는 조명 빔에 있는 광자의 수는[그리고 흡광 탐지기(및 심지어 형광 탐지기)의 배경 조명에 비교되는] 매우 작다. 그러므로, 입자들 사이의 작은 특정 차이의 탐지의 감작성의 한계는 광자 유동(적어도 광원의 고유 "밝기"에 의존한다)에 매우 의존적이고, 광자 유동의 혼란이 얼마나 큰가는 입자들 사이의 기타 작고 큰 차이에 의해 발생되는 것이다.
흡광, 산란 및 형광 유동 혈구계산법에서 간섭 노이즈(noise)의 주요 공급원은 각 종류의 시그날에 대해 매우 상이할 수 있다. 가장 근접하게는, 염색된 또는 염색되지 않은 세포로부터의 형광 시그날의 크기는 시그날이 발생하는 세포의 모양 또는 배향에 의해서는 거의 영향받지 않는 반면, 산란 및 흡수 시그날은 모양 및 배향에 의해 매우 강하게 영향받는다. 극단적인 예로서, 사람 적혈구의 자연적인 양쪽-오목한 모양(biconcave)은 이들이 발생하는 흡수 및 산란 시그날에 중요한 영향을 미치며, 전형적이고 전통적으로 염색된 망상적혈구의 작은 흡수 시그날 보다 더 큰 영향을 미친다(제8도 참조). 이러한 이유로 본 발명에 선행한 기술에서는 망상적혈구를 계산하기 위해서 또는 일반적으로 세포중 저 농도의 흡광 분자를 측정하는데 흡광 유동 혈구계산법이 유용하지 않았다. 한편, 세포 또는 이들의 주위매질(예를 들어, 비결합된 형광 염료)중에 있는 약한 형광 물질은 흡광 또는 산란 시그날에 실질적으로 영향을 미치지 않는다.
전혈의 항응고 샘플중 망상적혈구의 백분율을 계산하는데 유용할 수 있는 수개의 반-자동화 방법이 이용가능 하다. 기존의 각각의 방법에서, 유기 양이온성 염료, 예를 들어, AO, AuO 또는 TO를 함유하는 희석제는 망상적혈구내의 RNA를 염색하기 위해 사용된다. 염료는 세포막을 투과하여 RNA와 결합하고 대개는 각 망상 적혈구내에 "망상질"을 침전시킨다. 염색된 RNA로부터의 시그날의 양은 대략적으로 RNA 함량에 비례한다. 적당한 염색후, 적당한 여기 광원(전형적으로 488nm에서 방출되는 아르곤 이온 레이저)을 갖춘 형광 유동 혈구계산기 및 방출 탐지 시스템은 유출액에서 망상적혈구의 백분율을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
형광 염료 및 유동 혈구계산법을 사용하여 전혈 샘플중 망상적혈구를 판별하기 위한 예시적 방법은 특허문헌에 기술되어 있다.
예를 들어, 미합중국 특허 제3,684,377호에서 아담스(Adams) 및 카멘츠키(Kamentsky)는 사람 혈액을 위한 정상 생리적 범위내에 있는 매 인자 및 삼투압 농도를 갖는 아크리딘 오렌지의 수성 용액을 포함하는 차동 혈액 분석용 염료 조성물을 기술하고 있다. 이 염료 조성물은 적혈구 산란 시그날과 함께 형광 시그날의 존재 또는 부재를 측정함으로써 망상적혈구를 계산하는데 사용될 수 있다.
미합중국 특허 제3,883,247호에서 아담스(Adams)는 10-6내지 10-5g/㎖의 농도를 갖는 아크리딘 오렌지를 포함하는 염료 조성물을 사용하는, 아담스와 카멘츠키의 방법과 유사한 방법을 기술하고 있다.
미합중국 특허 제4,336,029호에서 네이탈(Natale)은 약 7.4의 pH 및 등장성삼투압 농도의 염료 AO, 시트레이트 이온 및 파라포름알데하이드의 수용액을 포함하는 시약 조성물을 기술하고 있다. 다양한 성분의 농도는 망상 적혈구 및 혈소판의 염료 흡수를 최대화하고 혈액 샘플 및 시약 조성물의 혼합이 2 내지 5분내에 달성되도록 하는 염료의 흡수가 제공되도록 선택된다. 네이탈 시약(Natale reagent)을 이용한 혈소판 및 망상적혈구를 탐지하는 자동화된 방법은 미합중국 특허 제4,325,706호에서 거쉬만(Gershman)등에 의해 기술되었다.
미합중국 특허 제4,707,451호에서 세이지(Sage) 2세에 의해 기술된 시약에서, 망상적혈구는 티오플라빈 T 또는 크리사닐린으로 염색된다. 전혈 샘플은 등장성 염수 용액중 염료(0.2mg/㎖)의 25㎕ 분취량을 항응고 전혈 10㎕와 혼합하고 약 7분동안 항온처리하여 효과적으로 염색됨이 밝혀졌다.
미합중국 특허 제4,883,867호에서 리(Lee) 등은 RNA 또는 DNA를 염색하기 위한 염료 조성물을 기술하고 있다. 염료 조성물은 바람직한 염료 화합물로서 TO를 포함한다. 망상 적혈구는 30분의 최소 시간내에 염색된다.
유동 혈구 계산 기술을 사용한 망상 적혈구 계산을 위한 시약이 미합중국 특허 제4,971,917호에서 구로다(Kuroda)에 의해 기술되어 있는데, 이 시약은 형광 유동 혈구계산법에 의해 분석되는 경우 성숙한 적혈구가 망상적혈구로서 착오되어 계산되는 것을 방지하기 위해 염료(예: AuO)에 의한 성숙한 적혈구의 비-특이적 염색을 감소시키는 탄산염을 함유한다.
미합중국 특허 제4,981,803호는 2가지 용액, 즉, 비-수성 용매중에 염료 AuO가 용해되어 있는 염색을 위한 스톡 용액 및 적정 염색 조건을 만족시키는 완충 용액을 포함하는 망상적혈구 계산용 시약을 기술하고 있다.
AuO를 포함하는 형광 유동 혈구 계산 기술을 위한 또하나의 망상적혈구 염색시약은 미합중국 특허 제4,985,176호 에서 구로다등에 의해 기술되어 있다. 이 참조문헌은 어느 경우에서나 시약과 샘플의 항온처리 시간을 30초 내지 20분으로 교시하고 있다.
상기 명시한 바와 같이, 단지 양이온성 염료의 작은 서브-세트만이 망상적혈구를 선택적으로 염색하며 이들중 더 작은 서브-세트만이 망상적혈구를 급속히 투과한다. 본 발명의 양이온성 염료 화합물은 5분이내에 망상적혈구를 염색하여 유동 혈구계산법에 의한 망상적혈구 분석은 혈액 샘플 및 시약 조성물이 함께 혼합된 후 즉시 수행될 수 있으므로 본 발명은 자동화된 방법에 용이하게 적용될 수 있다.
망상 적혈구를 정량하기 위한 4급화된 A0 유도체가 본원에서 참조로 인용되는 계류중인 미합중국 특허원 제07/444,255호(1989.1.12 출원)[참조: "Compounds and Reagent Compositions and Their Use in the Quantitative Determiration of Reticulocyte in Whole Blood"란 명칭으로 Fan 및 Fischer가 출원]에 기술되어 있다. 팬(Fan)등에 의하면, 시약은 파라포름알데하이드 및 옥살산 칼륨를 포함하는 완충용액중 AO 유도체 1㎖당 10-6g이 포함된다. 이러한 시약 조성물은 망상적혈구를 염색하여 혈액 샘플중 망상적혈구의 정량적 형광 유동 혈구 계산 분석을 가능하게 해준다. 이 시약 또는 상기 언급된 시약중 어떤것도 하기 언급될 배향 노이즈문제를 방지하는 구형화제를 함유하지 않으며 어떤 것도 기타 진단학적으로 중요한 파라미터, 예를 들어, 셀-바이-셀(cell-by-cell)에 기초하여 망상적혈구 및 적혈구의 용적 및 헤모글로빈 함량의 동시 측정을 허용하지 않는다.
샤피로와 스티븐스(Sapiro and Stevens)는 유동 혈구 계산법에 의해 DNA 함량을 측정하는데 옥사진 750(0xazine 750)의 사용 방법을 기술하고 있다[참조: Flow Cytometry of DNA Content Using Oxazine 750 or Related Laser Dyes With 633nm Excitation, Cytometry, Vo1.7, pp.107-110 (1986)]. 세포는 10㎛ 내지 30㎛의 옥사진 750으로 염색되고 DNA 측정을 위한 에탄올의 첨가로 고정된다. 샤피로 및 스티븐스는 옥사진 750이 RNA를 염색하는것 같지는 않다고 주장한다. 더우기, 옥사진 750을 사용한 이러한 프로토콜(protocol)은 망상적혈구 계산 및 또는 기타 진단학적으로 중요한 적혈구 파라메터, 예를 들어, 셀-바이-셀(cell-by-cell)에 기초한 용적 및 헤모글로빈 농도의 동시 측정을 허용하지 않는다.
상기 언급한 바와 같이, 흡광 또는 산란 광 유동 혈구 계산기의 사용을 통한 망상적혈구 정량의 단점은 배향 노이즈 및 망상적혈구 시그날을 구분할 수 없다는 것이다. 사람 및 수많은 기타 포유동물 적혈구는 양쪽이 오목한 디스크 모양을 갖는다. 이러한 비대칭성 적혈구에 의해 산란된 광의 양은 세포의 배향에 따라 다양하다. 따라서, 2개의 동일한 적혈구는 감지영역내에서 이들의 배향이 동일하지 않는 한 감지 영역을 통해 통과될때 매우 다른 산란광 및 흡광 시그날을 발생시킨다.
이 결과 정상 적혈구의 산란 및 흡광 시그날의 크기 분포는 매우 광범위하고 이중 형태(bimodal)가 된다(제8a도 및 제8b도 참조). 소량의 염색된 망상질중 하나에 존재한다는 점을 제외하고는 동일한 2개의 적혈구는 일반적으로 이들의 상이한 배향때문에 산란 광 및 흡광 탐지기상에서 큰 시그날 차이를 발생시킨다. 이것이 발생하면, 염색된 망상질이 발생할 수 있는 매우 작은 차이가 배향 노이즈에 묻히게 된다.
미합중국 특허 제4,575,490호 및 제4,412,004호에서 킴과 오른스타인(Kim and Ornstein)은 유동 혈구계산기에서 적혈구의 용적의 측정시 배향 노이즈를 제거하는 방법을 교시하고 있다. 이들의 방법은 세포사이의 어떤 배향 차이를 제거하기 위한 비염색된 적혈구의 등용적식(isovolumetric) 구형화법을 수반하여 더 정밀하고 정확한 세포 용적의 측정을 가능하게 한다. 각 적혈구 세포는 양쪽이 오목한 모양 으로부터 계면 활성 구형화제에 의해 완전한 구형으로 전환된다. "완충" 단백질 및/또는 알데하이드 고정제는 구형화제와 함께 사용되어 적혈구의 용혈(lysis)을 방지한다. 킴과 오른스타인에 의해 기술된 음이온성 계면활성제는 급속히 반응하여 망상질을 염색하고 침전시키기 위해 사용된 양이온성 염료를 침전시키는 것으로 밝혀졌기 때문에 망상적혈구 염색물과 함께 사용될 수 없다.
미합중국 특허 제4,735,504호에서 타이코는 항응고 전혈 샘플중 적혈구에 대한 개별적 및 평균 적혈구 용적(MCV), 및 개별적 및 평균 소체 헤모글로빈 농도(MCHC)를 측정하기 위한 완전히 자동화된 방법 및 수단을 제공하는 유동 혈구 계산기인 TECHNICON H*1시스템의 적혈구 채널을 기술하고 있다. 이 방법에서, 2㎕ 분취량의 전혈 샘플중의 적혈구는 우선 희석된 다음 방금 기술된 킴과 오른스타인 방법을 사용하여 등용적식으로 구형화된다. 20초 항온처리 시간후, 이들 세포는 분석기의 적혈구 채널내의 조명된 측정 영역을 통해 한번에 하나씩 필수적으로 통과된다. 2개의 분리 각 간격으로 상기 세포에 의해 산란된 광의 크기가 측정된다. 광원 및 탐지각의 선택은 본 출원에서 중요하다. 광원이 633nm에서 빛을 방출하는 헬륨 네온 레이져인 경우,2개의 산란된 광 집합각 간격은 2 내지 3도(2˚내지 3˚) 및 5 내지 15도(5˚내지 15˚)이다. 각 간격에서 산란된 광의 수준이 세포에 대해 알려지면, 그 세포에 대한 용적 및 헤모글로빈 농도는 미(Mie) 산란 이론에 의해 예상 되는 값과 비교하여 결정된다. 각 세포에 대한 용적(V) 및 헤모글로빈 농도(HC)는 기억장치에 저장되고 MCV 및 MCHC는 타이코에서 기술된 바와 같은 당해 분야에서 공지된 기술에 의해 샘플 측정 주기의 완결시 계산된다. V 및 HC 분포 사이토그램 멎 V 및 HC 히스토그탬은 상기 계산을 사용하여 만들어진다.
상기 어떤 방법도 망상적혈구와 비-망상적혈구를 구별하지 못하고, 상기 기술되고 실행된 방법들은 망상적혈구 및 적혈구의 진단학적으로 중요한 파라미터, 예를 들어, 셀-바이-셀(cell-by-cell)을 기준으로 하여 용적 및 헤모글로빈 농도를 분리적으로 측정하기 위해서는 사용될 수 없다.
유동 혈구계산기를 사용한 망상적혈구 계수 탐지에 있어서 또 하나의 난점은 망상적혈구 탐지 시그날, 성숙한 적혈구 세포 시그날 및 시스템 노이즈 사이를 구별하는데에 어려움이 있다는 점이다. RNA의 염색된 스트랜드는 미성숙한 망상적혈구에 많이 존재하며, 유동 혈구 계산기로 탐지되는 경우 비교적 큰 크기의 시그날을 발생한다. 그러나, 더 성숙한 세포는 덜 염색된 RNA를 함유하여 유동 혈구 계산기 측정 시스템의 노이즈에 의해 차단될 수 있는 더 작은 시그날을 발생한다.
광 산란 및 흡광 또는 형광 유동 혈구계산 기술에 의해 전혈 샘플중 망상 적혈구의 동정 및, 동시에 망상적혈구 및 적혈구의 용적, 헤모글로빈 농도 및 헤모글로빈 함량을 개별적으로 측정하기 위한 방법 및 시약에 대한 필요성이 대두되었다.
본 발명자들은 여러가지 널리 공지된 기술로 양이온성 염료를 사용하여 망상질을 염색시키고자 한다는 전제로 시작하였다. 본 발명자들은 또한 형광 및/또는 흡광도를 이용하여 적혈구를 검출할 수 있는 유동 혈구계산법을 개발하는데 관심을 갖고 있었다. 또한, 흡광도의 경우, 본 발명자들은 적혈구의 구형화를 통해 배향 노이즈를 제거시키고자 하였다(제8c도 및 제8d도 참조). (원래 세포 용적을 회수하고 동시에 정확하게 측정하는 데 관심이 없는 경우, 구형화는 대부분의 배향노이즈를 제거하기 위하여 반드시 등용적이거나 완전할 필요는 없다). 본 발명자들은 또한, 등용적 구형화 및 전술한 타이코(Tycko) 방법, 즉, 형광 및 흡광방법을 사용함으로써, 적혈구를 또한 선택적으로 염색시키는 시약을 사용하여 셀-바이-셀을 기준으로 하여 망상적혈구를 동시에 측정하고 성숙한 적혈구 용적 및 헤모글로빈을 측정하고자 하였다.[등용적은 아니나 구형화가 완전하여 등장성의 X인자[X는 약 0.5 내지 2(0.15 내지 0.600sm)]에 대해 어느 정도 알려져 있는 경우, 용적에 대해서 1/X로 보정하고 단백질, 예를 들어, 헤모글로빈 농도에 대해서 X로 보정하는 타이코의 방법을 사용하여 원래값을 계산할 수 있다는 점을 주지할 것].
이들 발명은 본 원과 동일자로 출원되고, 본원의 양수인에게 양도된, 둘다 " 전혈 중 망상적혈구의 동정 및 특성화에 있어서 시약 조성물 및 이의 용도"란 명칭의 공계류중인 미합중국 특허 제 호 및 제 호의 주제이며, 이들 기술내용은 본원에서 참조문헌으로 인용된다.
타이코의 방법을 이용하기 위해서는, 헤모글로빈이 매우 투명한 영역에서 단색광을 방출하는 광원이 필요하며; 전형적으로 적색 헬륨 네온(HeNe) 레이저, 또는 보다 더 긴 파장의 레이저와 같은 광원이 있다. 이는 파장을 또한 흡광 측정용으로 사용하고자 하는 경우, 염료가 적색광을 강하게 흡수하는 청색 염료이어야 함을 의미한다.
본 발명자들은 양이온성 염료와의 혼화성을 위해서, 및 킴과 오른스타임(Kim and Ornstein)의 교시에 의해 제시되는 바와 같은 적혈구 구형화제로서 비이온성, 양이온성 및 양쪽이온성 계면활성제를 탐구하였다. 킴과 오른스타인 방법에서와 같이, 본 발명자들은 적혈구 용혈작용을 지연시키기 위한 계면활성제의 농도를 "완충"시키기 위하여 단백질(전형적으로 소 혈청 알부민)을 사용하였다. 수많은 계면활성제(예: 트리톤 X100 및 라우릴프로필아미도베타인)가 만족스럽게 작용하였다.
그다음 본 발명자들은 또한 라우릴 프로필아미도베타인 및 기타 양쪽이온성 계면활성제(예: DAPS 및 TDAPS)가 적혈구 용혈작용을 지연시키기 위한 단백질 완충을 필요로하지 않으며, 킴과 오른스타인 방법에 있어서 모든 종류의 혈구에 대한 이상적인 구형화 대체제임을 발견하였다. 이들은 단백질 완충을 필요로 하지 않기 때문에, 제조하기에 안정하고 더욱 간단한 시약이다(킴과 오른스타인의 고정 단계가 더 이상 필수적인 것은 아니다; 달리, 단백질-함유 시약에 있어서 세균 생육 문제가 또한 제거된다).
따라서, 본 발명의 주 목적은 혈액 샘플중 세포를 구형화시키는 데 있어서 배향 노이즈를 감소 또는 제거시키기 위한 개선된 시약 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 적혈구의 구형화를 위해 상술한 바와 같은 시약 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 적혈구와 망상적혈구를 구형화시키고 동시에 망상적혈구를 염색시키기 위한, 상기와 같은 시약 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 그의 목적은 흡광 및 산란 광 유동 혈구계산법으로 전혈 샘플중에서 망상적혈구와 적혈구의 용적, 헤모글로빈 농도 및 헤모글로빈 함량을 동시에 측정하기 위한, 상기와 같은 시약 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 혈액 샘플내의 각각의 적혈구와 망상적혈구를 구별하고 동시에 각각을 계수하며, 셀-바이-셀을 기준으로 결정한 각 세포 형의 용적, 헤모글로빈 함량, 헤모글로빈 농도, 평균 적혈구 용적, 및 평균적인 미립자 헤모글로빈 농도를 측정하기 위한, 상기와 같은 시약 조성물 및 방법을 제공하는 것아다.
본 발명의 한 양태에 따르는 시약 조성물은 망상적혈구를 염색시키기 위한 유기 양이온성 염료 및 pH를 약 6 내지 약 9로 유지시키기 위한 완충 용액을 포함한다. 염료는 하기 구조식의 청색 흡광 염료 옥사진 750[오하이오 데이톤 소재의 엑시톤 인코포레이티드(Exciton,Inc.)로부터 구입]
하기 구조식의 청색 흡광 염료 뉴 메틸렌 블루(New Methy1ene blue)일 수 있다.
시약 조성물의 완충 시스템은 시약 조성물의 pH를 약 6 내지 약 9로 유지시키기에 적합한 완충물질을 함유한다. 상기 용액은 하기 성분중 하나 이상을 표시된 농도로 포함할 수 있는데, KCl 또는 NaCl를 사용하여 최종 삼투압을 약 250m 0sm에서 약 330m 0sm으로 조정한다.
바람직하게는, 상기 용액을 시약 조성물의 pH가 약 7 내지 약 8에서 유지되도록 제형화하고, 주어진 농도 범위로 다음 성분 중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 삼투압을 약 280m 0sm에서 약 300m 0sm으로 유지시킨다.
본 시약 조성물이 적혈구 막을 통한 염료 침투를 용이하게 하기 위해서는 특정 음이온 및 양이온을 함유해야만 한다는 것을 발견하였다. 그러한 음이온에는 비카보네이트, 클로라이드, 보레이트, 바비탈, 옥살레이트(Ox) 또는 에틸렌디아민테트라 아세트산(EDTA)이 포함될 수 있다. 모두 그런 것은 아니지만 음이온은 세포막을 통한 염료 침투를 촉진시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 다음 음이온, 즉, 말레이트, 타르타레이트, 포스페이트중 하나 이상이 본 시약 조성물에 주 음이온으로, 경우에 따라, 소량으로 포함된 경우, 망상적혈구와 적혈구를 구별할 수 있다. 가능한 양이온에는 칼륨, 나트륨, 트리스하이드록시메틸아미노(Tris), 또는 트리에탄올아민(TEA)이 있다.
산란/흡광 유동 혈구계산법을 이용하여 전혈 샘플 중 망상적혈구를 동정하는데 본 시약 조성물을 사용할 수 있다. 광범위한 적용방법에는 전혈 분취량을 상기 시약 조성물과 혼합하는 것이다. 적당한 배양 기간 후, 샘플/시약 혼합물을 유동혈구계산기의 특이 감지 영역을 통하여, 한번에 세포 1개씩 통과시킨다. 유체역학적 포커싱 방법(hydrodynamic focusing)을 이용하여, 1개의 세포를 감지 영역에 통과시키는 데, 여기서 이들은 적합한 조사 파장을 갖는 촛점화된 광원에 의해 조사된다. 산란 광 시그날중 적어도 하나와 흡광 시그날 중 적어도 하나를 셀-바이-셀에 기준하여 세포에 대해 측정 한다. 이들 측정치로 부터, 망상적혈구를 적혈구와 구별할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 상기 시약 조성물은 또한 적혈구와 망상적혈구를 등용적식으로 구형화시키기 위해 양쪽이온성 계면활성제를 포함한다. 양쪽이온성 구형화제는 바람직하게는 라우르아미도프로필베타인(LAB), 코코아미도프로필 베타인(CAPB) 및 코코아미도설포베타인(CASB)과 같은 알킬 아미도 베타인 또는 알킬 베타인이다. 기타 바람직한 구형화제는 N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포 네이트(TDAPS) 및 N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트(DDAPS)이다. TDAPS와 DDAPS가 샘플 제조를 가장 안정하게 해주므로 가장 바람직한 구형화제이다.
혈액 샘플내의 망상적혈구와 적혈구를 효과적으로 등용적식으로 구형화시키기 위한, 본 시약 조성물 중의 구형화제의 농도는 약 3.9㎍/㎖ 내지 약 148㎍/㎖이다. 구형화제에는 LAB가 약 12㎍/㎖ 내지 약 87.5㎍/㎖; TDAPS가 약 3.9㎍/㎖ 내지 약 11.8㎍/㎖; DDAPS가 약 49.3㎍/㎖ 내지 148㎍/㎖; CAPB가 약 8.8㎍/㎖ 내지 약 17.5㎍/㎖; 또는 CASB가 약 12.5㎍/㎖ 내지 약 15㎍/㎖의 양으로 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 상술한 완층 시스템의 존재하에서, RNA를 염색시키는데 필요한 시약 조성물중 뉴 메틸렌 블루 농도 범위가 약 10 내지 100㎍/㎖임을 발견하였다.
본 발명자들은 예를 들어, 상술한 완충 시스템의 존재하에서, RNA 염색에 필요한 시약 조성물 중 옥사진 750의 농도는 낮으며, 즉 약 2㎍/㎖ 내지 약 15㎍/㎖ 범위이며, 상기 완충제가 침투를 향상시켜 염료가 망상적혈구의 RNA를 5분이내에 염색시킴을 발견하였다. 그러한 저농도의 염료는 성숙한 적혈구의 비-망상적혈구 염색을 최소화시켜 노이즈 백그라운드로부터 양호한 시그날이 분리되도록 한다. 상기와 같은 신속한 염색은 본 시약 조성물이 자동화 방법에 매우 적합하도록 한다.
상기 전혈/시약 조성물 혼합물을 유동 혈구계산기의 감지 영역에 통과시켜, 각 세포에 의해 산란되고 흡수된 광을 측정할 경우, 적혈구를 망상적혈구와 구별할 수 있으며 각각의 망상적혈구 또는 적혈구의 용적 및 헤모글로빈 농도를 측정할 수 있다. 망상적혈구 및 적혈구의 수, 및 망상적혈구 또는 적혈구의 헤모글로빈 함량, 평균 세포 용적, 평균 혈구성 헤모글로빈 농도, 및 평균 세포 헤모글로빈을 측정된 셀-바이-셀 용적 및 헤모글로빈 농도로부터 계산한다.
따라서 본 발명은 이후 기술되는 조성물 및 방법을 포함하며, 발명의 범주는 특허청구의 범위에서 제시된다.
본 발명의 상기 및 기타 목적 및 중요한 잇점은 본원에 수반되는 도면과 함께 기술된 하기의 이의 상세한 설명에 의해 명백히 된다고 믿어진다.
제1a도 및 제1b도에 의하면, 본 발명의 원리를 수행 하는데 사용할 수 있는 유동 혈구 계산 장치의 양식적, 기능적 및 구조적 묘사가 도시되어 있다. 사실상, 장치는 본원의 양수인에 의해 상표명[TECHNICON H 1]으로 시판되는 시스템을 변형시킨 특정 시스템을 묘사하고 있다.
상기 장치는 세포 분석용 유동 혈구계산 원리를 도입시켜, 특정 유형의 조명에 대한 세프의 광 산란 및 흡광 반응을 감지하는 수행력을 포함한다. 본 발명에 따라 가장 관심의 대상이 되는 성분만을 도시하였다. 따라서, 도면은 장치의 다양한 부품을 운용하고 제어하는데 요구되는 모든 기계적이고 전기적인 부품, 즉 모터, 솔레노이드, 펌프, 밸브, 센서를 도시하지는 않는다. 이들 부품은 모두, 의도된 방식으로 샘플을 처리하기 위한 본 발명에 따른 유동 혈구 계산 장치중의 다양한 부품의 바람직한 작동 양식에 대해 하기에 제시되는 정보에 관한 지식을 갖고 있는 당해 분야의 통상적인 숙련가에 의해 용이하게 인지될 수 있는, 모든 공지된 통상적 형태를 지닐 수 있다.
가장 일반적인 측면에 의하면, 외장류(sheath-stream) 유동셀(flow cell) 및 지지성 유체역학(supporting hydraulics)으로 제조된 세포를 측정 지점으로 전달한다. 세포는 유동셀(flowcell)의 사각 횡단면 유동 채널의 중앙부인 원추형 용적에 제한된다. 유동셀 구조는 TECHNICON H 1 시스템에 사용된 것과 동일하다. 수리 시스템은 매우 간단하며, 단지 2개의 연동 폄프 및 이들의 관련된 배관으로 이루어져 있다. 외장 펌프 및 튜브는 외장을 1.6×10-7m3/초의 속도로 운반한다; 샘플은 3.5×10-10m3/초의 속도로 운반된다; 유동 셀내 유동 채널은 250㎛×250㎛이다. 외장류내에서 측으로 유동하는 수득된 원추형 샘플류의 직경은 7㎛이고 속도는 2.5m/초이다.
주요 목적은, TECHNICON H 1 시스템으로 제공되는 2개의 적혈구 세포 산란채널이외에, 흡광 측정을 지지하는 광학 시스템을 제공하는 것이다. 산란/흡광 유동 혈구 계산기의 광학 시스템은 일반적으로 2가지 서브시스템으로 분할할 수 있다:a) 조명 광학(제1a도); 및 b) 검출 광학(제1b도).
먼저 제1a도를 참고로, 조명 광학 시스템은 일반적으로 참조 번호(10)으로 표시된 것으로, 633nm에서 2mW 광선 비임을 방사하는 헬륨-네온 레이저(12)를 포함한다. 비임은 레이저 비임 위치를 조절하는 2개의 반사 거울(14) 및 (16)에 의해 접지된다. 조절로 인해 비임 축이 조명 광학 장치의 물리적 광학 축과 일치하게 된다. 그런 다음 비임은 한쌍의 실린더 렌즈(18) 및 (20)에 의해 192×77㎛ 타원형 비임(1/e2)의 형상이 된다. 150mm 촛점 길이 실린더 렌즈(18)에 의해 192㎛ 디멘존이 형성되고, 이는 A-1 구경(22)(제1a도에 있어 페이지의 평면에 평행)의 장축을 조명한다. 60mm 촛점 길이 실린더 렌즈(20)에 의해 77㎛ 디멘존이 형성되어, 이는 A-1 구경의 단축을 조명한다. A-1 구경은 653×89㎛이다. 조명 더블렛(23)은 유동셀(24)중에서 37.4×12.6㎛의 타원형 가우시안(Gaussian) 강도 분포를 나타낸다. 타원의 부(minor) 측은, 예를 들면 화살표(26)의 방향에 수직인, 유동 방향과 평행이다.
측정 용적을 통과하는 세포는 투사적 방사를 산란하고 흡수한다. 산란되고 흡수된 광선이 포획되어 제1b도에 도시적으로 나타낸 검출 광학 장치로 측정된다. 비산란 광선 및 19.5˚이하로 산란된 광선을 큰 수치의 구경(Hi-NA)렌즈(28)로 모아 시준한다. 비임은 30/70(30% 반사, 70% 투과) 비임분리기 (30)에 의해 두 분획으로 분할된다. 비임(32)는 포토다이오드로 반사되어 흡광 측정을 위해 사용되는 반면, 투과된 비임(34)는 20/80(20% 반사,80% 투과) 비임분리기(36)에 의해 좀더 분리되어 2개의 산란 채널이 만들어진다. 반사된 산란 채널(38)은 5 내지 15˚다크스톱(darkstop)(40)을 갖고, 투과된 채널(42)는 2 내지 3˚다크스톱(44)을 갖는다. 그런 다음, 이와 같이 다크스톱(40),(44) 각각을 통과한 광선은 렌즈(46) 및 (48)을 통해, 각각 포토다이오드(50) 및 (52)로 촛점화된다. 그런 다음 뉴트럴 밀도 필터(54),(56) 및 (57)을 사용하여 각각의 포토다이오드에서 광선 수준을 표준 검출기 및 예비 증폭기에 있어 적절한 수준으로 감소시킨다.
비임(32)는 렌즈(58)을 통해 검출기/예비증폭기(60)로 촛점화된다. 예비증폭기 출력은 시스템을 통해 투과되는 광력에 비례한다. 이는 비산란 광선 및 약 19.5˚ 이하의 각도로 산란되는 광선을 모은다. 이러한 각도 간격 내에서, 구형적혈구 및 망상적혈구에 의해 산란된 광선의 약 98%를 모은다.
시판되는 TECHNICON H 1 장치의 흡광 채널은 세포 흡광 측정에 대해 최적화되어 있지 않다. 흡광 시그날은 흡광 예비증폭기상의 노이즈와 동일 수준이다.
흡광 검출 공정의 수학적 모델이 개발되었다. 이 모델은 유동셀내에서 레이저에 의해 조명 영역이 감소되면 시그날이 급격히 향상된다는 사실을 예측한다. 슬릿크기는 공칭 150×20μ(TECHNICON H 1 시스템)에서 공칭 40×20μ으로 감소하여 시그날 대 노이즈비를 3.75 인자만큼 증가시킨다.
흡착 예비 증폭기로부터의 시그날(펄스 높이)은 20과 50 밀리볼트 사이이다. 이는 시그날 프로셋싱 전자학이 요구하는 수치보다 훨씬 작다. 두번째 이득(gain) 단계는 약 25의 이득으로 흡광 예비증폭기에 가해진다. 이로써 펄스 높이는 약 1 볼트까지 초래된다.
예비증폭기 회로의 이득 및 각각의 산란 채널 내 뉴트럴 밀도 필터의 광학밀도가 선택되어, 테크니콘(TCN) 광학 시험 재료(Optical Test Material, OTM, TCH T03- 1704)를 분석하는 경우 각 채널의 출력에서 약 2볼트의 평균 펄스 시그날 수준을 나타낸다. OTM은 구형 및 견고히 고정된 적혈구 세포로 이루어진다. 이 재료는 본원의 양수인으로부터 시판되며, TECHNICOH H 1 시스템상에서 사용하도록 조절한다. 그런 다음 이것은 검출 후 시그날 프로셋싱 하드웨어 내의 다양한 이득증폭기를 사용하여 각각의 채널내에서의 총 이득의 미세한 조절을 가능케 한다.
검출후 시그날 프로셋싱 시스템의 작용상 블럭 도면이 제1c도에 도시되어 있다. 시스템은 예비증폭기(62), 가변성 이득 증폭기(64), 펄스 높이 분석기(66), 아날로그 디지탈 변환기(68) 및 데이타 습득 하드웨어(컴퓨터)(70) 및 소프트 웨어로 이루어져 있다.
시스템을 위한 전자 시스템은 주로 4사이트(Cyte) 시스템 [Howard Shapiro, M.D., P.C., Cambridge, MA,에서 입수가능 4Cyte Model FE Front End 및 4cyte ModelI[Interface Card]으로 이루어져 있다. 펄스-높이 분석기, 아날로그 디지탈 변환기 및 데이타 습득 소프트웨어는 모두 4사이트 시스템의 부품이다. 이들 부품은 4 이하의 입력 시그날에 대한 펄스 높이를 나타내는 펄스로 고정시키고, "유효"펄스 높이를 역치 수준으로 셋팅 시킨다. 4사이트 공유 영역 카드를 4 이하의 입력 시그날의 아날로그 디지탈 변환, 및 호스트 컴퓨터의 램(RAM) 메모리내에 이들 수치를 저장하기 위해 4사이트 소프트웨어와 함께 사용한다. 디지탈 시그날은 리스트 양식으로 저장된다. 각각의 세포에 대해 5개의 8-비트 바이트 정보가 있는데, 하나는 측정된 4개의 변수 각각에 대한 것이고, 하나는 플래징(flagging)을 위한 것이다. 이들 실험을 위한 호스트 컴퓨터는 컬러 모니터 및 매스 코프로세서(math coprocessor)가 장착된 IBM PC/XT 클론이다. 데이타 변환은 IBM 호환 컴퓨터로 수행할 수 있다.
하기 실시예는 시약 조성물 및 망상적혈구 동정을 위한 조성물 혼입방법 및 흡착 유동 혈구 계산 기술을 사용한 망상적혈구 및 적혈구 세포의 특성화를 설명한다. 표준 시판되는 시약 등급의 물질을 가능한한 사용한다. 하기 제형 및 제법은 단지 예시적 목적으로 제공되었고, 기타 성분, 비율 및 방법은 본 발명의 기술에 따라 사용할 수 있음을 이해해야 한다.
[실시예 1]
본 발명의 시약 조성물 및 방법을 사용하여 혈액 샘플중의 망상적혈구 및 적혈구를 구별하기 위한 산란 및 흡광 측정
옥사진 750 염료를 1mg/mI N,N-디메틸포름아미드 스톡 용액중에 저장한다. 실험 시약은 염료 스톡을, 지시된 농도의 하기 성분을 함유하는 완충 용액에 가해 제조한다.
본 연구중 사용된 실험 시약의 최종 삼투압 및 pH는 각각 272mmol/kg 및 8.1이다.
샘플을, 자동화 TECHNICON H*1 시스템 적혈구 세포 샘플 프로셋싱 방법을 모사한 방식으로 손으로 혼합한다. 유리 시험관을 실험 시약 5㎖로 충진한다. 그런다음 혈액 샘플 5㎕를 시약을 와동 혼합기상에서 교반하면서 시약중으로 피펫팅한다. 그런 다음 1:1000 희석 혈액을 유동 혈구 계산 장치의 샘플 라인으로 공급한다. 약 2분후 샘플을 유동 셀에 통과시킨후 적혈구 세포 및 망상적혈구 분석을 위해 헬륨-네온 레이저 공급원에 노출시킨다. 각각의 샘플을 샘플 용적이 허용하는 한 2회 측정한다. 현미경 검경하여 이 혼합물중의 대부분의 적혈구 세포 및 망상적혈구가 부분적으로 구형임을 발견하였다.
분석 완료시, 원 데이타를 제2a도의 형태[Red Scatter V. Red Absorption cytogram]로 열거한다. 별개의 세포 집단을 이의 특정 산란 및 흡광 시그날을 기초로 명확하게 관측한다. 적혈구 집단은 수직축 및 수직선 X 사이의 영역 A내에 속한다. 이들 세포는 고도의 산란 시그날 및 낮은 세포 흡광 시그날을 나타낸다.
망상적혈구 집단의 대부분의 분획은 X의 우측 영역, 영역 B에 속한다. 이들 세포는 이들의 옥사진 750 염색된 RNA로 부터의 보다 높은 흡광 시그날로 인해 성숙한 적혈구로부터 판별 가능하다. 혈소판 집단은 영역 C 라인 Y 하부에 위치하고, 합치 영역은 영역 D 라인 Z 상부에 존재한다. 망상적혈구에 비해 혈소판은 비교적 낮은 산란 시그날을 갖는다.
성숙한 적혈구 및 망상적혈구 사이의 흡광 분리를 기초로, 환자 샘플의 망상적혈구 수는 망상적혈구 및 적혈구를 확인하는 산란광 및 흡광 영역을 제한하는 전자적 "윈도우"를 제조하여 측정할 수 있다. 각각의 "윈도우"내에 속하는 망상적혈구 및 성숙한 적혈구 수를 측정하여 전체 세포집단 중에 존재하는 망상적혈구 및 적혈구의 %를 계산한다. 제2a(1)도에서, 망상적혈구 "윈도우"를 영역 B에 의해 측정하고 성숙한 적혈구 "윈도우"를 영역 A에 의해 측정한다. 제2a(2)도 및 모든 산란/산란 사이토그램에 있어, 비-선형 그릿(grid) 중첩은 일정 용적 위치 및 상기 타이코 방법에 따른 완전 구를 위한 일정 굴절율을 나타낸다.
각각의 샘플중의 망상적혈구 대조 %는 NCCLS[National Committee for Clinical Laboratory Standards]에 의해 권장된 수동 현미경 방법으로 측정한다.
이 방법에서, 소 용적의 샘플을 제조하고, 샘플중의 망상적혈구 %를 현미경을 사용하여 계산한다. 현미경에는 10OX 오일 침윤된 대물렌즈 및 1OX 접안 렌즈가 장착되어 있다. 각각의 샘플에 있어 최소 1000개 세포를 계수한다. 밀러(Miller) 디스크를 현미경 접안렌즈중에 삽입하여 계수 정밀성을 향상시킨다. 염색후 청색 물질 둘 이상의 입자를 함유하는 적혈구 세포를 망상적혈구로 표지한다.
환자 샘플의 망상적혈구 수를 이러한 유동 혈구 계산 기술에 의해 2.3%로서 측정한다. 동일한 혈액 샘플 또한 NCCLS 방법으로 분석한다. 그 결과는 망상적혈구 수가 1.7%이다.
두번째 실험을 수행하여 세포를 뉴 메틸렌 블루로 염색 하고 산란/흡광 유동혈구계산기로 측정하는 경우 망상적혈구와 적혈구를 판별한다. 완충 제형은 옥사진 750을 함유하는 시약 조성물에서와 동일하다. 실험 시약중 옥사진 750을 대체한 뉴 메틸렌 블루 염료의 농도는 60㎍/㎖이다. 상기한 샘플 제법 및 분석 프로토클을 수행한다. 하지만, 현미경 검경시 적혈구 세포 및 망상적혈구가 옥사진 750 혼합물에서 보다 덜 구형인 것으로 나타났다. 분석으로부터의 원 데이타를 제2b(1)도의 적색광 산란 대 적색광 흡수 사이토그램의 형태로 열거한다. 제2a(1)도와 비교하여, 흡광 및 산란 시그날이 보다 분산적인데, 이는 배향 노이즈에 기인하는 것 같다. 적혈구와 망상적혈구간의 흡광 분리를 기본으로 하여, 환자 샘플의 망상적혈구 수를 2.2%로 측정한다. NCCLS 방법으로 분석하는 경우, 망상적혈구 수는 1.7%로서 수득된다.
[실시예 2]
양쪽이온성 계면활성제를 함유하는 실시예 1의 시약 조성물을 사용하여 혈액 샘플내의 망상적혈구 및 적혈구를 구별하기 위한 산란 및 흡광 측정
두번째 실험 셋트를, 양쪽이온성 계면활성제를 추가로 포함하는 실시예 1의 시약 조성물을 사용하여 수행함으로써 등용적식으로 적혈구 세포 및 망상적혈구를 구형화시킨다.
각각의 실험을 위해, 시약 조성물에 계면활성제, 라우르 아미도프로필 베타인을 가해 시약중 계면활성제 최종 농도가 63㎍/㎖가 되도록 실험 시약을 제조한다.
상기 실시예 1에서 기술한 샘플 제법을 수행한다.
현미경으로 관측시, 제조된 샘플에서의 성숙한 적혈구 세포 및 망상적혈구는 완전한 구형으로 망상적혈구는 염색된 상태로 나타난다. 구형의 완전성이 증가함에 따라 배향 노이즈의 감소가 증가함을 나타내는 제8a도 및 제8b도와 제2도 및 제3도간의 상이성을 주시한다.
제3a(1)도는 세포를, 옥사진 750 염료 및 상기 계면활성제를 함유하는 시약 조성물로 염색하는 경우 망상적혈구와 적혈구 집단사이의 보다 높은 정도의 차이를 나타낸다. 제8c도에서 비염색된 대조인 영역 B는 세포가 배제된 상태이다.
환자 샘플의 망상적혈구 수는 이러한 기술에 의해 8.0% 로서 측정된다. 동일 혈액 샘플 또한 NCCLS 방법으로 분석한다. 그 결과 망상적혈구 수는 9.1%이다.
제3b(1)도는 세포를 뉴 메틸렌 블루 염료 및 상기 계면 활성제를 함유하는 시약 조성물로 염색하는 경우 망상적혈구와 적혈구 사이의 차이 정도를 나타낸다.
환자 샘플의 망상적혈구 수는 이 기술로 5.0%로 측정 된다. 동일한 혈액 샘플 또한 NCCLS 방법으로 분석한다. 그 결과 망상적혈구 수는 9.1%이다.
[실시예 3]
가성 흡광(Pseudo Absorption)에 대해 보정된 흡광 데이타를 사용한, 본 발명의 시약 조성물 및 방법과 NCCLS 참조방법간의 상관관계 연구
검출 광학 서브시스템은 유동 셀내 레이저 비임을 통과하는 세포로부터의 산란 및 비산란 광선 모두를 모은다. 세포는 광선을 모든 방향으로 산란시킨다. 상기한 바와 같이, 광학 시스템내의 비교적 Hi-NA 렌즈는, 19.5˚이하의 반 각도로 광학 축에 포커싱되는 원추체상으로 산란하는 광선을 수용한다. 따라서, 19.5˚이상의 각도로 산란된 광선은 손실된다. 그 결과, 세포 흡광을 측정하려는 경우에 있어, 완전한 비-흡광 세포는 투사광의 수%까지만을 흡수하는 것으로 "나타난다"(가성- 흡광). 측정된 흡광치는 하기로 표현될 수 있다:
흡광 시그날 = 가성 흡광 + 헤모글로빈 흡광 + 염료 흡광
성숙한 적혈구 세포의 가성-흡광 시그날은 일반적으로 염색된 망상적혈구로부터의 실질적인 흡광 시그날의 크기와 동일하다. 이것은 흡광 사이토그램상에서 비염색된 적혈구 세포로부터 염색된 망상적혈구의 분리 정도를 감소시킨다. 흡광 채널의 시그날 대 노이즈 비는, 각각의 적혈구 세포 및 망상적혈구 흡광 시그날로부터 가성-흡광 및 헤모글로빈 흡광 성분을 제거하여 시그날을 보정함으로써 향상 될 수 있다. 가성-흡광 및 헤모글로빈 흡광량은 상기 타이코 특허에서 기술한 널리 공지되어 있는 (미) 광 산란 이론을 사용하여 어떠한 주어진 세포에 대해서도 계산할 수 있다. 헤모글로빈 흡광 성분과 함께 19.5˚내지 180˚각도 간격에 대한 산란 교차- 단면 S3은 하기와 같이 계산할 수 있다.
S3=πa2Qext-S(λ, ns, θ3, △θ3; V, HC) 상기식에서, a는 구형 세포 반경이고, λ는 여기(또는 조명) 파장이며 ns는 샘플 스트림 및 외장의 굴절률이고, Qext는 세포의 소멸(extinction) 효율이고, 가성-흡광의 경우에있어, θ3=0˚이고 △θ3=19.5˚이다.
S3값은 모든 기대되어지는 V 및 HC에 대해 표로 작성되어 있다.
가성-흡광 보정은 하기와 같이 수행한다: V 및 HC값을 먼저 타이코에 의해 기술된 바와 같이 산란-산란 사이토그램으로 부터의 세포로부터의 2개의 산란 시그날로부터 측정해야 한다. 그런 다음 S3은 측정된 V 및 HC에 대해 표로부터 검색하여, 흡광 채널에 의해 측정된 값으로부터 공제한다. 그 결과 세포 염색으로 인한 실질적 흡광치가 계산된다. 측정된 흡광 시그날은 하기 식을 사용하여 조절해 각각의 세포에 대한 염료 흡광치만을 계산해낸다:
염료 흡광 = 흡광 시그날 - 헤모글로빈 흡광 - 가성 - 흡광 = 흡광 시그날 - S3
모든 데이타에 있어, 조절된 값을 역치 및 플래징 이전의 원 데이타 변수로 대체한다. 적색 산란 변수가 V-HC 지도 상에 나타나지 않는 어떠한 대상도 데이타 분석 도식에서 제외시킨다. 그후 이 데이타를 제5a도 및 제5b도에 도시한 바와 같이 보정된 값을 반영하는 적색 산란 v. 흡광 사이토그램으로 다시 나타낸다.
NCCLS 수동 방법과 산란/흡광 유동 혈구계산기내에 시약 조성물중 옥사진 750을 사용한 수행을 비교하기 위한 연구를 수행한다. 혈액 샘플을 시약 조성물로 염색한다. 동한 혈액 샘플중 망상적혈구 또한 NCCLS 방법을 사용하여 계수한다.
샘플 제법 및 분석 프로토콜은, 추가적인 가성-흡광 보정을 제외하고 실시예 2에 대해 기술한 바와 동일하다.
현미경 관측시, 제조된 샘플중의 성숙한 적혈구 세포 및 망상적혈구는 완전한 구형이고 망상적혈구는 염색된 상태임을 발견하게 된다.
이들 두가지 방법으로부터 수득한 망상적혈구 수(%)를 제6도에서 비교한다.
시약 조성물중 옥사진 750 2㎍/㎖의 농도 에서, 시약 조성물 및 제1도의 유동 혈구 계산치를 사용한 측정치와 NCCLS 참조 방법으로 수득한 측정치 사이에 근접한 상관관계가 존재하는 것으로 나타난다. 직각 회기 분석에 의해 수득된 측정치에 대한 상관계수는 0.92이다.
[실시예 4]
흡광 유동 혈구 계산기 및 가성-흡광에 대해 보정된 흡광 데이타를 이용하는 TECHNICON H*1 참조 방법에 대한 상관 연구
가성-흡광을 보정하고 적당히 게이팅한 후, 적혈구 및 망상적혈구 지표, MCV MCHC를 개별적으로 측정하고 산란/흡광 유동 혈구 계산기 및 TECHNICON H 1 측정기에서 본 발명의 시약 조성물을 이용하여 수득된 값과 비교한다. 제4a도 및 제4b도는 총 적혈구 MCV 및 MCHC 각각에 대해 상관 데이타를 보여준다.
제7도는 HC 대 V 사이토그램에서 "+"로 표지된 망상적혈구를 보여준다.
상기 기술로부터 명백한 본 발명의 몇몇 잇점은 흡광 유동 혈구 계산법 기술에 의해 전혈 샘플중 망상적혈구를 동정하기 위해서 및 망상적혈구 및 적혈구의 용적, 헤모글로빈 함량 및 헤모글로빈 농도의 동시 정량을 위한 시약 조성물 및 방법을 포함한다.
상기의 관점에서, 본 발명의 수 개의 목적이 달성되었고 기타 유리한 결과가 수득됨을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 영역으로부터 이탈하지 않는 한 상기 구성 및 방법에서 다양한 변화가 있을 수 있으므로, 상기 설명에 포함된 또는 수반되는 도면에 나타난 모든 사항들은 제한의 의미없이 예시적으로 이해되어야 할 것이다.
Claims (31)
- 항응고된 전혈 샘플을, 구형화제로서 양쪽이온성 계면활성제를 함유하는 단일의 수성 시약 조성물로 처리하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 계면활성제는 적혈구의 용혈(lysis)을 지연시키기 위한 추가의 단백질 완충제를 요하지 않고, 상기 혈액 샘플과 상기 시약 조성물을 유동 혈구계산기 광 산란 측정에 적용시기는 경우, 배향 노이즈를 제거하기 위해 전혈 샘플중 성숙 적혈구와 망상적혈구를 실질적으로 구형화할 수 있는 농도로 시약 조성물중에 존재하는 것을 특징으로 하는, 전자광학적으로 연속적이고 효과적으로 측정할 수 있는 전혈 샘플 중 포유류 적혈구를 처리하는 방법.
- 제1항에 있어서, 희석된 전혈 샘플중 양쪽이온성 계면활성제의 농도가 약 3.9㎍/㎖ 내지 약 148㎍/㎖인 것을 특징으로 하는, 전혈 샘플 중 포유류 적혈구를 처리하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 양쪽이온성 계면활성제가 알킬 베타인 또는 알킬아미도베타인인 것을 특징으로 하는, 전혈 샘플 중 포유류 적혈구를 처리하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 양쪽이온성 계면활성제가 라우르아미도프로필베타인, N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 코코아미도프로필베타인 및 코코아미도설포베타인으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 전혈 샘플중 포유류 적혈구를 처리하는 방법.
- (a) 혈액 샘플의 분취량을, 구형화제로서 양쪽이온성 계면활성제를 함유하는 단일의 수성 시약 조성물과 혼합하여 현탁액을 형성하는 단계, 여기서 상기 계면활성제는 적혈구의 용혈을 지연시키기 위한 추가의 단백질 완충제를 요하지 않고, 상기 시약 조성물은 등장액의 약 0.5 내지 2.0배의 강장성(tonicity)을 갖는 용액을 포함하며; (b) 단계(a)의 헌탁액을 실질적으로 한번에 하나의 세포씩 포커싱된 광학 조명 영역을 통해 통과시키는 단계; (c) 각 세포에 의한 산란광을 검출하고 측정하는 단계; 및 (d) 상기 산란 광의 측정치를 기준으로 하여 적어도 부분적으로 관심대상인 아계열 세포를 판별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 혈액 샘플중 관심대상인 아계열 세포를 동정하는 방법.
- 제5항에 있어서, 단계(a)는, 염료 화합물을 첨가하여 관심대상인 아계열 세포를 선택적으로 염색시키는 단계를 포함하고; 단계(c)는 각 세포에 의한 산란광과 흡수광을 검출하고 측정하는 단계를 포함하며; 단계(d)는 상기 산란광 및 흡수광의 측정치를 기준으로 하여 적어도 부분적으로 관심대상인 아계열 세포를 판별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 혈액 샘플증 관심대상인 아계열 세포를 동정하는 방법.
- (a) 혈액 샘플 분취량을, 수성 시약 조성물과 혼합하여 현탁액을 형성시키는 단계, 여기서 상기 시약 조성물은 세포의 핵산을 염색시키는 염료 화합물, pH를 대략 중성으로 유지시키는 완충액, 및 구형화제로서 적혈구의 용혈을 지연시키기 위한 추가의 단백질 완충제 또는 고정제를 요구하지 않는 양쪽이온성 계면활성제를 포함하며: (b) 단계(a)의 현탁액을 실질적으로 한번에 하나의 세포씩 포커싱된 광학 조명 영역을 통해 통과시키는 단계; (c) 각 세포에 의한 산란광 및 흡수광을 검출 및 측정하는 단계;및 (d) 상기 산란광 및 흡수광의 측정치를 기준으로 하여 적어도 부분적으로 관심대상인 아계열 세포를 판별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 혈액 샘플중 관심대상인 아계열 세포를 동정하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 시약 조성물의 pH가 약 6에서 약 9인 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 혈액 샘플중 관심대상인 아계열 세포를 동정하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 시약 조성물의 pH가 약 7에서 약 8인 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 혈액 샘플중 관심대상인 아계열 세포를 동정하는 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 단계(a)의 염료 화합물이 양이온성 염료인 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 혈액 샘플중 관심대상인 아계열 세포를 동정하는 방법.
- 제7항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 상기 전체 완충액 농도가 혈액 샘플중 세포를 등용적으로 구형화시키기 위해 등장성인 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 혈액 샘플중 관심대상인 아계열 세포를 동정하는 방법.
- 제5항 또는 제7항에 있어서, 상기 단계(a)의 양쪽이온성 계면활성제가 알킬 베타인 또는 알킬아미도베타인인 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 혈액 샘플중 관심대상인 아계열 세포를 동정하는 방법.
- 제5항 또는 제7항에 있어서, 상기 단계(a)의 양쪽이온성 계면활성제가 라우르아미도프로필베타인, N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 코코아미도프로필베타인 및 코코아미도설포베타인으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 혈액 샘플중 관심대상인 아계열 세포를 동정하는 방법.
- 제5항 또는 제7항에 있어서, 희석된 전혈 샘플 중 양쪽이온성 계면활성제의 농도가 약 3.9㎍/㎖ 내지 약 148㎍/㎖인 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 혈액 샘플중 관심대상인 아계열 세포를 동정하는 방법.
- (a) 혈액 샘플의 분취량을, 망상적혈구의 리보핵산을 염색시키는 양이온성염료 화합물, 구형화제로서 적혈구의 용혈을 지연시키기 위한 추가의 단백질 완충제를 요하지 않는 양쪽이온성 계면활성제, 및 완충 용액을 포함하는 시약 조성물과 혼합하여 현탁액을 형성시키는 단계; (b) 단계(a)의 한탁액을 실질적으로 한번에 하나의 세포씩 포커싱된 광학 조명 영역을 통해 통과시키는 단계; (c) 각 세포에 의한 산란광 및 흡수광을 검출 및 측정하는 단계;및 (d) 상기 산란광 및 흡수광의 측정치를 기준으로 하여 염색된 세포와 비염색된 세포를 동정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 전혈액 샘플중의 망상적혈구와 적혈구를 특성화하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 산란광 및 흡수광의 측정치를 기준으로 하여 각각의 망상적혈구와 적혈구의 수, 용적, 헤모글로빈 농도, 및 RNA 농도를 측정하는 단계 (e)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 전혈액 샘플중의 망상적혈구와 적혈구를 특성화하는 방법.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 단계(a)의 양쪽이온성 계면활성제가 알킬 베타인 또는 알킬아미도베타인인 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 전혈액 샘플중의 망상적혈구와 적혈구를 특성화하는 방법.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 단계(a)의 양쪽이온성 계면활성제가 라우르아미도프로필베타인, N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 코코아미도프로필베타인 및 코코아미도설포베타인으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 전혈액 샘플중의 망상적혈구와 적혈구를 특성화하는 방법.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 단계(a)의 양쪽이온성 계면활성제가 약 3.9㎍/㎖ 내지 약 148㎍/㎖의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 전혈액 샘플중의 망상적혈구와 적혈구를 특성화하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 단계(a)의 양쪽이온성 계면활성제가 약 3.9㎍/㎖ 내지 약 148㎍/㎖의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 전혈액 샘플중의 망상적혈구와 적혈구를 특성화하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 단계(a)의 양쪽이온성 계면활성제가 약 3.9㎍/㎖ 내지 약 148㎍/㎖의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 의해 전혈액 샘플중의 망상적혈구와 적혈구를 특성화하는 방법.
- 혈액 샘플과 시약 조성물을 유동 혈구계산기 광 산란 측정에 적용시키는 경우, 배향 노이즈를 제거하기 위해 구형화제로서 양쪽이온성 계면활성제를 함유하는 시약 조성물로서, 상기 양쪽이온성 계면활성제는 i) 상기 전혈 샘플중 성숙 적혈구와 망상적혈구를 실질적으로 구형화할 수 있는 농도로 존재하며, ii) 적혈구의 용혈(lysis)을 지연시키기 위한 추가의 단백질 완충제를 요하지 않는 것을 특징으로 하는, 전자광학적으로 연속적이고 효과적으로 측정할 수 있는 전혈 샘플중 포유류 적혈구를 처리하기 위한 시약 조성물.
- 망상 적혈구내의 리보핵산을 염색시키는 유효량의 염료 화합물 및 적혈구의 용혈을 지연시키기 위한 추가의 단백질 완충제를 요하지 않으며, 혈액 샘플에서 망상적혈구와 적혈구를 등용적식으로 구형화하기 위한 유효량의 양쪽이온성 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유동 혈구계산법에 전혈액 샘플중의 망상적혈구를 특성화하기 위한 시약 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 염료 화합물이 양이온성 염료인 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
- 제22항 내지 제24항중 어느 한 항에 있어서, 희석된 전혈 샘플중에서 양쪽이온성 계면활성제의 농도가 약 3.9㎍/㎖ 내지 약 148㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
- 제22항 내지 제24항중 어느 한 항에 있어서, 상기 시약 조성물은 등장액의 약 0.5 내지 2.0배의 강장성(tonicity)을 갖는 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
- 제22항 내지 제24항중 어느 한 항에 있어서, 시약 조성물의 pH를 대략 중성으로 유지시키기 위한 pH 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
- 제27항에 있어서, 시약 조성물의 pH가 약 6 내지 약 9인 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
- 제27항에 있어서, 시약 조성물의 pH가 약 7 내지 약 8인 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
- 제22항 내지 제24항중 어느 한 항에 있어서, 상기 양쪽이온성 계면활성제가 알킬베타인 또는 알킬아미도베타인인 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
- 제22항 내지 제24항중 어느 한 항에 있어서, 상기 양쪽이온성 계면활성제가 라우르아미도프로필베타인, N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 코코아미도프로필베타인 및 코코아미도설포베타인으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
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