DE102004006182B4

DE102004006182B4 - Verfahren zur elektrooptischen Analyse von Zellsuspensionen

Info

Publication number: DE102004006182B4
Application number: DE102004006182A
Authority: DE
Inventors: Alexander Dr.-Ing. Angersbach; Victor Dr. Bunin
Original assignee: BIOTRONIX GmbH
Current assignee: Elosystems Dr Angersbach & Dr Bunin GbR (ver De
Priority date: 2003-08-19
Filing date: 2004-02-06
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2024-02-07
Also published as: DE102004006182A1

Abstract

Verfahren zur elektrooptischen Analyse von Zellsuspensionen, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
a) Anlegen eines elektrischen Wechselfeldes, das auf die Zellen, die in der Suspension vorliegen, einwirkt, wodurch
– eine räumliche (dreidimensionale) Polarisation der Zellstrukturen induziert wird; und
– bei Interaktion der induzierten polarisierten Ladungen und dem elektrischen Feld die Orientierung der Zellen geändert wird;
b) optische Registrierung der Orientierungsänderung der Zellen;
c) Bestimmung der Komponenten des Tensors der Zellpolarisierbarkeit;
d) Anlegen eines elektrischen Rotationsfeldes, welches eine Rotation des Vektors des elektrischen Feldes mit der Frequenz erzeugt, die eine Änderung der Orientierung der Zellen hervorruft, wobei die Feldrotationsfrequenz unabhängig von der Frequenz des orientierenden elektrischen Feldes ist;
e) schrittweise Erhöhung der Frequenz des elektrischen Rotationsfeldes und/oder Senkung der Feldstärke, wobei für jede Stufe die Konzentration der Zellfraktionen mit definierten Polarisationswerten berechnet wird;
f) Detektion der Zellfraktionen durch photometrische Messung der Abschwächung des Lichtstrahls bei...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrooptischen Analyse von Zellsuspensionen, nach welchem auf die Zellen, die in der Suspension vorliegen, ein elektrisches Wechselfeld einwirkt und eine räumliche (dreidimensionale) Polarisation der Zellstrukturen induziert wird, wobei bei Interaktion der induzierten polarisierten Ladungen und dem elektrischen Feld die Zellorientierung geändert wird und die Orientierungsänderung optisch registriert wird. Nach diesen Änderungen werden die Komponenten des Tensors der Zellpolarisierbarkeit bestimmt und die strukturellen und physiologischen Eigenschaften abgeleitet. Der Vektor des elektrischen Feldes rotiert mit der Frequenz, die eine Änderung der Zellenorientierung hervorruft. Die Detektion der Zellfraktionen mit unterschiedlichen Eigenschaften erfolgt durch photometrische Messung der Abschwächung des Lichtstrahls bei der Änderung der Zellorientierung.
In der Mikrobiologie, der Lebensmittelindustrie und der Biotechnologie, wo eine Vielzahl von natürlichen und modifizierten Zellkulturen eingesetzt wird, steht die Aufgabe, verschiedene hochvariable Eigenschaften und Zustände von Zellkulturen zu bestimmen. Herkömmliche Zellanalyseverfahren, wie z.B. Mikroskopanalyse zur Bestimmung von morphometrischen Eigenschaften, Ausplattieren auf Nährmedien oder periodische Zellzählung in der Zählkammer zur Bestimmung der Vitalität und der spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit entsprechen den modernen Anforderungen nicht, weil sie nicht empfindlich genug oder wegen des hohen Zeit- und Arbeitsaufwandes nicht praktikabel sind.
Die elektrooptische Analyse basiert auf dem so genannten Kerr-Effekt. Das Prinzip dieses Effektes besteht in der Veränderung der optischen Eigenschaften der Suspension, zum Beispiel Zellensuspension, durch Wirkung eines elektrischen Feldes.

Eine in SU 913169 beschriebene Einrichtung beschreibt ein Verfahren der elektrooptischen Analyse der Zellsuspension, in dem der Lichtstrahl durch zwei Zellsuspensionsproben durchgeführt wird. Gleichzeitig wird um die Suspension ein Radioimpuls des elektrischen Feldes mit der fixierten Feldfrequenz und Feldstärke angelegt. Der Vektor des Radioimpulses ist für die eine Probe dem Lichtstrahl parallel und für die andere Probe dem Lichtstrahl orthogonal. Die Frequenz des elektrischen Feldes wird bei jedem Messimpuls neu variiert. Es werden die Intensitäten der durch die zu untersuchende Suspension ausgetretenen Lichtstrahlen gemessen, die gleichzeitig die optischen Dichten der Suspension für beide Proben bestimmen. Anhand der Differenz dieser Werte wird die Anisotropie der Polarisierbarkeit bestimmt, nach dem die elektrophysikalischen Eigenschaften der Zellen beurteilt werden.

Jedoch gestatten die Vorrichtung und das Verfahren nach SU 913169 nicht eine vollständige und selektive Analyse der Zellen, die heterogen nach ihren elektrophysikalischen Eigenschaften sind, weil sie nur die Veränderung der summarischen optischen Dichte der Suspension und, dementsprechend, durchschnittlichen Werfe der Anisotropie der Polarisierbarkeit einschätzen lassen. Die Verwendung von zwei Messzellen und zwei Photosensoren kompensiert zum Teil die mit der Sedimentation und Flockung von Zellen verbundenen Messfehler, aber sie ruft zusätzliche Messfehler hervor, die mit der nicht identischen Ausführung der Messzellen und der Anwesenheit der nicht kompensierten Niederfrequenzgeräusche der Photosensoren verbunden sind.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem die physiologischen und/oder andere Heterogenitäten von Zellen in einer Suspension bestimmt werden können.

Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur elektrooptischen Analyse von Zellsuspensionen, wobei auf die Zellen ein elektrisches Wechselfeld einwirkt, durch das eine räumliche (dreidimensionale) Polarisation der Zellstrukturen induziert wird. Bei Interaktion der induzierten polarisierten Ladungen und des elektrischen Feldes wird die Zellorientierung geändert, ihre Erfassung erfolgt mit optischen Methoden, wobei nach der erfassten Zellorientierung die Differenz der Komponenten des Tensors der Zellpolarisation registriert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht erstmalig die Bestimmung der elektrophysikalischen Heterogenität von Zellsuspensionen mittels Anwendung elektrischer Rotationsfelder und Erstellung einer Zellverteilung nach ihrer Polarisierbarkeit bei definierter Frequenz des Polarisationsfeldes.

Das an die Zellsuspension angelegte elektrische Feld induziert eine Polarisation der elektrischen Ladungen in den suspendierten Zellen. Das Ausmaß und die Verteilung der induzierten Polarisationsladungen werden durch den effektiven Polarisationsmechanismus bestimmt [Dukhin, Elektrooptik von Kolloiden, Verlag: Naukowa Dumka, Kiew, 1975]. Bei dem räumlichen (dreidimensionalen) Polarisierbarkeitsmechanismus entstehen induzierte Ladungen an der Phasengrenze von zwei Medien mit den unterschiedlichen komplexen dielektrischen Eigenschaften. Phasengrenzen der Zellstrukturen sind beispielsweise Kontaktflächen der Doppelelektronenschicht und der Zellwand, der Zellwand und der zytoplasmatischen Membran, der zytoplasmatischen Membran und des Zytoplasmas. Die Menge der auf der Phasengrenze induzierten Ladungen ist proportional der Stärke des elektrischen Feldes und ist von dem Verhältnis der dielektrischen Permeabilität der Zellstrukturen abhängig. In einer heterogenen Zellpopulation verfügt jede einzelne homogene Zellfraktion über einen unikalen Komplex elektrophysikalischer Parameter.

Als Integralwert, der die Polarisierbarkeit charakterisiert, gilt der Tensor der Polarisierbarkeit der Zelle. Der Tensor der Polarisierbarkeit unsphärischer Zellen besitzt wenigstens zwei unterschiedliche Komponenten. Die Längskomponente befindet sich der langen Zellenachse entlang, die Querkomponente liegt orthogonal zur langen Zellenachse. Die in der Zelle verteilten induzierten elektrischen Ladungen mit den verschiedenen Vorzeichen bilden einen Dipol. Der Dipol wirkt mit dem elektrischen Feld zusammen und ruft die Bildung eines Drehmomentes hervor. Es entsteht eine dominante Richtung der Zellorientierung, die den wahrscheinlichen Charakter der Verteilung der Zellen im Orientierungswinkel (wird durch Bolzmann-Funktion beschrieben) verändert. Den Orientierungswinkel der Zelle zählt man von der Richtung des fallenden Lichtstrahles zu der Richtung der langen Zellachse.

Dabei entsteht eine Veränderung aller optischen Charakteristika der Suspension: der Größe der Lichtdoppelbrechung, des Charakters der. Lichtstreuung und der optischen Dichte der Suspension (infolge der Veränderung des Streuungsschnittes G(t) der Zellen). Im Bereich der schwachen Zellorientierung hat die Abhängigkeit der Veränderung der optischen Dichte der Suspension von dem Quadrat der Stärke des elektrischen Feldes E einen linearen Charakter.

Abhängig von der Frequenz des elektrischen Feldes und den elektrischen Eigenschaften der Zellen kann die Richtung der dominanten Zellorientierung mit der Richtung des Vektors des elektrischen Feldes übereinstimmen oder orthogonal dazu sein. Die Zellorientierung mit der langen Achse entlang des Lichtstrahls führt zur Vergrößerung des Zerstreuungsschnittes und zur Reduzierung der Intensität des Lichtstrahles. Die Orientierung quer zum Lichtstrahl führt dabei zur Reduzierung des Streuungsschnittes und dementsprechend zur Zunahme der Lichtstrahlintensität.

Für Zellsuspensionen, die ähnliche Dimensionen der einzelnen Zellen haben, ist die Änderung der optischen Dichte bis zu einem bestimmten Schwellenwert proportional zu dem Quadrat der Stärke des elektrischen Feldes. Dieser Schwellenwert entspricht dem Übergang von einem schwachen Grad der Zellorientierung zu einem starken Orientierungsgrad. Die Messung im Bereich dieses Schwellenwertes garantiert eine ausreichende. Messpräzision. Im Zusammenhang damit wird am Anfang der Messreihe experimentell die Feldstärke bestimmt, bei der die Zellen von einem schwachen zu dem starken Orientierungsgrad übergehen. Weiterhin werden alle Messungen ohne Veränderung der Stärke des elektrischen Feldes durchgeführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Bestimmung elektrophysikalischer Parameter von Zellen in einer Suspension, welche wiederum die Konzentrationsbestimmung von Zellfraktionen mit definierten elektrophysikalischen Eigenschaften zulassen. Außerdem wird die Analyse der elektrophysikalischen Heterogenität von Zellen in der Suspension und die Bestimmung von Zellfraktionen mit veränderten elektrophysikalischen Eigenschaften durch das Verfahren ermöglicht.

Erfindungsgemäß ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass für die selektive Erfassung der Zellfraktionen mit definierter Größe der Polarisierbarkeit, die ihre Eigenschaften nach einer physikalisch-chemischen Testwirkung geändert haben, der Vektor des elektrischen Polarisationsfeldes mit einer Frequenz rotiert, die eine Änderung der Zellorientierung gewährleistet. Die Rotationsfrequenz der Vektorrichtung wird dabei unabhängig von der Frequenz des elektrischen Polarisationsfeldes eingestellt. Erfindungsgemäß wird das elektrische Rotationsfeld bevorzugt mit Gitternetzelektroden (die Elektroden haben endliche Länge und werden zum Beispiel in den Seiten des Parallelepipeds platziert) und mittels periodischer Änderung der Feldstärke des Polarisationsfeldes von jeder einzelnen Elektrode nach linearen oder anderen Gesetzmäßigkeiten vom Maximum bis zum Nullminimum und sprungartiger Phasenänderung um 180° im Moment des Minimums generiert. Die Periode der Feldstärkeänderung steuert in dem Zusammenhang die Rotationsfrequenz des Feldvektors.

Bevorzugt wird das elektrische Feld als Superposition von elektrischen Feldern gebildet, die von zwei um 45° gegeneinander verschobenen Elektrodengruppen erzeugt werden, wodurch die Zellen zwei orientierenden Feldern mit verschiedenen Frequenzen und Feldstärken, jedoch mit gegenseitigen Rotationsrichtungen, ausgesetzt werden können. Die von zwei Elektrodengruppen gebildeten Felder können auch wechselnd wirken. Es gilt dabei zu beachten, dass der Zeitabschnitt des Feldwechsels größer (schneller) sein muss, als die Inerzionszeit (Trägheit) des Stopps der Zellen.

Zum einen erfolgt die Erfassung der resultierenden Wirkung des Feldes auf die Änderung der Zellorientierung photometrisch, nach der Abschwächung des Lichtstrahles, wobei das Signal von rotierenden Zellen, mittels synchroner Filtration bei der Frequenz des Rotationsfeldes ermittelt wird, was eine Ausprägung der Signalkomponente, die nur mit der Rotation der Zellen durch das Feld verbunden ist, gewährleistet.

Ein andere Möglichkeit der Erfassung der resultierenden Wirkung des Feldes auf die Änderung der Zellenorientierung erfolgt durch Analyse nacheinander (kontinuierlich) registrierter Bilder (Image) von suspendierten Zellen. Dabei erfolgt die Signalerfassung von rotierenden Zellen durch

– Bestimmung der Unterschiede/Differenzen zwischen den nacheinander fixierten Bildern (Image),
– Summieren dieser Unterschiede und
– Analyse auf dunklem Hintergrund der Trecken (Bewegungsspuren) von rotierenden Zellen als Ringe oder Zylinder.

Bei der Bildanalyse der Zellrotation in einer Suspension wird die fokale Ebene des Bildregistrierungssystems vertikal zur Suspensionsschichtdicke bewegt und die auf jeder Ebene aufgenommenen Trecken (Bewegungsspuren) der rotierenden Zellen summiert.

Bei der Erfassung der Konzentration von Zellen mit gleichen Polarisationswerten werden, im Falle der Anwendung eines rotierendes Feldes mit einzelner Frequenz, eine definierte, hohe Feldstärke und eine niedrige Rotationsfrequenz vorgegeben. Dabei erfolgt die Bestimmung der Polarisierbarkeit dieser Zellfraktion mittels Erfassung des Rotationsstops, welches durch die Erhöhung der Rotationsfrequenz des elektrischen Feldes oder durch die Senkung der Feldstärke hervorgerufenen wird. Die Bestimmung der Konzentration dieser Zellfraktion erfolgt durch Erfassung der Abnahme von absoluten Signalwerten. Die Analyse aller Zellfraktionen erfolgt durch schrittweise Erhöhung der Rotationsfrequenz des elektrischen Feldes oder durch die Senkung der Feldstärke. Dabei wird für jede Stufe die Konzentration der Zellfraktion mit definierten Polarisationswerten berechnet.

Eine selektive physikalisch-chemische Testwirkung auf eine bestimmte Zellfraktion oder Änderung des physiologisches Zustandes (wachstums-, stressbedingt) wird durch die Bestimmung der Differenz zwischen der Polarisationswertverteilung der Zellen vor und nach der Testwirkung oder während des Wachstums bzw. der Stressausübung ermittelt.

Bei der Analyse mit zwei auf sich zulaufenden rotierenden Felder, die gleiche Rotationsfrequenz jedoch eine unterschiedliche Frequenz des Polarisationsfeldes haben, wird zuerst durch die Stärkeänderung von einem der beiden Felder der Zellstopp erreicht. Nach einer selektiven physikalisch-chemischen Testwirkung wird die Rotation einer Zellfraktion registriert und die absoluten Werte des entstehendes Signals, das der Konzentration der „geänderten" Zellen proportional ist, gemessen.

Bekanntermaßen wirkt eine Menge von Faktoren auf eine Zelle ein, z.B. Stressfaktoren, Temperaturen, Wachstumsmedien und zahlreiche andere. Der momentane Zustand einer Zelle ist hochvariabel und dynamisch. So ergibt jede Veränderung von äußeren Bedingungen ein anderes Proteom und einen anderen Zustand der Zellkultur, der mit einer Reihe von Parametern definiert wird (Zellzahl, Zellgröße und -form, Vitalität, metabolischer Zustand, Zellstruktur und Proteinkonzentration). Das erfindungsgemäße elektrooptische Meßverfahren besitzt deshalb den großen Vorteil, eine Momentaufnahme des Zellzustandes zu ermöglichen und erlaubt Rückschlüsse auf verschiedene Parameter, wie z.B. den physiologischen Zustand der Zellen, ihre Proteinkonzentration, ihre Struktur sowie den Zustand der Zellbestandteile.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.
Beschreibung der Abbildungen:
1 stellt das Erzeugungsprinzip eines rotierenden elektrischen Feldes mittels eines Vierelektrodensystems (1, 2, 3 und 4) dar.
2: a) zeigt den Verlauf des elektrooptischen photometrischen Signals als Funktion der Rotationsfrequenz des Vektors des elektrischen Polarisationsfeldes. b) zeigt die berechnete Form der nach den Werfen der Polarisationsanisotropie rangierten Zellverteilung.
3: a) zeigt die Image-Fragmente von rotierenden Zellen. b) stellt das Ergebnis der Bildverarbeitung einer rotierenden Zelle ohne laterale Bewegung dar. c) zeigt das Ergebnis der Bildverarbeitung einer rotierenden Zelle die sich lateral entlang der Achse X bewegt.
4 zeigt die Ergebnisse der Konzentrationsberechnung von Zellfraktionen mit definierten Polarisationswerten, für welche eine Testwirkung das Polarisationssignal verringert hat.
Für die Erzeugung eines rotierenden elektrischen Feldes in der mit der Suspension gefühlten Messzelle, die mit vier Elektroden ausgestattet ist, wird an jede Elektrode ein „sägeförmiger" Radioimpuls (wie in 1 dargestellt ist) angelegt, wobei die Frequenzphase der Spannungen der Elektrodenpaare 1 und 3, 2 und 4 um 180° verschoben sind. Die Superposition von vier Spannungsfeldern erzeugt in der Messzelle ein Rotationsfeld, wobei die gleichmäßige und homogene Rotation im zentralen Bereich, nah an der Symmetrieachse der Messzelle, erreicht wird.
Existieren einige Fraktionen mit definierten Werten der Anisotropie der Polarisierbarkeit, so stellt sich das detektierte photometrische Signal als eine sinkende Funktion mit einigen Stufen, oder als eine kontinuierlich sinkende Funktion der kontinuierlichen Verteilung dar. Die typische Form des photometrischen Signals ist in 2a dargestellt. Die Berechnung der Signalzunahme in diskreten Punkten der Funktion der Anisotropie der Polarisierbarkeit versus Frequenz des Rotationsfeldes ermöglicht die Zellkonzentration in jeder Fraktion mit konstanten Polarisationswerten zu bestimmen und eine Verteilungsfunktion der Zellen nach ihren Polarisationswerten zu erstellen.
Bei der Anwendung der Bildverarbeitungsanalyse werden, um die Zellverteilungsfunktion, als eine Funktion der Polarisationswerte, zu gewinnen, nacheinander folgende Bilder analysiert (wie in 3 dargestellt), die bei den verschiedenen Rotationsfrequenzen des elektrischen Feldes aufgenommen wurden. Dabei hinterläßt jede rotierende Zelle nach der in der Reihe folgenden
Unterschiedsummierung von zwei folgenden Bildern ein Treck, der einem Ring für nicht verschobene Zellen (3b) oder einen Zylinder mit Abrundungen und zentraler, dunklerer Zone für bewegliche/verschobene Zellen (3c) darstellt. Dabei steht die Orientierungsrichtung des zylindrischen Trecks im Zusammenhang mit der Bewegungsrichtung der Zelle. Wird die Zellrotation geschwächt, verschwindet der Treck der Zelle, infolge dessen, dass die berechnete Differenz zwischen zwei Punkten in aufeinander folgenden Bildern, die in der Zeit t_i und t_i+1 registriert werden, sehr gering wird. Der Auswahl der Bildaufnahmefrequenz erfolgt unter der Voraussetzung, dass die Zeitdifferenz t_i+1 – t_i so gering sein soll, dass in dieser Zeitspanne auch bei der höchsten Rotationsfrequenz der Zellorientierungswinkel, beispielsweise den Wert 45°, nicht überschreiten darf.
Unabhängig von der Registrierungsmethode gewährleistet das Verfahren die Erfassung der Änderung von elektrophysikalischen Eigenschaften der Zellen einer Fraktion, wenn zwei rotierende Felder mit unterschiedlichen Richtungen erzeugt werden. Dabei werden solche Frequenzen des elektrischen Orientierungsfeldes ausgewählt, bei denen die Polarisationsunterschiede, die durch eine physikalisch-chemischen Testwirkung entstehen, am höchsten ausgeprägt sind. Zu Beginn der Messung wird eine Balance von zwei Feldern eingestellt, so dass die gegenseitig wirkenden Kräfte ausbilanziert sind und die Zellen sich in einem „gebremsten" Zustand befinden. Beginnt nach der Wirkung eines äußeren physikalisch-chemischen Faktors eine Zellfraktion zu rotieren, wird dies photometrisch registriert; somit erfolgt die Detektierung dieser labilen Zellfraktion.

Claims

Verfahren zur elektrooptischen Analyse von Zellsuspensionen, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Anlegen eines elektrischen Wechselfeldes, das auf die Zellen, die in der Suspension vorliegen, einwirkt, wodurch – eine räumliche (dreidimensionale) Polarisation der Zellstrukturen induziert wird; und – bei Interaktion der induzierten polarisierten Ladungen und dem elektrischen Feld die Orientierung der Zellen geändert wird; b) optische Registrierung der Orientierungsänderung der Zellen; c) Bestimmung der Komponenten des Tensors der Zellpolarisierbarkeit; d) Anlegen eines elektrischen Rotationsfeldes, welches eine Rotation des Vektors des elektrischen Feldes mit der Frequenz erzeugt, die eine Änderung der Orientierung der Zellen hervorruft, wobei die Feldrotationsfrequenz unabhängig von der Frequenz des orientierenden elektrischen Feldes ist; e) schrittweise Erhöhung der Frequenz des elektrischen Rotationsfeldes und/oder Senkung der Feldstärke, wobei für jede Stufe die Konzentration der Zellfraktionen mit definierten Polarisationswerten berechnet wird; f) Detektion der Zellfraktionen durch photometrische Messung der Abschwächung des Lichtstrahls bei der Änderung der Orientierung der Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrische Rotationsfeld a) mit Hilfe von Gitternetzelektroden endlicher Länge, die sich in den Seiten des Parallelepipeds befinden, erzeugt wird; und b) mittels periodischer Änderung der Feldstärke von jeder einzelnen Elektrode nach allgemein gültigen Gesetzmäßigkeiten, vorzugsweise nach linearen Gesetzmäßigkeiten, vom Maximum bis zum Nullminimum und sprungartiger Phaseänderung um 180° im Moment des Minimums generiert wird, wobei die Periode der Feldstärkeänderung die Rotationsfrequenz des Feldvektors bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Rotationsfrequenz des Vektors des elektrischen Feldes umgekehrt proportional der Zellvolumina und der Viskosität der Suspension ist.
Verfahren nach Anspruch 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrische Wechselfeld als Superposition von mindestens zwei elektrischen Feldern gebildet wird, die von zwei um 45° gegeneinander verschobenen Elektrodengruppen erzeugt werden, indem die Zellen zwei orientierenden Feldern mit verschiedenen Frequenzen und Feldstärken, aber mit gegenseitigen Rotationsrichtungen ausgesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die von zwei Elektrodengruppen gebildeten Felder wechselnd wirken, wobei die Periode des Feldwechsels größer ist als die Inertionszeit (Trägheit) des Stopps der Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass ein elektrisches Rotationsfeld erzeugt wird, indem an jede von vier Elektroden ein „sägeförmiger" Radioimpuls angelegt wird; wobei die Phase der Spannungen der Elektrodenpaare 1 und 3, 2 und 4 um 180° verschoben sind.
Verfahren nach Anspruch 1–6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Polarisierbarkeit von Zellfraktionen mit gleichen Polarisationswerten mittels Erfassung des Rotationsstops von Zellen erfolgt, welcher durch die Erhöhung der Rotationsfrequenz des elektrischen Feldes und/oder durch die Senkung der Feldstärke hervorgerufenen wird.
Verfahren nach Anspruch 1–7, dadurch gekennzeichnet, dass mit der Auswahl der Frequenz des Orientierungsfeldes charakteristische Bereiche der maximalen Unterschiede der Polarisierbarkeit der zu untersuchende Zellfraktion festgelegt werden, und mittels der Auswahl der Feldstärke ein Verharren der Zellen im Anfangsmoment erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1–8, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Rotationsfelder die gleiche Rotationsfrequenz haben, die jedoch unterschiedlich zur Frequenz des Polarisationsfeldes ist, wobei zu Beginn der Messung eine Balance von zwei Feldern eingestellt wird, so dass die gegenseitig wirkenden Kräfte ausbilanziert sind und die Zellen sich in einem „gebremsten" Zustand befinden.
Verfahren nach Anspruch 1–9, dadurch gekennzeichnet, dass nach einer selektiven Testwirkung (Behandlung) die Konzentrationsbestimmung der „geänderten" Zellen durch photometrische Registrierung der Rotation dieser Zellfraktion erfolgt.
Verfahren nach Ansprüchen 1–10, dadurch gekennzeichnet, dass die photometrische Erfassung der Zellorientierung durch eine synchrone Filtration des Messsignals (Photosignals) bei der Frequenz des Rotationsfeldes erfolgt, wobei solche Signalkomponenten heraus gefiltert werden, die nicht mit der Rotation der Zellen durch das Feld verbunden sind.
Verfahren nach Ansprüchen 1–11, dadurch gekennzeichnet, dass die Erfassung der resultierenden Wirkung des Feldes auf die Änderung der Zellenorientierung durch Analyse nacheinander (kontinuierlich) registrierter Bilder (Image) vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1–12, dadurch gekennzeichnet, dass das Erfassen der rotierenden Zellen erfolgt durch: – die in gleichmäßigen Zeitintervallen stattfindende Bildregistrierung; – Bestimmung der Unterschiede/Differenzen zwischen den nacheinander fixierten Bildern (Image); – Summieren dieser Differenzen; und – Analyse der Trecks (Bewegungsspuren) von rotierenden Zellen als Ringe oder Zylinder auf dunklem Hintergrund.
Verfahren nach Anspruch 1–13, dadurch gekennzeichnet, dass die fokale Ebene des Bildregistrierungssystems sich vertikal zur Suspensionsschichtdicke bewegt und die auf jeder Ebene aufgenommene Trecken (Bewegungsspuren) der rotierenden Zellen summiert werden.