DE2523209A1

DE2523209A1 - Elektrooptische, substanzschonende erfassung von nicht zellgebundenen immunostoffen

Info

Publication number: DE2523209A1
Application number: DE19752523209
Authority: DE
Inventors: Hans-Guenter Dr Med Noeller
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1975-05-26
Filing date: 1975-05-26
Publication date: 1976-12-16
Also published as: US4133873A

Description

Dr^_Hans_Crünter N_ö_l_l_e_r__A_Heidelterg_JL_Fasanenweg_8

Elektrooptische, substanzsehonende Erfassung von nicht ze11gebundenen Immunostoffen.

Praeambel

Die Antigen-Antikörper-Reaktion, eines der Grundprinzipien der Immunologie, wird heute in ständig zunehmendem Maße sowohl zur Erkennung als auch zur quantitativen Erfassung der verschiedensten organischen Stoffe eingesetzt, die mit vorliegenden oder durchgemachten Krankheiten einen direkten Zusammenhang haben.

I¹Ur viele dieser Antigen-Antikörpern-reaktionen wird eine möglichst sehr hohe Nachweisempfindlichkeit angestrebt.

Radio-Isοtopen-Verfahren

Der Radio-Immuno-Assay (RIA), bei dem der Verlauf einer Antigen-Antikörper-Reaktion auf dem Umwege über die Erfassung des Verhaltens radioaktiv markierter Reaktionsbestandteile erkennbar ist, gilt heute als eines der empfindlichsten Immunoverfahren.

Kit kritikloser Ehrfurcht verneigt sich ein großer Teil der Wissenschaftler vor dem angeblichen Non Plus Ultra des Radio-Immuno-Assay, obwohl die erheblichen Nachteile der RIA-Techniken nur zu bekannt sind.

Unter den Nachteilen der RIA-Verfahren seien hier nur einige kurz erwähnt:

1.) der erforderliche hohe und teure Meßaufwand,

2.) das Erfordernis der Auswertung durch speziell geschulte Kräfte,

3.) die von den Isotopen ausgehende energiereiche Strahlung, die eine strikte Befolgung vieler Richtlinien, insbesondere spezieller Schutzmaßnahmen und Abfallbeseitigungsvorschriften, erforderlich macht,

4.) die Abhängigkeit dar Verbraucher von bestimmten Lieferterminen der radioaktiv markierten Substan-

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5.) die isotopenhalbwertszeitbedingte, nur beschränkte Lagerfähigkeit der radioaktiv markierten Antigene "bzw. Antikörper, und der damit notwendigerweise verbundene hohe Preis dieser Substanzen,

etc., etc.

Eine einfache Überlegung mit überschläglicher Berech-

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nung zeigt am Beispiel des J, daß die radioaktive Markierung keine Idealmarkierung darstellt.

1 uC liefert 3,7 x 10 Zerfallsereignisse pro see. 1

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Da ^J eine Halbwertszeit von 2 Monaten oder ca

5 184 000 Sekunden (5,184 x 10 see) aufweist, sind 3,7 x 5,184 x 10¹⁰ Atome ¹²⁵J erforderlich, um ei Radioaktivität von 1 pC am ersten Tae;e zu ergeben.

1 ng eines Antikörpers (Γ-Globulin) durchschnittlicher Größe und somit eines Molekulargewichten um 160 enthält ca 10 Moleküle, also etwa die gleiche Anzahl von Molekülen, die - in Form von Atomen - in 1 uC

^J enthalten sind.

Diese Radioaktivität ( InC/Ing Antikörper) ist aus Strahlenschutzgründen praktisch kaum tolerabel, und trotzdem würde whärend einer Meßdauer von 5 Minuten nur etwa der 10 OOO-ste Teil aller radioaktiv markierten Antikörpermoleküle ein Zerfallsereignis zeigen. Abgesehen hiervon werden in der Regel - vorwiegend geometriebedingt - mit der üblichen Isotopenmeßtechnik maximal 10 % der Zerfallsereignisse vom Zählrohr erfasst !

kierungstectoik_möglichst_2edes_markierte_Molekül während_der_ Meßdauer_ zur_Signalabgabe_bewegt_werden kann_x_ist_also_erstrebenswert_.

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Elektronische Nicht-RIA-Verfahren.

Hü dem Ziele, dem Arzt ein auch für die Verwendung in einem Kleinen Krankenhaus und im Labor der kleinen ärztlichen Praxis geeignetes, hochverlässliches
Werkzeug zur immunologischen Untersuchung von Blut, Blutplasma oder von Blutserum in die Hand zu gehen, habe ich in der ersten Hälfte des Jahres 1973 teils in Raleigh, N.G., (USA), teils in Heidelberg, fünf
verschiedene elektronische und elektrooptisch^ Immunoverfahren entwickelt, die sämtlich die mit der Verwendung von radioaktiven Isotopen verbundenen Nachteile des RIA umgehen, und die primär zum Einsatz
für die Hepatitis-B=Erfassung und damit für die Auswahl von Blutspendern ohne Hepatitisrisiko geeignet sind.

Gegenstand der Erfindung

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist eines dieser Verfahren, dasjenige, bei dem ein mit fluoreszierender Substanz markiertes Antigen oder ein entsprechender Antikörper an der Immunoreaktion mit dem zu bestimmenden Blut- oder sonstigen Körperflüssigkeits-Anteil teilnimmt, und bei dem der Grad seiner Teilnahme an der Reaktion, und damit die Menge des im Blut- oder sonstigen Körperflüssigkeits-Anteil nachzuweisenden Immunostoffes mit höchster Empfindlichkeit und Meßpräzision auf elektrooptischen! Wege erfaßt wird.

Abgrenzung gegenüber bisher beschriebenen Techniken

(o 1.) Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Immunooo fluoreszenzverfahren ist der Gegenstand der Er- ° findung nicht auf die Erfassung zellgebundener
^" Immunostoffe beschränkt, sondern vorwiegend auf

oo in Flüssigkeiten frei bewegliche Immunostoffe

_o anwendbar.

2.) Im Gegensatz zum Bisherigen ist das Verfahren nicht auf die Markierung von Antikörpern beschränkt,
sondern kann mühelos ebenso auf Antigene ausgedehnt werden. COONS 1941 (1.) hat die Immunofluoreszenz unter dem Namen "Fluorescent Antibody

Technique" "begründet und eingeführt, und somit ausschließlich auf die Markierung von Antikörpern z-ur Erfassung von zellgebundenen Antigenen hingewiesen.

3.) Im Gegensatz zur "bisherigen "Fluorescent Antibody Technique" wird energiereiches Pulslicht statt Dauerstrichlichtes zur Fluoreszenzerzeugung angewandt und so eine lichtintensitätsbedingte und eine wärmeentwicklungsbedingte Fluoreszenzeinschränkung durch Über-, Sättigung, Bleichung und sonstige Schädigungen umgangen.

Zu den Grundlagen der Fluoreszenz.

Fluoreszenz ist die zeitlich begrenzte Aussendung monochromatischer Lichtenergie durch eine Substanz unter dem Einfluss der Einstrahlung ebenfalls monochromatischer - kurzwelligerer - Lichtenergie.

Da ein fluoreszierendes Molekül selbst unter optimalen Bedingungen nur einen Teil bis Bruchteil der aufgenommenen Lichtenergie in Form von Fluoreszenzenergie wieder abgibt, muß die zur Anregung verwandte Lichtmenge ganz beträchtlich sein, damit eine noch meßbare Menge von Fluoreszenzlicht emittiert werden kann.

Eine sehr strenge Filterung hat dafür zu sorgen, daß das zur Anregung verwandte Licht monochromatisch und frei von Resten von Licht der Emissionswellenlänge des fluoreszierenden Stoffes ist, und daß - weiteres Filter - ausschließlich emittiertes Fluoreszenzlicht vom Sample an den Sensor herantritt.

Zur Erzeugung der für die Fluoreszensanregung - auch in der mikroskopischen Technik - benötigten beträchtlichen Lichtenergie werden in der Regel Hochdruckquecksilberdampflampen herangezogen, aus deren breitem, sich vom Ultraviolett bis in den Infrarotbereich Min erstreckendem Frequenzspektrum dann schließlich das benötigte monochromatische Licht herausgefiltert wird.

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Die hohe Lichtenergie "bewirkt - wenn statt eines mikroskopischen ein makroskopisches Sample ausgewertet wirdim Verein mit der selbst nach Ausfilterung der direkten Infrarotstrahlung auftretenden fortgeleiteten Wärme zumeist schon nach wenigen Sekunden - wie "bereits oben erwähnt -

1.) eine in "Bleichung" resultierende Schädigung des fluoreszierenden Stoffes und

2.) eine irreversible Schädigung des mit der fluoreszierenden Substanz konjugierten Antikörpers bzw. Antigens.

Grundidee der Patentanmeldung.

Da die Fluoreszenz noch von Spuren fluoreszierender Stoffe mühelos elektroontisch nachgewiesen werden kann,

- noch 1O~ g einer derartigen Substanz lassen sich bequem und exakt erfassen,-, und

da weiter ein durch Licht angeregtes fluoreszierendes

-8 Molekül in der Regel binnen von 10 Sekunden die gespeicherte Energie in Form eines Fluoreszenzlichtquants wieder abgibt, also bei entsprechender Anregung

- theoretisch - nacheinander bis zu 100 000 000 Lichtquanten pro Sekunde abgeben kann,

läßt sich das Fluoreszenzprinzip zu einem der empfindlichsten Meßverfahren speziell .,für die Anwendung in der Immunologie ausbauen,

organischen_Verbindung - z.B. einer T-G-lobulinfraktion eintritt.

Eben diese Voraussetzungen, also die Verhinderung einer "Bleichung" der fluoreszierenden Substanz und der Schädigung dieser Substanz und der damit konjugierten Verbindung durch Hitzeeinwirkung etc.,wurden von mir geschaffen, sodaß nunmehr die theoretischen Möglichkeiten des Fluoreszenzprinzips erstmals zugunsten der Entwicklung eines Meßverfahrens mit bisher nicht erreichter

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Empfindlichkeit für die Immunologie voll ausgenutzt werden können.

Beim Gegenstand der Erfindung wurde das gesteckte Ziel vor allem durch Nutzbarmachung des Pulsverfahrens erreicht.

Ein Lichtblitz einer Dauer von beispielsweise IO see. (Pulslängen von 1O^--⁵ bis 1 χ 10 sec. sind ebenfalls noch geeignet ) von einer Blitzlichtröhre, die während ihrer Brenndauer eine ganz gewaltige Lichtenergie freimacht, wird zur ^Anregung der Fluoreszenz des Samples verwendet, und diese nach entsprechender Filterung von einem hochempfindlichen Pulssensor erfasst, elektronisch gespeichert und zur Anzeige gebracht.

Eine Blitzdauer in der gewählten Größenordnung ist trotz der hohen momentan freiwerdenden Lichtenergie viel zu kurz, um auf den fluoreszierenden Stoff eine "bleichende Wirkung" ausüben zu können; sie reicht weiter bei weitem nicht aus, um das Sample merklich zu erwärmen, oder es gar zu schädigen.

Vergleich der Pulsfluoroimmunotechnik mit der RIA-

technik.

Wenn es auch nur gelingt, von den ca 10 während der Bauer eines Blitzes bei optimaler Anregung durch ein einfach fluoreszent markiertes Antigen- oder Antikörper-Molekül ausgesandten und theoretisch nachweisbaren Lichtquanten ein einziges zu erfassen, dann liegt die Anzahl der pro Meßdauer registrierten Ereignisse bereits um ein Vielfaches höher, als diejenige, die sich beim RIA unter gleichstarker radioaktiver Markierung - 1 Tracer=Atom pro Molekül - während einer Meßdauer von 5 Minuten erfassen läßt.

Theoretisch können bei einfacher Markierung aller Moleküle von 1 ng Antikörper eines mittleren Molekulargewichtes von ca 160 000, also von ca 10 Molekülen,

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erfasst werden:

a.) "bei der RIA-Technik ca ICT Zerfalls-

(wenn mit ¹²⁵J markiert

wird, und die Meßdauer
5 Minuten "beträgt)

"b.) "bei der Puls-Fluoro-

15 Immuno-Assay-Technik ca 10 Lichtquanten

("bei einer Lichfblitzdauer von 10 see.)

Diese Ziffern legen einen Beweis für die Überlegenheit der Puls-Fluoro-Immuno-Assay-Technik (PPIA) ü"ber die RIA-Technik a"b. Technisch gelingt es, sowohl einzelne IsotopenhZierfallsereignisse als auch einzelne Lichtquanten zu erfassen.

Aufbau des Gerätes

Die Puls-Fluoro-Immurio-Assay-AOparatur (A"b"b. 1) besteht aus

a.) der BaugruOpe zur Erzeugung des monochromatischen Pulslichtes, zerfallend in

1.) eine Blitzlichtröhre mit dem^hierfür erforderlichen Subsystert&zur Erzeugung der von der Blitzlichtröhre "benötigten Spannungen,

2.) ein Interferrenzfilter zur Ausfilterung des Exzitationslichtes, 3

3.) ein Lichtspalt

"b.) der Me ß ζ ell dv

c.) der Baugruppe zur Erfassung und Auswertung

des vom Sample ausgehenden JFluoreszenzlichtes, zerfallend in

1.) ein Interferrenzfilter ,zur Selektion des Emissionslichtes, (6y

2.) einen Lichtspalt (7)

3.) einen hochempfindlichen Lichtsensor, einen Photomultiplier mit dessen Stromversorgungssystem,(Sy

4.) den elektronischen Konverter-Spei-"' '

eher mit seimem Stromversorgungs-609851/0876 system;g)und

5·) das Anzeige-Instrument "bzw.-Suhsyszeigt das StrahlengangWchema wnd das

Punktion

Der durch Knopfdruck ausgelöste und durch Filterung auf eine einheitliche Wellenlänge eingeengte Lichtblitz erzeugt in dem in der Meßzelle enthaltenen Sample je nach Maßgabe der Konzentration des zu bestimmenden Antigens ( bzw. Antikörpers) einen Fluoreszenzlichtblitz verschiedenhoher Intensität, -^ieses Fluoreszenzlicht wird 90° gegenüber der Blitzeinstrahlrichtung verdreht von der Meßzelle abgenommen, durch ein Interferrenzfilter von Licht anderer Wellenlänge getrennt und erreicht durch einen - weiteren - Spalt den Photomultiplier.

Der vom Photomultiplier unter dem Einfluss der einfallenden Lichtquanten des Fluoreszenzlichtpulses erzeugte Spannungspuls wird über einen Widerstand\J2) dem Eingang des Konverter-Speichers (Abb.2.) zugeführt und zwischen dem Gate eines in Source-Follower-Konstellation angeordneten ersten FeldeffekttrajnsistorsQJ) und einem Abgriff eines Spannungsteilers- eingespeist.

(B>

Das am Source-Widerstand"auftretende sekundäre Pulssignal wird über die Kollektor/Basis-Junetion eines als Gleichrichter mit-höchstohmigem Sperrweg fungierenden npn-Transistors einem Ladekondensator(u? zugeführt, der gleichzeitig mit dem Gate eines weiteren in Source—Follower-Konstellation arbeitenden Feldeffekttransistors QB) verbunden ist, und der vor dem Lichtblitz über einen Schalter ((D entladen bzw. aufgeladen werden kann. Das an dem Ladekondensator (I?) unter dem Einfluss des Fluoreszenzlichtblitzes auftretende Potential bleibt nach Erlöschen der Blitzlampe unbegrenzt lange erhalten, da es weder über die höchstohmige DioäeJJa) noch über das Gate des Feldeffekiitransistorsd^ abfliessen kann. Ein entsprechendes, jedoch erheblich belastbares Potential wird an der Source des Feldeffekttransistors (^aufgebaut und über das Meßinstrument Qj) analog angezeigt; es kann jedoch auch in digitaler Form dargestellt und zur Auswertung gebracht werden.

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Entweder Antigen oder Antikörper wird mittels bereits bekannter Technik (NAIRN (2.)) konjugiert. Ich verwandte zur Fluoreszenzmarkierung stets Fluoreszein-Iso-Thio-Cyanat, zumeist in Form des Isomer 1.

Weiter wird nicht markiertes Antigen bzw nicht markierter Antikörüer in üblicher Weise immobilisiert, in der Regel an Polysterene, an PolyoroOylene oder an Glas. Ich bediente mich für die Immobilisierung im Wesentlicher der von LING und OVERBY (3.) beschriebenen Technik.

Analog der beim RIA üblichen Technik kann das Fluoreszeinkonjugierte Antigen oder der Fluoreszein-konjugierte AntikörOer mit den übrigen Immunoreaktioiis-Stotffen. zusammengebracht werden, etwa zur Durchführung der bekannten

, Il 11 B

Coirmetitive-Binding-Technique oder der Sandwich-Technique.

Da bei den von mir durchgeführten Puls-Fluoro—Immuno-Assays ein Antigen oder Antikörper zumeist in immobilisierter Form vorlag, konnte ich in der Regel nach Ablauf der Reaktion direkt auswerten, ohne lange zentrifugieren oder mit Kohle etc. abtrennen zu müssen.

Bei der Auswertung habe ich nach Ablauf der Reaktion 1.) entweder die Konzentration des fluoreszierenden Antikörpers bzw. Antigens in der Flüssigkeit,

2.) oder den nun an der immobilisierten Substanz wandständig haftenden fluoreszierenden Immunokörtter durch Einbringung dieser Wand(bzw. eines Segmentes hiervon) in den Strahlengang,

3.) oder aber die Fluoreszens des unter der Reaktion an die Wand niedergeschlagenen, jedoch nach Waschen hiervon entfernten, also in Lösung gebrachten, fluoreszierenden Immunokörpers

mit dem obenbeschriebenen Gerät bestimmt.

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Anwendungsbeispiel

In größerem Stil habe ich das Verfahren parallel zum Hepatitis B -RIA nach der Sandwich-Technik eingesetzt. Es seien hier Ergebnisse ans der allerersten diesbezüglichen Versuchsreihe, noch vor der methodischen Verfeinerung, geschildert.

Für diese Untersuchungen wurden ebenfalls Polypropylenerchrchen, wie sie bei der Sandwich-Technik üblich sind, herangezogen. iJiese Röhrchen enthalten an ihrer Innenwand in immobilisierter Form nichtmarkierten Antikörper gegen HAA(HeOatitis-Associated-Antigen).

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Statt des radioaktiv mit J markierten HAA-Antikörpers benutzte ich mit Fluoreszein konjugierten HAA-Antikörper vom Kaninchen.

Beide besonderen Bestandteile sind heute bereits kommerziell erhältlich, brauchen also im Gegensatz zu früher nicht mehr mühsam bereitet werden.

Ich erhielt für diese Tests 10 menschliche Seren (Nr. 1 - 10), die mit der RIA-Technik ein einwandfrei negatives Ergebnis aufwiesen, und 10 Seren (Nr. 11 - 20^ die mit der RIA-Technik eben gerade ein -positives Ergebnis zeigten.

Ermittlungsprozedur

1.) 0,1 ml Serum der Proben 1-10 wurden je in ein Polypropylene -Röhrchen gegeben, dessen Innenwand in immobilisierter Form eine dosierte Menge HAA-Antikörper enthielt,

und 0,1 ml Serum der Proben 11 - 20 wurden in 10 weitere entsprechende Polypropylene-Röhrchen gefüllt

2.) Nach Verkorken wurden die Röhrchen 4 Stunden lang bei 37⁰O inkubiert„

3.) Alle Röhrchen wurden ausgeleert und zweimal hintereinander je mit 5 ml einer Pufferlösung A folgender Zusammensetzung

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0,72 g Tris
5,0 g NaCl
ad 600,0 ml H₃O

mit 2L HCl bzw. mit γττ NaOH auf pH = 7,4 eingestellt

10
ausgewaschen und wieder geleert.

4.) Einbringung von 0,1 ml fluoreszeinmarkierter HAA-Antikörperlösung B in alle 20 Röhrchen

(Bereitung der HAA-Antikörperlösung B : Die mit standardisierter Menge Fluoreszein-Iso-Thio-Cyanat,Isomer % nach der bei NAIRN (2.) angegebenen Methode konjugierte Ψ- Globulinfraktion eines Meerschweinchen=HAA-Antikörperserums mit hohem durch physiologische NaCl-Lösung genau eingestelltem Antikörpertiter wird mit Pufferlösung A auf 1:10 000 -verdünnt)

5.) Inkubierung der Röhrchen 1 - 20 für 90 Minuten bei 37⁰C.

6.) Zufügung von 3 ml Pufferlösung A zu den Röhrchen 1-20

7.) Einbringung der Röhrcheninhalte 1-20 nacheinander in die Meßküvette und Messung.

8.) Meßergebnisse

Röhrchen 1	7.7	V
2	7,9-	Y
3	7,95	Y
4	7,2	Y
VJl	3,4	Y
6	6,65	Y
7	7,3	Y
8	3,15	Y
9	7,9	Y
10	7,2	Y
Röhrchen 11	2,73	Y
12	2,92	Y
13	1,94	Y
14	1,87	Y
15	2,83	Y
16	1,98	Y
17	2,81	Y
18	2,84	Y
19	2,7	Y
20	2,52	Y

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Die Meßergebnisse zeigen, daß acht der zehn Röhrchen mit "negativen" Serumproben Werte zwischen 6,65 V und 7,95 V ergaben, und daß alle der"RIA-positiven" Seren Werte zwischen 1,87 Y und 2,92 V aufwiesen. Die Befunde der im RIA—Test noch unverdächtigen Proben Nr. 5 und Nr. 8 zeigten im Puls-Fluoro-Immuno-Assay-Verfahren bereits" Werte, die ( - auch bei wiederholt durchgeführter Kontrolle - ) erheblich den bereits RIA-positiven Ergebnissen der Serumproben Nr. 11 - Nr. 20 nahekamen, also offensichtlich mit der Ria-Technik noch nicht als verdächtig oder als positiv angesehen werden konnten.

Statt der Ermittlung der Fluoreszenzwerte in der Reaktionslösung wurden von mir in zahlreichen Untersuchung gen auch die Fluoreszenzwerte des unter dem Einfluss der Antigen-Antikörperreaktion wandständig gewordenen, markierten Antikörpers ermittelt (nach Auswaschung der Reaktionslösung, nach nachfolgender Ablösung des wandfixierten fluoreszeinhaltigen Antikörpers mit jj? FaOH und nach nachfolgender Neutralisierung mit γ*? NaCl). Bei diesen Untersuchungen ergab sich ein - nahezu sniegelbildliches - Fluoreszenzverhalten; die Fluoreszenz stieg parallel mit dem ermittelten Antigengehalt; doch die drei zusätzlichen Arbeitsgänge mit den hierdurch in die sonst einfache Arbeitstechnik möglicherweise eingebrachten Störfaktoren machen eine derartige Modifikation für die Praxis wenig sinnvoll.

Stand der Technik

Zum Stand der Technik verweise ich besonders auf die umfassenden Abhandlungen von JOHNSON und HOLBOROW (4.) und von PARKER (5.)» sowie von CHERRY (6.).

Soweit mir bekanntgeworden ist, hat die Immunofluoreszenz Technik auf Grund der oben umrissenen Schwierigkeiten ihren Routineeinsatz ausschließlich auf mikroskopischem Gebiet, und zwar zum Nachweis zellgebundener Antigene

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gefunden, und darüber hinaus nur zur Fluoreszenzmarkierung von Antikörpern gemäß der von COONS (l.) "bei der Einführung der"Fluorescent Antibody Technique" gegebenen Definition.

Γ. Π 9 'κ 5 i / 0 B /

Literatur

1.) Coons, A.H. , Creech, H.J. u. Jones, R.N.:

Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group.

Proc. Soc. Exp.Bio + Med. 47,200-202, 1941

2.) Nairn, R.C: Fluorescent Protein Tracing. 3 Edition 1969
Livingstone, Edinburgh + London

3.) Ling, C.M. + Overby, L.R.:

Prevalence of Hepatitis B Virus Antigen as Revealed by Direct RIA with -⁵J Antibody. The Journal of Immunology, 109,834,1972

4.) Johnson G-.D. + Holborow E.J.:

Immunofluorescence 18,1 - 18,20 in Weir, D.M.: Handbook of Experimental Immunology, 2 Edition, F.A.Davis Company, Philadelphia,PA.

5.) Parker, C.W.: Spectrofluorometric Methods 14,1 - 14,25 in

Weir, D.M.: Handbook of Experimental Immunology, 2 Edition, F.A. Davis Company, Philadelphia,PA.

6.) Cherry, W.B.: Fluorescent Antibody Techniques.

US Department of Health, Education and Welfare I960

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Claims

- 15 Patentansprüche.

Entwicklung zum Nachweis und zur quantitativen Erfassung von nicht zellgebundenen Antigenen oder Antikörpern mittels eines Fluoreszenzmarkierungsverfahrens, dadurch gekennzeichnet, daß Untersuchungstechniken und Lichtquellen herangezogen werden, die das Auftreten von Schädigungen der für die Untersuchungen benötigten fluoreszierenden Verbindungen, insbesondere deren Bleichung, und von Schädigungen des zu untersuchenden Materials und sonstiger Immunoreaktionspartner durch Licht-, durch Hitze- und durch andere Einwirkungen verhindern.
2.) Entwicklung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Pulslicht hoher Pulsenergie zur Pluoreszenzerzeugung herangezogen wird, etwa ein Lichtblitz oder eine Folge mehrerer Lichtblitze aus einer ElektronenOhotoblitzröhre.
3.) Entwicklung nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erfassung der Fluoreszenzenergie ein Photomultiplier oder ein anderer hochempfindlicher Lichtsensor verwandt wird, der es erlaubt, noch einzelne bis wenige Lichtquanten zu erfassen.
4.) Entwicklung nach Anspruch 1 - 3 , dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des unter dem Einfluß einer kurzzeitigen bew. gepulsten Beleuchtung, oder mehrerer nacheinander erfolgender Beleuchtungen, des Samples erzeugten ITuoreszenzlichtes einer Pulsnöhenspeichereinrichtung zugeführt wird.
5.) Entwicklung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die -^uIs speicherung auf analogem statt auf dem üblichen digitalen Wege erfolgt.

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6.) Entwicklung nach. Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur analogen Speicherung eine Einrichtung herangezogen wird, in der mit oder ohne vorausgehende Impedanzwandlung über eine in Sperrichtung höchstohmige Diode ein Kondensator unter dem Einfluß der Pulseinspeisung auf- oder ab-geladen und nachfolgend die durch die Einspeisung erzeugte Kondensatorladung auf praktisch belastungsfreiem Wege über einen, zweckmäßigerweise in Source-Folger-Konntella-tion betriebenen, Feldeffekttransistor abgefragt wird und an dessen Source oder Drain mit einem ordinären, leistungsverbrauchenden Meßinstrument zur ^Anzeige gebracht werden kann.
7.) Entwicklung nach Anspruch 1 - 6 , dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Lichtspektrum der Kurzzeitlichtquelle ein Lichtanteil oder mehrere in ihrer Wellenlänge verschiedene Lichtanteile herausgefiltert werden, und bei der dieser oder diese Lichtanteile zur Anregung der Fluoreszenz eines oder mehrerer verschiedener fluoreszierender Substanzen verwendet werden.
8.) Entwicklung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,daß die vom Sample unter dem Einfluß der Belichtung ausgehende Fluoreszenzstrahlung bzw -Strahlungen durch ein oder mehrere in ihrer Wellenlänge verschiedene monochromatische Filter ,gejuessen und somit die Menge des mit fluoreszierenden Substanzen markierten Stoffes ermittelt werden kann.
9.) Entwicklung nach Anspruch 1- - 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz einer in der Meßzelle befindlichen fluoreszierenden Lösung ermittelt werden kann.
10.) Entwicklung nach Anspruch 1-9» dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszens eines Trägerstreifens oder Trägerstabes ermittelt wird, der einer Antigen-Antikörperreaktion mit fluoreszierendem Antikörper oder mit fluoreszierendem Antigen ausgesetzt worden ist, nachdem an seiner Oberfläche nicht fluoreszierender Antikörper oder nicht fluoreszierendes Antigen immobilisiert fixiert worden war. R η Q 8 5 1 /0876
11.) Entwicklung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sich der Trägerstreifen oder Trägerstab in einer mit Flüssigkeit gefüllten Meßzelle befindet und im Falle des Trägerstreifens zwecks Erzeilung optimaler Ergebnisse möglichst diagonal zwischen Lienteinfalle- und i'luoreszensabfragrichtung orientiert ist.
12.) Entwicklung anch Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerstreifen bzw. Trägerstab in trocknem Zustand zur Messung herangezogen wird und selbst als Meßzelle dient.
13.) Entwicklung nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz eines ursprünglich an der Wand eines Reaktionsgefäßes oder an poröses Glas, an Zellulose oder an andere Materie adsorbierten Produktes einer Antigen-Antikörperreaktion nach Mobilisierung -und nach eventueller Zerstörung der nicht von der Markierung herrührenden Eigenfluoreszenz von an der Reaktion teilhabenden oder jedenfalls anwesenden Substanzen - und nach Einbringung dieses mobilisierten und gelösten Reaktionsproduktes in die Meßzelle bestimmt wird.
14.) Entwicklung nach Anspruck 10, dadurch gekennzeichnet, daß nach Ablauf der Immunoreaktion in einem mit immobilisiertem Antigen oder Antikörper versehenen Reaktionsgefäß die Fluoreszenz der darin befindlich gewesenen Lösung - eventuell nach Zerstörung der Eigenfluoreszenz bestimmt und somit der Anteil des durch die Reaktion nicht gebundenen fluoreszenzmarkierten Antigens bzw. Antikörpers ermittelt wird.
15.) Entwi<JO_ung nach Anspruch 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt eines Antigens in einer Lösung bestimmt wird, indem dieses Antigen mit einer geeigneten Menge fluoreszierend markierten Antigens und mit nichtmarkiertem - möglichst immobilisiertem - Antikörper in geeigneter Reihenfolge zusammengebracht wird, und indem nachfolgend eine Fluoreszenzmessung - eventuell nach Zerstörung der Eigenfluoreszenz von an der Reaktion beteiligten, nicht zur Markierung verwandten Stoffen entweder im antigenfreien oder im antikörverhalt;gen cnQflRi /Q876

Teil des Reaktionssystems durchgeführt wird.
16.) Entwicklung nach Anspruch 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt eines Antikörpers in einer Lösung "bestimmt wird, indem dieser Antikörüer mit einer geeigneten Menge fluoreszierenden Antikörpers und mit nichtmarkiertem möglichst immobilisiertem - Antigen in geeigneter Reihenfolge zusammengebracht wird, und indem nachfolgend eine ITuoreszenzmessung - eventuell nach Zerstörung der Eigenfluoreszenz von "bei der Reaktion anwesenden, nicht zur Markierung verwendeten Stoffen - entweder im nun Antigen-freien oder im Antigen-haltigen Teil des Reakti- ... ons-systems durchgeführt wird.
17.) Entwicklung nach Anspruch 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt eines Antigens in einer Lösung "bestimmt wird, indem die Lösung bei geeigneter Temperatur mit

- möglichst immobilisiertem - Antikörper und hernach mit fluoreszenzmarkiertem Antikörper zusammengebracht wird, und indem nachfolgend eine Fluoreszenzmessung

- eventuell nach Zerstörung der Eigenfluoreszenz von bei der Reaktion anwesenden, nicht zur Markierung verwendeten Stoffen - durchgeführt wird, entweder in der Lösung, die den immobilisierten Antikörper benetzt hatte, oder aber in dem immobilisierten Antikörper direkt oder im wieder mobilisierten, in Lösung gebrachten Antikörper.
18.) Entwicklung nach Anspruch 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt eines Antikörpers in einer Lösung bestimmt wird, indem die Lösung bei geeigneter Temperatur mit

- möglichst immobilisiertem - -Antigen und hernach mit fluoreszenzmarkiertem Antigen zusammengebracht wird, und indem nachfolgend eine Pluoreszenzmessung - eventuell nach Zerstörung der Eigenfluoreszenz von "bei der Reaktion anwesenden, nicht zur Markierung verwendeten Stoffen durchgeführt wird, entweder in der Lösung, die das immobilisierte Antigen benetzt hatte, oder aber in dem Antigen direkt oder im wieder mobilisierten, in Lösung zurückgeführten Antigen.

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19.) Entwicklung nach Anspruch 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ermittlung von Antigen-Antikörperreaktionen die "Doppelte oder Präzipitierende AntikcrOertechnik" genutzt und zur Fluoreszenztechnik modifiziert angewandt wird zwecks Präzipitation des primären Antigen-Antikörperkomplexes und somit zwecks Trennung des gebundenen

^H*/ Haptens^vom ungebundenen, resultierend in einer Auswerttechnik unter Umgehung der Immobilisierung von Immunostoffen.
20.) Entwicklung nach Ansnruch 1-6 und 9 - 19, dadurch gekennzeichnet, daß - wie in Anspruch 7-8 erwähnt statt eines Antigens oder Antikörpers mehrere von diesen gleichzeitig ermittelt werden.

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