DE2401620A1

DE2401620A1 - Verfahren zur spektrophotometrischen erfassung von zonengrenzen, welche bei der isotachophoretischen trennung erhalten werden

Info

Publication number: DE2401620A1
Application number: DE2401620A
Authority: DE
Inventors: Tord Lennart Arlinger
Original assignee: LKB Produkter AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1973-01-15
Filing date: 1974-01-14
Publication date: 1974-07-25
Also published as: JPS49105598A; GB1459320A; DE2401620B2; DE2401620C3; SE369279B; FR2214126A1; US3912609A; FR2214126B1

Description

A 6437

LKB-Produkter AB
S-161 25 Bromma 1 / SCHWEDEN

Verfahren zur spektrophotometrischen Erfassung von Zonengrenzen, welche bei der isotachophoretischen Trennung erhalten werden

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spektrophotometrischen Erfassung innerhalb eines Wellenlängenintervalles von Zonengrenzen, welche bei der isotachophoretischen Trennung erhalten werden.

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N/G

Bei der Isotachophorese wird eine Trennung einer ionisierten Probe, welche Ionen einer bestimmten Polarität enthält, durchgeführt, indem man die Probe in eine Säule einbringt, die zwischen zwei Elektroden angeordnet ist. Des weiteren befindet sich in der Säule ein Leitelektrolyt, der in den Teil der Säule eingebracht ist, der zwischen der Probe und der Elektrode vorhanden ist, gegen die die Ionen wandern, wenn an die Elektroden eine Spannung angelegt wird. Dieser Leitelektrolyt enthält Ionen von der gleichen Polarität, jedoch mit einer höheren Beweglichkeit als die Probenionen. Des weiteren befindet sich in der Säule ein Endelektrolyt, der in den Teil der Säule eingebracht ist, der zwischen der Probe und der anderen Elektrode liegt. Dieser Endelektrolyt enthält Ionen von der gleichen Polarität, jedoch mit einer geringeren Beweglichkeit als die der Probenionen. Über die gesamte Säule hin ist eine Ionenart eingebracht, weiche eine entgegengesetzte Polarität aufweist. Diese Ionen werden als sogenannte Gegenionen bezeichnet. Das geeignete Gegenion hat puffernde Eigenschaften. Die Isotachophorese ist im einzelnen in Analytica Chemica Acta 38 (1967), Seiten 233-237 unter dem Titel "Displacement Electrophoresis" beschrieben. Außerdem ist die Isotachophorese aus dem schwedischen Patent 340 376 bekannt.

Bei der isotachophoretischen Trennung von Ionen werden zwischen den Zonen, welche von den Ionen gebildet werden, scharfe Grenzen erhalten. Bei der Durchführung einer isotachophoretischen Trennung können verschiedene Arten von Detektoren an der Säule angeordnet werden, um die erhaltenen Zonengrenzen zu erfassen. Hierbei wird durch diese Erfassung ein Erfordernis erfüllt, nämlich daß, nachdem sich scharfe Zonengrenzen zwischen allen Probenzonen eingestellt haben, die Beendigung des Trennvorganges angezeigt wird. Ein andex-es Erfordernis, das an eine derartige Erfassung gestellt werden kann, besteht darin, einen

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Gegenfluß, der in verschiedenen Fällen verwendet wird, so zu steuern, daß die Zonengrenze zwischen dem Leitelektrolyten und der Probenmischung in der Säule stationär gehalten wird, wie das im vorstehend erwähnten schwedischen Patent 340 376 beschrieben ist.

Die Erfassungsmethoden, welche in der Praxis zur Anwendung kommen, sind prinzipiell thermische Erfassungsverfahren, welche darauf gegründet sind, daß die Wärmeentwicklung in den verschiedenen Zonen unterschiedlich ist und daß die Wärmeentwicklung in Richtung vom Leitelektrolyt zum Endelektrolyt hin anwächst. Eine weitere Untersuchungsmethode besteht in der spektrophotometrischen Erfassung der verschiedenen Zonen. Letzteres Verfahren sieht eine raschere Messung als das erste Verfahren vor, das notwendigerweise bei der Ausführung eine Zeit von etwa 5 Sekunden beansprucht. Darüber hinaus ermöglicht die spektrophotometrische Erfassung eine bedeutend größere Auflösung als die thermische Erfassung in einem solchen Grad, daß die Genauigkeit um das 50- bis 100-fache größer ist. Vorbedingung bei der spektrophotometrischen Erfassung ist jedoch, daß die verschiedenen getrennten Ionenarten ein Absorptionsvermögen aufweisen. Die Anzahl von Substanzen, welche jedoch innerhalb des sichtbaren Spektrums ein Absorptionsvermögen aufweisen, ist sehr klein. Demgegenüber gibt es jedoch eine große Anzahl von Substanzen, welche innerhalb des UV-Bereiches ein Absorptionsvermögen aufweisen. Daher ist die spektrophotometrische Erfassung innerhalb des UV-Bereiches im allgemeinen bevorzugter verwendbar. Auf vielen chemischen Gebieten, beispielsweise in der Biochemie ist es folglich von Vorteil, mit UV-Erfassung zu arbeiten. Häufig ist es jedoch erwünscht, Substanzen isotachophoretisch zu trennen, welche jedoch keine UV-Absorbenten sind. Gewöhnlich werden derartige isotachophoretische Trennverfahren abwechselnd mit Trennungen von UV-absorbierenden Substanzen durchgeführt. Es

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kann jedoch auch vorkommen, daß eine Anzahl von Substanzen, von denen lediglich ein paar UV-absorbierend sind, durch Isotachophorese getrennt werden müssen. Die vorstehenden Verfahren erlauben dann eine spektrophotometrische Erfassung in derartigen Fällen nicht.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur spektrophotometrischen Erfassung von Zonen von Substanzen zu zeigen, welche kein Absorptionsvermögen aufweisen, so daß man die raschere Durchführung des Meßverfahrens und ein größeres Auflösungsvermögen mit Hilfe der spektrophotometrischen Erfassung im Vergleich zur thermischen Erfassung erhält.

Diese Aufgabe wird bei dem Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Gegenion so gewählt wird, daß sein molares Absorptionsvermögen bei sauren und basischen Bedingungen innerhalb des Wellenlängenbereiches sich unterscheidet.

Vorteilhaft ist es bei der Erfindung, daß auch eine UV-Erfassung bei Substanzen, die nicht UV-absorbierend sind, durchgeführt werden kann und daß somit hierbei ein rascheres Messen und ein größeres Auflösungsvermögen, das bei der UV-Erfassung ermöglicht ist, im Vergleich zur thermischen Erfassung gewährleistet wird.

Anhand der beiliegenden Zeichnungen soll an bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung die Erfindung noch näher erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1 schematisch eine Säule zur isotachophoretischen Trennung; Fig. 2 die gleiche Säule nach erhaltenem Gleichgewicht;

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Fig. 3 schematisch die elektrische Feldstärke E entlang der Säule;

Fig. 4 die Konzentration der verschiedenen Anionen bei Gleichgewicht;

Fig. 5 die Konzentration des Gegenions R⁺ entlang der Säule; Fig. 6 schematisch den pH-Verlauf entlang der Säule und

Fig. 7-9 Beispiele von Detektorkurven bei isotachophoretischen Trennverfahren.

Ih den Fig. 1 und 2 ist eine Säule 1 dargestellt, in welche eine Anode 2 und eine Kathode 3 eingeführt sind. In der Fig. 1 ist die zu trennende Probe in den Teil der Säule eingebracht, der durch S bezeichnet ist. Die Probe enthält Salze, welche drei verschiedene Anionen C₁"", C«~ und C₃" enthalten. Es sei angenommen, daß C-" eine größere Beweglichkeit aufweist als C₂", welches hinwiederum eine größere Beweglichkeit als C ~ haben soll. Der Teil der Säule, welcher mit L bezeichnet ist, ist mit dem eingangs schon erwähnten Leitelektrolyten angefüllt. Dieser besteht aus Anionen A~, welche eine größere Beweglichkeit aufweisen als alle Anionen in der Probe. Der Teil der Säule, der der Kathode am nächsten ist und mit T bezeichnet ist, ist mit einem Elektrolyten angefüllt, der ein Anion B^- aufweist, dessen Beweglichkeit geringer ist als die aller Anionen in der Probe. Über die gesamte Säule hin ist eine Kationenart ausgebreitet, welche allen Anionen gemeinsam ist und welche als Gegenion R⁺ bezeichnet wird. Dieses Gegenion hat in geeigneter Weise puffernde Eigenschaften. Wenn eine Gleichspannung an die Elektroden 2 und 3 gelegt wird, wandern die Anionen in Richtung auf die Anode 2. Aufgrund der unterschiedlichen

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Beweglichkeiten der Anionen wächst die elektrische Feldstärke über die Zonen L, S und T schrittweise an. Hierdurch wird bewirkt, daß die Anionen, welche in der Zone S vorhanden sind, aufgrund ihrer Beweglichkeiten getrennt werden, so daß die Ionen CL", welche eine größere Beweglichkeit aufweisen, eine Zone, welche dem Leitelektrolyten am nächsten liegt, bilden. Auf diese Zone folgt eine Zone, welche aus C~ besteht und schließlich folgt darauf eine Zone, welche aus C₃" besteht. Die letzte Zone liegt dem Endelektrolyten, wie es in der Fig. 2 dargestellt ist, am nächsten. Entlang dieser Zonen wächst die elektrische Feldstärke schrittweise an. Dies ist in der Fig. 3 dargestellt. Die so gebildeten Zonen sind sehr stabil und scharf voneinander abgegrenzt. Dies resultiert daraus, daß bei dem Versuch eines

zu diffundieren, Anions, von einer Zone in eine vorhergehende Zone^ wo eine geringere elektrische Feldstärke herrscht, dieses Anion eine geringere Wanderungsgeschwindigkeit dann aufweist. Es wird deshalb wiederum von seiner ursprünglichen Zone aufgefangen. Wenn in der gleichen Weise ein Anion versucht, in eine nachfolgende Zone zu diffundieren, wird dieses in seine ursprüngliche Zone zurückgebracht aufgrund der höheren elektrischen Feldstärke, welche in der nachfolgenden Zone herrscht. Auf diese Weise wird eine sehr gute selbststabilisierende Wirkung der Zonengrenzschichten erzielt.

Die Bedingungen an einer Zonengrenze zwischen zwei Salzlösungen, die gemeinsam ein Ion aufweisen und einem elektrischen Feld unterworfen sind, ist durch eine Beziehung von Kolrausch (Ann. Phys. Leipzig 62, 209 (1897)) wiedergegeben:

^CA ⁰A · <^ÜB^+UR> ·

^CB <^ÜA ^{+ U}R> ^UB ^LA

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2
U = Beweglichkeit (cm /Volt, sec)

wobei C = Konzentration,

U = Beweglichkeit

L = elektrische Ladung,

wobei die Indizes A, B und R den Ionen A , B~ und R⁺ entsprechend zugeordnet sind.

Gemäß dieser Beziehung besteht zwischen den verschiedenen Anionen an verschiedenen Zonengrenzen eine Konzentrationsstufe. Dies ist in der Fig. 4 wiedergegeben. Das Gegenion ist in geeigneter Weise so beschaffen, daß es puffernde Wirkungen aufweist. Wenn dies der Fall ist, so zeigt die Gesamtkonzentration der Gegenionen beträchtlich geringereStufen an den verschiedenen Zonengrenzen, wie das aus der Fig. 5 hervorgeht. Wie sich der pH-Wert an den verschiedenen Zonengrenzen ändert, ist beispielsweise aus der Fig. 6 ersichtlich.

Gemäß der Erfindung wird ein Gegenion R⁺ verwendet, das puffernde Eigenschaften aufweist. Das Gegenion wird so gewählt, daß seine molaren Absorptionsvermögen bei sauren und basischen Bedingungen bei einer Wellenlänge sich unterscheiden, die zur Messung geeignet ist. Der pH-Verlauf, welcher in der Fig. 6 gezeigt ist, ruft dann einen Absorptionsvermögens-Verlauf entlang der Säule hervor.

In derFig. 7 ist die Trennung von fünf Anionen mittels Isotachophorese dargestellt. Die Fig. 7a zeigt eine Trennung gemäß dem Stand der Technik, während die Fig. Tb das Ergebnis der Trennung gemäß der Erfindung zeigt. Jede der Fig. 7a und 7b zeigt von oben nach unten Detektorauf zeichnungen von einem thermischen Detektor, einem differenziellen thermischen Detektor und einem spektrophotometrischen Detektor, lh den verschiedenen Kurven sind bestimmte Bereiche ersichtlich, welche zu jeweils einem bestimmten Ion gehören. Jeder

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dieser Bereiche ist mit einer Zahl, welche dem Ion entspricht, bezeichnet. Im Ausführungsbeispiel der Fig. 7 ist der Leitelektrolyt mit 1 bezeichnet; dieser ist 0, 01M Cl". Der Endelektrolyt bzw. das Endion ist mit 7 bezeichnet; dieses ist Kapronat. Fünf Ionen sind getrennt worden, 2 = ClO₃", 3 = Oxalat, 4 = Tartrat, 5 = Zitrat, 6 = Azetat. In der Fig. 7a ist das Gegenion 0, 0465M β -Alanin, während in der Fig. 7b das Gegenion 0, 012M Kreatinin ist. Die Leitelektrolyten haben in beiden Fällen einen pH-Wert von 4,1. Die spektrophotometrische Erfassung wurde bei 254 nm durchgeführt. Es zeigt sich, daß bei spektrophotometrischen Erfassung im ersten Fall immer kein Ausgangssignal erhalten wird. Wenn Kreatinin als Gegenion im zweiten Fall der spektrophotometrischen Erfassung verwendet worden ist, ergibt sich ein sehr gutes Bild. Es ist ersichtlich, daß die Auflösung der spektrophotometrischen Kurve in der Fig. 7b eine größere Auflösung ist als die thermischen Kurven der gleichen Figur. Die Spitze in der Fig. 7a zwischen den Probenkomponenten 5 und 6 entspricht einer Verunreinigung in der Probe.

Ein anderes Trennverfahren ist in einem Ausführungsbeispiel in der Fig. 8 dargestellt. Die Figur zeigt von oben nach unten eine Kurve, welche von einem spektrophotometrischen Detektor bei 254 nm erhalten worden ist sowie eine Kurve, welche man mit einem thermischen Detektor gewonnen hat. Das System, welches im Beispiel der Fig. 8 zu trennen war, hatte einen Leitelektrolyten 0, 01M (CHj.NCl in Methanol, gesättigt mit SuIfanilsäure und der auf pH 4,4 (wie es mittels

einer gewöhnlichen, wasserenthaltenden Kalomel-KCl-Elektrode aneingestellt war.

gezeigt wurde) durch (CHg)₄NOHx Der Endelektrolyt ist 0,2M Zinkazetat in Methanol und als Gegenion wird SuIfanilsäure verwendet. Die Bezeichnung in der Figur bedeuten: 1 = (CHg)₄N⁺, 2 = NH₄ ⁺. 3 = K⁺, 4 =Na⁺, 5 = Ba²⁺, 6 = Li⁺, 7 = Mg²⁺, 8 = Ca²⁺, 9 = Zn²⁺.

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Die Konzentration des Na⁺ beträgt 0, 0015M und die der anderen Probenionen 0,03M.

Das in der Fig. 9 dargestellte Beispiel betrifft die Trennung der gleichen Ionen wie im Beispiel der Fig. 8 in einem Methanolsystem. Im Beispiel der Fig. 9 ist der Leitelektrolyt 0, 0089M NaCl + 0, 007M NaOCOCH₃ in Methanol, gesättigt mit Sulfanilsäure und mit einem pH von 5, 0 (wie er gemessen wurde mit einer gewöhnlichen, wasserhaltigen Kalomel-KCl-Elektrode). Der Endelektrolyt und das Gegenion waren die gleichen wie im Beispiel der Fig. 8. Die spektrophotometrische Ablesung wurde bei 254 nm durchgeführt.

Die Figuren zeigen, daß bei der spektrophotometrischen Erfassung, welche gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht wird, die Auflösung bedeutend höher ist als bei der thermischen Erfassung.

Demgemäß zeigt Fig. 7 eine isotachophoretische Trennung in einem Wassersystem, während die Fig. 8 und 9 Trennungen in Methanolsystemen zeigen.

Das Beispiel der Fig. 7 zeigt außerdem die Trennung und Erfassung von Anionen gemäß der Erfindung, während die Fig. 8 und 9 Trennungen und die Erfassung gemäß der Erfindung von Kationen zeigen.

Durch die Auswahl des Gegenions, das puffernde Eigenschaften aufweist, ist es möglich, Zonen von Probenkomponenten zu erfassen, die als solche kein Absorptionsvermögen aufweisen.

Insbesondere kann man ein derartiges Gegenion wählen, das unterschiedliche molare Absorptionsvermögen bei sauren und basischen

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Bedingungen bei einigen Wellenlängen innerhalb des UV-Bereiches aufweisen. Demgemäß wird die spektrophotometrische Erfassung innerhalb des UV-Bereiches von Substanzen ermöglicht, die nicht UV-absorbierend sind. Wie schon erwähnt, kann das Verfahren gemäß der Erfindung auch zur spektrophotometrischen Erfassung von Probenzonen verwendet werden, bei denen nur einige ein Absorptionsvermögen zeigen. Des weiteren kann die Erfindung vorteilhaft bei der Erfassung von Probenzonen nach der isotachophoretischen Trennung von einer Probenmischung verwendet werden, wo jede Probenkoniponente bei einigen Wellenlängen eine Absorption zeigt, wobei jedoch die spektrophotometrische Erfassung gemäß der Erfindung mit noch einer anderen geeigneten ausgewählten Wellenlänge ein bedeutend klareres Ergebnis sich erzielen läßt.

Der Unterschied im molaren Absorptionsvermögen beim Gegenion bei sauren und basischen Bedingungen kann natürlich mittels des Spektrophotometers, das bei der Messung verwendet wird, aufgezeichnet werden. Der geringste Unterschied im Absorptionsvermögen, welcher bisher bei den bekannten Instrumenten aufgezeichnet werden kann, beträgt etwa 10~ - 10" Einheiten. Messungen von geringeren Unterschieden im Absorptionsvermögen durch noch genauere Instrumente sind natürlich denkbar.

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Claims

Patentansprüche

I.) Verfahren zur spektrophotometrischen Erfassung innerhalb eines Wellenlängenbereiches von Zonengrenzen, welche bei der isotachophoretischen Trennung erhalten werden, dadurch gekennzeichnet, daß das Gegenion so ausgewählt wird, daß seine molaren Absorptionsvermögen bei sauren und basischen Bedingungen innerhalb dieses Wellenlängenbereiches sich unterscheiden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wellenlängenbereich im UV-Bereich liegt.

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