DE4315928C1 - Verfahren zur Steuerung der Kapillarelektrophorese und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steuerung der Kapillarelektrophorese, eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens und die Verwendung einer Kapillarelektrophorese-Vorrichtung.

Bei der Kapillarzoneelektrophorese (CZE) handelt es sich um ein Analyseverfahren, bei dem geladene Moleküle im elektrischen Feld aufgrund unterschiedlicher Ionenbeweglichkeit getrennt werden. Während des Trennvorganges kommt es zur Ausbildung des elektro­ endosmotischen Flusses (EOF), der zu einem zusätzlichen Transport der Probenzonen führt und für gegebene Randbedingungen eine Konstante darstellt. In vielen Fällen hängt der EOF unmittelbar mit der Ionenbeweglichkeit zusammen.

Da der EOF die Trennzeit der CZE mitbestimmt, beeinflußt der EOF auch die Auflösung der CZE. Daher ist es für nicht vollständig ablaufende Trennungen wünschenswert, den EOF zu verlangsamen oder ganz auszuschalten (maximale Auflösung), um so die Trennleistung der CZE zu verbessern. Andererseits ist eine Erhöhung der Fließgeschwindigkeit bei einfachen Trennungen erwünscht, um zu einer Verkürzung der Analysenzeit und dadurch zu einer Verringerung der Kosten zu gelangen. Grundsätzlich besteht daher ein Bedürfnis nach einer effektiven EOF-Kontrolle.

Bisher sind zwei unterschiedliche Vorgehensweisen zur EOF- Kontrolle bekannt. Einerseits besteht die Möglichkeit, den EOF durch die Wahl der Zusammensetzung des zur Trennung eingesetzten Puffersystems statisch einzustellen. Dies geschieht beispielsweise durch die Verwendung von Kapillarwandbelegungsreagentien bzw. die Änderung des Deprotonierungsgrades oder des Cetapotentials, wie von S. Terabe, et al in Anl. Chem. 56 (111) 1984; X. Huang, et al in Anl. Chem. 61, 766, (1988) oder H. Sauer und H. McManigill in Anl. Chem. 58, 166-170 (1986) beschrieben. Andererseits kann der EOF, insbesondere für niedrige pH-Werte, durch den Einsatz eines elektrischen Querfeldes beeinflußt werden, wie von B. Patel, et al in Anl. Chem. 63, 1519-1523 (1991); A. G. Ewing und A. M. Hayes in Anl. Chem. 64, 512-516 (1992) oder A. G. Ewing, et al in Anl. Chem. 65, 27-31 (1993) beschrieben.

Bei den auf die Zusammensetzung des Puffersystems zurückgreifenden Verfahren zur EOF-Kontrolle muß berücksichtigt werden, daß diese Methoden zu einer statischen Fließgeschwindigkeit führen, die im Verlauf der CZE nicht verändert werden kann. Zur Optimierung einer Analyse sind daher mehrere Durchläufe mit veränderten Randbedingungen durchzuführen. Dabei ist zu beachten, daß die Umrüstung der Analysenapparatur von einer Konfiguration auf eine andere in der Regel erhebliche Zeit beansprucht, da beispielsweise bei dynamischen Wandbelegungen lange Gleichgewichteinstellungszeiten auftreten, die in Kauf genommen werden müssen, um reproduzierbare Resultate zu erhalten, oder da im Fall von statischen Wandbelegungen bei jeder Systemumstellung ein Kapillarwechsel erfolgen muß. Zudem ist der pH-Wert durch die Stabilität der chemischen Modifizierung nach oben und unten begrenzt. Daher bieten diese Verfahren keine Möglichkeit einer wirklich effektiven EOF-Kontrolle, die dem Bedarf gerecht wird.

Zwar ermöglicht der Einsatz eines Querfeldes senkrecht zur Kapillare eine Kontrolle des EOF für saure Elektrolyten in einem weiten Bereich. Jedoch wird die überwiegende Zahl der Messungen bei deutlich höheren pH-Werten durchgeführt (z. B. Trennung von Phenolen), so daß trotz der prinzipiellen Brauchbarkeit dieser Vorgehensweise, weiterhin Bedarf für eine allgemein einsetzbare und effektive EOF-Kontrolle besteht.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Steuerung der Kapillarelektrophorese anzugeben, mit dem eine effektive Kontrolle des elektroendosmotischen Flusses (EOF) durchgeführt werden kann, und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zu schaffen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 bzw. eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 4. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sowie der Vorrichtung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die effektive EOF-Kontrolle gemäß der Erfindung wird durch das Anlegen einer Druckdifferenz an die Enden der Kapillare während der Kapillarelektrophorese erzielt. Die angelegte Druckdifferenz übt eine Kraft auf den Elektrolyten aus, die den EOF unterstützt oder ihm entgegenwirkt. Diese Kraft kann in weiten Bereichen und auch deutlich höher als die durch das elektrische Feld erzeugte Kraft gewählt werden, die während der CZE auf die zu trennenden Komponenten der Probe einwirkt. Die EOF-Druckkontrolle gemäß der Erfindung ist somit zum Beschleunigen, Verlangsamen, Ausschalten und zur Umkehr des EOF einsetzbar.

Mit einer CZE, bei der der EOF erfindungsgemäß durch Anlegen einer Druckdifferenz über der Kapillare kontrolliert wird, erreicht man eine erhöhte Auflösung und eine schnellere Trennung. Da Drücke in kurzer Zeit reproduzierbar erzeugt und verändert werden können, sind nicht nur Variationen im Verlauf der CZE durchführbar, sondern es ist dabei eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit gewährleistet. Das erfindungsgemäße Verfahren unterstützt in besonderem Maße CZE-Optimierungsvorgänge, da die Auswirkung einer Druckveränderung im voraus sicher abgeschätzt werden kann.

Gegenüber den bisher bekannten Verfahren werden zahlreiche Vorteile erlangt. So fallen praktisch keine Umrüstzeiten an, die insbesondere bei wandbelegten Kapillaren in Kauf genommen werden mußten. Es können einheitlichere Puffer verwendet werden, da die Feinanpassung über die erfindungsgemäße EOF- Kontrolle durch Druck erfolgen kann. Praktisch kann auf Wandbelegungen ganz verzichtet werden und die CZE mit einfachen Kapillaren durchgeführt werden. Es existiert kein pH-Stabilitätsproblem wie bei der chemischen Modifizierung der Kapillarwand und keine Begrenzung des pH-Wertes wie bei permanent belegten Kapillaren oder bei der EOF Kontrolle durch ein Querfeld. Ein sehr wesentlicher Vorteil ist darin zu sehen, daß durch die erzielte Reproduzierbarkeit die CZE in die Standardanalysen einzureihen ist und der Aufnahme der CZE in die Klasse der DIN-Analysen nun nichts mehr im Wege steht.

Die EOF-Kontrolle gemäß der Erfindung unterscheidet sich vom aus EP-A-0 395 796 oder EP-A-0 475 533 bekannten Vorgehen dadurch, daß erfindungsgemäß die Druckdifferenz über der Kapillare während der Kapillarelektrophorese aufrecht erhalten wird. Die Druckdifferenz über der Kapillare ist erfindungsgemäß sowohl hinsichtlich der Größe als auch der Richtung frei wählbar, so daß eine gezielte Beeinflussung des EOF während der Kapillarelektrophorese durchgeführt werden kann. Demgegenüber wird in EP-A-0 395 796 und EP-A-0 475 533 lediglich die Probenaufgabe unter Druck beschrieben, ohne daß erkannt wurde, daß sich durch Aufrechterhaltung einer Druckdifferenz über der Kapillare auch während der Kapillarelektrophorese eine vorteilhafte Beeinflussung des Elektroendosmotischen Flusses erzielen läßt. Dementsprechend ist in EP-A- 0 395 796 und EP-A-0 475 533 auch nur die Erzeugung einer Druckdifferenz in einer Richtung beschrieben, nämlich derart, daß auf der Seite der Probenaufgabe ein erhöhter Druck vorliegt.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der beigefügten Zeichnungen genauer beschrieben, in denen zeigt,

Fig. 1 den Aufbau eines ersten Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 2 Strömungsprofile in der Kapillare zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens,

Fig. 3a bis g Darstellungen von Analyseergebnissen, die bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erzielt werden,

Fig. 4 den Aufbau eines weiteren Ausführungsbeispiels der Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Fig. 5 den Aufbau einer Kapillarelektrophorese- Apparatur zur simultanen Bestimmung von Anionen und Kationen, die sich für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet,

Fig. 6 die Kapillarelektrophorese-Apparatur nach Fig. 5 mit zusätzlichen Komponenten,

Fig. 7a bis 7c Darstellungen von Analyseergebnissen, die bei Anwendung der Kapillarelektrophorese-Apparatur gemäß Fig. 5 und 6 erzielt wurden.

Fig. 1 zeigt den grundsätzlichen Aufbau einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Vorrichtung umfaßt zwei Behältnisse 1a und 1b zur Aufnahme der Probe 2 bzw. des Elektrolyten 3, eine Kapillare 4 zwischen den beiden Behältnissen, einen im Verlauf der Kapillare angeordneten Detektor 5 und eine Hochspannungsquelle 6, die mit in den Behältnissen angeordneten Elektroden 7a und 7b verbunden ist. Die erfindungsgemäße Vorrichtung entspricht insoweit dem grundsätzlichen Aufbau bekannter CZE-Apparaturen. Eine weitergehende Erläuterung der einzelnen Komponenten ist insofern entbehrlich. Angemerkt sei jedoch, daß die CZE- Apparatur keinen Beschränkungen unterworfen ist und daß die für den Einzelfall erforderliche Auswahl der Kapillare, des Detektors oder anderer Vorrichtungsbestandteile ohne Rücksicht auf das erfindungsgemäße Verfahren getroffen werden kann.

Erfindungsgemäß ist die CZE-Vorrichtung ausgestattet mit einer Druckerzeugungseinrichtung 8, die über Druckleitungen 9a und 9b mit den Behältnissen 1a und 1b derart verbunden ist, daß an die Kapillare 4 während der CZE eine Druckdifferenz angelegt wird. Die Größe und die Richtung der Druckdifferenz ist über eine Drucksteuerung 10 frei wählbar.

Mit einer derart aufgebauten CZE-Apparatur kann die CZE durchgeführt werden, während erfindungsgemäß über der Kapillare 4 eine Druckdifferenz anliegt. Der angelegte Druck übt eine Kraft auf den Elektrolyten aus, die den EOF unterstützt oder ihm entgegenwirkt. Da der EOF durch die Kraft erzeugt wird, die das von der Hochspannungsquelle 6 erzeugte elektrische Feld auf die Oberflächenladung der verwendeten Kapillare ausübt, kann der über der Kapillare liegende Druck als weitere Kraft verstanden werden, die auf die Flüssigkeit in der Kapillare wirkt und über die durch Variation des Druckes die resultierende Kraft und somit die Fließgeschwindigkeit und Richtung beeinflußt werden kann.

Der Wirkungsweise und dem zugrundeliegenden Prinzip sei folgendes angemerkt.

Die Flußkontrolle über einen externen Druck bedingt die Aufhebung des idealen Strömungsprofils der CZE. Eine Abschätzung des Druckeinflusses auf die Peakform ist durch Kombination der Gleichung (1) für die durch ein parabolisches Flußprofil bedingte Dispersion mit der Poiseuilleschen Gleichung (2) möglich:

Die Kombination von (1) und (2) führt zu:

Die Peakverbreiterung wird somit in der Zeit (t) und der Höhe der angelegten Druckdifferenz (ΔP) beeinflußt. Aufgrund der quadratischen Abhängigkeit erweist sich ein geringerer Druck über einen längeren Zeitraum oftmals als günstiger, verglichen mit einem entsprechend höheren Druck über einen kürzeren Zeitraum.

Aufgrund der extrem hohen Trennstufenzahlen, die in der CZE erreicht werden und den hieraus resultierenden hohen Auflösungen, ist eine Peakverbreiterung meist zu tolerieren. Das Anlegen einer Druckdifferenz gemäß der Erfindung führt jedoch nicht zwangsläufig zu einer Peakverbreiterung. Eines der Ziele der Druckkontrolle ist die Verbesserung der Auflösung durch die Verminderung der Fließgeschwindigkeit. Dabei gilt für die Auflösung (R):

µ_A1A2 = Ionenbeweglichkeiten der Analyten
µ_A = durchschnittliche Ionenbeweglichkeit
D = Diffusionskoeffizient

Eine Peakverbreiterung würde diesen Effekt teilweise kompensieren.

In der CZE tritt ein Temperaturgradient von der Mitte der Kapillare zur Kapillarwand hin auf. Da die Migrationsgeschwindigkeit der Analyten eine Funktion der Temperatur ist, erhält man qualitativ das in Fig. 2a dargestellte Migrationsprofil. Dieser Sachverhalt läßt sich wie folgt beschreiben.

Das Anlegen einer Druckdifferenz und das hieraus resultierende entgegengesetzt gerichtete Strömungsprofil gem. Fig. 2b führt für kleine Druckdifferenzen, wie in Fig. 2c dargestellt, zu einer Begradigung des resultierenden Profils und daher neben einer besseren Auflösung durch die geringere Gesamtgeschwindigkeit der Analyten auch zu verminderten Peakbreiten. Eine effektive Verbesserung der Auflösung für schwierige Trennprobleme ist durch das erfindungsgemäße Vorgehen daher möglich.

Für reale Proben besteht grundsätzlich die Gefahr, daß Probenbestandteile an der Kapillarwand adsorbiert werden und somit den EOF im Verlauf der Analyse beeinflussen. Da die Peakfläche in direktem Zusammenhang mit der EOF- Geschwindigkeit steht, führt eine schlechte Reproduzierbarkeit des EOF zu einer entsprechend schlechten Reproduzierbarkeit der Peakfläche. Des weiteren wirkt sich die Migrationsgeschwindigkeit der Analyten ebenfalls direkt auf die Peakfläche aus. Felderniedrigung durch lokale Leitfähigkeitsunterschiede, z. B. bei hohem Überschuß einer Komponente, verändern die Geschwindigkeit des Analyten.

Der Druck ist unabhängig von diesen Problemen. Daher besteht grundsätzlich die Möglichkeit die Reproduzierbarkeit der Peakfläche dadurch zu erhöhen, daß die Signale mit einem konstanten Fluß und ohne Eigenbewegung am Detektor vorbeigeführt werden. Für eine Vielzahl einfach zusammengesetzter Proben ist die Trennung bereits abgeschlossen, bevor das erste Analytsignal den Detektor erreicht. In diesem Fall können alle Signale durch Verwendung einer geringen und entsprechend konstanten Druckdifferenz ohne angelegte Spannung durch die Meßzelle gefördert werden. Die Konstanz des Flusses wirkt sich positiv auf die zu erreichende Reproduzierbarkeit aus.

Im Folgenden soll am Beispiel der Trennung von 10 Phenolen die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen EOF-Kontrolle durch Druck für einige der beschriebenen Anwendungsmöglichkeiten demonstriert werden.

Aufbau der CZE-Apparatur

Alle Untersuchungen wurden mit einer CZE-Einheit bestehend aus einem Hochspannungs-Netzgerät (0-30 kV) mit umkehrbarer Polarität und einem UV-Detektor ausgeführt. Erfindungsgemäß wurde das Gerät mit einer externen Gasdruckkontrolle, z. B. einer Stickstoffgasflasche mit Reduzierventil und nachgeschaltetem Nadelventil für einen Gassplit ausgestattet. Der Druck konnte in einem Bereich von 10 mbar bis ca. 5 bar über das Nadelventil variiert werden. Anwendbar erscheint in der Regel ein Bereich von 1 mbar bis 10 bar, der als sinnvoller Einsatzbereich der erfindungsgemäßen EOF-Kontrolle anzusehen ist. Das Ablassen des Gases zum schnellen Druckabbau erfolgte über einen Dreiwegehahn.

Chemikalien

Alle Chemikalien für die Standardisierung, sowie für die Herstellung der Puffer (2-Chlorophenol, 2,4-Dichlorophenol, 2,4-Dinitrophenol, 2-Methyl-4,6-dinitrophenol, 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, Pentachlorphenol, Phenol, 2,4,6- Trichlorphenol, Natriumphosphat, Natriumborat) wurden in z.A. Qualität eingesetzt. Die Verdünnung der Standards bzw. das Ansetzen der Elektrolytlösungen erfolgte unter Verwendung von Reinstwasser eines Milli-Q-Reinigungssystems.

Ergebnisse

Die pK_S-Werte der untersuchten Phenole sind in Tab. 1 zusammengefaßt. Die Phenole sind in Abhängigkeit vom pH-Wert des eingesetzten Elektrolyten negativ geladen und somit ohne den Einsatz von Mizellen zu trennen. Aufgrund der Säurekonstanten wurde der pH-Bereich von 9-11 für die Optimierung der Trennung untersucht. Die Analyse bei pH 10 ergab eine vollständige Separierung aller Analyten. Der EOF besitzt eine höhere Geschwindigkeit als die Phenole, so daß die Detektion mit dem EOF erfolgt. Die Trennzeit beträgt weniger als 20 min.

Um den Leitfähigkeitsunterschied zwischen Probe und Elektrolyt im Hinblick auf die elektrokinetische Aufgabe oder das Elektrostacking zu maximieren, wird ein Elektrolyt hoher Leitfähigkeit (20 mM Natriumborat 10 mM Natriumphosphat) eingesetzt. Die Selektivität konnte durch Zusatz von ca. 15% Methanol optimiert werden. Das resultierende Elektropherogramm für die hydrodynamische Probenaufgabe ist in Fig. 3a dargestellt, die mit folgenden Angaben zu sehen ist:
Elektrolyt: Mischung aus 20 mM Natriumtetraborat, 10 mM Natriumphosphat, 15% Methanol, pH 10
Kapillare: Gesamtlänge 68 cm, 51 cm zum Detektor, 50 µm I.D.
Probenaufgabe: hydrodynamisch (50 mbar, 12 s)
Spannung: 30 kV
Detektion: UV, 206 nm
Probe: Mischstandard, 100 µM, pH 11, 40% Methanol
Identifizierung: 1: EOF, 2: Phenol, 3: 4-Chlormethylphenol, 4: Pentachlorphenol, 5: 2,4,6-Trichlorphenol, 6: 2,4- Dichlorphenol, 7: 2-Chlorphenol, 8: 2-Methyl-4,6- dinitrophenol, 9: 2,4-Dinitrophenol, 10: 4-Nitrophenol, 11: 2-Nitrophenol

In einer weiteren Meßreihe wurde der Einfluß des Druckes zur Flußkontrolle untersucht. Durch das Anlegen eines Überdrucks von 50 mbar in Richtung Detektor während der gesamten Analyse konnte die Analysenzeit für einen aus vier Phenolen bestehende Standard von 8 auf weniger als 4 min verkürzt werden, wie in Fig. 3b und 3c mit folgenden Angaben gezeigt ist:
Fig. 3b: Hydrodynamische Probenaufgabe eines 4-Komponenten- Mischstandards
Elektrolyt: Mischung aus 20 mM Natriumtetraborat, 10 mM Natriumphosphat, pH 10
Kapillare: Gesamtlänge: 68 cm, 51 cm zum Detektor, 50 µm I.D.
Probenaufgabe: hydrodynamisch (50 mbar, 12 s)
Spannung: 30 kV
Detektion: UV, 206 nm
Probe: Mischstandard, 1000 µM, pH 11, 40% Methanol
Identifizierung: 1: EOF, 2: Phenol, 3: 4-Chlormethylphenol, 5: 2,4,6-Trichlorphenol, 10: 4-Nitrophenol
Fig. 3c: Hydrodynamische Probenaufgabe eines 4 Komponenten Mischstandards, Trennung durch Druck beschleunigt
Elektrolyt: Mischung aus 20 mM Natriumtetraborat, 10 mM Natriumphosphat, pH 10
Kapillare: Gesamtlänge: 68 cm, 51 cm zum Detektor, 50 µm I.D.
Probenaufgabe: hydrodynamisch (50 mbar, 12 s)
Spannung und Druck: 30 kV, 50 mbar
Detektion: UV, 206 nm
Probe: Mischstandard, 1000 µm, pH 11, 40% Methanol
Identifizierung: 1: EOF, 2: Phenol, 3: 4-Chlormethylphenol, 5: 2,4,6 Trichlorphenol, 10: 4-Nitrophenol.

Die minimale Auflösung zwischen den Peaks ist deutlich größer als 1. In Tab. 2 sind die erzielten Reproduzierbarkeiten für die Peakflächen zweier Komponenten (ein früh und ein spät eluierendes Phenol) für alle untersuchten Verfahren gegenübergestellt. Bedingt durch die mit dem Druck auftretende Peakverbreiterung sinkt die Trennstufenzahl. Da eine ausreichende Auflösung erzielt wird, ist der Verlust an Trennstufen tolerierbar. Die Reproduzierbarkeit der Peakflächen ist vergleichbar oder nur minimal verschlechtert.

Für die elektrokinetische Probenaufgabe müssen die Analyten geladen, d. h. deprotoniert als Phenolate vorliegen, um eine Anreicherung zu erzielen. Aufgrund der pH_S-Werte der eingesetzten Phenolkomponenten sind pH-Werte der Probe < 10 nicht sinnvoll, da einige Substanzen keine oder nur sehr geringe Ladungen aufweisen. Entsprechend hohe pH-Werte führen zu höherer Leitfähigkeit in der Probe und stellen somit eine Limitierung des Anreicherungsfaktors dar. Die Leitfähigkeit ist bei hohem pH-Wert durch die Ionenbeweglichkeit von OH⁻ dominiert. Zur Unterdrückung der Ionenbeweglichkeit von OH⁻ wird die Probe mit ca. 40% Methanol versetzt (Unterdrückung des speziellen Leitmechanismus für OH⁻). Der Methanolanteil führt grundsätzlich zur Erhöhung der pK_S-Werte aller Komponenten. Die Kombination aus pH 11 der Probe in 40% Methanol stellt somit einen Kompromiß zwischen pK_S- Werterhöhung 1 und Leitfähigkeitssenkung dar.

Im vorliegenden Fall unterscheiden sich Migrationsrichtung der Analyten und EOF-Richtung. Trotz der erhöhten Beweglichkeit der Analyten durch das effektiv in der Probe wirkende Feld verglichen mit der Trennung (geringere Ionenstärke in der Probe), ist beim Einsatz der elektrokinetischen Aufgabe keine Anreicherung zu erzielen. Eine deutliche Verbesserung wird durch das Ausschalten des EOF durch die angelegte Druckdifferenz erzielt (berechnet aus EOF-Geschwindigkeit und einer durch einen Druck hervorgerufenen Gegengeschwindigkeit, experimentell verifiziert durch Messungen mit Dimethylsulfoxid, DMSO, als Neutralmarke). Fig. 3d zeigt mit folgenden Angaben die erhaltenen Ergebnisse:
Fig. 3d: Elektrokinetische Probenaufgabe eines 10 Komponenten Mischstandards mit zeitlich begrenzter Flußumkehr Elektrolyt-Mischung aus 20 mM Natriumtetraborat, 10 mM Natriumphosphat, 15% Methanol, pH 10
Kapillare: Gesamtlänge 68 cm, 51 cm zum Detektor, 50 µm I.D.
Probenaufgabe: hydrodynamische Elektromigration (300 mbar, 30 kV, 6 s)
Spannung: 30 kV
Detektion: UV, 206 nm
Probe: Mischstandard, 10 µM, pH 11, 40% Methanol
Identifizierung: 1: EOF, 2: Phenol, 3: 4-Chlormethylphenol, 4: Pentachlorphenol, 5: 2,4,6-Trichlorphenol, 6: 2,4- Dichlorphenol, 7: 2-Chlorphenol, 8: 2-Methyl-4,6- dinitrophenol, 9: 2,4-Dinitrophenol, 10: 4-Nitrophenol, 11: 2-Nitrophenol.

Der erzielte Anreicherungsfaktor liegt in Abhängigkeit von der Ionenbeweglichkeit in der Probe bei bis zu 100. Die Auflösung wird bedingt durch den großen Feldgradienten und die damit verbundene kurze Dauer der Aufgabe nur geringfügig beeinflußt.

Für das zweite eingesetzte Anreicherungsverfahren, das Elektrostacking, ist ein Gewinn im wesentlichen für das langsamste Ion der Probe, im vorliegenden Fall Phenol, zu erhalten.

Ein Vergleich zweier Versuche a) Stacking ohne Gegendruck und b) Stacking mit zeitlich begrenztem Gegendruck zeigt, vgl. Fig. 3e und 3f mit folgenden Angaben:
Fig. 3e: Probenanreicherung eines 10 Komponenten Mischstandards durch Elektrostacking
Elektrolyt: Mischung aus 20 mM Natriumtetraborat, 10 mM Natriumphosphat, 15% Methanol, pH 10
Kapillare: Gesamtlänge 68 cm, 51 cm zum Detektor, 50 µm I.D.
Probenaufgabe: Elektrostacking (Probenaufgabe 400 mbar, 6 s, Dauer des Elektrostackingvorgangs 3,4 min, -30 kV)
Spannung: 30 kV
Detektion: UV, 206 nm
Probe: Mischstandard, 10 µM, pH 11, 40% Methanol
Identifizierung: 1: EOF, 2: Phenol, 3: 4-Chlormethylphenol, 4: Pentachlorphenol, 5: 2,4,6-Trichlorphenol, 6: 2,4- Dichlorphenol, 7: 2-Chlorphenol, 8: 2-Methyl-4, 6- dinitrophenol, 9: 2,4-Dinitrophenol, 10: 4-Nitrophenol, 11: 2-Nitrophenol, und
Fig. 3f: Probenanreicherung eines 10 Komponenten Mischstandards mit einer angelegten Druckdifferenz entgegengesetzt zur Flußrichtung
Elektrolyt: Mischung aus 20 nM Natriumtetraborat, 10 mM Natriumphosphat, 15% Methanol, pH 10
Kapillare: Gesamtlänge 68 cm, 51 cm zum Detektor, 50 µm I.D.
Probenaufgabe: Elektrostacking (Probenaufgabe 400 mbar, 6 s, Dauer des Elektrostackingvorgangs 10 min, -30 kV)
Spannung: 30 kV
Detektion: UV, 206 nm
Probe: Mischstandard, 10 µM, pH 11, 40% Methanol
Identifizierung: 1: EOF, 2: Phenol, 3: 4-Chlormethylphenol, 4: Pentachlorphenol, 5: 2,4,6-Trichlorphenol, 6: 2,4- Dichlorphenol, 7: 2-Chlorphenol, 8: 2-Methyl-4,6- dinitrophenol, 9: 2,4-Dinitrophenol, 10: 4-Nitrophenol, 11: 2-Nitrophenol,
daß für die gewählten Bedingungen die Probeionen, mit Ausnahme des Phenols, bereits vollständig angereichert werden. Der Phenolpeak weist bei der zweiten Messung mit zeitlich begrenztem Gegendruck eine ca. um den Faktor 2 vergrößerte Fläche auf. Unter weniger günstigen Anreicherungsbedingungen kann gezeigt werden, daß eine deutliche verbesserte Anreicherung auch für die anderen Komponenten erreicht wird. Der zu erzielende Anreicherungsfaktor für das Elektrostacking liegt bei ca. 100. In Tabelle 3 sind die Nachweisgrenzen für die hydrostatische, die elektro-kinetische Probenaufgabe und das Elektrostacking gegenübergestellt.

Abschließend wurde die Reproduzierbarkeit in Abhängigkeit vom Transportmechanismus untersucht. Grundsätzlich sollte die Reproduzierbarkeit für die Flächen der untersuchten Signale bei Verwendung eines reinen durch Druck induzierten Flusses gegenüber der mit Spannung betriebenen Variante verbessert werden.

Die Trennung des 4-Komponentenstands erfolgt im elektrischen Feld. Die Zeitdauer beträgt ca. 4 min. Anschließend werden die bereits vollständig separierten Signale durch den druckinduzierten Fluß am Detektor vorbeigeführt. Ein typisches Elektropherogramm zeigt Fig. 3g mit folgenden Angaben:
Fig. 3g Hydrodynamische Probenaufgabe eines 4-Komponenten- Mischstandards, Trennung im Feld anschließender Transport zum Detektor durch Druck
Elektrolyt: Mischung aus 20 mM Natriumtetraborat, 10 mM Natriumphosphat, pH 10
Kapillare: Gesamtlänge 68 cm, 51 cm zum Detektor 50 µm I.D.
Probenaufgabe: hydrodynamisch (50 mbar, 12 s)
Spannung: 30 kV, 4 min, dann 50 mbar
Detektion: UV, 206 nm
Probe: Mischstandard, 1000 µM, pH 11, 40% Methanol
Identifizierung: 2: Phenol, 3: 4-Chlormethylphenol, 5: 2,4,6- Trichlorphenol, 10: 4-Nitrophenol.

Der Vergleich der Reproduzierbarkeit (Tab. 2) zwischen druckbetriebener und normaler Detektion, am gleichen Gerät, zeigt bereits eine Verbesserung für das druckbetriebene Verfahren.

Tabelle 1 Übersicht der pK_S-Wert der eingesetzten Phenole

Phenolderivat
pKS-Wert
4-Chloro-3-methylphenol
9,54
2-Chlorophenol	8,55
2,4-Dichlorophenol	7,89
2,4-Dinitrophenol	4,07
2-Methyl-4,6-dinitrophenol	4,70
2-Nitrophenol	7,23
4-Nitrophenol	7,16
Pentachlorphenol	4,50
Phenol	11,00
2,4,6-Trichlorphenol	6,23

Tabelle 2

Relative Standardabweichung der Peakflächen verschiedener Verfahren

Tabelle 3

Nachweisgrenzen für die verwendeten Aufgabentechniken

Im folgenden wird ein weiteres Ausführungsbeispiel der Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Bezugnahme auf die Fig. 4 beschrieben.

Zur Durchführung der Kapillarelektrophorese unter gleichzeitigem Anlegen einer Druckdifferenz weist die CZE- Apparatur dieses Ausführungsbeispiels den oben bereits beschriebenen grundsätzlichen Aufbau auf. Danach umfaßt die CZE-Apparatur zwei Behältnisse 1a und 1b für die Probe 2 bzw. den Elektrolyten 3, eine Kapillare 4 zwischen den beiden Behältnissen 1a und 1b, einen Detektor 5 an der Kapillare 4 und eine Hochspannungsquelle 6, die mit in den Behältnissen 1a und 1b angeordneten Elektroden 7a und 7b verbunden ist.

Wie in Fig. 4 gezeigt, ist das die Probe 2 enthaltende Behältnis 1a auf einem höheren Niveau angeordnet als das Behältnis 1b mit dem Elektrolyten 3. Die Höhe h des Niveauunterschieds bestimmt die Druckdifferenz, die erfindungsgemäß während der Kapillarelektrophorese über der Kapillare aufrecht erhalten wird. Der Niveauunterschied h wird eine Druckerzeugungseinrichtung 11 aufrecht erhalten, die bei diesem Ausführungsbeispiel in Form einer Hebeeinrichtung realisiert ist. Die Druckerzeugungseinrichtung 11 kann das Behältnis 1a über das Niveau des Behältnisses 1b anheben und darunter absenken. Gesteuert wird die Druckerzeugungseinrichtung 11 durch eine Drucksteuerung 10, die die Höhe h vorgibt und die eingesetzte Hebeeinrichtung entsprechend ansteuert.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Steuerung der Kapillarelektrophorese kann besonders vorteilhaft bei einer Kapillarelektrophoreseapparatur eingesetzt werden, die die simultane Bestimmung von Kationen und Anionen erlaubt. Bei der dafür ausgelegten Apparatur wird die entgegengesetzte Wanderungsrichtung von Anionen und Kationen in wäßriger Lösung unter Einwirkung eines elektrischen Feldes und gleichzeitig die Trennung der Ionen aufgrund ihrer unterschiedlichen Beweglichkeiten ausgenutzt. Zur Verdeutlichung des Aufbaus und des Bestimmungsverfahrens wird im folgenden die Kapillarelektrophoreseapparatur unabhängig von der EOF-Drucksteuerung erläutert.

Fig. 5 zeigt den Aufbau der CZE-Apparatur für die simultane Bestimmung von Kationen und Anionen. Zwei Behältnisse 1a und 1b dienen zur Aufnahme einer Probe bzw. einer Elektrolytlösung, mit der auch die Kapillare 4 gefüllt ist. Zur Simultanbestimmung wird die Probe an beiden Enden der mit Elektrolytlösung gefüllten Kapillare 4 aufgegeben. Nach Anlegen des elektrischen Feldes, das mit Hilfe einer Hochspannungsquelle und mit zwei mit der Hochspannungsquelle verbundenen Elektroden 7a und 7b erzeugt wird wandern auf der einen Seite die Kationen und auf der anderen Seite die Anionen der Proben in die Kapillare 4, an der sich in einer für die jeweilige Trennung günstigen Position der Detektor 5 befindet. Grundsätzlich ist der Detektor 5 an der Kapillare 4 derart angebracht, daß seine Position veränderbar ist. Im Rahmen eines standardisierten Aufbaus ist der Detektor 5, wie in Fig. 5 dargestellt, in der Mitte zwischen den beiden Kapillarenden angebracht. Insbesondere bei diesem standardisierten Aufbau wird die Kapillarelektrophoreseapparatur zur simultanen Bestimmung von Kationen und Anionen vorteilhaft um die zuvor beschriebene Druckerzeugungseinrichtung für die EOF-Kontrolle ergänzt. Durch Steuerung der Druckdifferenz über der Kapillare 4 kann dann die CZE so beeinflußt werden, daß an der Position des Detektors 5 ein optimaler Nachweis der Probenbestandteile gewährleistet ist.

Wie bereits im Zusammenhang mit der EOF-Kontrolle erwähnt, handelt es sich auch bei den einzelnen Komponenten der CZE- Apparatur zur simultanen Bestimmung von Kationen und Anionen um die allgemein bekannten Bestandteile, beispielsweise eine polyimidummantelte Quarzglaskapillare, ein UV-Detektor und eine übliche Hochspannungsquelle. Eine Autosampler-Anordnung ermöglicht die Probenaufgabe an beiden Enden der Kapillare ebenso wie das Befüllen mit Elektrolytflüssigkeit und Spüllösungen mit Hilfe einer Druckdifferenz, wozu vorteilhaft auch die optionale Druckerzeugungseinrichtung zur EOF- Kontrolle eingesetzt werden kann.

Bei einer CZE-Apparatur dieses Aufbaus können alle in der Kapillarelektrophorese verwendeten on-column- Detektionsmethoden eingesetzt werden. Während bei herkömmlichen Anordnungen der Detektor an dem der Probenaufgabenseite gegenüberliegenden Kapillarende positioniert ist, befindet sich der Detektor bei der erfindungsgemäßen CZE-Apparatur an einer frei wählbaren Stelle zwischen den Kapillarenden oder ist in der Mitte zwischen den beiden Kapillarenden fest angebracht. Dabei ist die Positionierung nur dadurch eingeschränkt, daß die Kapillare 4 vor und hinter dem Detektor 5 in die Elektrolyt- bzw. Probengefäße 1a und 1b geführt werden muß. Dadurch kann für verschiedene Trennungen der zeitliche Abstand zwischen der Retention von Kationen und Anionen klein gehalten und eine Überlagerung von Signalen vermieden werden. Weiterhin kann bei bekannten Systembedingungen (Ionenbeweglichkeiten der langsamsten und schnellsten Kationen und Anionen, Richtung und Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses) die günstigste Stelle für den Detektor 5 entlang der Kapillare 4 berechnet und das Detektionsfenster in der Kapillare 4 entsprechend angebracht werden.

Wird ein programmierbarer Detektor verwendet, können die Detektionswellenlängen für die Kationenbestimmung und für die Anionenbestimmung unabhängig voneinander optimiert werden.

Zur weiteren Erläuterung der CZE-Apparatur zur simultanen Bestimmung von Kationen und Anionen wird im folgenden die Probenaufgabe unter Bezugnahme auf Fig. 6 näher beschrieben.

Zur Probenaufgabe werden die Elektrolytgefäße 1a und 1b, die in Fig. 6 als Bestandteile einer Autosampler-Vorrichtung 12 dargestellt sind, an den beiden Enden der Kapillare 4 durch Probengefäße ersetzt. Der Autosampler 12 besteht aus zwei drehbaren Tellern 12a und 12b, die mit Gefäßen 1a und 1b für Probe-, Elektrolyt- und Spüllösungen bestückt sind. Das jeweils benötigte Gefäß wird, vorzugsweise programmgesteuert, in die Position unter dem Kapillarende gebracht, und von unten durch einen beweglichen Stempel 12c und 12d angehoben, bis die Kapillarenden 4 und die Elektroden 7a und 7b in die Lösung eintauchen. Durch eine nicht dargestellte Dichtung wird die Verbindung zwischen Kapillare 4 und Gefäß 1a bzw. 1b verschlossen, so daß die Lösung durch Anlegen eines Druckes bzw. Vakuums in die Kapillare 4 initiiert, vorzugsweise ferner eine EOF-Drucksteuerung durchgeführt werden kann. Auf diese Weise kann die Probe aufgegeben oder die Kapillare mit Elektrolyten und Spülflüssigkeiten bespült werden.

Im einfachsten Fall geschieht das Einbringen der Ionen aus der Probe durch gleichzeitige, beidseitige elektrokinetische Injektion. Während die Enden der Kapillare 4 in die Gefäße 1a und 1b für die Proben eingetaucht sind, wird für eine definierte Zeit mit Hilfe der Hochspannungsquelle 6 eine Spannung an die Elektroden 7a und 7b angelegt, die ebenfalls in die Probenflüssigkeit eingetaucht sind. Da die Position des Detektors 5 verändert werden kann, können Kationen und Anionen (der jeweils dafür vorgesehenen Kapillarseite) aufgegeben werden, was dazu führt, daß eine umpolbare Hochspannungsquelle nicht mehr erforderlich ist. Dadurch wird der gerätetechnische Aufwand im Bereich der Hochspannungsquelle verringert.

Eine zeitlich verschobene Probenaufgabe von Kationen und Anionen kann erfolgen, indem nach einseitiger Injektion die Trennung zu einem beliebigen Zeitpunkt unterbrochen wird und die entgegengesetzt geladenen Probeionen am anderen Kapillarende elektroinetisch aufgegeben werden. Dabei kann die zweite Probenaufgabe unter anderen Bedingungen bezüglich der Spannung und der Aufgabezeit erfolgen.

Bei der bereits erwähnten hydrodynamischen Probeninjektion, d. h. bei Aufgabe der Probenlösungen nacheinander mittels Druck oder Vakuum muß die aufgegebene Probenmenge der ersten Injektion größer sein als bei der zweiten, da das gleiche Flüssigkeitsvolumen, das an einem Ende der Kapillare 4 aufgegeben wird, am anderen Ende herausgedrückt wird. Die hydrodynamische Probeninjektion kann ebenfalls zeitlich versetzt erfolgen, wodurch ein Verlust an der zuerst aufgegebenen Probe vermieden wird.

Für die direkte Detektion (UV-VIS, Fluoreszenz) können Elektrolytsysteme wie die bereits in der Kapillarelektrophorese verwendeten Pufferlösungen (Borat, Phosphat, . . .) verwendet werden. Hier muß das System nur bezüglich der Retentionszeiten von Kationen und Anionen optimiert werden, was durch die Positionierung des Detektors und durch Beeinflussung des elektroosmotischen Flusses (z. B. pH-Wert, EOF Drucksteuerung) geschehen kann.

Indirekte Detektionsmethoden müssen eingesetzt werden, um die Anzahl der zu bestimmenden Ionen (insbesondere anorganischer Ionen) zu erhöhen. Da das Prinzip der indirekten Detektion auf der Verdrängung der jeweils gleichsinnig geladenen Ionen des Elektrolyten beruht, müssen Elektrolytsysteme verwendet werden, die detektoraktive Kationen und detektoraktive Anionen enthalten. Die jeweiligen Gegenionen der Kationenelektrolytkomponente und der Anionenelektrolytkomponente können in der Probe nicht bestimmt werden, da an der entsprechenden Stelle im Elektropherogramm Systempeaks erscheinen. Da es sich dabei oft um Ionen handelt, die von analytischem Interesse sind (Alkali-, Erdalkaliionen, Sulfat, Nitrat oder Halogeneide) müssen diese ggf. mittels Ionenaustauscher aus dem Elektrolyten entfernt werden.

Um spezielle Trennprobleme zu lösen, können dem Elektrolyten weitere Substanzen zugesetzt werden. So kann die für viele Bestimmungen wichtige Trennung von Kalium und Ammonium durch Zugabe von 18-Krone-6 erreicht werden. Mit Komplexbildnern wie Zitronensäure, Weinsäure oder Hydroxyisobuttersäure können Übergangsmetalle getrennt werden. Zusätzlich erfüllen diese organischen Säuren eine weitere wichtige Funktion, da durch deren Zugabe der pH-Wert der Elektrolytlösung und damit der elektroosmotische Fluß eingestellt werden kann. (Die Verwendung anorganischer Säuren würde die Bestimmung des jeweiligen Säureanions verhindern).

Die Kontrolle des elektroosmotischen Flusses ist insbesondere für die hier beschriebene Methode zur Simultanbestimmung von Kationen und Anionen wichtig, denn dadurch können ebenfalls die Retentionsabstände zwischen Kationen und Anionen gesteuert und Signalüberlagerungen verhindert werden.

Die indirekte UV-Detektion ist aufgrund ihres großen Einsatzbereiches bezüglich der Elektrolytkonzentration und der Vielfalt der bestimmbaren Ionen die z.Z. am weitesten verbreitete Detektionsmethode in der Kapillarelektrophorese.

Elektrolytkomponenten, die für die gleichzeitige Bestimmung von Kationen und Anionen in der Kapillarelektrophorese mit indirekter UV-Detektion verwendet werden können, sind nachfolgend zusammengestellt.
Elektrolytkomponente für die Kationendetektion

• - Imidazol
• - Kreatinin
• - N-Methylbenzylamin

Elektrolytkomponente für die Anionendetektion

• - Thiocyanat
• - Molybdat
• - Chromat
• - Hexacyanoferrat (III)

Additive

• - 18-Krone-t (Trennung von K⁺/NH₄⁺ und Ca²⁺/Sr²⁺)
• - Zitronensäure, Weinsäure, Hydroxyisobuttersäure (Trennung von Übergangsmetallen und Einstellung des pH- Wertes).

Die in Fig. 7a bis 7c gezeigten Elektropherogramme von anorganischen Ionen in Standardlösungen und einer Trinkwasserprobe wurden unter folgenden Bedingungen aufgenommen.
Fig. 7a und Fig. 7b:
Kapillare: fused silica, 50 µm I.D., 16 cm von der Anode bis zum Detektor und 55 cm von der Kathode bis zum Detektor
Probenaufgabe: Elektrokinetisch, 5 kV, 10 s
Trennspannung: 30 kV
Elektrolytlösung: 5 mM Imidazol, 5 mM Thiocyanat (aus KSCN, K⁺ durch Ionenaustausch entfernt), 2 mM Zitronensäure
Fig. 7c:
Kapillare: fused silica, 50 µm I.D., 16 cm von der Anode bis zum Detektor und 55 cm von der Kathode bis zum Detektor
Probenaufgabe:
Kationen: 2 kV, 10 s
Anionen: 4 kV, 10 s
Trennspannung: 25 kV
Elektrolytlösung: 5 mM Imidazol, 5 mM Thiocyanat (aus KSCN, K⁺ durch Ionenaustausch entfernt), 2 mM Zitronensäure, 1 mM 18-Krone-6

Claims (11)

1. Verfahren zur Steuerung der Kapillarelektrophorese, dadurch gekennzeichnet, daß während der Durchführung der Kapillarelektrophorese über der Kapillare eine Druckdifferenz aufrecht erhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Druckdifferenz im Bereich von 1 mbar bis 10 bar liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Druckdifferenz im Bereich von 10 mbar bis 5 bar liegt.

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, mit

• - zwei Behältnissen (1a, 1b) für die Probelösung (2) bzw. die Elektrolytlösung (3);
• - einer Kapillare (4) zwischen den beiden Behältnissen (1a, 1b)
• - einem Detektor (5), der an der Kapillare (4) angeordnet ist;
• - einer Hochspannungsquelle (6), die mit zwei zum Anlegen eines elektrischen Feldes an die Elektrolytlösung in der Kapillare vorgesehenen Elektroden (7a, 7b) verbunden ist; und
• - einer Druckerzeugungseinrichtung (8, 11) zur Erzeugung einer Druckdifferenz über der Kapillare (4) während der Kapillarelektrophorese.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Behältnisse (1a, 1b) für die Probelösung (2) bzw. den Elektrolyten (3) vorgesehen sind und die Behältnisse Teil einer Autosampler-Vorrichtung (12) sind.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Druckerzeugungseinrichtung (8) eine Druckgasquelle umfaßt, die über Druckleitungen (9a, 9b) mit den Behältnissen (1a, 1b) druckdicht verbunden ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Druckerzeugungseinrichtung (11) eine Hebeeinrichtung umfaßt, die das eine Behältnis (1a) über das Niveau des anderen Behältnisses (1b) anhebt bzw. darunter absenkt.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Drucksteuerung (10) zur Steuerung der durch die Druckerzeugungseinrichtung (8, 11) erzeugten Druckdifferenz vorgesehen ist.

9. Kapillarelektrophorese-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß

• - die Behältnisse (1a, 1b) an beiden Enden der Kapillare für die Probeninjektion vorgesehen sind; und
• - der Detektor (5) entlang der Kapillare (4) verschiebbar angeordnet ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (5) in der Mitte der Kapillare (4) angeordnet ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Behältnisse (1a, 1b) Teil einer Autosampler-Vorrichtung (12) ist, die mehrere Behältnisse (1a, 1b) in einem Drehteller (12a, 12b) aufnimmt und mittels einer Bewegungseinrichtung (12c, 12d) jeweils an die Enden der Kapillare (4) bzw. die Elektroden (7a, 7b) heranbewegt.