DE2401620C3

DE2401620C3 - Verfahren zur spektrophotometrischen Erfassung von Zonengrenzen, welche bei der isotachophoretischen Trennung erhalten werden

Info

Publication number: DE2401620C3
Application number: DE2401620A
Authority: DE
Inventors: Tord Lennart Ekeroe Arlinger (Schweden)
Original assignee: LKB-PRODUKTER BROMMA (SCHWEDEN) AB
Current assignee: LKB-PRODUKTER BROMMA (SCHWEDEN) AB
Priority date: 1973-01-15
Filing date: 1974-01-14
Publication date: 1975-10-02
Also published as: SE369279B; US3912609A; FR2214126B1; FR2214126A1; JPS49105598A; DE2401620A1; DE2401620B2; GB1459320A

Description

Säule angeordnet werden, um die erhaltenen Zonen- Vorteilhaft ist es bei der Erfindung, daß auch

grenzen zu erfassen. Hierbei wird durch diese Erfas- 60 eine UV-Erfassung bei Substanzen, die nicht UV-sung ein Erfordernis erfüllt, nämlich daß, nachdem absorbierend sind, durchgeführt werden kann und sich scharfe Zonengrenzen zwischen allen Proben- daß somit hierbei ein rascheres Messen vnd ein grözonen eingestellt haben, die Beendigung des Trenn- ßeres Auflösungsvermögen, das bei der UV-Erfasvorganges angezeigt wird. Ein anderes Erfordernis, sung ermöglicht ist, im Vergleich zur thermischen das an eine derartige Erfassung gestellt werden kann, 65 Erfassung gewährleistet wird.

besteht darin, einen Gegenfluß, der in verschiedenen An Hand der Zeichnungen soll an bevorzugten

Fällen verwendet wird, so zu steuern, daß die Zonen- Ausführungsbcispielen der Erfindung die Erfindung grenze zwischen dem Leitelektrolyten und der noch näher erläutert werden. Es zeigt

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F i g. l schematisch eine Säule zur isotachophore- zwei Salzlösungen, die gemeinsam ein Ion aufweisen

tischen Trennung, _uncj einem elektrischen Feld unterworfen sind, ist

Fig. 2 die gleiche Säule nach erhaltenem deich- durch eine Beziehung von Kolrausch (Ann. Phys.,

gewicht, Leipzig, 62, 209 [1897]), wiedergegeben:

Fig. 3 schematisch die elektrische Feldstärke £ 5

entlang der Säule, Ca_ _ Va ' (^ub + Vr) ' ^lb

Fig.4 die Konzentration der verschiedenen An- ~~rZ ~~ W.+ U₀)VrL. '

ionen bei Gleichgewicht, ^B ^^υΛ^^υΌ^υΒ α

Fig. 5 die Konzentration des GegenionsR^ ent- wobei

lang der Säule, _lo c = Konzentration,

Fig. 6 schematisch den pH-Verlauf entlang der „ ,. _L, . , ... . .

Säule und V = Beweglichkeit (cmWolt, see),

F i g. 7 bis 9 Beispiele von Detektorkurven bei iso- L=- elektrische Ladung,
tachophoretischen Trennverfahren.

In den Fig. 1 und 2 ist eine Säule 1 dargestellt, 15 wobei die Indizes A, B und R den Ionen A~, B~ in welche eine Anode 2 und eine Kathode 3 einge- und R + entsprechend zugeordnet sind,
führt sind. In der F i g. I ist die zu trennende Probe Gemäß dieser Beziehung besteht zwischen den in den Teil der Säule eingebracht, der durch S be- verschiedenen Anionen an verschiedenen Zonenzeichnet ist. Die Probe enthält Salze, welche drei grenzen eine Konzentrationssrufe. Dies ist in der verschiedene Anionen C₁-, C,- und C₃- enthalten, ao Fig. 4 wiedergegeben. Das Gegenion ist in geeig-Es sei angenommen, daß C,- eine größere Beweg- neter Weise so beschaffen, daß es puffernde Wirlichkeit aufweist als C₃-, welches hinwiederum eine kungen aufweist. Wenn dies der Fall ist, so zeigt die größere Beweglichkeit "als C₃- haben soll. Der Teil Gesamtkonzentration der Gegenionen beträchtlich der Säule, welcher mit L bezeichnet ist, ist mit dem geringere Stufen an den verschiedenen Zoneneingangs schon erwähnten Leitelektrolyten angefüllt. »5 grenzen, wie das aus der F i g. 5 hervorgeht. Wie sich Dieser besteht aus Anionen A ~, welche eine größere der pH-Wert an den verschiedenen Zonengrenzen Beweglichkeit aufweisen als alle Anionen in der ändert, ist beispielsweise aus der F i g. 6 ersichtlich. Probe. Der Teil der Säule, der der Kathode am Gemäß der Erfindung wird ein Gegenion R⁺ vernächsten ist und mit T bezeichnet ist, ist mit einem wendet, das puffernde Eigenschaften aufweist. Das Elektrolyten angefüllt, der ein Anion ß- aufweist, 30 Gegenion wird so gewählt, daß seine molaren Abdessen Beweglichkeit geringer ist als die aller An- Sorptionsvermögen bei sauren und basischen Bedinionen in der Probe. Über die gesamte Säule hin ist gungen bei einer Wellenlänge sich unterscheiden, die eine Kationenart ausgebreitet, welche allen Anionen zur Messung geeignet ist. Der pH-Verlauf, welcher gemeinsam ist und welche als Gegenion R + bezeich- in der F i g. 6 gezeigt ist, ruft dann einen Absorpnet wird. Dieses Gegenion hat in geeigneter Weise 35 tionsvermögens-Verlauf entlang der Säule hervor,
puffernde Eigenschaften. Wenn eine Gleichspannung In der F i g. 7 ist die Trennung von fünf Anionen an die Elektroden 2 und 3 gelegt wird, wandern die mittels Isotachophorese dargestellt. Die F i g. 7 a zeigt Anionen in Richtung auf die Anode 2. Auf Grund eine Trennung gemäß dem Stand der Technik, wähder unterschiedlichen Beweglichkeiten der Anionen rend die Fig. 7b das Ergebnis der Trennung gemäß wächst die elektrische Feldstärke über die Zonen 40 der Erfindung zeigt. Jede der F i g. 7 a und 7 b zeigt L, S und T schrittweise an. Hierdurch wird bewirkt, von oben nach unten Detektoraufzeichnungen von laß die Anionen, welche in der Zone S vorhanden einem thermischen Detektor, einem diffcrentiellen Mnd, auf Grund ihrer Beweglichkeiten getrennt wer- thermischen Detektor und einem spektrophotoden, so daß die Ionen C₁ ^-, welche eine größere Be- metrischen Detektor. In den verschiedenen Kurven weglichkeit aufweisen, eine Zone, welche dem Leit- 45 sind bestimmte Bereiche ersichtlich, welche zu jeelektrolyten am nächsten liegt, bilden. Auf diese Zone weils einem bestimmten Ion gehören. Jeder dieser folgt eine Zone, we'che aus C₂ ^- besteht, und schließ- Bereiche ist mit einer Zahl, welche dem Ion entlich folgt darauf eine Zone, welche aus C₃" besteht. spricht, bezeichnet. Im Ausführungsbeispiel der Die letzte Zone liegt dem Endelektrolyten, wie es Fig. 7 ist der Leitelektrolyt mit 1 bezeichnet; dieser in der F i g. 2 dargestellt ist, am nächsten. Entlang 50 ist 0,01 M Cl -. Der Endelektrolyt bzw. das Endion dieser Zonen wächst die elektrische Feldstärke ist mit 7 bezeichnet; dieses ist Kapronat. Fünf Ionen schrittweise an. Dies ist in der F i g. 3 dargestellt. sind getrennt worden, 2 = ClO₃ , 3 = Oxalat, Die so gebildeten Zonen sind sehr stabil und scharf 4 = Tartrat, S = Zitrat, 6 = Azetat. In der F i g. 7 a voneinander abgegrenzt. Dies resultiert daraus, daß ist das Gegenion 0,0465 M /J-Alanin, während in der bei dem Versuch eines Anions, von einer Zone in 55 Fig. 7b das Gegenion 0,012M Kreatinin ist. Die eine vorhergehende Zone zu diffundieren, wo eine Leitelektrolyten haben in beiden Fällen einen pH-geringere elektrische Feldstärke herrscht, dieses Wert von 4,1. Die spektrophotometrische Erfassung Anion eine geringere Wanderungsgeschwindigkeit wurde bei 254 nm durchgeführt. Es zeigt sich, daß dann aufweist. Es wird deshalb wiederum von seiner bei spektrophotometrischer Erfassung im ersten Fall ursprünglichen Zone aufgefangen. Wenn in der glei- 6u immer kein Ausgangssignal erhalten wird. Wenn chen Weise ein Anion versucht, in eine nachfolgende Kreatinin als Gegenion im zweiten Fall der spektro-Zone zu diffundieren, wird dieses in seine Ursprung- photometrischen Erfassung verwendet worden ist, liehe Zone zurückgebracht auf Grund der höheren ergibt sich ein sehr gutes Bild. Es irt ersichtlich, daß elektrischen Feldstärke, welche in der nachfolgenden die Auflösung der spektrophotometrischen Kurve in Zone herrscht. Auf diese Weise wird eine sehr gute 65 der F i g. 7 b eine größere Auflösung ist als die therselbststabilisierende Wirkung der Zonengrenzschich- mischen Kurven der gleichen Figur. Die Spitze in ten erzielt. der Fig. 7a zwischen den Probenkomponenten S

Die Bedingungen an einer Zonengrenze zwischen und 6 entspricht einer Verunreinigung in der Probe.

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Ein anderes Trennverfahren ist in einem Ausfiih- Fig. 8 und 9 Trennungen in Methanolsystemen

rungsbeispiel in der F i g. 8 dargestellt. Die Figur zeigen.

zeigt von oben nach unten eine Kurve, welche von Das Beispiel der F i g. 7 zeigt außerdem die Tren-

einem spektrophotometrischen Detektor bei 254 nm nung und Erfassung von Anionen gemäß der Erfin-

erhalten worden ist, sowie eine Kurve, welche man 5 dung, während die F i g. 8 und 9 Trennungen und

mit einem thermischen Detektor gewonnen hat. Das die Erfassung gemäß der Erfindung von Kationen

System, welches im Beispiel der Fig. 8 zu trennen zeigen.

war, hatte einen Leitelektrolyten 0,01 M (CH₃)₄NC1 Durch die Auswahl des Gegenions, das puffernde in Methanol, gesättigt mit Sulfanilsäure und der auf Eigenschaften aufweist, ist es möglich, Zonen von ph 4,4 (wie es mittels einer gewöhnlichen, wasserent- io Probenkomponenten zu erfassen, die als solche kein haltenden Kalomel-KCl-Elektrode angezeigt wurde) Absorptionsvermögen aufweisen,
durch (CHj)₄NOH eingestellt war. Der Endelektro- Insbesondere kann man ein derartiges Gegenion lyt ist 0,2 M Zinkazetat in Methanol, und als Gegen- wählen, das unterschiedliche molare Absorptionsion wird Sulfanilsäure verwendet. Die Bezeichnun- vermögen bei sauren und basischen Bedingungen bei gen in der Figur bedeuten: »5 einigen Wellenlängen innerhalb des UV-Bereiches

aufweist. Demgemäß wird die spektrophotometrische

, _ _{nir \ -κι+ ο _ μη + α — ν+ 4 —Ki_n+ Erfassung innerhalb des UV-Bereiches von Sub-

l - ^h₃J₄IN , t - INM₄ , j R. , * «d , _stanzen ermöglicht, die nicht UV-aibsorbierend

5 = Ba²⁺, 6 = Li⁺, 7 = Mg«+, 8 = Ca*+, sind. Wie schon erwähnt, kann das Verfahren ge-

^{ao m}äß der Erfindung auch zur spektrophotometrischen Erfassung von Probenzonen verwendet werden, bei denen nur einige ein Absorptionsvermögen zeigen.

Die Konzentration des Na⁺ beträgt 0,0015 M und Des weiteren kann die Erfindung vorteilhaft bei der

die der anderen Probenionen 0,03 M. Erfassung von Probenzonen nach der isotacho-

Das in der Fig. 9 dargestellte Beispiel betrifft die 25 phoretischen Trennung von einer Probenmischung

Trennung der gleichen Ionen wie im Beispiel der verwendet werden, wo jede Probenkomponente bei

F i g. 8 in einem Methanolsystem. Im Beispiel der einigen Wellenlängen eine Absorption zeigt, wobei

Fig. 9 ist der Leitelektrolyt 0,0089 M NaCl jedoch die spektrophotometrische Erfassung gemäß

+ 0,007 M NaOCOCH₃ in Methanol, gesättigt mit der Erfindung mit noch einer anderen geeigneten

Sulfanilsäure und mit einem pH von 5,0 (wie er ge- 30 ausgewählten Wellenlänge ein bedeutend klareres

messen wurde mit einer gewöhnlichen, wasserhaltigen Ergebnis sich erzielen läßt.

Kalomel-KCl-Elektrode). Der Endelektrolyt und dps Der Unterschied im molaren Absorptionsvermögen

Gegenion waren die gleichen wie im Beispiel der beim Gegenion bei sauren und basischen Bedingun-

F i g. 8. Die spektrophotometrische Ablesung wurde gen kann natürlich mittels des Spektrophotometers,

bei 254 nm durchgeführt. 35 das bei der Messung verwendet wird, aufgezeichnet

Die Figuren zeigen, daß bei der spektrophoto- werden. Der geringste Unterschied im Absorptionsmetrischen Erfassung, welche gemäß der vorliegen- vermögen, welcher bisher bei den bekannten Instruden Erfindung ermöglicht wird, die Auflösung be- menten aufgezeichnet werden kann, beträgt etwa deutend höher ist als bei der thermischen Erfassung. 10~³ bis 10-« Einheiten. Messungen von geringeren

Demgemäß zeigt F i g. 7 eine isotachophoretische 40 Unterschieden im Absorptionsvermögen durch noch

Trennung in einem Wassersystem, während die genauere Instrumente sind natürlich denkbar.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

1 2 Probenmischung in der Säule stationär gehalten Patentansprüche: wird, wie das im vorstehend erwähnten schwedischen Patent 340 376 beschrieben ist

1. Verfahren zur spektrophotometrischen Er- Die Erfassungsmethoden, welche in der Praxis zur fassung innerhalb eines Wellenlängenbereiches 5 Anwendung kommen, sind prinzipiell thermische von Zonengrenzen, welche bei der isotacho- Erfassungsverfahren, welche darauf gegründet sind, phoretischen Trennung erhalten werden, da- daß die Wärmeentwicklung in den verschiedenen durch gekennzeichnet, daß das Gegen- Zonen unterschiedlich ist und daß die Warmeion so ausgewählt wird, daß seine molaren Ab- entwicklnug in Richtung vom Leitelektrolyt zum sorptionsvermögen bei sauren und basischen Be- i° Endelektrolyt hin anwächst. Eine weitere Unterdingungen innerhalb dieses Wellenläcgenberei- suchungsmethode besteht in der spektrophotometri ches sich unterscheiden. sehen Erfassung der verschiedenen Zonen. Letz-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- teres Verfahren sieht eine raschere Messung als das kennzeichnet, daß der Wellenlängenbereich im erste Verfahren vor, das notwendigerweise bei der UV-Bercich liegt. 15 Ausführung eine Zeit von etwa 5 Sekunden beansprucht. Darüber hinaus ermöglicht die spektrophotometrische Erfassung eine bedeutend größere Auflösung als die thermische Erfassung in einem

solchen Grad, daß die Genauigkeit um das 50- bis

30 10Ofache größer ist. Vorbedingung bei der spektrophotometrischen Erfassung ist jedoch, daß die verschiedenen getrennten Ionenarten ein Absorptions-Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spektro- vermögen aufweisen. Die Anzahl von Substanzen, photometrischen Erfassung innerhalb eines Wellen- welche jedoch innerhalb des sichtbaren Spektrums längenintervalls von Zonengrenzen, welche bei der 25 ein Absorptionsvermögen aufweisen, ist sehr klein, isotachophoretischen Trennung erhalten werden. Demgegenüber gibt es jedoch eine große Anzahl

Bei der Isotachophorese wird eine Trennung einer von Substanzen, welche innerhalb des UV-Bereiches ionisierten Probe, welche Ionen einer bestimmten ein Absorptionsvermögen aufweisen. Daher ist die Polarität enthält, durchgeführt, indem man die spektrophotometrische Erfassung innerhalb des Probe in eine Säule einbringt, die zwischen zwei 30 UV-Bereiches im allgemeinen bevorzugter verwend-Elektroden angeordnet ist. Des weiteren befindet bar. Auf vielen chemischen Gebieten, beispielsweise sich in der Säule ein Leitelektrolyt, der in den Teil in der Biochemie, ist es folglich von Vorteil, mit der Säule eingebracht ist, der zwischen der Probe UV-Erfassung zu arbeiten. Häufig ist es jedoch er- und der Elektrode vorhanden ist, gegen die die wünscht. Substanzen isotachophoretisch zu trennen, Ionen wandern, wenn an die Elektroden eine Span- 35 welche jedoch keine UV-Absorbenten sind. Gewöhnnung angelegt wird. Dieser Leitelektrolyt enthält lieh werden derartige isotachophoretische Trennionen von der gleichen Polarität, jedoch mit einer verfahren abwechselnd mit Trennungen von UV-abhöheren Beweglichkeit als die Probenionen. Des wei- sorbierenden Substanzen durchgeführt. Es kann teren befindet sich in der Säule ein Endelektrolyt, jedoch auch vorkommen, daß eine Anzahl von Subder in den Teil der Säule eingebracht ist, der zwi- 40 stanzen, von denen lediglich ein paar UV-absorbieschen der Probe und der anderen Elektrode liegt. rend sind, durch Isotachophorese getrennt werden Dieser Endelektrolyt enthält Ionen von der gleichen müssen. Die vorstehenden Verfahren erlauben dann Polarität, jedoch mit einer geringeren Beweglichkeit eine spektrophotometrische Erfassung in derartigen als die der Probenionen. Über die gesamte Säule Fällen nicht.

hin ist eine Ionenart eingebracht, welche eine ent- 45 Aufgabe der Erfindung ist es daner, ein Verfahren gegengesetzte Polarität aufweist. Diese Ionen wer- zur spektrophotometrischen Erfassung von Zonen den als sogenannte Gegenionen bezeichnet. Das ge- von Substanzen zu zeigen, welche kein Absorptionseignete Gegenion hat puffernde Eigenschaften. Die vermögen aufweisen, so daß man die raschere Isotachophorese ist im einzelnen in Analytica Chemica Durchführung des Meßverfahrens und ein größeres Acta 38 (1967), S. 233 bis 237, unter dem Titel 50 Auflösungsvermögen mit Hilfe der spektrophoto- »Displacement Electrophoresis« beschrieben. Außer- metrischen Erfassung im Vergleich zur thermischen dem ist die Isotachophorese aus dem schwedischen Erfassung erhält.

Patent 340 376 bekannt. Diese Aufgabe wird bei dem Verfahren der ein-

Bei der isotachophoretischen Trennung von Ionen gangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gewerden ^wischen den Zonen, welche von den Ionen 55 löst, daß das Gegenion so gewählt wird, daß sein gebildet werden, scharfe Grenzen erhalten. Bei der molares Absorptionsvermögen bei sauren und basi-Durchführung einer isotachophoretischen Trennung sehen Bedingungen innerhalb des Wellenlängenkönnen verschiedene Arten von Detektoren an der bereiches sich unterscheidet.