DE2363195B2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung der Gegenflußisotachophorese, insbesondere ein
Verfahren zur Stabilisierung einer Probe in einer vorbestimmten Stellung bei dieser Isotachophorese.
Bei der Gegenflußisotachophorese wird die Trennung einer ionisierten Probe, welche Ionen einer -bestimmten
Polarität aufweist, dadurch erhalten, indem man die Probe in eine Säule, die zwischen zwei Elektroden
angeordnet ist, einbringt. Außerdem wird in die Säule ein Leitelektrolyt, der Ionen der gleichen
Polarität wie die Probe, jedoch mit höherer Beweglichkeit, aufweist, in die Säule zwischen die Probe und
die Elektrode eingebracht, zu der die Ionen wandern, wenn an die Elektroden eine Spannung gelegt wird.
Außerdem wird ein Endelektrolyt in die Säule eingebracht, der Ionen mit der genannten Polarität aufweist,
die jedoch eine geringere Beweglichkeit haben als die Ionen der Probe. Der Endelektrolyt wird zwischen
die Probe und die andere Elektrode eingebracht. Der Leitelektrolyt wird unter Druck in die
Säule eingebracht, so daß der Elektrolyt in Richtung der Probe fließt. Die Isotachophorese ist im einzelnen
in Analytica Chemica Acta 38 (1967), Seiten 233 bis 237, unter der Bezeichnung »Displacement electrophoresis«
sowie in der schwedischen Patentschrift 340376 beschrieben. Wie aus diesen Veröffentlichungen
hervorgeht, weist die herkömmliche Isotachophorese den Nachteil auf, daß, wenn die Ionenkonzentration
niedrig ist und die Unterschiede bezüglich der Beweglichkeit der Ionen der Probe gering
sind, man eine sehr lange Säule benötigt, und daß man zur Erzielung einer ausreichenden elektrischen
Feldstärke in der Säule hohe Spannungen benötigt. Die Länge der Säule kann jedoch wesentlich verringert
werden, wenn man einen sogenannten Gegenfluß des Leitelektrolyten erzeugt, d. h. dieser Leitelektro-
lyt wird in eine Richtung entgegengesetzt zur Richtung
der Ionen der Probe gepumpt (Preets und Pfeifer, Analytica Chemica Acta 38 (1967), Seiten 255 bis
260). Bei einer derartigen Isotachophorese ist es möglich, eine Trennung zu erhalten, ohne daß die Grenz-
x5 fläche zwischen der Probe und dem Leitelektrolyten
in der Säule bewegt wird. Man erzielt hierbei eine Verringerung der Länge der Säule, und die erwünschte
elektrische Feldstärke kann durch Anlegen beträchtlich niedrigerer Spannungen erhalten werden.
Schwierigkeiten bereitet es jedoch, die Amplitude des Gegenflusses und den elektrischen Strom in der Säule
so zu bemessen, daß die Probe im wesentlichen eine festgelegte bzw. fixierte Position einnimmt, bis die
Trennung beendet ist und ein Gleichgewicht sich ein-
gestellt hat. Um diese Schwierigkeiten zu lösen, kann man die Grenzschicht zwischen dem Leitelektrolyten
und der ersten Zone der Probe beobachten und den Gegenfluß ständig von Hand einstellen, so daß diese
Grenzschicht in einer festgelegten Position gehalten wird. Hieraus ergibt sich jedoch, daß die Vorrichtung
von Hand während der gesamten Trennung gesteuert bzw. geregelt werden muß. Darüber hinaus ist es äußerst
schwierig, von Hand die nur sehr geringen Änderungen des Gegenflusses durchzuführen, so daß
keine Störung der Trennung sich ergibt. Aus der schwedischen Patentschrift 340376 ist es des weiteren
bekannt, die Einstellung mittels eines Detektors, der die Grenzschicht erfaßt, automatisch vorzunehmen.
Wenn sich hierbei die Grenzschicht bewegt, wird diese
Bewegung durch Änderung der Amplitude des Gegenflusses kompensiert. Der Nachteil dieses Verfahrens
ist es, daß ein gesonderter Detektor und ein elektronischer Schaltkreis zur Steuerung des Gegenflusses
notwendig sind. Hierdurch wird die Vorrichtung sehr aufwendig und auch teuer. Darüber hinaus ist es erwünscht,
die Grenzschicht scharf zu markieren bzw. zu bestimmen, da diese Grenzschicht der Parameter
ist, von dem aus die Regulierung bzw. Steuerung erfolgt. Da die Gegenflußisotachophorese hauptsächlich
dann verwendet wird, wenn die Komponenten der Probe schwer zu trennen sind, ist die Grenzschicht
zumindest beim Anfang des Trennvorganges ziemlich verschwommen bzw. diffus, wodurch die Steuerung
unsicher wird.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur automatischen Steuerung des Gegenflusses und der
Spannung, welche an die Säule gelegt ist, zu zeigen, bei dem die Probe ohne das Erfordernis von einem
gesonderten Detektor und einem dazugehörigen elektronischen Schaltkreis die Probe in einer festen
Position gehalten werden kann.
Diese Aufgabe wird beim Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß
die Spannung und der Gegenfluß auf konstante Werte eingestellt werden, so daß die aus dem Gegenfluß herrührende
Kraft sich an der gewünschten Stelle für die Fixierung der Probe kompensieren.
An Hand der Figuren soll an einem bevorzugten
Ausführungsbeispiel die Erfindung noch näher erläutert werden. Es zeigt
Fig. 1 schematisch das Verfahren der Ionentrennung bei der Isotachophorese,
Fig. 2 eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung und
Fig. 3 Kurvendarstellungen, welche das Arbeitsprinzip der Vorrichtung gemäß der Fig. 2 verdeutlichen.
In der Fig. 1 ist eine Säule 1 dargestellt, in der eine
Anode 5 und eine Kathode 4 vorgesehen sind. Es sei angenommen, daß die Probe, die getrennt werden soll,
in den Teil der Säule eingebracht ist, der mit S bezeichnet ist. Die Probe enthält zwei verschiedene Anionen
C1' und C2', von denen C,~ eine höhere Beweglichkeit
besitzt als C2 . Der Teil der Säule, der mit L bezeichnet ist, ist mit dem eingangs erwähnten
Leitelektrolyten angefüllt, der aus Anionen A~, welche eine höhere Beweglichkeit als die gesamten Anionen
des Probe aufweist, besteht. Der Teil der Säule, der mit T bezeichnet ist und welcher sich an die Kathode
anschließt, ist mit einem Elektrolyten angefüllt, der ein Anion B enthält, dessen Beweglichkeit geringer
ist als die Beweglichkeit der Anionen der Probe. Wenn eine Gleichspannung an die Elektroden 4 und
5 gelegt wird, wandern die Anionen in Richtung auf die Anode 5. Da die Anionen unterschiedliche Beweglichkeiten
aufweisen, erhält man einen zonenweise bzw. bereichsweise und schrittweise anwachsenden
Spannungsgradienten in den Zonen L, S und T. Der Spannungsgradient entlang der Zone S bedeutet
jedoch, daß die Ionen innerhalb dieser Zone gemäß ihrer Beweglichkeit getrennt werden, so daß
die Ionen C1 , welche die höhere Beweglichkeit aufweisen,
nahe dem Leitelektrolyten angeordnet sind und daß die Ionen C2 mit der geringeren Beweglichkeit
nahe dem Endelektrolyten angeordnet sind. Wenn an die Säule eine Spannung gelegt wird, werden
demgemäß die Anionen der Probe getrennt, und nach der Trennung wandern die verschiedenen Zonen der
Säulen in Richtung auf die Anode 5 mit einer Geschwindigkeit, die von der Beweglichkeit der Ionen
A abhängt. Entlang der SäuK wird ein zonenweise anwachsendes elektrisches lVtential erhalten.
Die so geformten Zonen sind sehr stabil, da bei der Diffusion eines Anions von einer Zone, d.h. von der
ursprünglichen Zone in eine Zone, welche vor dieser Zone liegt, das Anion auf Grund des geringeren Potentialgradienten
in der davor liegenden Zone eine verringerte Geschwindigkeit erhält und in die ursprüngliche
Zone zurückgebracht wird. Wenn in der gleichen Weise ein Anion in eine Zone hinter der ursprünglichen
Zone diffundiert, wird dieses Anion in die ursprüngliche Zone zurückgebracht, da der Potentialgradient
in der hinteren Zone höher ist. Um nun die verschiedenen Zonen und deren Längen zu erfassen,
verwendet man bevorzugt das schrittweise wachsende Potential. Man kann beispielsweise die schrittweise
anwachsende Temperatur an der Außenseite der Säule messen oder eine direkte Messung des Potentials
in einem oder verschiedenen Punkten der Säule vornehmen. Natürlich ist es auch möglich, mittels
Elektroden die Leitfähigkeit der Zonen, welche durch einen bestimmten Punkt gelangen, zu messen,
und wenn die getrennten Substanzen UV-absorbierend sind, kann man auch in herkömmlicher Weise
die UV-Absorption messen.
Wie eingangs jedoch schon erwähnt, liegt ein Nachteil des vorstehend beschriebenen Trennverfahrens
darin, daß insbesondere dann, wenn der Unterschied bezüglich der Beweglichkeit zwischen den verschiedenen
Ionen der Probe sehr gering ist, eine äußerst lange
Säule benötigt wird, um die Trennung durchzuführen.
Um nun eine ausreichende Feldstärke zu erhalten, muß eine sehr hohe Spannung ar die Elektroden angelegt
werden, woraus sich ein komplizierter Aufbau und auch Sicherheitsprobleme ergeben. Die Länge der
ίο Säule könnte jedoch wesentlich verringert werden,
wenn während der Trennung der Leitelektrolyt in die Säule als Gegenfluß eingebracht wird. Die Amplitude
des Gegenflusses kann dann bevorzugt so ausgewählt werden, daß die Grenzschicht zwischen den Zonen L
und S in einer festgelegten Position gehalten wird. Wie eingangs schon erwähnt, kann man die Steuerung
des Gegenflusses entweder manuell bei gleichzeitiger Beobachtung der Zonengrenzschicht durchführen.
Hierbei erhöht man oder verringert man den Gegen-
ao flußdruck, wenn sich die Grenzschicht bewegt. Die Steuerung kann auch automatisch mittels eines zusätzlichen
Detektors durch Regulierung des Gegenflusses durchgeführt werden. Der Detektor erfaßt die
Zonengrenzschicht, und in Abhängigkeit von den Bewegungen dieser Grenzschicht steuert er den Gegenflußdruck.
Hierbei ist es jedoch erforderlich, daß die Zonengrenzschicht genau definiert bzw. genau bestimmbar
ist, was normalerweise im Falle einer geringen Probenkonzentration und bei geringen Unterschieden
bezüglich der Beweglichkeit der Ionen nicht möglich ist. Demgemäß soll mit Hilfe der Erfindung
ein Verfahren gezeigt werden, bei dem die Zonengrenzschicht automatisch an einem festen Ort gehalten
wird, ohne daß hierzu ein besonderer Steuerdetektor oder Überwachungsdetektor notwendig ist.
In der Fig. 2 ist schematisch eine Vorrichtung zur Durchführung einer Gegenflußisotachophorese gemäß
der Erfindung dargestellt. In der Fig. 2 ist die Trennsäule 1 gezeigt, in die die Probe über eine Ein-
laßöffnung 3 zwischen den End- und den Leitelektrolyten T und L eingebracht werden kann. An die Säule
und die Elektrolyte kann mittels einer Spannungsquelle 2 eine Spannung gelegt werden, wobei die
Spannungsquelle 2 mit den Elektroden 4 und 5 verbunden ist, wobei die Probe S in der Säule wandert.
Die Spannungsquelle 2 ist so ausgestaltet, daß entweder eine einstellbare konstante Spannung oder ein
einstellbarer konstanter Strom an die Säule gelegt werden kann. Des weiteren ist die Spannungsquelle
mit einem Stromdifferenzierer versehen, der die Schwankungen des Stromes bezüglich der Zeit anzeigt.
Ein Gefäß, das den Leitelektrolyten enthält, ist getrennt von der Säule mittels einer semipermeablen
Membran 14, damit es möglich ist, die Säule ohne Einfluß auf den Inhalt des Behälters zu befluten. Die
Säule ist des weiteren mit einer weiteren Einlaßöffnung 13 versehen, durch die ein Gegenfl'iß des Leitelektrolyten
erzeugt werden kann. Hierzu dient eine Spritze 15, welche von einem Motor 16 angetrieben
wird. Des weiteren ist die Säule mit einem ersten Detektor 10 versehen zur Erfassung der getrennten Zonen.
Dieser Detektor ist mit einem Schreiber 12 über einen Verstärker Il verbunden. Die Vorrichtung
weist des weiteren einen zweiten Detektor 7 auf, der zur Stabilisierung der Orte der Zonen verwendet werden
kann. Dieser Detektor ist in entsprechender Weise über einen Verstärker 8 mit einem Schreiber 9
verbunden.
Die Wirkungsweise der Vorrichtung gemäß der Fig. 2 soll nun im einzelnen beschrieben werden, wobei
auf die Kurvendarstellungen in den Fig. 3 a bis 3c Bezug genommen wird. Die Fig. 3a zeigt den
Strom, der durch eine Säule gemäß der Fig. 2 hindurchfließt, wenn ein konstanter Strom an die Elektrodengelegt
wird. Dieser Strom ist als Funktion nach der Zeit aufgetragen. Außerdem ist die Lage der
Probe 5 in der Säule 1 während des Verfahrens angezeigt. Wenn die Spannung angelegt wird, sei angenommen,
daß die Probe S an das untere Ende der Säule verlagert wird. Die Säule ist hierbei vollständig
mit dem Leitelektrolyten gefüllt. Dieser Leitelektrolyt hat die höchste Leitfähigkeit. Während des Verfahrens
wandert die Probe unter Trennung ihrer Komponenten entlang der Säule. Wenn eine konstante Spannung
V0 an die Säule gelegt ist, nimmt der Strom
aufeinanderfolgend ab, da der Inhalt des Leitelektrolyten der Säule allmählich abnimmt, während der Inhalt
des Endelektrolyten, d. h. eine Komponente mit geringerer Leitfähigkeit, anwächst. Wenn nun die
Probe den Boden der Säule erreicht, ist die Säule vollständig mit dem Endelektrolyten angefüllt. Der Strom
hat dann einen konstanten Wert. An einem bestimmten Punkt, zur Zeit f„, hat dann der Strom einen bestimmten
Wert /0, welcher die Position S0 der Probe
in der Säule definiert. Wenn nun in der Säule einer von einer Anzahl verschiedenen Gegenflüssen CfI,
Cß und Cß, wobei Cf 1> Cß> Cß, erzeugt wird, ergeben sich entsprechende Stromkurven, wie sie in
der Fig. 3b dargestellt sind. Für eine bestimmte Position
der Probe Sl0, S20 und S30 bei den verschiedenen
Gegenflüssen kompensiert der Gegenfluß die vorwärtstreibende Wirkung, und der Strom, der durch
die Säule fließt, wird somit konstant. Wenn die Spannung V0 erhöht wird auf einen Wert Vx
> K0, wandern diese Positionen der Probe entlang der Säule nach unten,
d. h. die Spannung treibt die Probe weiter in der Säule. Wenn somit für eine bestimmte Probe und einen
bestimmten Leitelektrolyten sowie einen bestimmten Endelektrolyten der Gegenfluß und die
Spannung, bei denen die Probe in einer bestimmten Stellung festgehalten wird, bekannt sind, können diese
Spannungswerte und Gegenfliußwerte beim Beginn
des Versuchs eingestellt werden, so daß die Probe zur vorbestimmten Position wandert und dann in dieser
Position festgehalten wird, da sich dann ein Gleichgewicht einstellt.
Häufig sind diese Parameter exakt bekannt. Wenn
ίο diese Parameter nicht bekannt sind, kann man die
Tatsache ausnützen, daß bei Gleichgewicht der Strom konstant ist und man kann dann die entsprechenden
Einstellungen vornehmen. Hierbei wird dann die Probe mit einem geeigneten Abstand in die Säule ohne
Anwendung eines Gegenflusses eingebracht, woraufhin dann die Spannung und auch der Gegenfluß verändert
werden, so daß man einen konstanten Strom erhält, der vom Stromdifferenzierer der Spannungsquelle 2 empfangen wird und ermittelt wird. Die Posiao
tion der Probe kann hierbei entweder durch das Auge oder mittels eine:s geeigneten Detektors bestimmt
werden. Als Detektor eignen sich beispielsweise ein Thermodetektor oder ein Potentialdetektor oder ein
Leitfähigkeitsdetektor (Bexugszeichen 7 in der
»5 Fig. 2).
Das wesentliche Prinzip der Erfindung besteht darin, daß bei Anwendung eines konstanten Gegenflusses
und eines konstanten Gegenstromes in der Säule es möglich ist, die Probe zu fixieren. Es herrscht
dann ein Gleichgewicht, bei dem der durch die Säule hindurchfließende Strom konstant ist. Um nun die geeigneten
Werte für den Gegenfluß und die Spannung auszuwählen, kann man einen Stromdifferenzierdetektoroder
andere herkömmliche Detektoren, welche entlang der Säule angeordnet sind, verwenden. Gemäß
der Erfindung erhält man dann ein Verfahren, bei dem auf sehr einfache Weise und mit wenig
Aufwand die Probe an einer vorbestimmten Stelle während einer beliebigen Zeit gehalten werden
kann.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (7)
1. Verfahren zur Fixierung einer Probe in einer bestimmten Position bei der Gegenflußisotachophorese,
dadurch gekennzeichnet, daß die Spannung und der Gegenfluß auf konstante Werte eingestellt werden, bis die aus dem elektrischen
Feld resultierende Kraft und die aus dem Gegenfluß herrührende Kraft sich an der gewünschten
Stelle, an der die Probe fixiert werden soll, kompensieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß unter Verwendung eines
Stromdifferentialdetektors die Werte des Gegenflusses und der Spannung so eingestellt werden,
daß die Abteilung des elektrischen Stromes null wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Werte des Gegenflusses und
der Spannung mittels Anzeigeeinrichtungen, welche entlang der Säule vorgesehen sind, eingestellt
werden.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Anzeigeeinrichtung ein
Thermodetektor verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Anzeigeeinrichtung ein
UV-Detektor verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Anzeigeeinrichtung ein
Leitfähigkeitsdetektor verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Anzeigeeinrichtung ein Potentialdetektor
verwendet wird.
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