DE2363195A1

DE2363195A1 - Verfahren zur fixierung einer probe in einer bestimmten position bei der gegenflussisotachophorese

Info

Publication number: DE2363195A1
Application number: DE19732363195
Authority: DE
Inventors: Bengt Fritiof Sunden
Original assignee: LKB Produkter AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1972-12-19
Filing date: 1973-12-19
Publication date: 1974-06-27
Also published as: US3869365A; FR2226072A5; SE390766B; JPS4991495A; JPS5653694B2; GB1454553A; DE2363195B2

Description

Patentanwalt DipL-Phys. Gerhard Liedi 8 München 22 Steinsdorfstr. 21-22 Tel, 29 34

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LKB-Produkter AB S-161 25 Bromma 1 / SCHWEDEN

Verfahren zur Fixierung einer Probe in einer bestimmten Position bei der Gegenflußisotachophorese

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung der Gegenflußisotachophorese, insbesondere ein Verfahren zur Stabilisierung einer Probe in einer vorbestimmten Stellung bei dieser Isotachophorese.

Bei der Gegenflußisotachophorese wird die Trennung einer ionisierten Probe, welche Ionen einer bestimmten Polarität aufweist, dadurch er-

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halten, indem man die Probe in eine Säule, die zwischen zwei Elektroden angeordnet ist, einbringt. Außerdem wird in die Säule ein Leitelektrolyt, der Ionen der gleichen Polarität wie die Probe, jedoch mit höherer Beweglichkeit, aufweist, -in die Säule zwischen die Probe und die Elektrode eingebracht, zu der die Ionen wandern, wenn an die Elektroden eine Spannung gelegt wird. Außerdem wird ein Endelektrolyt in die Säule eingebracht, der Ionen mit der genannten Polarität aufweist, die jedoch eine geringere Beweglichkeit haben, als die Ionen der Probe. Der Endelektrolyt wird zwischen die Probe und die andere Elektrode eingebracht. Der Leitelektrolyt wird unter Druck in die Säule eingebracht, so daß der Elektrolyt in Richtung der Probe fließt. Die Isotachophorese ist im einzelnen in Analytica Chemica Acta 38 (1987), Seiten 233-237 unter der Bezeichnung "Displacement electrophoresis" sowie in der schwedischen Patentschrift 340. 376 beschrieben. Wie aus diesen Veröffentlichungen hervorgeht, weist die herkömrnliche Isotachophorese den Nachteil auf, daß, wenn die Ionenkonzentration niedrig ist und die Unterschiede bezüglich der Beweglichkeit der Ionen der Probe gering sind, man eine sehr lange Säule benötigt, und daß m_an zur Erzielung einer ausreichenden elektrischen Feldstärke in der Säule hohe Spannungen benötigt. Die Länge der Säule kann jedoch wesentlich verringert werden, wenn man einen sogenannten Gegenfluß des Leitelektrolyten erzeugt, d.h. dieser Leitelektrolyt wird in eine Richtung entgegengesetzt zur Richtung der Ionen der Probe gepumpt (Preets und Pfeifer, Analytica Chemica Acta 38 (1967), Seiten 255-260). Bei einer derartigen Isotachophorese ist es möglich, eine Trennung zu erhalten, ohne daß die Grenzfläche zwischen der Probe und dem Leitelektrolyten in der Säule bewegt wird. Man erzielt hierbei eine Verringerung der Länge der Säule und die erwünschte elektrische Feldstärke kann durch Anlegen beträchtlich niedrigerer Spannungen erhalten werden. Schwierigkeiten bereitet es jedoch, die Amplitude des Gegenflusses und den elek-

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irischen Strom m der Säule so zu bemessen, daß die Probe im wesentlichen eine festgelegte bzw. fixierte Position einnimmt bis die Trennung beendet ist und ein Gleichgewicht sich eingestellt hat. Tjm diese Schwierigkeiten zu lösen, kann man die Grenzschicht zwischen dem Leitelektrolyten und der ersten Zone der Probe beobachten und den Gegenfluß ständig von Hand einstellen, so daß diese Grenzschicht in einer festgelegten Position gehalten wird. Hieraus ergibt sich jedoch, daß die Vorrichtung von Hand während der gesamten Trennung gesteuert bzw. geregelt werden m^ß, Darübei* hinaus ist es äußerst schwierig, von Hand

gelt werden m^ß, Darübei hinaus ist es äußerst schwierig, die nur sehr geringen Änderungen des Gegenflusses durchzuführen,, so daß keine Störung der Trennung sieh ergibt. Aus der schwedischen Patentschrift 340.378 ist es des weiteren bekannt, die Einstellung mittels eines Detektors, der die Grenzschicht erfaßt, automatisch vorzunehmen;. Wenn sielt hierbei die Grenzschicht bewegt, wird diese Bewegung durch Änderung der Amplitude des Gegenflusses kompensiert. Der Nachteil dieses Verfahrens ist es, daß ein gesonderter Detektor und ein elektronischer Schaltkreis zur Steuerung des Gegenflusses notwendig sind. Hierdurch wird die Vorrichtung sehr aufwendig und auch teuer. Darüber hinaus ist es erwünscht, die Grenzschicht scharf zu markieren bzw. zu bestimmen, da diese Grenzschicht de** Parameter ist, von. dem aus die. Regulierung bzw. Steuerung erfolgt. Da die Gegenflußisotachophorese hauptsächlich dann verwendet wird, wenn die Komponenten der Probe schwer zu trennen sind, ist die Grenzschicht zumindest beim Anfang des'Trennvorganges ziemlich verschwommen bzw. diffus, wodurch die Steuerung unsicher wird.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur automatischen Steuerung des Gegenflusses und der Spannung, welche an die Säule gelegt ist, zu zeigen, bei dem die Probe ohne das Erfordernis von einem gesonderten Detektor und einem dazugehörigen elektronischen Schaltkreis die Probe

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in einer festen Position gehalten werden kann.

Diese Aufgabe wird beim Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Spannung und der Gegenfluß auf konstante Werte eingestellt werden, so daß die aus dem elektrischen Feld resultierende Kraft und die aus dem Gegenfluß herrührende Kraft sich an der gewünschten Stelle für die Fixierung der Probe kompensieren.

Anhand der beiliegenden Figuren soll an einem bevorzugten Ausführungsbeispiel die Erfindung noch näher erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1 schematisch das Verfahren der Ionentrennung bei der Isotachophorese;

Fig. 2 eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung und

Fig. 3 Kur\^rendarstellungen, welche das Arbeitsprinzip der Vorrichtung gemäß der Fig. 2 verdeutlichen.

In derFig. 1 ist eine Säule 1 dargestellt, in der eine Anode 5 und eine Kathode 4 vorgesehen sind. Es sei angenommen, daß die Probe, die getrennt werden soll, in den Teil der Säule eingebracht ist, der mit S bezeichnet ist. Die Probe enthält zwei verschiedene Anionen C₁ und C , von denen C. eine höhere Beweglichkeit besitzt als C„ . Der Teil der Säule, der mit L bezeichnet ist, ist mit dem eingangs erwähnten Leitelektrolyten angefüllt, der aus Anionen A , welche eine höhere Beweglichkeit als die gesamten Anionen der Probe aufweist, besteht. Der Teil der Säule, der mit T bezeichnet ist und welcher sich an die Kathode an-

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schließt, ist mit eine**¹ Elektrolyten angefüllt, der ein Anion B" enthält, dessen Beweglichkeit geringer ist als die Beweglichkeit der Anionen der Probe. Wenn eine Gleichspannung an die Elektroden 4 und 5 gelegt wird, wandern die Anionen in Richtung auf die Anode 5. Da die Anionen unterschiedliche Beweglichkeiten aufweisen, erhält man einen zonenweise bzw. bereichsweise und schrittweise anwachsenden Spannungsgradienten in den Zonen L, S und T. Der Spannungsgradient entlang der Zone S bedeutet jedoch, daß die Ionen innerhalb dieser Zone gemäß ihrer Beweglichkeit getrennt werden, so daß die Ionen C₁", welche die höhere Beweglichkeit aufweisen, nahe dem Leitelektrolyten angeordnet sind und daß die Ionen C„ mit der geringeren Beweglichkeit nahe dem Endelektrolyten angeordnet sind. Wenn an die Säule eine Spannung gelegt wird, werden demgemäß die Anionen der Probe getrennt und nach der Trennung wandern die verschiedenen Zonen der Säulen in Richtung auf die Anode 5 mit einer Geschwindigkeit, die von der Beweglichkeit der Ionen A abhängt. Entlang der Säule wird ein zonenweise anwachsendes elektrisches Potential erhalten. Die so geformten Zonen sind sehr stabil, da bei der Diffusion eines Anions von einer Zone, d.h. von der ursprünglichen Zone in eine Zone, welche vor dieser Zone liegt, das Anion aufgrund des geringeren Potentialgradienten in der davor liegenden Zone eine verringerte Geschwindigkeit erhält und in die ursprüngliche Zone zurückgebracht wird. Wenn in der gleichen Weise ein Anion in eine Zone hinter der ursprünglichen Zone diffundiert, wird dieses Anion in die ursprüngliche Zone zurückgebracht, da der Potentialgradient in der hinteren Zone höher ist. IJm nun die verschiedenen Zonen und deren Längen zu erfassen, verwendet man bevorzugt das schrittweise wachsende Potential. Man kann beispielsweise die schrittweise anwachsende Temperatur an der Außenseite der Säule messen oder eine direkte Messung des Potentials in eine^m oder verschiedenen Punkten der Säule vornehmen. Natürlich ist es auch möglich, mittels Elektroden die Leitfähig-

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keit der Zonen, welche durch einen bestimmten Punkt gelängen, zu messen und wenn die getrennten Substanzen UV-absorbierend sind, kann m_an auch in herkömmlicher Weise die UV-Absorption messen.

Wie eingangs jedoch schon erwähnt, liegt ein Nachteil des vorstehend beschriebenen Trennverfahrens darin, daß insbesondere dann, wenn der Unterschied bezüglich der Beweglichkeit zwischen den verschieden en Ionen der Probe sehr gering ist, eine äußerst lange Säule benötigt wird, um die Trennung durchzuführen. Um nun eine ausreichende Feldstärke zu erhalten, m_uß eine sehr hohe Spannung an die Elektroden angelegt werden, woraus sich ein komplizierter Aufbau und auch Sicherheitsprobleme ergeben. Die Länge der Säule könnte jedoch wesentlich verringert werden, wenn während der Trennungder Leitelektrolyt in die Säule als Gegenfluß eingebracht wird. Die Amplitude des Gegenflusses kann dann bevorzugt so ausgewählt werden, daß die Grenzschicht zwischen den Zonen L und S in einer festgelegten Position gehalten wird. Wie eingangs schon erwähnt, kann man die Steuerung des Gegenflusses entweder manuell bei gleichzeitiger Beobachtung der Zonengrenzschicht durchführen. Hierbei erhöht man oder verringert man den Gegenflußdruck, wenn sich die Grenzschicht bewegt. Die Steuerung kann auch automatisch mittels eines zusätzlichen Detektors durch Regulierung des Gegenflusses durchgeführt werden. Der Detektor erfaßt die Zonengrenzschicht und in Abhängigkeit von den Bewegungen dieser Grenzschicht steuert er den Gegenflußdruck. Hierbei ist es jedoch erforderlich, daß die Zonengrenzschicht genau definiert bzw. genau bestimmbar ist, was normalerweise im Falle einer geringen Probenkonzentration und bei geringen Unterschieden bezüglich der Beweglichkeit der Ionen nicht möglich ist. Demgemäß soll mit Hilfe der Erfindung ein Verfahren gezeigt werden, bei dem die Zonengrenzechieht automatisch an einem festen Ort gehalten wird, ohne daß hierzu ein besonderer Steuer detektor oder Überwachungsdetektor notwendig ist.

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In der Fig. 2 ist schematisch eine Vorrichtung zur Durchführung einer Gegenflußisotachophorese gemäß der Erfindung dargestellt. In der Fig. ist die Trennsäule 1 gezeigt, in die die Probe über eine Einlaßöffnung 3 zwischen den End- und den Leitelektrolyten T und L eingebracht werden kann. An die Säule und die Elektrolyte kann Mittels einer Spannungsquelle 2 eine Spannung gelegt werden, wobei die Spannungsquelle 2 mit den Elektroden 4 und 5 verbunden ist, wobei die Probe S in der Säule wandert. Die Spannungsquelle 2 ist so ausgestaltet, daß entweder eine einstellbare konstante Spannung oder ein einstellbarer konstanter Strom an die Säule gelegt werden kann. Des weiteren ist die Spannungsquelle mit einem Stromdifferenzierer verseilen, der die Schwankungen des Stromes bezüglich der Zeit anzeigt. Ein Gefäß, das den Leitelektrolyten enthält, ist getrennt von der Säule mittels 'mer semipermeable n Membran 14, da^mit es möglich ist, die Säule ohne Einfluß auf den Inhalt des Behälters zu befluten. Die Säule ist des weiteren mit einer weiteren Einlaßöffnung 13 versehen, durch die ein Gegenüuß des Leitelektrolyten erzeugt werden kann. Hierzu dient eine Spritze 15, welche von einem ^-otor 16 angetrieben wird. Des weiteren ist die Säule mit einem ersten Detektor 10 versehen zur Erfassung der getrennten Zonen. Dieser Detektor ist mit einem Schreiber 12 über einen Verstärker 11 verbunden. Die Vorrichtung weist des weiteren einen zweiten Detektor 7 auf, der zur Stabilisierung der Orte der Zonen verwendet werden kann. Dieser Detektor ist in entsprechender Weise über einen Verstärker 8 einem Schreiber 9 verbunden.

Die Wirkungsweise der Vorrichtung gemäß der Fig. 2 soll nun im einzelnen beschrieben werden; wobei auf die Kurvendarstellungen in den Fig. 3a-c Bezug genommen wird. Die Fig. 3a zeigt den Strom, der durch eine Säule gemäß der Fig. 2 hindurchfließt, wenn ein konstanter

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Strom an die Elektroden gelegt wird. Dieser Strom ist als Funktion nach der Zeit aufgetragen. Außerdem ist die Lage der Probe S in der Säule 1 während des Verfahrens angezeigt. Wenn die Spannung angelegt wird, sei angenommen, daß die Probe S an das untere Ende der Säule verlagert wird. Die Säule ist hierbei vollständig mit dem Leitelektrolyten gefüllt. Dieser Leitelektrolyt hat die höchste Leitfähigkeit. Während des Verfahrens wandert die Probe unter Trennung ihrer Komponenten entlang der Säule. Wenn eine konstante Spannung V_Q an die Säule gelegt ist, nimmt der Strom aufeinanderfolgend ab, da der Inhalt des Leitelektrolyten der Säule allmählich abnimmt, während der Inhalt des Endelektrolyten, d.h. eine Komponente mit geringerer Leitfähigkeit, anwächst. Wenn nun die Probe den Boden der Säule erreicht, ist die Säule vollständig mit dem Endelektrolyten angefüllt. Der Strom hat dann einen konstanten Wert. An einem bestimmten Punkt, zur Zeit t„, hat dann der Strom einen bestimmten Wert I welcher die Position S~ der Probe in der Säule definiert« Wenn nun in der Säule einer von einer Anzahl verschiedenen Gegenflüssen CfI, Cf2 und CiS, wobei CfI > Cf2 > CfS, erzeugt wird, ergeben sich entsprechende Stromkurven, wie sie in der Fig. 3b dargestellt sind. Für eine bestimmte Position der Probe SiL·, S2„ und S3 'bei den verschiedenen Gegenflüssen kompensiert der Gegenfluß die vorwärtstreibende Wirkung und der Strom_? der durch die Säule fließt, wird somit konstant. Wenn die Spannung V„ erhöht wird auf einen Wert V- > V_n, wandern diese Positionen der Probe entlang der Säule nach unten, d.h. die Spannung treibt die Probe weiter in der Säule. Wenn somit für eine bestimmte Probe und einen bestimmten Leitelektrolyten sowie einen bestimmten Endelektrolyten der Gegenfluß und die Spannung, bei denen die Probe in einer bestimmten Stellung festgehalten wird, bekannt sind, können diese Spannungswerte und Gegenflußwerte beim Beginn des Versuches eingestellt werden, so daß die Probe zur vorbestimmten Position wandert und dann in dieser Position festgehalten

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wird, da sich dann ein Gleichgewicht einstellt.

Häufig sind diese Parameter exakt bekannt. Wenn diese Parameter nicht bekannt sind, kann m_an die Tatsache ausnützen, daß bei Gleichgewicht der Strom konstant ist und m_an kann dann die entsprechenden Einstellungen vornehmen. Hierbei wird dann die Probe mit einem geeigneten Abstand in die Säule ohne Anwendung eines Gegenflusses eingebracht, woraufhin dann die Spannung und auch der Gegenfluß verändert werden, so daß m_an einen konstanten Strom erhält, der vom Strom differenzierer der Spannungsquelle 2 empfangen wird und ermittelt wird. Die Position der Probe kann hierbei entweder durch das Auge oder Mittels eines geeigneten Detektors bestimmt werden. Als Detektor eignen sich beispielsweise einTlser^odetektor oder ein Potentialdetektor oder ein Leitfähigkeitsdetektor (Bezugszeichen 7 in der Fig. 2).

Das wesentliche Prinzip der Erfindung besteht darin, daß bei Anwendung eines konstanten Gegenflusses und eines konstanten Gegenstro^es in der Säule es Möglich ist, die Probe zu fixieren. Es herrscht dann ein Gleichgewicht, bei dem der durch die Säule hindurchfließende Strom konstant ist. Ijm nun die geeigneten Werte für den Gegenfluß und die Spannung auszw/ählen, kann ^man einen Stromdifferenzierdetektor oder andere herkömmliche Detektoren, welche entlang der Säule angeordnet sind, verwenden. Gemaß der Erfindung erhält man dann ein Verfahren, bei dem _auf sehr einfache Weise und mit wenig Aufwand die Probe an einer vorbestimmten Stelle während einer beliebigen Zeit gehalten werden kann.

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Claims

- ίο -

Patentansprüche

ΓΏ Verfahren zur Fixierung einer Probe in einer besti^^ten Position bei der Gegenflußisotachophorese, dadurch gekennzeichnet, daß die Spannung und der Gegenfluß auf konstante Werte eingestellt werden, so daß die aus de™ elektrischen Feld resultierende Kraft und die aus de ¹^ Gegenfluß herrührende Kraft sich an der gewünschten Stelle, an der die Probe fixiert werden soll, kompensieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß unter Verwendung eines Stro^mdifferentialdetektors die Werte des Gegenflusses und der Spannung so eingestellt werden, daß die Ableitung des elektrischen Stromes null -»vird.
3. Verfahren nach Ansjjruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Werte des Gegenflusses und der Spannung Mittels Anzeigeeinrichtungen, welche entlang der Säule vorgesehen sind, eingestellt werden.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Anzeigeeinrichtung ein Ther^modetektor verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Anzeigeeinrichtung ein UV-Detektor verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Anzeigeeinrichtung ein Leitfähigkeitsdetektor verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Anzeigeeinrichtung ein Potentialdetektor verwendet wird.

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