DE2905160C2

DE2905160C2 - Vorrichtung für die Erzeugung von Elutionsmittelgradienten in der Flüssigkeitschromatographie

Info

Publication number: DE2905160C2
Application number: DE2905160A
Authority: DE
Inventors: Helge Ing.(Grad.) 7500 Karlsruhe Schrenker
Original assignee: Hewlett Packard GmbH Germany
Current assignee: Hewlett Packard GmbH Germany
Priority date: 1979-02-10
Filing date: 1979-02-10
Publication date: 1981-01-08
Also published as: JPS55107954A; JPS6421361U; DE2905160B1; US4239623A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Erzeugen von Elutionsmittelgradienten in der Flüssigkeitschromatographie gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Unter Gradientenelution versteht man in der Flüssigkeitschromatographie eine kontrollierte Veränderung der Zusammensetzung der mobilen Phase, also des Elutionsmittels, während des Trennvorgangs. Der zeitliche Verlauf der Flutionsmittelzusammensetzung ist der Elutionsmittelgradient. Wegen des teilweise sehr großen Einflusses dieses Gradienten auf den Trennungsverlauf und das Analyseergebnis werden an die Reproduzierbarkeit des Gradienten hohe Anforderungen gestellt.

Bei einer bekannten Vorrichtung /um Herstellen eines Elutionsmittelgradienten werden zwei Pumpen für je eine Elutionsmittelkomponente verwendet, die beide in eine Mischkammer fördern. Beide Pumpen sind regelbar in bezug auf das von ihnen geförderte Volumen pro Zeiteinheit. Die Veränderung der Elutionsmittcl/usammcnset/ung geschieht dabei durch Veränderung der Durchfliißraten der beiden Pumpen relativ zueinander (Beispiel: US-PS 446 293). Diese Vorrichtung hat jfcdouh den wesentlichen Nachteil, daß sie an den Durchflußstellbereich der beiden Pumpen Anforderung gen stellt, die technisch nur schwer zu realisieren sind, Bei einem Gemisch aus zwei Lösungsmitteln wird z. B. eine Vefstellbarkeit jedes Anteils zwischen I und 99% verlangt. Außerdem soll auch noch did Dufchflußrate durch die Trennsäule veränderbar sein, z. B. Zwischen 0,1 und 5 ml/min, Unterhalb einer Durchflußrale von etwa 1 ml/min ist es aber kaum noch möglich, die Elutionsmittelzusammensetzung über einen großen Verstellbereich hinreichend genau zu regeln. Gerade solche kleinen Durchflußraten werden aber bei den heute möglichen leistungsfähigen kurzen Trennsäulen angestrebt

Bei einer anderen bekannten Vorrichtung zum Erzeugen von Elutionsmittelgradienten (z. B. US-PS 39 85 019) werden die Elutionsmittelkomponente.il einer einzelnen Kolbenpumpe über je ein schnell wirkendes Auf/Zu-Ventil für jede Komponente zugeführt Diese Ventile öffnen und schließen alternierend jeweils während des Saughubes der Pumpe. Die Elutionsmittelzusammensetzung wird dabei durch das relative

Öffnungszeitverhältnis der Ventile bestimmt Da elektromagnetisch betätigte Ventile aber nicht beliebig schnell schalten können, ist dieses Verfahren auf relativ langsam laufende Kolbenpumpen mit einer Hubfrequenz unter 1 Hz beschränkt und wird auch tatsächlich nur bei solchen angewendet Die Hubvolumina solcher Pumpen liegen üblicherweise zwischen 50 und 200 μΙ. Bei kleinen Durchflußraten ergeben sich daher ungünstige Verhältnisse. Die Elutionsmittelzusammensetzung ist nämlich nur in Stufen veränderbar, deren jede die Zeitdauer mindestens eines Pumpenhubs umfaßt. Beträgt die Durchflußrate beispielsweise 200 μΐ/min und beträgt das Hubvolu nen 100 μΙ, so ist nur jede halbe Minute eine Stufe in der Elutionsmittelzusammensetzung möglich.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zum Erzeugen von Elutionsmittelgradienten für die Flüssigkeitschromatographie zu schaffen, die auch bei sehr niedrigen Durchflußraten eine kontinuierliche Verstellung in einem Bereich von 1 bis 99% Lösungsmittelanteil erlaubt. Weiterhin soll der Gradientenverlauf unabhängig von der Fördergeschwindigkeit der Pumpe erfolgen. Die Lösung dieser Aufgabe ist im Ansprucn 1 gekennzeichnet.

Vorteilhafte Weiterbildungen bzw. Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kommt mit einer Pumpe aus. Die Lösungsmittelmischung erfolgt vor der Pumpe. Unmittelbar stromabwärts von der Mischkammer wird die Lös' ngsmittelzusammensetzung gemessen, und zwar vorzugsweise durch Mi-ssung der Dichte der Mischung. Da die Dichtemessung kontinuierlich erfolgt, ist eine stetige Verstellung des Mischungsverhältnisses bei gleichzeitiger Regelung auf einen

in Sollverlauf möglich. Außerdem bestehen keinerlei Schwierigkeiten an den Bereichsgrenzen (etwa 1 oder 99% Anteil eines Lösungsmittels). Durch entsprechende Auslegung der Regelschaltung lassen sich außerdem Effekte ausgleichen, die auf dem nicht idealen

ij Mischungsverhalten mancher Flüssigkeiten beruhen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels in Verbindung mit der zugehörigen Zeichnung erläutert, in welcher eine erfindtingsge mäße Vorrichtung in Form eines Schaltbildes clarge-

mi stellt ist.

In der Zeichnung sind mit Π und 13 zwei Vorratsbehälter für ein Elutionsmittel A und ein Elutionsmittel B bezeichnet. Eine Pumpe 15 saugt die beiden Eluiionsmittelkomponenten A und B über Saugleitungen 17 bzw. 19 an Und fördert das sich in einem T-Stück 21 bildende Elutiohsmiitelgemisch zu der (in der Zeichnung nicht dargestellten) Säule des Flüssigkeitschi ömatographen.

Das Mischungsverhältnis zwischen den Lösungsmittelkomponenten A und B im Elutionsmittelgemisch ist stufenlos einstellbar über Drosselventile 23 und 25, die in den Saugleitungen 17 bzw. 19 liegen. Die Drosselventile 23 und 25 sind vorzugsweise Nadelventile mit sehr kleinem Konuswinkel (ca. 1°). Die Verstellung der Ventile 23 und 25 erfolgt durch je einen Schrittmotor 27 bzw. 29.

Unter der Voraussetzung, daß die beiden Lösungsmittelkomponenten A und B verschiedene Dichten haben, ist die Dichte des sich im T-Stück 21 bildende Elutionsmittelgemische!= ein Maß für das Mischungsverhältnis. Diese Dichte wird mittels einer Dichtemeßzelle 31 kontinuierlich erfaßt. Kontinuierlich arbeitende Dichtemeßzellen sind an sich bekannt, ζ B. aus der DE-PS 2 68 353. In dieser Anordnung, die sich auch für die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet, wird die Meßflüssigkeit durch eine schwingfähige Zelle geleitet, wobei die Eigenfrequenz dieser Zelle sich mit der Dichte der Meßflüssigkeit ändert. Diese Frequenz ist also ein Maß für die Dichte.

Der von der Dichtemeßzelle 31 ermittelte -.nome.itane Dichtewert wird in einen Funktionsgenerator 33 eingegeben, in welchem der Verlauf des Miscnungsverhältnisses über der Dichte gespeichert ist und der an seinem Ausgang ein dem jeweiligen Mischungsverhältnis entsprechendes Signal abgibt. Der Funktionsgenerator 33 ist zweckmäßigerweise freiprogrammierbar, so daß er an alle vorkommenden Elutionsmittelgemische anpaßbar ist Im Idealfall besteht ein einfacher linearer Zusammenhang zwischen der Dichte und dem Mischungsverhältnis, in Wirklichkeit jedoch oft ein nichtlinearer und im allgemeinen nur empirisch zu ermittelnder Zusammenhang.

Ein weiterer Funktionsgenerator 35 dient zur Erzeugung der Sollkurve des Verlaufs des Mischungsverhältnisses über der Zeit. Auch dieser Funktionsgenerator ist freiprogrammierbar. Sein Ausgangssignal ist jedoch nicht abhängig von einem Eingangssignal, sondern ver'äuft auf ein Startsignal hin reift zeitabhängig-

Die Ausgangssignale der Funktionsgeneratoren 33 und 35 werden einem Subtrahierer 37 zugeführt, der an seinem Ausgang die Differenz dieser beiden Signale abgibt. Dieses Differenzsignal dient als Regelsignal für eine Motorsteuerung 39, die an ih-em Ausgang die Stellsignale für die Schrittmotoren 27 und 29 abgibt, derart, daß das Mischungsverhältnis am T-Stück 21 auf den momentanen Sollwert geregelt wird. Insgesamt handelt es sich hier al'^ um eine Nachlaufregelung (Servosystem).

Die aus den Funktionsgeneratoren 33 und 35. dem Subtrahierer 34 und der Motorsteuerung 39 bestehende Regeleinrichtung braucht selbstverständlich nicht unbedingt aus analogen Baueinheiten aufgebaut sein, sondern kann auch ein digitales System sein. ι. B. ein entsprechend programmierter Tischrechner oder ein speziell auf den vorliegenden Anwendungsfall zugeschnittenes Mikroprozessorsystem.

Für die passende Einstellung des Funktionsgenerators 33 gelten die folgenden Überlegungen:

Für die Dichte einer idealen Mischung gilt einzelnen Komponenten und η die Anzahl der Komponenten. Für zwei Komponente wia im vorliegenden Beispiel (n = 2) wird aus Gleichung (1)

um = ^caUa +

mit r,, + c„ =

und somit

Daraus ergibt sich bei idealer Mischung für das Verhältnis des Volumens der Komponente B zum Gesamtvolumen

_ L'm - 'Ja

^CB —

L¹B - L¹A

Daraus ist ersichtlich, daß bei idealer Mischung ein linearer Zusammenhang zwischen »„, und c_B besteht.

ία Sind die Dichten der Komponenten * und B bekannt, kann man aus <j_m also cr ermitteln.

Bei vielen realen Mischungen ist das Gesamtvolumen geringer als die Summe der Volumina der einzelnen Komponenten z. B. bei Wasser/Äthanol bis zu 4%.

η Entsprechend ist die Dichte der Mischung höher als sich aus Gleichung (1) ergibt. Dieser Umstand macht sich in Gleichung (2) im Zähler des Bruches bemerkbar und führt zu einem großen Fehler, vor allem bei kleiner Differenz zwischen »mund <j.\ bzw. {'/?und cm· Nimmt man das Volumen einer realen Mischung aus den Komponenten A und Swie folgt an:

wobei k die relative Volumenänderung mit k=f(c_B) ist, so ergibt sich

_ (V_A+V„)il+k) V_A+V_B'

dab"i bedeuten »_mr die reale Dichte der Mischung, »_m, die ideale Dichte der Mischung, m„, die Masse der Mischung und K₁ und V_n die Volumina der Komponenten.
4ϊ Für

ι A- ! «c 1 (z. B. i: * -0,04 für Wasser Äthanol) kann vereinfacht werden zu
w „_mr = (1 - A),,,,,, b/w. ,,„„ = (I + A-)»_m,

Für reale Lösungen wird Gleichung (2) also zu

(I t A|i_w -

-i

Dabeisind i'„, die Dichte der Mischung, »,,die Dichte der einzelnen Kombonenleii, c„ die Volumenanteile der Da die Abhängigkeit von k von Cn keiner einfachen physikalischen Gesetzmäßigkeit unterliegt, die für alle denkbaren Lösung^mittelmischungen gültig wäre, ist es zweckmäßig, brauchbare vereinfachende Annahmen über diese funktionell Abhängigkeit zu machen. Außerdem sollte ein einfaches Eichverfahren für die Ermittlung von k vorhanden sein, das möglichst mit nur einer einzigen Messung auskommt, Subtrahiert man die Gleichung (2) Von der Gleichung (3), so ergibt sich

_r _ „ _ 0 + k)»mr ~ ¹JΛ Um ~ Ua

Qn — 0,1

On — Pj

f. _ ("β" Cl)(^Br-C_Bi)

h. — " — " ~—— .

(4)

Für diesen Verlauf von k in Abhängigkeit von Cß_r hat sich folgende Näherung als brauchbar erwiesen, wobei ko.\ der einzige zu messende Är-Wert, und zwar bei Cßr=0,5 ist:

für c_Br < 0,25:

10

0,25

für 0,25 < CBr < 0,70:

Jt = k

Ό.5

für c„_r > ö,7Ö:

k = 3,3 A-O_-5 (\-c„_r).

15

20

Eine Überprüfung dieses Näherurigs^ und Eichverfahfiins ergab selbst für kritische WassesVÄthsnol-Gemisc'he nur maximale Abweichungen zwischen der wahren und der errechneten Konzentralion von 3%. Dadurch entstehen bei der Fliissigkeitschromatographie jedoch keine Reproduzierbärkeitsprobleme.

Für die praktische Graduefitenelution sollten noch Konzentrationen bis herab zu Cß=0i5% meßbar seih. Dazu wird zunächst vorausgesetzt, daß die Dichtedifferenz der zu mischenden Lösungsmittel den Wert 5 · IO-²gcm-³ nicht unterschreitet. Dies führt nur in wenigen Sonderfällen zu einer gewissen Einschränkung der freien Wahl der Lösungsmittel. Sollte eine solche Einschränkung tatsächlich einmal auftreten, müDle eines der vorgesehenen Lösungsmittel durchf ein solches mit abweichender Dichte aber vergleichbaren chromatographischen Eigenschaften ersetzt werden.

Für das erforderliche Auflösungsvermögen der Meßeinrichtung gilt dann folgende Grerizbetrachtung:

lim \e_m-üA I= ^lim l(?s; |C_fl(_i)„-_i)^)«2'10"⁴gcm~^J I Qn - Sa I ~> 0,05 | e, - &, | — 0,05 (5)

Dies läßt sich ohne weiteres erreichen, wenn die Temperaturkonstanz in der Dichtemeßzelle besser als 0,1° ist, was seinerseits auch keine technische Schwierigkeit darstellt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zum Erzeugen von Elutionsmittelgradienten in der Flüssigkeitschrcmatographie, bei der die einzelnen Komponenten des Elutionsmittels über verstellbare Dosiervorrichtungen einer Mischkammer zugeführt werden und anschließend das Gemisch mittels einer Pumpe in die Trennsäule gefördert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Dosiervorrichtungen (23, 25) verstellbare Strömungswiderstände sind, daß zwischen Mischkammer (21) und Pumpe (15) eine Einrichtung (31) zur Messung der Elutionsmitielzusammensetzung geschaltet ist und daß eine Regeleinrichtung (33, 35, 37, 39) vorgesehen ist, die den jeweils gemessenen Dichtewert mit einem vorgegebenen Sollwertverlauf vergleicht und dementsprechend die Strömungswiderstände derart verstellt, daß der vorgegebene SoIIv"Tt des Dichteverlaufs entsprechend einem vorgegebenen Verlauf des Mischungsverhältnisses im Elutionsmittel eingehalten wird.

2. Vorrichtung nach Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Messung der Elutionsmittelzusammensetzung eine Dichtemeßzelle (31) aufweist.

3. Vorrichtung nach Ansprucn 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verstellbaren Strömungswiderstände (23,25) durch Schrittmotoren (27,29) verstellbare Nadelventile sind.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dao die Dichtemeßzelle (31) eine vom Elutionsmittel durchströmte ui J mit diesem gefüllte Schwingkammer ist.