DE112011100752B4

DE112011100752B4 - Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung und Verfahren zum Zuführen einer Flüssigkeit zu der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung

Info

Publication number: DE112011100752B4
Application number: DE112011100752.3T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Suzuki; Masahito Ito; Hiroaki Nakagawa
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2010-03-01
Filing date: 2011-02-22
Publication date: 2014-06-26
Anticipated expiration: 2031-02-23
Also published as: CN102753970A; US20120312081A1; DE112011100752T5; JP5134636B2; WO2011108401A1; JP2011179962A

Abstract

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung mit einer Flüssigkeitszuführeinrichtung (4) zum Zuführen eines Eluents unter Veränderung des Mischungsverhältnisses von zwei oder mehr Arten von Eluenten; einer Probeninjektionseinrichtung (8) zum Injizieren einer Probe in den von der Flüssigkeitszuführeinrichtung (4) zugeführten Eluenten; einer Trennsäule (10), der der Eluent zugeführt wird, in die die Probeninjektionseinrichtung (8) die Probe injiziert hat, um eine in der Probe enthaltende Zielkomponente abzutrennen; einem Detektor (11) zum Bestimmen der von der Trennsäule (10) abgetrennten Zielkomponente; und mit einer Steuereinrichtung (13) zum Steuern des Betriebs der Flüssigkeitszuführeinrichtung (4), der Probeninjektionseinrichtung (8), der Trennsäule (10) und des Detektors (11), wobei die Steuereinrichtung (13) umfaßt eine Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahren-Speichereinheit (13c) zum Speichern eines Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit, das mit einer Änderung des Mischungsverhältnisses von zwei oder mehr Arten von Eluenten den Eluent mit einer konstanten Geschwindigkeit zuführt; eine Konstantdruckgradientenverfahren-Umwandlungseinheit (13b) zum Umwandeln des Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit in ein Gradientenverfahren mit konstantem Druck, das mit einer Änderung des Mischungsverhältnisses von zwei oder mehr Arten von Eluenten den Eluent mit einem konstanten Druck zuführt; und ...

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung, bei der das Elutionsgradientenverfahren angewendet wird.
Stand der Technik
Bei Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtungen wird zur Verkürzung der Meßzeit das Elutionsgradientenverfahren angewendet, bei dem eine Flüssigkeit unter Veränderung des Mischungsverhältnisses von zwei oder mehr Arten von Eluenten zugeführt wird. Im allgemeinen ist dabei die Fließgeschwindigkeit konstant, um zu verhindern, daß sich die Spitzenform verändert.
In der Patent-Druckschrift 1 ist ein Beispiel für eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung beschrieben, bei der das Elutionsgradientenverfahren angewendet wird.
Druckschriften zum Stand der Technik
Patent-Druckschrift

Patent-Druckschrift 1: WO 2003/079000 A1

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Problem, das mit der Erfindung gelöst werden soll
In den letzten Jahren wurden Trennsäulen mit einem Füllmaterial mit einer mittleren Teilchengröße von 2,5 Mikrometer und weniger entwickelt, kleiner als bei den bis dahin bekannten Trennsäulen. Bei den bekannten Trennsäulen mit einem Füllmaterial mit einer großen Teilchengröße (etwa 5 Mikrometer) führt eine erhöhte Fließgeschwindigkeit zu einer beeinträchtigten Spitzenform. Die Trennsäule mit einem Füllmaterial mit einer kleinen Teilchengröße ist dadurch charakterisiert, daß die Spitzenform davon im wesentlichen nicht beeinträchtigt wird.
Bei Trennsäulen mit einer kleinen Füllmaterial-Teilchengröße ist bei gleichbleibender Spitzenform die Meßzeit um so kürzer, je höher die Fließgeschwindigkeit ist, solange dabei der Druckfestigkeitsbereich der Trennsäule nicht überschritten wird.
Bei den bekannten Trennsäulen wird für jede Säule die optimale Fließgeschwindigkeit festgelegt und die Trennsäule nicht sehr oft mit einer Fließgeschwindigkeit betrieben, die davon erheblich abweicht.
Wenn das Elutionsgradientenverfahren mit zum Beispiel einer wässrigen Lösung oder einem organischen Lösungsmittel als Eluent angewendet wird, variiert der Druck bei der Messung in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis, da jede Flüssigkeit eine andere Viskosität aufweist.
Beim Stand der Technik wird das Elutionsgradientenverfahren bei Trennsäulen mit einer kleinen Füllmaterial-Teilchengröße mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit angewendet.
Die konstante Fließgeschwindigkeit wird dabei so eingestellt, daß zu dem Zeitpunkt, an dem bei der Messung der Druck am größten ist, die Druckfestigkeit der Trennsäule nicht überschritten wird.
Beim Stand der Technik wird nicht in Betracht gezogen, die Meßzeit durch Erhöhen der Fließgeschwindigkeit auf einen Wert über dem Einstellwert zu verkürzen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung zu schaffen, bei der der gleiche Trenneffekt wie mit dem Elutionsgradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit erhalten wird und dabei die Meßzeit kürzer ist. Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Zuführen einer Flüssigkeit zu der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung zu schaffen.
Mittel zum Lösen des Problems
Zur Lösung der obigen Aufgaben umfaßt die vorliegende Erfindung die folgenden Merkmale.
Eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung umfaßt nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Flüssigkeitszuführeinrichtung zum Zuführen eines Eluenten mit einer Änderung des Mischungsverhältnisses von zwei oder mehr Arten von Eluenten; eine Probeninjektionsvorrichtung zum Injizieren einer Probe in den zugeführten Eluenten; eine Trennsäule, der der Eluent zugeführt wird, in den die Probe injiziert wurde, um eine in der Probe enthaltene Zielkomponente abzutrennen; einen Detektor für die Bestimmung der abgetrennten Zielkomponente; und eine Steuereinrichtung zum Steuern des Betriebs der Flüssigkeitszuführeinrichtung, der Probeninjektionsvorrichtung, der Trennsäule und des Detektors.
Die Steuereinrichtung umfaßt eine Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahren-Speichereinheit zum Speichern eines Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit, das unter Änderung des Mischungsverhältnisses von zwei oder mehr Arten von Eluenten den Eluent mit einer konstanten Geschwindigkeit zuführt; eine Konstantdruckgradientenverfahren-Umwandlungseinheit zum Umwandeln des Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit in ein Gradientenverfahren mit konstantem Druck, das unter Änderung des Mischungsverhältnisses von zwei oder mehr Arten von Eluenten den Eluent mit einem konstanten Druck zuführt; und eine Fließgeschwindigkeits-Einstelleinheit, um die Fließgeschwindigkeit des zugeführten Eluenten gemäß dem bei der Umwandlung erhaltenen Gradientenverfahren mit konstantem Druck zu steuern.
Auswirkungen der Erfindung
Mit der vorliegenden Erfindung wird eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung, mit der in kürzerer Meßzeit der gleiche Trenneffekt wie mit dem Elutionsgradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit erhalten wird, und ein Verfahren zum Zuführen einer Flüssigkeit zu der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung erhalten.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt schematisch den Aufbau einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung, bei der die vorliegende Erfindung angewendet wird.
2 zeigt beispielhaft die Anzeige auf dem Bildschirm eines Datenprozessors zum Festlegen eines Gradientenverfahrens mit konstantem Druck bei der vorliegenden Erfindung.
3 zeigt schematisch anhand von Funktionsblöcken den Aufbau des Datenprozessors zum Ausführen des Gradientenverfahrens mit konstantem Druck bei der vorliegenden Erfindung.
4 zeigt eine beispielhafte Tabelle für das Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit bei der vorliegenden Erfindung.
5 zeigt eine beispielhafte Tabelle für das Gradientenverfahren mit konstantem Druck bei der vorliegenden Erfindung.
6 zeigt ein beispielhaftes Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit bei der vorliegenden Erfindung.
7 zeigt ein Chromatogramm, das bei einer Messung mit dem Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit der 6 erhalten wird.
8 zeigt den Verlauf der Druckwerte, die bei einer Messung mit dem Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit der 6 erhalten werden.
9 zeigt in einer Tabelle die Druckwerte zu verschiedenen Zeitpunkten in der 8 auf der Basis einer Unterteilung des Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit der 6.
10 zeigt in einer Tabelle die Daten nach der Umwandlung des Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit der 9 in ein Gradientenverfahren mit konstantem Druck.
11 zeigt ein Chromatogramm, das bei einer Messung mit dem Gradientenverfahren mit konstantem Druck der 10 erhalten wird.
12 zeigt den Verlauf der Druckwerte, die bei einer Messung mit dem Gradientenverfahren mit konstantem Druck der 10 erhalten werden.
13 ist ein Flußdiagramm für die allgemeine Arbeitsweise der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Arten der Erfindungsausführung
Anhand der beiliegenden Zeichnungen wird im folgenden eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Ausführungsform
Die 1 zeigt schematisch den Aufbau einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung, bei der die vorliegende Erfindung angewendet wird. Wie in der 1 gezeigt, werden von einem Flüssigkeitszuführungsabschnitt A5 und einem Flüssigkeitszuführungsabschnitt B6 in einer Flüssigkeitszuführpumpe 4 ein Eluent A2 und ein Eluent B3 aus einem Reagenzgestell 1 einer Probeninjektionsvorrichtung 8 zugeführt. Für die Flüssigkeitszuführungsabschnitte 5, 6 wird in der Regel eine Spritze verwendet.
Für das Elutionsgradientenverfahren wird das Mischungsverhältnis zum Beispiel durch Ändern der Betriebsgeschwindigkeit der Flüssigkeitszuführungsabschnitte 5, 6 eingestellt. In die Abgabeseite der Flüssigkeitszuführpumpe 4 ist in der Regel ein Drucksensor 7 eingebaut, um einen Fehler bei der Flüssigkeitszuführung oder einen verstopften Fließweg feststellen zu können. Von der mit der Probeninjektionsvorrichtung 8 injizierten Probe wird in einer Trennsäule 10, die zur Aufrechterhaltung einer vorgegebenen Temperatur in einem Säulenofen 9 angeordnet ist, eine Zielkomponente abgetrennt, die dann von einem Detektor 11 erfaßt wird.
Mit jeder der verschiedenen Einheiten (der Flüssigkeitszuführpumpe 4, der Probeninjektionsvorrichtung 8, dem Säulenofen 9 und dem Detektor 11) ist über ein Signalkabel 12 ein Datenprozessor 13 verbunden. Der Datenprozessor 13 steuert nicht nur den Betrieb dieser Einheiten, sondern er zeichnet auch die Signalstärke vom Detektor 11 und die Druckwerte vom Drucksensor 7 auf und speichert sie. Der Datenprozessor 13 umfaßt auch eine Anzeige, an der die notwendigen Informationen angezeigt werden.
In der Trennsäule 10 befindet sich ein Füllmaterial aus einer Anzahl von Teilchen mit einer mittleren Teilchengröße von etwa 2,5 Mikrometer oder weniger.
Die 2 zeigt einen beispielhaften Einstellbildschirm, wie er am Datenprozessor 13 angezeigt wird, wenn ein Gradientenverfahren mit konstantem Druck angewendet werden soll.
Wie in der 2 gezeigt, werden vom Benutzer an den Positionen 1 und 2 die Werte für ein Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit eingegeben. Bei dem in der 2 gezeigten Beispiel werden die Verhältnisse des Eluenten A und des Eluenten B relativ zu der verstrichenen Zeit und die Fließgeschwindigkeit festgelegt.
Die Auswahlposition 3 ermöglicht die Auswahl des Gradientenverfahrens mit konstantem Druck. Das Eingeben eines Werts an der Position 4 legt einen bestimmten Punkt (Zeitpunkt) im Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit fest, von dem an das Gradientenverfahren mit konstantem Druck auszuführen ist.
Wenn das Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit auf der Basis des Verlaufs der Druckwerte, die bei einer früheren Messung mit dem Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit erhalten wurden, in ein entsprechendes Gradientenverfahren mit konstantem Druck umgewandelt werden soll, wird dies an der Position 5 ausgewählt und an der Position 6 die zugrundezulegende Druckverlaufsdatei angegeben.
Die Positionen 7 und 8 ermöglichen die Festlegung des Bezugs-Druckwerts oder des höchsten Druckwerts im früheren Druckwertverlauf.
Die 3 zeigt schematisch die Funktionseinheiten des Datenprozessors 13 bei der vorliegenden Ausführungsform.
Wie in der 3 gezeigt, werden bei einer Umwandlung des Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit in ein entsprechendes Gradientenverfahren mit konstantem Druck auf der Basis des Verlaufs der Druckwerte, die bei einer früheren Messung mit dem Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit erhalten wurden, die in einer Druckwertverlauf-Speichereinheit 13a gespeicherten Informationen über den Druckwertverlauf und das in einer Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahren-Speichereinheit 13c gespeichert Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit zu einer Konstantdruckgradientenverfahren-Umwandlungseinheit 13b übertragen.
Das bei der Umwandlung erhaltene Gradientenverfahren mit konstantem Druck wird mittels einer Fließgeschwindigkeits-Einstelleinheit 13d und einer Mischungsverhältnis-Einstelleinheit 13e von den Flüssigkeitszuführungsabschnitten 5, 6 ausgeführt.
Die 4 zeigt in einer beispielhaften Tabelle die tatsächlich in den Zeitintervallen, in die das Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit unterteilt ist, gemessenen Druckwerte. Die 5 zeigt in einer beispielhaften Tabelle die bei der Umwandlung des Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit in das entsprechende Gradientenverfahren mit konstantem Druck erhaltenen Werte.
Wie den 4 und 5 zu entnehmen ist, wird die Fließgeschwindigkeit f_m im Gradientenverfahren mit konstantem Druck unter Verwendung des folgenden Ausdrucks (1) berechnet: f_m = F·{(P_s oder P_max)/P_m} (1), wobei m eine Zahl von 0 oder größer bezeichnet, F eine konstante Fließgeschwindigkeit, P_s einen Druckwert, der vom Benutzer auf der Basis von zum Beispiel einer garantierten Säulendruckfestigkeit festgelegt wird, P_max den maximalen Druckwert im Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit und P_m den tatsächlich gemessenen Druckwert angibt.
Dann wird die Zeit t_n im Gradientenverfahren mit konstantem Druck unter Verwendung des folgenden Ausdrucks (2) berechnet: t_n = t_n-1 + F·(T_n – T_n-1)/{(f_n-1 + f_n)/2} (2), wobei n eine Zahl von 1 oder größer bezeichnet, T_n und T_n-1 Zeiten im Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit und f_n-1 und f_n Fließgeschwindigkeiten nach der Umwandlung in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck sind.
Vorzugsweise erfolgt die Unterteilung im Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit in so kurze Zeitintervalle wie möglich. Statt in Zeitintervallen kann die Aufteilung des Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit auch anhand von Druckänderungswerten erfolgen.
Die 6 zeigt in einer Tabelle beispielhafte Meßwerte für das Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit. Die 7 zeigt das mit den Meßwerten der 6 bei dem Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit erhaltene Chromatogramm. Die 8 zeigt den dabei erhaltenen Druckwertverlauf.
Die 9 gibt in einer Tabelle die aus der 8 erhaltenen Druckwerte zu verschiedenen Zeitpunkten auf der Basis einer Unterteilung des Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit der 6 in Zeitintervalle von 0,5 min an.
Die 10 gibt in einer Tabelle die bei der Umwandlung des Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck unter Verwendung der obigen Ausdrücke (1) und (2) auf der Basis des höchsten Druckwerts im Druckwertverlauf bei 0,5 min und später erhaltenen Daten an. Die für die Messung mit dem Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit der 9 erforderliche Zeit von 10 min verkürzt sich bei dem Gradientenverfahren mit konstantem Druck der 10 auf 8,15 min.
Die Messung ist beim Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit und beim Gradientenverfahren mit konstantem Druck dann beendet, wenn die gesamte vorgegebene Flüssigkeitsmenge zugeführt wurde. Das heißt, daß bei dem Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit die gesamte vorgegebene Flüssigkeitsmenge innerhalb von 10 min zugeführt wird und beim Gradientenverfahren mit konstantem Druck die gesamte vorgegebene Flüssigkeitsmenge innerhalb von 8,15 min zugeführt wird.
Die Tabellen der 9 und 10 können auf dem Bildschirm des Datenprozessors 13 angezeigt werden, so daß die bei der Umwandlung des Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck eingesparte Zeit abgeschätzt werden kann.
Die 11 zeigt das bei der Messung mit dem bei der Umwandlung aus dem Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck erhaltene Chromatogramm. Die 12 zeigt den Druckwertverlauf bei der Messung mit dem bei der Umwandlung erhaltenen Gradientenverfahren mit konstantem Druck. Wie in der 12 zu sehen ist, bleiben die Druckwerte mit geringen Schwankungen während der Messung im wesentlichen konstant, was die Annahme erlaubt, daß ein ähnlicher Trenneffekt (11) wie bei dem Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit erhalten werden kann.
Bei einer Flüssigkeitszufuhr mit konstanter Beschleunigung ändert sich die zugeführte Flüssigkeitsmenge mit einer quadratischen Funktion. Bei einer Steuerung der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung für eine striktere Umwandlung vom Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck wird vorzugsweise das Eluentmischungsverhältnis B_x für die Zeitspanne von t_p bis t_p+1 (ein vorgegebenes Zeitintervall) im Gradientenverfahren mit konstantem Druck nach einer quadratischen Funktion verändert, zum Beispiel mit dem folgenden Ausdruck (3): B_x = B_p + [f_p·(t_x – t_p) + (t_x – t_p)·{(f_p+1 – f_p)/(t_p+1 – t₁)}·(t_x – t_p)/2]/{F·(T_p+1 – T_p)}·(B_p+1 – B_p) (3), wobei B_p ₊₁ und B_p die Eluentmischungsverhältnisse im Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit, f_p und f_p+1 die Fließgeschwindigkeiten nach der Umwandlung, t_x die gegenwärtige Zeit, T_p und T_p+1 Zeitpunkte im Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit und t₁ die Zeit nach dem Verstreichen einer vorgegebenen Zeitspanne seit dem Beginn der Messung (z. B. 0,5 min) bezeichnet bzw. bezeichnen.
Im folgenden wird eine Einstellung (Verfahrensumwandlung) auf der Basis von in Echtzeit gemessenen Druckwerten anstelle der Umwandlung in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck auf der Basis von früheren Daten über den Druckwertverlauf beschrieben.
Für die Einstellung auf Echtzeitbasis wird in der 2 die Position 9 ausgewählt und ein Wert für die Position 10 (ein bestimmter Druckwert) oder die Position 11 (der Druckwert zu Beginn der Messung) für den Bezugs-Druckwert angegeben.
Der Ablauf ist in diesem Fall der folgende.
Zu der Konstantdruckgradientenverfahren-Umwandlungseinheit 13b werden Informationen über den Druckwert zum gegenwärtigen Zeitpunkt, der mit dem Drucksensor 7 der 3 gemessen wird, und über das in der Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahren-Speichereinheit 13c gespeicherte Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit übertragen.
Die Konstantdruckgradientenverfahren-Umwandlungseinheit 13b stellt mittels der Fließgeschwindigkeits-Einstelleinheit 13d die Fließgeschwindigkeit am Flüssigkeitszuführungsabschnitt 5, 6 so ein, daß der an der Position 10 oder 11 der 2 angegebene Bezugs-Druckwert erreicht wird.
Parallel dazu berechnet die Konstantdruckgradientenverfahren-Umwandlungseinheit 13b auf der Basis von zum Beispiel der Motordrehzahl der Flüssigkeitszuführpumpe 4 die seit dem Beginn der Messung insgesamt zugeführte Flüssigkeitsmenge. Zum Beispiel werden, wenn die gesamte zugeführte Flüssigkeitsmenge 10 ml ist, die Flüssigkeitszuführungsabschnitte 5 und 6 mittels der Mischungsverhältnis-Einstelleinheit 13e so eingestellt, daß im Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min nach 10 min ein vorgegebenes Mischungsverhältnis erreicht ist.
Die 13 zeigt ein Flußdiagramm für die obige Arbeitsweise. Der Datenprozessor 13 steuert die verschiedenen Einheiten so, daß dieser Ablauf ausgeführt wird.
Im Schritt S1 der 13 werden Daten in die Positionen 1 und 2 der 2 eingegeben. Im Schritt S2 wird festgestellt, ob das Gradientenverfahren mit konstantem Druck anzuwenden ist. Wenn das Gradientenverfahren mit konstantem Druck nicht anzuwenden ist, geht der Prozeß zum Schritt S12 weiter, und es wird das Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit ausgeführt.
Wenn im Schritt S2 festgestellt wird, daß das Gradientenverfahren mit konstantem Druck anzuwenden ist, geht der Prozeß zum Schritt S3 weiter, und es werden die Daten an der Position 4 der 2 eingegeben. Im Schritt S4 wird ausgewählt, ob die Umwandlung in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck auf der Basis des Verlaufs von früher gewonnenen Druckwerten (Position 5) oder auf der Basis von in Echtzeit gemessenen Druckwerten (Position 9) erfolgen soll.
Wenn im Schritt S4 ausgewählt wird, daß die Umwandlung in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck auf der Basis des Verlaufs von früher gemessenen Druckwerten (Position 5) erfolgen soll, geht der Prozeß zum Schritt S5 über. Die Datei mit dem früheren Druckwertverlauf wird dabei ausgewählt. Die ausgewählte Verlaufsdatei wird am Bildschirm angezeigt (Schritt S6) und der Druckwert festgelegt (Schritt S7).
Dann wird das Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck umgewandelt (Schritt S8), und es werden die Zahlen für das bei der Umwandlung erhaltene Gradientenverfahren mit konstantem Druck (10) auf dem Bildschirm angezeigt.
Anschließend wird festgestellt, ob das Gradientenverfahren mit konstantem Druck mit diesen Zahlen ausgeführt werden soll (Schritt S10). Wenn die Ausführung praktikabel erscheint, geht der Prozeß zum Schritt S11 weiter, und das Verfahren wird mit den angezeigten Zahlen ausgeführt.
Wenn im Schritt S10 festgestellt wird, daß eine Ausführung mit den angezeigten Zahlen nicht erwünscht ist, kehrt der Prozeß zum Schritt S5 zurück und beginnt wieder mit der Auswahl der Datei mit dem Verlauf der Druckwerte.
Wenn im Schritt S4 die Position 9 ausgewählt wird, geht der Prozeß zum Schritt S13 weiter, und es werden der Bezugs-Druckwert und der Druckwert zu Beginn der Messungen eingegeben. Es erfolgt dann die tatsächliche Messung (Schritt S14) und die Umwandlung des Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit auf der Basis der tatsächlichen Messung in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck (Schritt S15).
Im Schritt S16 wird die tatsächliche Messung auf dem Bildschirm angezeigt. Es wird dann festgestellt, ob eine Ausführung mit den angezeigten Zahlen erwünscht ist (Schritt S17). Wenn die Ausführung praktikabel erscheint, geht der Prozeß zum Schritt S18 weiter, und das Verfahren wird mit den angezeigten Zahlen ausgeführt.
Wenn im Schritt S17 festgestellt wird, daß eine Ausführung mit den angezeigten Zahlen nicht erwünscht ist, kehrt der Prozeß zum Schritt S13 zurück und beginnt wieder mit der Eingabe des Bezugs-Druckwerts und anderer Daten.
Wie beschrieben wird bei der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Fließgeschwindigkeit des Eluenten so gesteuert, daß ein optimaler maximaler Druck erreicht wird. Wenn eine Trennsäule mit einem Füllmaterial mit einer kleinen Teilchengröße (die mittlere Teilchengröße sollte etwa 2,5 Mikrometer sein) verwendet wird, kann innerhalb des Bereichs des maximalen Drucks die Fließgeschwindigkeit des Eluenten erhöht werden, so daß die Analysezeit kürzer wird. Bei einer Trennsäule mit einer kleinen Teilchengröße des Füllmaterials kann eine vorgegebene oder bessere Spitzenform auch mit einer erhöhten Fließgeschwindigkeit erhalten werden, solange die Druckfestigkeit der Trennsäule nicht überschritten wird.
Mit der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung mit dem gleichen Trenneffekt wie bei dem Elutionsgradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit in kürzerer Meßzeit und ein Verfahren zum Zuführen einer Flüssigkeit zu der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung erhalten.
Bei längerem Gebrauch der Trennsäule setzt sich diese durch den in der Probe oder im Eluent enthaltenen Staub allmählich zu, wodurch der Druck ansteigt, auch wenn immer der gleiche Eluent mit derselben Zusammensetzung mit der gleichen Fließgeschwindigkeit zugeführt wird.
Bei einer Messung mit einer Umwandlung in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck auf Echtzeitbasis nimmt daher die Spitzenelutionszeit zu. Um die Elutionszeit reproduzierbar zu machen, können die folgenden Maßnahmen ergriffen werden. Die Umwandlung erfolgt ein erstes Mal auf Echtzeitbasis, wobei die Änderungen in der Fließgeschwindigkeit und im Mischungsverhältnis während dieser Periode aufgezeichnet werden; bei nachfolgenden Messungen wird nicht der Druckwert zum gegenwärtigen Zeitpunkt verwendet, sondern es werden statt dessen die vorher aufgezeichneten Änderungen in der Fließgeschwindigkeit und im Mischungsverhältnis verwendet.
Vorzugsweise wird die vorliegende Erfindung bei einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung mit einer Trennsäule mit einem Füllmaterial mit einer kleinen Teilchengröße (einer mittleren Teilchengröße von etwa 2,5 Mikrometern) angewendet. Die vorliegende Erfindung ist jedoch auch anwendbar bei Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtungen mit einer Trennsäule mit einem Füllmaterial mit der üblichen Teilchengröße (einer mittleren Teilchengröße von etwa 5 Mikrometern).
Bei einer Trennsäule mit einem Füllmaterial mit der üblichen Teilchengröße kann eine erhöhte Fließgeschwindigkeit die Spitzenform beeinträchtigen, allerdings wird auch die Meßzeit verkürzt.
Eine Trennsäule mit einem Füllmaterial mit der üblichen Teilchengröße ist dann geeignet, wenn eine kürzere Meßzeit erwünscht ist, auch wenn dabei die Meßgenauigkeit verringert ist.
Die Beeinträchtigung der Spitzenform kann durch geeignete Softwareprozesse abgemildert werden.
Bezugszeichenliste

1: Reagenzgestell
2: Eluent A
3: Eluent B
4: Flüssigkeitszuführpumpe
5: Flüssigkeitszuführungsabschnitt A
6: Flüssigkeitszuführungsabschnitt B
7: Drucksensor
8: Probeninjektionsvorrichtung
9: Säulenofen
10: Trennsäule
11: Detektor
12: Signalkabel
13: Datenprozessor
13a: Druckwertverlauf-Speichereinheit
13b: Konstantdruckgradientenverfahren-Umwandlungseinheit
13c: Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahren-Speichereinheit
13d: Fließgeschwindigkeits-Einstelleinheit
13e: Mischungsverhältnis-Einstelleinheit

Claims

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung mit einer Flüssigkeitszuführeinrichtung (4) zum Zuführen eines Eluents unter Veränderung des Mischungsverhältnisses von zwei oder mehr Arten von Eluenten; einer Probeninjektionseinrichtung (8) zum Injizieren einer Probe in den von der Flüssigkeitszuführeinrichtung (4) zugeführten Eluenten; einer Trennsäule (10), der der Eluent zugeführt wird, in die die Probeninjektionseinrichtung (8) die Probe injiziert hat, um eine in der Probe enthaltende Zielkomponente abzutrennen; einem Detektor (11) zum Bestimmen der von der Trennsäule (10) abgetrennten Zielkomponente; und mit einer Steuereinrichtung (13) zum Steuern des Betriebs der Flüssigkeitszuführeinrichtung (4), der Probeninjektionseinrichtung (8), der Trennsäule (10) und des Detektors (11), wobei die Steuereinrichtung (13) umfaßt eine Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahren-Speichereinheit (13c) zum Speichern eines Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit, das mit einer Änderung des Mischungsverhältnisses von zwei oder mehr Arten von Eluenten den Eluent mit einer konstanten Geschwindigkeit zuführt; eine Konstantdruckgradientenverfahren-Umwandlungseinheit (13b) zum Umwandeln des Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit in ein Gradientenverfahren mit konstantem Druck, das mit einer Änderung des Mischungsverhältnisses von zwei oder mehr Arten von Eluenten den Eluent mit einem konstanten Druck zuführt; und eine Fließgeschwindigkeits-Einstelleinheit (13d) zum Steuern der Fließgeschwindigkeit des von der Flüssigkeitszuführeinrichtung (4) zugeführten Eluenten gemäß dem bei der Umwandlung durch die Konstantdruckgradientenverfahren-Umwandlungseinheit (13b) erhaltenen Gradientenverfahren mit konstantem Druck.
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 1, mit des weiteren einem Drucksensor (7) zum Messen des Drucks des von der Flüssigkeitszuführeinrichtung (4) zugeführten Eluenten, wobei die Steuereinrichtung (13) eine Druckwertverlauf-Speichereinheit (13a) zum Speichern der vom Drucksensor (7) gemessenen Druckwerte umfaßt, und wobei die Konstantdruckgradientenverfahren-Umwandlungseinheit (13b) der Steuereinrichtung (13) das Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit auf der Basis der in der Druckwertverlauf-Speichereinheit (13a) gespeicherten Druckwerte in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck umwandelt.
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 1, mit des weiteren einem Drucksensor (7) zum Messen des Drucks des von der Flüssigkeitszuführeinrichtung (4) zugeführten Eluenten, wobei die Steuereinrichtung (13) das Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit auf der Basis der vom Drucksensor (7) gemessenen gegenwärtigen Druckwerte und der Menge des von der Flüssigkeitszuführeinrichtung (4) zugeführten Eluenten in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck umwandelt.
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 2, wobei die Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahren-Speichereinheit (13c) eine Anzahl von Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit speichert; die Steuereinrichtung (13) eine Einstelleinheit (13d) umfaßt, mit der eines der Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit und eine Fließgeschwindigkeit festgelegt werden; und wobei die Konstantdruckgradientenverfahren-Umwandlungseinheit (13b) das Gradientenverfahren mit konstanter Geschwindigkeit auf der Basis des Gradientenverfahrens mit konstanter Geschwindigkeit und der Fließgeschwindigkeit, die in der Einstelleinheit (13d) festgelegt wurden, in das Gradientenverfahren mit konstantem Druck umwandelt.
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 4, wobei in der Einstelleinheit (13d) der Zeitpunkt festgelegt wird, an dem das Gradientenverfahren mit konstantem Druck anzuwenden ist; und wobei die Steuereinrichtung (13) nach dem festgelegten Zeitpunkt die Fließgeschwindigkeit des von der Flüssigkeitszuführeinrichtung (4) zugeführten Eluenten gemäß dem bei der Umwandlung erhaltenen Gradientenverfahren mit konstantem Druck steuert.
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 2, wobei die Steuereinrichtung (13) eine Anzeige umfaßt, an der Daten über die Beziehung zwischen der verstrichenen Zeit gemäß dem bei der Umwandlung erhaltenen Gradientenverfahren mit konstantem Druck, dem Mischungsverhältnis des Eluenten und der Fließgeschwindigkeit angezeigt werden.
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 3, wobei die Steuereinrichtung (13) eine Anzeige umfaßt, an der der gegenwärtige Druckwert angezeigt wird, der vom Drucksensor (7) gemessen wird.
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Trennsäule (10) ein Füllmaterial mit einer Anzahl von Teilchen enthält, wobei jedes Teilchen eine mittlere Teilchengröße von etwa 2,5 Mikrometern oder weniger aufweist.
Verfahren zum Zuführen einer Flüssigkeit zu einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung, der ein Eluent unter Änderung des Mischungsverhältnisses von zwei oder mehr Arten von Eluenten zugeführt wird, wobei in den zugeführten Eluenten eine Probe injiziert wird, der Eluent, in den die Probe injiziert wurde, einer Trennsäule (10) zugeführt wird, und eine in der Probe enthaltene Zielkomponente abgetrennt und mit einem Detektor (11) die abgetrennte Zielkomponente bestimmt wird, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Speichern eines Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahrens zum Zuführen des Eluenten mit einer konstanten Geschwindigkeit, während das Mischungsverhältnis von zwei oder mehr Arten von Eluenten verändert wird; Umwandeln des Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahrens in ein Konstantdruckgradientenverfahren zum Zuführen des Eluenten mit einem konstanten Druck, während das Mischungsverhältnis von zwei oder mehr Arten von Eluenten verändert wird; und Steuern der Fließgeschwindigkeit des zugeführten Eluenten gemäß dem bei der Umwandlung erhaltenen Konstantdruckgradientenverfahren.
Verfahren zum Zuführen einer Flüssigkeit zu einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 9, mit den weiteren Schritten Messen des Drucks des zugeführten Eluenten; und Speichern des gemessenen Druckwerts, wobei das Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahren auf der Basis der gespeicherten Druckwerte in das Konstantdruckgradientenverfahren umgewandelt wird.
Verfahren zum Zuführen einer Flüssigkeit zu einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 9, mit dem weiteren Schritt Messen des Drucks des zugeführten Eluenten; wobei das Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahren auf der Basis des gemessenen gegenwärtigen Druckwerts und der Menge an zugeführtem Eluent in das Konstantdruckgradientenverfahren umgewandelt wird.
Verfahren zum Zuführen einer Flüssigkeit zu einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 10, mit dem weiteren Schritt Speichern einer Anzahl von Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahren, wobei eines der Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahren und eine Fließgeschwindigkeit festgelegt werden; und wobei das Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahren auf der Basis des festgelegten Konstantgeschwindigkeitsgradientenverfahrens und der festgelegten Fließgeschwindigkeit in das Konstantdruckgradientenverfahren umgewandelt wird.
Verfahren zum Zuführen einer Flüssigkeit zu einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 12, wobei der Zeitpunkt festgelegt wird, ab dem das Konstantdruckgradientenverfahren anzuwenden ist; und wobei die Fließgeschwindigkeit des von der Flüssigkeitszuführeinrichtung (4) zugeführten Eluenten nach dem festgelegten Zeitpunkt gemäß dem bei der Umwandlung erhaltenen Konstantdruckgradientenverfahren gesteuert wird.
Verfahren zum Zuführen einer Flüssigkeit zu einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 10, wobei Daten für die Beziehung zwischen der verstrichenen Zeit gemäß dem bei der Umwandlung erhaltenen Konstantdruckgradientenverfahren, dem Mischungsverhältnis des Eluenten und der Fließgeschwindigkeit an einer Anzeige angezeigt werden.
Verfahren zum Zuführen einer Flüssigkeit zu einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 11, wobei der gemessene gegenwärtige Druckwert an einer Anzeige angezeigt wird.
Verfahren zum Zuführen einer Flüssigkeit zu einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographievorrichtung nach Anspruch 9, wobei die Trennsäule (10) ein Füllmaterial mit einer Anzahl von Teilchen enthält, wobei jedes Teilchen eine mittlere Teilchengröße von etwa 2,5 Mikrometern oder weniger aufweist.