DE102005020286A1

DE102005020286A1 - Verfahren zur Applikation wässriger Lösungen mit unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen an lebenden Zellen bzw. an isolierten Membran-Patches von Zellen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE102005020286A1
Application number: DE102005020286A
Authority: DE
Inventors: Klaus Prof. Dr. med. habil. Benndorf; Günter Dipl.-Ing. Ditze; Günther SAMMLER
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2005-04-26
Publication date: 2006-11-09

Abstract

Aufgabe war es, mit hoher Präzision und möglichst geringem Verfahrens- und Handhabungsaufwand eine Vielzahl definiert unterschiedlicher Wirkstoff-Konzentrationen einer zu testenden Substanz in kurzer Zeit an den Applikationsort (7) der Zelle zu bringen. DOLLAR A Erfindungsgemäß werden zumindest zwei Lösungen (3, 4) verschiedener Wirkstoffkonzentration in unmittelbarer Nähe des Applikationsortes (7) mit einem wählbaren Mengenverhältnis in einer Mischkammer (8) miteinander vermischt. DOLLAR A Das Verfahren findet Anwendung, um Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen von zu applizierenden Substanzen an Zellen und isolierten Membran-Patches schneller und genauer messen zu können.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Applikation wässriger Lösungen mit unterschiedlichen (insbesondere beliebig wählbaren) Wirkstoffkonzentrationen an lebenden Zellen bzw. an isolierten Membran-Patches von Zellen, um Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen dieser applizierten Lösungen (Wirkstoffe) als Zellreaktion messen zu können. Des Weiteren wird eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens angegeben.

Elektrophysiologisch werden ganze Zellen oder isolierte (exzidierte) Membran-Patches untersucht, indem diese mit vorgegebenen intra- und extrazellulären Salzlösungen über einen Giga-Seal an der Spitze einer Patch-Pipette fixiert werden und die Ionenströme mittels geeigneter Verstärkertechnik bei der gewünschten Membranspannung gemessen werden (O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann und F. J. Sigworth: Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches, Pflügers Archiv 391, 1981, 85–100). Die Badlösung (intrazelluläre Lösung bei isolierten Membranpatches bzw. extrazelluläre Lösung bei Ganzzellableitungen) kann verändert werden, indem das große Reservoir des Bades durch eine andere Lösung ersetzt wird oder indem Lösungsapplikationssysteme eingesetzt werden. Lösungsapplikationssysteme bestehen bisher aus einer Anzahl dünner Röhrchen, die jeweils eine Lösung mit einer vorgegebenen Konzentration einer zu testenden Substanz enthalten. Die Anzahl der Röhrchen beträgt typischerweise 2 bis 12. Die Zelle bzw. der isolierte Patch wird mit diesen Lösungen nacheinander überspült. Größere Anzahlen von Lösungen, und damit Röhrchen, sind im Allgemeinen nicht sinnvoll, da der Lösungswechsel zu lang dauert und somit die Ableitbedingungen nicht ausreichend stabil sind. Bei Untersuchungen zur Messung des konzentrationsabhängigen Effektes dieser Substanz ist es so nur möglich, die Messwerte für die vorgegebene Anzahl von Konzentrationen (Röhrchen) zu erhalten. Für die genaue Messung von Effekten in Abhängigkeit von der Konzentration der Substanz sind diese Messungen oft nicht aussagefähig.

Eine weitere Begrenzung ergibt sich für die Ermittlung der Konzentrations-Wirkungsbeziehung daraus, dass für jede zu testende Konzentration ein eigenes Vorratsgefäß plus Zuleitung eingesetzt werden muss. Für Substanzen, die nur in kleinen Mengen vorhanden oder sehr teuer sind, ist die Ermittlung der Konzentrations-Wirkungsbeziehung dann häufig nicht möglich.

Es ist deshalb die Aufgabe der Erfindung, mit hoher Präzision und möglichst geringem Verfahrens- und Handhabungsaufwand eine Vielzahl definiert unterschiedlicher Wirkstoff-Konzentrationen einer zu testenden Substanz in kurzer Zeit an den Applikationsort der Zelle zu bringen.

Erfindungsgemäß werden die Wirkstoffkonzentrationen einer zu testenden Substanz nicht wie bisher vor dem Experiment jeweils als separate Applikationslösungen einzeln hergestellt und zum Applikationsort geführt, sondern es wird aus zumindest zwei Lösungen verschiedener Wirkstoffkonzentrationen jeweils eine Applikationslösung gemischt. Die Ausgangslösungen werden vorzugsweise in an sich bekannten Präzisionskolbenspritzen aufgenommen, getrieben von Schrittmotor-gesteuerten Spritzenpumpen über Stahlleitungen zu einer mikroskopisch kleinen Mischkammer in der Nähe des der Zelle bzw. des isolierten Membran-Patches der Zelle transportiert, wobei sie unmittelbar nahe dem Applikationsort einstellbar definiert gemischt und nach der Vermischung über ein kurzes, dünnes Röhrchen appliziert werden.

Mit der Vermischung entfällt der technisch-ökonomische Verfahrensaufwand, wie auch der Zeitaufwand, im Vorfeld der Applikation entsprechend der vorgesehene Wirkstofftests eine vorbestimmte Anzahl von Ausgangslösungen mit jeweiliger Wirkstoffkonzentration bereitzustellen und diese Ausgangslösungen dann im Experiment jeweils nacheinander separat an den Applikationsort zu transportieren. Auf Grund dieses Aufwands war in der Praxis bisher die Applikation auf ca. 12 unterschiedliche Wirkstoffkonzentrationen pro Minute begrenzt.

Das erfindungsgemäße Mischungsverfahren erlaubt hingegen, dass beliebig fein abgestufte Konzentrationssprünge auf universell anwendbare Weise, in kürzester Zeit, mit geringem Aufwand sowie durch einfachste Handhabung aus nur wenigstens zwei Ausgangslösungen hergestellt und exakt appliziert werden können, wobei nahezu kontinuierliche Konzentrationsänderungen ermöglicht werden. Die Lösungen für die besagte Vielzahl der Konzentrationsvarietät brauchen nicht extra hergestellt oder durch aufwendige Vorrichtungen und Handhabungen zum Applikationsort transportiert zu werden. Vielmehr wird das gesamte Konzentrationsprofil mit allen Konzentrationsänderungen unmittelbar zur Applikation möglichst nahe am Ort der Einwirkung auf die lebende Zelle bzw. auf den Membran-Patch der Zelle aus dem Vorrat der zumindest zwei Ausgangslösungen generiert sowie mit hoher Präzision sofort zur Anwendung gebracht.

Vorzugsweise stehen die Schrittmotor-gesteuerten Pumpen für den Transport der Lösungen mit einer programmierbaren Steuereinrichtung, beispielsweise einem Computer mit geeigneten Steuer- bzw. Wandlerstufen in Verbindung. Auf diese Weise können im Gegensatz zum bekannten Stand der Technik mit hoher Präzision beispielsweise bis zu 20 verschiedene Wirkstoffkonzentrationen der zu testenden Substanz pro Sekunde appliziert werden. Das Konzentrationsprofil in Abhängigkeit von der Zeit kann vorteilhaft über das Computerprogramm vollständig frei gewählt werden. Dies erlaubt z. B. auch die Testung von Effekten in Abhängigkeit der Geschwindigkeit der Änderung der Substanzkonzentration.

Die Erfindung soll nachstehend anhand eines in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert werden.
Zumindest zwei Vorratsbehälter 1, 2, beispielsweise an sich bekannte Präzisionskolbenspritzen, in welchen sich wässrige Lösungen 3, 4 jeweils unterschiedlicher Wirkstoffkonzentration einer an lebenden Zellen bzw. an isolierten Membran-Patches von Zellen zu testenden Substanz befinden, stehen über Stahlleitungen 5, 6 mit einer möglichst nahe einem Applikationsort 7 der lebenden Zelle bzw. dem isolierten Membran-Patch angeordneten Mischkammer 8 in Verbindung. In dieser mikroskopisch kleinen Mischkammer 8 werden die zumindest zwei Lösungen 3, 4 miteinander zwecks Einstellung einer definierten zu applizierenden Wirkstoffkonzentration der besagten Substanz vermischt sowie anschließend, angedeutet durch Pfeildarstellung, über ein kurzes, dünnes Röhrchen 9 zum Applikationsort 7 gebracht. Eine mit einem geeigneten Verstärker verbundene Pipette 10 am Applikationsort 7 misst den elektrischen Strom in der lebenden Zelle bzw. am isolierten Patch in Abhängigkeit von der Wirkstoffapplikation und ist zu deren Auswertung über eine Analog/Digital-Stufe 11 an einen Rechner 12 angeschlossen.
Das Mischungsverhältnis der Lösungen 3, 4 in der Mischkammer 8 wird durch die Strömungsgeschwindigkeiten der Lösungen 3, 4 eingestellt, indem diese mit jeweils definierter Strömungsgeschwindigkeit durch gesteuerte Pumpen 13, 14 aus den Vorratsbehältern 1, 2 in die Mischkammer gepumpt werden.
Zur programmgesteuerten Einstellung stehen die Pumpen über eine Steuerstufe 15 mit dem Rechner 12 in Verbindung. Vorteilhaft eignen sich Schrittmotor-gesteuerte Pumpen, wobei die Schrittmotoren über entsprechende Schrittschaltstufen als Steuereinheit 15 digital und reproduzierbar sehr hochauflösend vom Rechner 12 betrieben werden können (aus Übersichtsgründen nicht explizit in der Zeichnung dargestellt).
Für die Herstellung der Applikationslösung (Mischung der Lösungen 3, 4) können diese als Ausgangslösungen jeweils beide den Wirkstoff der zu testenden Substanz in unterschiedlicher Konzentration enthalten. Es ist jedoch auch möglich, dass lediglich eine der beiden Lösungen 3, 4 den besagten Wirkstoff enthält, wobei die jeweils andere Ausgangslösung die Wirkstoffkonzentration "Null" aufweist.
Um ein variables Mischungsverhältnis mit wählbarer Wirkstoffkonzentration für die Applikation zu erhalten, sind zumindest zwei Ausgangslösungen verschiedener Wirkstoffkonzentration erforderlich. Es besteht hingegen auch die Möglichkeit, aus nicht näher ausgeführten Gründen mehr als zwei Ausgangslösungen unterschiedlicher Wirkstoffkonzentration zur Vermischung vorzusehen. In der Zeichnung soll diese Möglichkeit als Option mit gestrichelter Darstellung zum Einsatz des Vorratsbehälters 16 mit der Lösung 17, der Stahlleitung 18 sowie der Pumpe 19 angedeutet werden. In diesem Fall würde die Applikationslösung aus drei Ausgangslösungen (Lösungen 3, 4, 17) über die Stahlleitungen 5, 6, 18 in der Mischkammer 8 erzeugt. Die Einstellung des Mischungsverhältnisses erfolgt programmgesteuert vom Rechner 12 über die Pumpen 13, 14, 19.

1, 2, 16: Vorratsbehälter
3, 4, 17: Lösung
5, 6, 18: Stahlleitung
7: Applikationsort
8: Mischkammer
9: Röhrchen
10: Pipette
11: Analog/Digital-Wandler
12: Rechner
13, 14, 19: Pumpe
15: Steuereinheit

Claims

Verfahren zur Applikation wässriger Lösungen mit unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen an lebenden Zellen bzw. an isolierten Membran-Patches von Zellen, bei dem eine Anzahl definiert unterschiedlicher Wirkstoffkonzentrationen der zu untersuchenden Lösung an den Applikationsort gebracht werden, um Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen als Zellreaktion auf den applizierten Wirkstoff messen zu können, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei Lösungen verschiedener Wirkstoffkonzentration in unmittelbarer Nähe des Applikationsortes in einem wählbaren Mengenverhältnis miteinander vermischt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine der zumindest zwei zu vermischenden Lösungen die Wirkstoffkonzentration 'Null' aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass alle zu vermischenden Lösungen eine von 'Null' abweichende Wirkstoffkonzentration besitzen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösungen unmittelbar nach ihrer Vermischung an die Zelle bzw. an den isolierten Membran-Patch der Zelle appliziert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Einstellung des Mischungsverhältnisses die Flussgeschwindigkeiten der zur Vermischung vorgesehenen Lösungen verändert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussgeschwindigkeiten der zu mischenden Lösungen durch Veränderung der Pumpleistungen für die Lösungen verändert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Einstellung des Mischungsverhältnisses rechentechnisch gesteuert wird.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest zwei Lösungen (3, 4) in Vorratsbehältern, beispielsweise Präzisionskolbenspritzen (1, 2), aufgenommen werden, welche zum Zweck der Vermischung der Lösungen, über Stahlleitungen (5, 6) mit einer vorzugsweise mikroskopisch kleinen Mischkammer (8) unmittelbar nahe dem Applikationsort (7) in Verbindung stehen, und dass Pumpen (13, 14) für einen Transport der Lösungen (3, 4) zur Mischkammer (8) mit präzise einstellbarer Flussgeschwindigkeit vorgesehen sind.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass zur Einstellung der Flussgeschwindigkeit durch Schrittmotoren gesteuerte Pumpen (13, 14) vorgesehen sind.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Schrittmotoren der Pumpen (13, 14) zum Zweck ihrer Steuerung mit einer programmierbaren Steuerstufe (12), beispielsweise einem Rechner, in Verbindung stehen.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass an den Ausgang der Mischkammer (8) ein kurzes, dünnes Röhrchen (9) zur Applikation der Lösungsmischung mit der durch die Vermischung eingestellten Wirkstoffkonzentration angeschlossen ist.