DE10003416A1

DE10003416A1 - Verfahren zur Dosierung exakter Volumina von Flüssigkeiten in eine Vorlage sowie dafür geeignete Vorrichtung

Info

Publication number: DE10003416A1
Application number: DE2000103416
Authority: DE
Inventors: Arne Buchholz; Ralf Takors; Christian Wandrey
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2000-01-27
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2001-08-16

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Dosierung exakter Volumina von Flüssigkeiten in einer Vorlage, bei der ein sich in der Zuleitung befindendes Flüssigkeitselement, welches frei von Gasblasen ist, durch Beaufschlagung von Druck in Verbindung mit einem dem zu dosierenden Volumen entsprechend berechneten Öffnungsteil eines Ventils aus der Zuleitung in die Vorlage gefördert wird. Das Ventil wird so schnell geschlossen, daß die geförderte Flüssigkeitsmenge ohne Abriß und, bedingt durch die Kapillarkräfte des Austritts der Zuleitung, im Austrittsbereich der Zuleitung verbleibt. Vorzugsweise erfolgt die Zuleitung in einem Bereich unterhalb des Flüssigkeitsspiegels der Vorlage. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der dafür geeigneten Vorrichtung ist es möglich, Volumina extrem exakt und besonders schnell in eine Vorlage einzudosieren. Durch intensives Verrühren der Vorlage findet eine schnelle Durchmischung und somit Homogenisierung der Lösung statt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Dosierung exakter Volumina von Flüssigkeiten in eine Vorlage nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie eine für die Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung.

Die Untersuchung dynamischer Stoffwechselvorgänge in Zellen ist in der biologischen Forschung von großem Interesse. Zellen, insbesondere Mikroorganismen, die Untersuchungen zu dynamischen Stoffwechselvorgängen unterzogen werden sollen, befinden sich unter normalen Versuchsbedingungen in einem Stoffwechselgleichgewicht. Die Untersuchung dynamischer Stoffwechselvorgänge und damit verbunden dynamischer Metabolitkonzentration in Mikroorganismen setzt eine Anregung des Stoffwechsels aus einem substratlimitierten Fließgleichgewichtszu stand voraus. Zur Untersuchung dieser dynamischen Stoffwechselvorgänge in Zellen müssen Mikroorganismen daher kontinuierlich substratlimitiert kultiviert wer den und anschließend durch schnelle Zugabe eines limi tierenden Substrats aus diesem metabolischen Gleichge wicht ausgelenkt werden. Mikroorganismen reagieren jedoch in wenigen 100 ms auf Veränderungen der Medien zusammensetzung, wie aus der Veröffentlichung Black, J. Bacteriol., 153, S. 1187-1195, zu entnehmen ist. Um die Dynamik der Stoffwechselvorgänge zu analysieren, müssen daher während und nach der Zugabe des limitierenden Substrates dem Reaktionssystem Proben entnommen werden. Eine Möglichkeit für eine schnelle Probenahme ist in dem deutschen Patent mit der Nummer 197 05 289 C1 bekannt. Da zur Analyse der Stoffwechselvorgänge Proben grundsätzlich aus dem gesamten Kulturvolumen entnommen werden müssen, ist es aufgrund der Tatsache, daß die Mikroorganismen innerhalb von wenigen 100 msec auf Ver änderungen der Medienzusammensetzung reagieren können und dem Erfordernis, daß zu einem möglichst genau defi nierten Zeitpunkt an jeder Stelle des Kulturvolumens von Anfang an dieselbe Konzentration limitierenden Sub strats vorhanden ist, notwendig, eine besonders schnelle, aber auch exakte Zugabe des Substrats vorzu nehmen. Nur unter diesen Bedingungen ist es möglich, sofort nach der Substratzugabe, aus jedem beliebigen Volumenelement der die Mikroorganismen enthaltenden Vorlage eine Probe zu entnehmen, welche sich bezüglich ihrer Konzentration am limitierenden Substrat und somit ihrer Ausgangssituation bezüglich der kinetischen Untersuchungen nicht von einer anderen Stelle des Kul turmediums unterscheidet.

Um Kulturmedien möglichst schnell mit für die Limitie rung dynamischer Stoffwechselvorgänge verantwortlichen Substanzen zu versehen, wurden nach dem Stand der Tech nik Spritzen verwendet, wie sie aus Theobald, U.; Mailinger, W.; Baltes, M.; Rizzi, M.; Reuss, M., (1997), In Vivo Analysis of Metabolic Dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental Observations; Biotechnology and Bioengeneering, Vol. 55 (305-316) bekannt sind. Weiterhin wurden bisher Reservoirs mit Injektionsrohren unter Zuhilfenahme von Druckluft ver wendet (Buchholz, Arne (1998); Reaktionstechnische Untersuchungen zur Dynamik intrazellulärer Metabolite in Escherichia coli K12; Diplomarbeit: Universität Bonn und Schäfer Ulrike, (1999); Automatisierte Probenahme zur Messung intrazellulärer Metabolitdynamiken; Disser tation: Universität Bonn). Die von Theobald, U.; Mailinger, W.; Baltes, M.; Rizzi, M.; Reuss, M., (1997) in "In Vivo Analysis of Metabolic Dynamics in Saccharo myces cerevisiae", I. Experimental Observations, Bio technology and Bioengeneering, Vol. 55 (305-316) einge setzten Spritzen haben den Nachteil, daß sie nur einmal verwendet werden können und daß nur eine einmalige langsame Zugabe von Substrat mit einem vorgegebenen Volumen erfolgen kann. Die Verwendung eines Reservoirs mit Injektionsrohr unter Zuhilfenahme von Druckluft führt zu dem Nachteil, daß der durch Druckluft bedingte pulsartige Anstieg des Druckes im Reaktor, in welchem sich das Kulturmedium befindet, durch ein Ventil ausge glichen werden muß. Das kommt beispielsweise dann zum Tragen, wenn die Mikroorganismen physiologisch auf Druckänderungen reagieren.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, mit denen eine schnelle und exakte Zugabe eines frei wählbaren Volumens erfolgen kann, vorzugsweise ohne dabei zusätz liche Betriebsparameter, wie den Druck und/oder die Gelöstsauerstoffkonzentration zu verändern.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Auf gabe erfindungsgemäß gelöst mit dem im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmal.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Vorrichtung ist es nunmehr möglich, in eine Vorlage, wie beispiels weise ein Kulturmedium, ein frei wählbares Volumen einer Flüssigkeit besonders schnell und besonders exakt einzudosieren. Konzentrationsgradienten an zugegebenem Substrat werden in der Vorlage in kürzester Zeit unter bunden, so daß eine schnelle Entnahme einer repräsenta tiven Probe möglich ist. Das Verfahren kann besonders steril durchgeführt werden und verläuft ohne Druckanstieg innerhalb des verwendeten Reaktors oder Bioreak tors bedingt durch die Substratzugabe. Vorteilhafter weise erfolgt die Zugabe des Volumens so, daß keine Konzentrationsgradienten an zugegebenem Substrat mög lich sind. Es ist nunmehr möglich, den Inhalt eines Reaktors in kürzester Zeit unter Erreichung eines defi nierten Zustandes in einen Nichtgleichgewichtszustand auszulenken.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Zeichnungen zeigen eine erfindungsgemäße Vorrich tung in chematischer Form sowie experimentelle Daten.

Es zeigt:

Fig. 1: eine erfindungsgemäße Vorrichtung

Fig. 2: eine vorteilhafte Ausgestaltung der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung

Fig. 3: Messungen der Mischzeiten an verschie denen Stellen im Bioreaktor

Fig. 4: Messungen der Mischzeiten, der Leitfä higkeit sowie des Druckes

Fig. 5: Darstellung bei Mehrfachpulszugabe

Fig. 6: Viskositätseinfluß auf Dosierung

Fig. 7: Zudosierte Menge in Abhängigkeit vom Dosier-Druck

Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung zeigt einen Vorratsbehälter 1, in dem sich ein Substrat befindet, welches mittels einer Pumpe 2 durch die Leitung 3 in einen im Bodenbereich konisch zulaufenden Pulsbehäl ter 4 befördert wird. Leitung 3 ist mit einem Ventil 5 ausgestattet. In den Pulsbehälter 4 mündet ebenfalls eine Leitung 6, die mit einem Ventil 7 ausgestattet ist, mittels der Druckluft in den Pulsbehälter 4 einge führt werden kann. Die Leitung 7 führt im oberen Be reich des Pulsbehälters 4 in einen sterilen Filter 8 und ist mit einem Ventil 9 ausgestattet. Im unteren Be reich des Pulsbehälters führt eine Leitung 10 mit einem Ventil 11 zu einem elektrisch ansteuerbaren 3-Wege-Ven til 12, welches in seiner direkten Fortführung in einen Injektor 13 mündet, und in seiner Abzweigung über die Leitung 14 mit dem Ventil 15 in einen Auffangbehälter 16 führt, der ebenfalls mit einem sterilen Filter 17 ausgestattet ist. Der Injektor 13 weist eine Anstechna del 18 auf, welche in den Innenraum des Reaktors 19 mündet. Der Reaktor 19 ist mit einem Rührer 20 ausges tattet. An dem Vorratsbehälter befindet sich zum Druck ausgleich ebenfalls ein Sterilfilter 21.

In Fig. 2 sind funktionell gleichwertigen Merkmalen dieselben Bezugszeichen zugeordnet. Fig. 2 zeigt eine vorteilhafte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vor richtung, bei der mehrere Vorratsbehälter und Pulsbe hälter parallel für eine Injektion von Substrat in den Reaktorraum sorgen. Die Vorratsbehälter 1a, 1b und 1c sind über die Leitungen 3a, 3b und 3c, welche mit den Pumpen 2a, 2b und 2c ausgestattet sind, mit den Pulsbe hältern 4a, 4b und 4c in Verbindung. Im oberen Bereich der Pulsbehälter 4a, 4b und 4c treten Leitungen 7a, 7b und 7c aus, welche in die Leitung 7 münden, welche mit einem Sterilfilter 8 ausgestattet ist und zum Druck ausgleich dient. Die Leitungen 7a, 7b und 7c tragen Ventile 5a, 5b und 5c. Die Pulsbehälter 4a, 4b und 4c werden über die Leitung 6, welche sich in die Leitungen 6a, 6b und 6c aufspaltet, mit Druckluft versorgt. Lei tung 6 ist mit einem Sterilfilter 22 ausgestattet. Im unteren Bereich der Pulsbehälter 4a, 4b und 4c zweigen Leitungen 10a, 10b und 10c ab, welche mit Ventilen 11a, 11b und 11c ausgestattet sind, die in einen 4-Wege Hahn 23 führen. Vom 4-Wege Hahn 23 zweigt eine Leitung 24 ab, welche sich in die Leitungen 24a und 24b aufspal tet. Die Leitungen 24a und 24b führen zu den elektrisch ansteuerbaren 3-Wege Ventilen 12a und 12b, welche mit den Injektoren 13a und 13b in Verbindung stehen. Von den 3-Wege Ventilen 12a und 12b führen die Leitungen 14a und 14b ab, welche sich in die Leitung 14 vereini gen, welche mit dem Ventil 15 ausgestattet ist. Leitung 14 mündet wiederum in einen Auffangbehälter 16, der mit dem Sterilfilter 17 ausgestattet ist. Die Anstechnadeln 18a und 18b der Injektoren 13a und 13b münden in den Reaktor 19, welcher mit dem Rührer 20 ausgestattet ist.

Im folgenden soll die Erfindung beispielhaft erläutert werden. In dem Reaktor 19 befindet sich eine wässerige Phase, enthaltend Mikroorganismen, deren dynamische Stoffwechselvorgänge untersucht werden sollen. Der Vor ratsbehälter 1 beinhaltet eine Lösung eines auf Stoff wechselvorgänge in den Zellen limitierend wirkenden Substrates. Das Substrat wird über die Pumpe 2 und Lei tung 3 in den Pulsbehälter 4 gefördert. Hierbei ist das Ventil 5 und 9 geöffnet. Die bei der Förderung des Sub strats verdrängte Luft in der Leitung 3 sowie dem Puls behälter 4 kann durch die Leitung 7 über einen Steril filter 8 entweichen. Wenn der Pulsbehälter 4 mit dem Substrat gefüllt ist, werden die Ventile 5 und 9 ge schlossen und die Ventile 6d und 11 geöffnet. Der 3- Wege Hahn 12 wird so eingestellt, daß eine Durchfluß verbindung zwischen der Leitung 10 und der Leitung 14 hergestellt wird. Ventil 15 wird geöffnet, so daß, aus gehend vom Pulsbehälter 4, das Substrat in einer ge schlossenen Flüssigkeitssäule die Leitung 10 und 14 blasenfrei auffüllt. Ventil 15 wird dann geschlossen und der 3-Wege Hahn 12 so eingestellt, daß eine Verbindung zwischen Leitung 10 und dem Injektor 13 herge stellt ist. Wenn eine schnelle und exakte Eindosierung des Substrats in die flüssige Phase des Reaktors 19 erfolgen soll, wird über die Leitung 6, welche mit dem Sterilfilter 22 ausgestattet ist, ein definierter Druck beaufschlagt, und der 3-Wege Hahn so eingestellt, daß die Leitung 10 mit dem Injektor 13 durchläufig geöffnet ist. Erfindungsgemäß erfolgt die Eindosierung derart, daß sich die in der Leitung 10 befindende geschlossene, blasenfreie Flüssigkeitssäule über den beaufschlagten Druck in den Reaktorraum entleert. Charakteristisch hierbei ist, daß der beaufschlagte Druck in Verbindung mit dem Querschnitt der Anstechnadel 18 so gewählt ist, daß für einen definierten Zeitintervall ein exaktes Volumen den Querschnitt der Austrittsstelle der Anstechnadel durchläuft. Somit kann ein exaktes Volumen in einem definierten Zeitintervall gefördert werden. Charakteristisch ist dabei, daß mit dem Austritt durch die Anstechnadel keine Druckluft in den Innenraum des Reaktors 19 eingebracht wird, da lediglich ein blasenfreies geschlossenes Volumenelement der Flüssig keitssäule gefördert wird. Zur intensiven Durchmischung und zur raschen Herstellung einer sofortigen gleichför migen Verteilung des limitierenden Substrats in der flüssigen Phase des Reaktors 19, wird mittels des Rüh rers 20 intensiv gerührt. Vorzugsweise wird das Sub strat in die Reaktorzone der größten Durchmischung ein geführt. Dies führt in Verbindung mit der exakten Dosierung dazu, daß in einem möglichst kleinen Zeitin tervall von Δt < 1 s ein neuer stationärer Zustand er reicht ist, welcher vom alten Gleichgewichtszustand der Zellsuspension verschoben ist, und von dem aus die dy namischen Stoffwechselprozesse kinetisch verfolgt wer den können. Bei einem Volumen der Vorlage im Reaktor 19 von 7 l kann eine gleichmäßige Verteilung des zugegebe nen Stoffes bereits nach 800 ms vorliegen, wenn 100 bis 200 ml zudosiert werden. Da die Anstechnadel 18, die mit ihrer Öffnung in die Reaktorflüssigkeit eintaucht, nach dem Schließen des 3-Wege Hahnes 12 ebenfalls eine geschlossene Flüssigkeitssäule enthält, die bis zum Ventil 12 reicht und somit keine Luft in die Anstechna del 18 eindringen kann, welche zum Herauslösen von limitierender Substratflüssigkeit aus der noch in der Anstechnadel verbleibenden Flüssigkeit führt, kann aus der Anstechnadel 18 durch die schnelle Rotation der sich im Reaktor 19 befindenden Flüssigkeit, kein limi tierendes Substrat mehr aus der Anstechnadel herausge rissen und in den Flüssigkeitsraum des Reaktors 19 eingetragen werden. Der Durchmesser der Anstechnadel 18 ist bevorzugterweise 1 bis 10 mm, besonders bevorzugt 2 bis 5 mm.

Die in Fig. 2 dargestellte Ausführungsform der erfin dungsgemäßen Vorrichtung ist eine bevorzugte Ausfüh rungsform. In ihr sind 3 Vorratsbehälter 1a, 1b und 1c über verschiedene Leitungen 3a, 3b und 3c mit verschie denen Pulsbehältern 4a, 4b und 4c verbunden. Die aus den Pulsbehältern 4a, 4b und 4c im unteren Bereich aus mündenden Leitungen 10a, 10b und 10c vereinigen sich im 4-Wege Hahn 23 und führen sich in Leitung 24 fort. Lei tung 24 zweigt sich bei dieser Vorrichtung in die Lei tungen 24a und 24b auf, die in Ventile 12a und 12b füh ren. Diese versorgen die Injektoren 13a und 13b. Ein Injektor 13c befindet sich hinter dem Reaktor an einer anderen Stelle und ist daher in der Zeichnung nicht sichtbar. Vorzugsweise sind die Injektoren 13a, 13b und 13c derart angeordnet, daß sie einen Eintrag des Sub strates an unterschiedlichen Stellen des Reaktors 19 ermöglichen. In einer besonders begünstigten Ausfüh rungsform befinden sich die unterschiedlichen Injekto ren 13a und 13b in Positionen, welche in Bezug auf die Rührachse unterschiedliche Abstände aufweisen, und weiterhin in einer bevorzugten Ausführungsform treten die Anstechnadeln 18a und 18b der Injektoren 13a und 13b in unterschiedlichen Höhen, gemessen vom Reaktorboden, in die Flüssigkeit des Reaktors 19 ein. Diese günstigen geometrischen Anordnungen der Injektoren 13a, b, c füh ren zu kürzeren Mischzeiten. In einem alternativen Auf bau, welcher in Fig. 2 nicht dargestellt ist, vereini gen sich die Leitungen 10a, 10b und 10c nicht in einer Leitung 24, sondern werden separat in Injektoren fort geführt, welche das Substrat in die Flüssigkeit des Reaktors einbringen. Hierbei kann auf das 4-Wege Ventil 23 und die sich aufspaltende Leitung 24, bzw. 24a und 24b verzichtet werden, da sich die Leitungen 10a, 10b und 10c bis zum 3-Wege Hahn 12a, 12b und 12c fortfüh ren. Die Verwendung von mehreren 3-Wege-Ventilen 12a, b, c mit den Injektoren 13a, b, c führt auch dazu, daß mehr Substrat in kürzerer Zeit zudosiert werden kann.

In einer alternativen Ausgestaltung des erfindungsge mäßen Verfahrens können über die unterschiedlichen Pulsbehälter 4a, 4b und 4c verschiedene Substanzen auch mehrfach eingebracht werden. Diese können allesamt für den Stoffwechsel der zu untersuchenden Zellen limitie rend sein, oder es handelt sich um andere Substrate. Die Zugabe der exakten und schnellen Dosierung erfolgt rechnergesteuert über die Ventilöffnungszeiten der Ven tile 12a, b, c und den beaufschlagten Druck.

Da mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Vorrich tung besonders genau und besonders schnell eine Ablen kung des Gleichgewichtszustandes der sich in der Flüs sigkeit befindenden Zellen in einer homogenen Vertei lung im Reaktorraum erreicht werden kann, von der aus eine Stoffwechseldynamik untersucht werden kann, ist es möglich, zum schnellstmöglichen Zeitpunkt Proben aus dem Reaktor 19 zu entnehmen. Es können pro Sekunde bei spielsweise 4 oder 5 Proben entnommen werden. Diese Proben können nunmehr üblichen Messungen zugeführt wer den, um kinetische Daten über die Stoffwechseldynamik zu erhalten. Diese sind beispielsweise Induktions-, Mischzeitmessungen, extra- und intrazelluläre Metabo litdynamiken und andere Kinetiken. Je nach Zweck der Untersuchung können aus den Vorratsbehältern unter schiedliche Stoffe steril eindosiert werden. Es können beispielhaft limitierend wirkende, toxische, stoffwech selregulatorische Substanzen, (cyclisches Adenosinmo nophosphat) oder Botenstoffe, die Einfluß auf den Stoffwechsel haben, zudosiert werden. Selbstverständ lich können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch Substanzen in rein chemische Systeme eindosiert werden, die zur Untersuchung von chemischen Kinetiken dienen. Der Zeitpunkt der Dosierung ist variabel bestimmbar. Nach Versuchsablauf können alle Teile der Vorrichtung in den Auffangbehälter 16 entleert werden. Zur Reinhal tung der Gesamtvorrichtung sind an allen Stellen, wel che Öffnungen zur Umgebung darstellen, Sterilfilter 8, 22, 21 und 17 angebracht. Der Reaktor 19 kann ebenfalls mit einem Sterilfilter ausgestattet sein. Dieses kann auch zum Druckausgleich dienen. Hierdurch ist ein ste riles Arbeiten mit Reinstkulturen möglich. Vor Gebrauch kann die gesamte Vorrichtung mit den üblichen bekannten Mitteln sterilisiert werden, so daß Fremdeinflüsse vermieden werden können. Vorteilhafterweise führt die erfindungsgemäße Zudosierung zu keinem Druckanstieg im Reaktor 19, wodurch kein druckbedingter Einfluß auf die im Reaktor 19 befindlichen Organismen ausgeübt wird. Die isobare Betriebsweise nimmt auch keinen Einfluß auf die Probemenge, die zu Untersuchungszwecken entnommen wird. Nach entsprechender Eichung können sowohl newton'sche als auch nicht-newton'sche Flüssigkeiten exakt zudosiert werden. Die zudosierten Volumina sowie der Zeitpunkt der Zudosierung können variabel bestimmt werden. Es können verschiedene Reaktortypen, vorzugsweise Rührkesselreaktoren eingesetzt werden, so daß aufgrund des modularen Systems keine Umbauten an einem Reaktor vorgenommen werden müssen. Durch entsprechende Anschlußstellen kann die Anzahl der mit dem Reaktor 19 in Verbindung stehenden Pulsbehälter und, damit verbun den, die Möglichkeit Proben zuzugeben, vergrößert wer den.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung kön nen beispielsweise bei folgenden Einsatzgebieten zur Anwendung kommen:

Sicherheitstechnik

Schnelle Zugabe von reaktionsinhibierenden Substanzen (Radikalfänger) in ein außer Kontrolle geratendes Reak tionsgemisch.

Produktionstechnik für Polymere

Exakte Zugabe genau dosierter Komponenten um Eigen schaften eines Polymers (Kettenlänge, chemische Modifi zierung) zu beeinflussen.

Lebensmitteltechnik

Sterile Zugabe.

Chemische Reaktionstechnik

Kinetik-Untersuchungen, z. B. Bestimmung der Anfangsge schwindigkeit bei verschiedenen Substratkonzentratio nen.

Synchronisation von Mikroorganismen-Kulturen

Online Kopplung der Dosierung an ein Regelsignal, z. B. pO₂ an Substratzugabe durch definierte Zugabe von Wachstumsentkoppler.

Tierische Zellkultur

Schonende, schnelle Zugabe und Vermischung (keine Scherkräfte), Tracerexperimente.

Tracerexperimente

Allgemein schnelle, definierte Zugabe.

Beispiele

Die Mischzeiten, die mit der erfindungsgemäßen Vorrich tung mit zwei Ventilen mit einem Einschlußwinkel von 72° zwischen den Injektoren erreicht werden können, liegen bei 0,630 ± 0,15 ms. Θ₉₀ entspricht der Zeit, die notwendig ist, um einen Substratpuls bis zur defi nierten Mischqualität von 90% zu homogenisieren. Die Messung der Mischzeiten erfolgt über eine Bestimmung der Leitfähigkeit (LF) nach Einbringen einer Tracerlö sung.

Fig. 3 zeigt Ergebnisse von Mischungen an verschiede nen Stellen im Biorektor gemessen an der unterschiedli chen End-Leitfähigkeit, bei unterschiedlich positio nierten Elektroden.

Es zeigt:
Die Abszisse x: Zeit (s)
Die linke Ordinate: y = relative Leitfähigkeit (mS/cm)
Die rechte Ordinate y': Druck (bar)

Durch Dosierung der Pulslösung über die Ventilschalt zeit wird verhindert, daß Druckluft in den Fermenter gelangt. Somit wird eine Druckspitze während der Pulsaufgabe verhindert und ein zweites Ventil zum Ab fangen dieser Druckspitze überflüssig.

Fig. 4 zeigt einen Versuchsverlauf bei einer Ventil öffnungszeit von 400 ms, 3,5 bar Pulsdruck, 4 mm Rohr durchmesser; Sollwert für Druck = 0,23 bar; gestri chelte Linie entspricht dem Mischendwert, schwarze Linien kennzeichnen den 90% Mischbereich.

Es zeigt:
Die Abszisse: Zeit (s)
Die linke Ordinate: y = Leitfähigkeit (mS/cm)
Die rechte Ordinate: y' = Druck (bar)

Fig. 5 zeigt einen Versuchsverlauf, bei dem Mehrfach pulse aufgegeben werden, wobei es zu einem zu vernach lässigenden Druckanstieg kommt. Das Ventil wurde 4 mal jeweils für 0,3 ms geöffnet. Die Intervalle zwischen den Öffnungszeiten betrugen 3 s. Der Sollwert für den Druck beträgt 0,21 bar.

Es zeigt:
Die Abszisse: x = Zeit (s)
Die linke Ordinate: Y = Leitfähigkeit (mS/cm)
Die rechte Ordinate: y' = Druck (bar)

Fig. 6 zeigt den Viskositätseinfluß auf die Dosier menge einer Flüssigkeit bei diversen Konzentrationen an viskositätserhöhenden Substanzen. Es werden Versuche gezeigt, bei denen den zuzudosierenden Flüssigkeiten zur Viskositätserhöhung Glycerol oder Glucose zugefügt sind. Die Viskosität variiert zwischen 40 und 400 g/l Glucose und Glycerol. Der Fehler der Zugabe im gesamten Konzentrationsbereich ist unterhalb von 1,5% des Zuga bevolumens.

Es zeigt:
Die Ordinate: x = Konzentration (g/l)
Die linke Abszisse: y = Zugabe (ml Pulslösung)
Die rechte Abszisse: y' = Zugabe (g Substrat)

Fig. 7 zeigt die Einstellung eines definierten Pulsvo lumens durch Variation von beaufschlagtem Pulsdruck und Ventilschaltzeit bei Verwendung eines Magnetventils vom Typ 330F mit Anstechnadel.

Es zeigt:
Die Ordinate: x = Schaltzeit (ms)
Die Abszisse: y = Zugabe (ml)

Folgende Vorrichtungsbestandteile und Parameter haben sich als besonders geeignet herausgestellt.

3-Wege Ventil: 3-Wege Magnetventil Typ 330 von Bückert, 220 V/140 Hz
Sonstige Ventile: Hoke 2/2 Wege Kugelhahn.
Pulsbehälter: Zylinder V2A-Stahl, unten konisch zulau fend, elektropoliert Volumen ≧ 250 ml, 4 Anschlußstut zen.
Verbindungsleitungen: Teflonschläuche, 4 mm Durchmesser
Zweigstelle: Swagelog
Druckbeaufschlagung: ≧ 3 bar
Sterilfilter und Anstechnadel: Standard.

Reinigungsprozedur bei der Dosierung unterschiedlicher Flüssigkeiten in den Bioreaktor:

Die Pulsbehälter 4a, 4b in Fig. 2 werden über die je weiligen Vorratsbehälter mit Pulsflüssigkeit A, Puls flüssigkeit B und Reinigungsflüssigkeit (z. B. bidestil liertem Wasser) befüllt. Zu Versuchszwecken wird die Pulsflüssigkeit A über den Injektor 13a in den Reaktor 19 dosiert. Anschließend wird der 4-Wegehahn 23 in Stellung Pulsbehälter 4c (Reinigungsflüssigkeit) gebracht und unter Schließen der Drei-Wegehähne 12a, 12b, 12c und Öffnung des Ventils 15 die gesamte strecke mit Reinigungsflüssigkeit gespült. Wahlweise kann ein kurzer Puls Reinigungsflüssigkeit in den Bio reaktor gegeben werden, um Verunreinigungen und Rück stände hinter den Drei-Wegehähnen 12a, 12b, 12c zu ent fernen. Anschließend wird der Vier-Wegehahn 23 in Stel lung 4b gebracht (Pulsflüssigkeit B) und wie schon für Pulsflüssigkeit A beschrieben, die Strecke bis zu den Drei-Wegehähnen 12a, 12b, 12c mit Pulsflüssigkeit B ge füllt. Durch diese Prozedur ist es möglich, diverse Pulsflüssigkeiten, begrenzt durch die Anzahl der modu lar angeordneten und erweiterbaren Pulsbehälter, in den Reaktor zu dosieren, ohne das es zu einer Vermischung der einzelnen Flüssigkeiten kommt.

Claims

1. Verfahren zur Zudosierung exakter Volumina von Flüssigkeiten in eine Vorlage, dadurch gekennzeichnet,

- daß die zuzudosierende Flüssigkeit durch min destens eine Zuleitung mittels definierter Druckbeaufschlagung in Verbindung mit definier ter Öffnungszeit eines Ventils in die Vorlage eingetragen wird, und die Zufuhr zu einem aus Beaufschlagungsdruck und Öffnungszeit des Ven tils berechnetem Zeitpunkt schlagartig unterbro chen wird, so daß keine Luft in den Austritt der Zufuhr eintritt, die dort einen Austritt von noch verbleibender Flüssigkeit ermöglicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß daß die Zudosierung durch zwei oder drei Zu leitungen erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zu dosierende Flüssigkeit mit dem Aus trittsende der Zuleitung unterhalb der Oberfläche der Vorlage eindosiert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorlage intensiv gerührt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zudosierung bei Verwendung von minde stens zwei Zuleitungen an unterschiedlichen Stellen des vorgelegten Volumens erfolgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das zuzudosierende Volumen der Flüssigkeit einem Pulsbehälter (4) entnommen wird, der durch Druck beaufschlagt werden kann und eine ununterbro chene Flüssigkeitssäule bis zu dem Flüssigkeitsaus tritt bildet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß alle mit der Umgebung in Verbindung stehen den Öffnungen steril gehalten werden.

8. Vorrichtung, umfassend einen Reaktor (19) und min destens eine Zuleitung für zu dosierende Flüssig keiten, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuleitung (10) mit einem Ventil (12) ausgestattet und an einen Pulsbehälter (4) ange schlossen ist, welcher an ein Mittel zur gesteuer ten Druckbeaufschlagung angeschlossen ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Austrittsstelle in den unteren Bereich des Reaktors (19) mündet.

10. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Austrittsstellen, sofern davon minde stens zwei vorhanden sind, an unterschiedlichen Stellen des Reaktors (19) einmünden.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10 dadurch gekennzeichnet, daß der Pulsbehälter (4) an einen Vorratsbehäl ter (1) über eine Pumpe (2) angeschlossen ist.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Ventil (12) über eine Leitung (14) an einen Auffangbehälter (16) angeschlossen ist.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß an den mit der Umgebung in Verbindung ste henden Teilen ein Sterilfilter (8, 22, 17) angebracht ist.