DE2401620B2 - Verfahren zur spektrophotometrischen Erfassung von Zonengrenzen, welche bei der isotachoporetischen Trennung erhalten werden - Google Patents

Description

an

raiitii Yuiiwuvl wird, so zu steuern,

grenze zwischen dem Leitelektrolyten und der

^Bfind""⁸

2kSP

F i g. 1 schematisch eine Säule zur isotachophoretischen Trennung,

F i g. 2 die gleiche Säule nach eihaltenem Gleichgewicht,

F i g. 3 schematisch die elektrische Feldstärke E entlang der Säule,

F i g. 4 die Konzentration der verschiedenen Anionen bei Gleichgewicht,

Fig. 5 die Konzentration des GegenionsR⁺ entlang der Säule,

F i g. 6 schematisch den pH-Verlauf entlang der Säule und

F i g. 7 bis 9 Beispiele von Detektorkurven bei isotachophoretischen Trennverfahren.

In den F i g. 1 und 2 ist eine Säule 1 dargestellt, in welche eine Anode 2 und eine Katü<ode 3 eingeführt sind. In der Fig. I ist die zu trennende Probe in den Teil der Säule eingebracht, der durch 5 bezeichnet ist. Die Probe enthält Salze, welche drei verschiedene Anionen C₁", C₂ ^- und C₃' enthalten. Es sei angenommen, daß C₁ ~ eine größere Beweglichkeit aufweist als C₂", welches hinwiederum eine größere Beweglichkeit als C,~ haben soll. Der Teil der Säule, welcher mit L bezeichnet ist, ist mit dem eingangs schon erwähnten Leitelektrolyten angefüllt. Dieser besteht aus Anionen A~, welche eine größere Beweglichkeit aufweisen als alle Anionen in der Probe. Der Teil der Säule, der der Kathode am nächsten ist und mit T bezeichnet ist, ist mit einem Elektrolyten angefüllt, der ein Anion B~ aufweist, dessen Beweglichkeit geringer ist als die aller Anionen in der Probe. Über die gesamte Säule hin ist eine Kationenart ausgebreitet, welche allen Anionen gemeinsam ist und welche als Gegenion R * bezeichnet wird. Dieses Gegenion hat in geeigneter Weise puffernde Eigenschaften. Wenn eine Gleichspannung an die Elektroden 2 und 3 gelegt wird, wandern die Anionen in Richtung auf die Anode 2. Auf Grund der unterschiedlichen Beweglichkeiten der Anionen wächst die elektrische Feldstärke über die Zonen L, S und T schrittweise an. Hierdurch wird bewirkt, daß die Anionen, welche in der Zone S vorhanden sind, auf Grund ihrer Beweglichkeiten getrennt werden, so daß die Ionen C,-, welche eine größere Beweglichkeit aufweisen, eine Zone, welche dem Leitelektrolyten am nächsten Hegt, bilden. Auf diese Zone folgt eine Zone, welche aus C₂" besteht, und schließlich folgt darauf eine Zone, welche aus C,~ besteht. Die letzte Zone liegt dem Endelektrolyten, wie es in der F i g. 2 dargestellt ist, am nächsten. Entlang dieser Zonen wächst die elektrische Feldstärke schrittweise an. Dies ist in der F i g. 3 dargestellt. Die so gebildeten Zonen sind sehr stabil und scharf voneinander abgegrenzt. Dies resultiert daraus, daß bei dem Versuch eines Anions, von einer Zone in eine vorhergehende Zone zu diffundieren, wo eine geringere elektrische Feldstärke herrscht, dieses Anion eine geringere Wanderungsgeschwindigkeit dann aufweist. Es wird deshalb wiederum von seiner ursprünglichen Zone aufgefangen. Wenn in der gleichen Weise ein Anion versucht, in eine nachfolgende Zone zu diffundieren, wird dieses in seine ursprüngliche Zone zurückgebracht auf Grund der höheren elektrischen Feldstärke, welche in der nachfolgenden Zone herrscht. Auf diese Weise wird eine sehr gute selbststabilisierende Wirkung der Zonengrenzschichten erzielt.
Die Bedingungen an einer Zonengrenze zwischen zwei Salzlösungen, die gemeinsam ein Ion aufweisen und einem elektrischen Feld unterworfen sind, ist durch eine Beziehung von Kolrausch (Ann. Phys., Leipzig, 62, 209 [1897]), wiedergegeben:

Cb
wobei
C = Konzentration,

U = Beweglichkeit (cmWolt, see), L = elektrische Ladung,

wobei die Indizes A, B und R den Ionen A~, B~ und R⁺ entsprechend zugeordnet sind.

Gemäß dieser Beziehung besteht zwischen den verschiedenen Anionen an verschiedenen Zonengrenzen eine Konzentrationsstufe. Dies ist in der F i g. 4 wiedergegeben. Das Gegenion ist in geeigneter Weise so beschaffen, daß es puffernde Wirkungen aufweist. Wenn dies der Fall ist, so zeigt die Gesamtkonzentration der Gegenionen beträchtlich geringere Stufen an den verschiedenen Zonengrenzen, wie das aus der F i g. 5 hervorgeht. Wie sich der pH-Wert an den verschiedenen Zonengrenzen ändert, ist beispielsweise aus der F i g. 6 ersichtlich. Gemäß der Erfindung wird ein Gegenion R ⁺ verwendet, das puffernde Eigenschaften aufweist. Das Gegenion wird so gewählt, daß seine molaren Absorptionsvermögen bei sauren und basischen Bedingungen bei einer Wellenlänge sich unterscheiden, die zur Messung geeignet ist. Der pH-Verlauf, welcher in der F i g. 6 gezeigt ist, ruft dann einen Absorptionsvermögens-Verlauf entlang der Säule hervor.

In der F i g. 7 ist die Trennung von fünf Anionen mittels Isotachophorese dargestellt. Die F i g. 7 a zeigt eine Trennung gemäß dem Stand der Technik, während die F i g. 7 b das Ergebnis der Trennung gemäß der Erfindung zeigt. Jede der F i g. 7 a und 7 b zeigt von oben nach unten Detektoraufzeichnungen von einem thermischen Detektor, einem differentiellen thermischen Detektor und einem spektrophotometrischen Detektor. In den verschiedenen Kurven sind bestimmte Bereiche ersichtlich, welche zu jeweils einem bestimmten Ion gehören. Jeder dieser Bereiche ist mit einer Zahl, welche dem Ion entspricht, bezeichnet. Im Ausführungsbeispiel der F i g. 7 ist der Leitelektrolyt mit 1 bezeichnet; dieser ist 0,01 M Cl-. Der Endelektrolyt bzw. das Endion ist mit 7 bezeichnet; dieses ist Kapronat. Fünf Ionen sind getrennt worden, 2 = ClO₃ ^-, 3 = Oxalat, 4 = Tartrat, 5 = Zitrat, 6 = Azetat. In der Fig. 7a ist das Gegenion 0,0465 M /i-Alanin, während in der Fig. 7b das Gegenion 0,012M Kreatinin ist. Die Leitelektrolyten haben in beiden Fällen einen pH-Wert von 4,1. Die spektrophotometrische Erfassung · wui de bei 254 nm durchgeführt. Es zeigt sich, daß bei spektrophotometrischer Erfassung im ersten Fall immer kein Ausgangssignal erhalten wird. Wenn Kreatinin als Gegenion im zweiten Fall der spektrophotometrischen Erfassung verwendet worden ist, ergibt sich ein sehr gutes Bild. Es ist ersichtlich, daß die Auflösung der spektrophotometrischen Kurve in der Fig. 7b eine größere Auflösung ist als die thermischen Kurven der gleichen Figur. Die Spitze in der Fig. 7a zwischen den Probenkomponenten 5 und 6 entspricht einer Verunreinigung in der Probe.

Ein anderes Trennverfahren ist in einem Ausfüh- F i g. 8 und 9 Trennungen in Methanolsystemen

rungsbeispiel in der F i g. 8 dargestellt. Die Figur zeigen.

zeigt von oben nach unten eine Kurve, welche von Das Beispiel der F i g. 7 zeigt außerdem die Tren-

einem spektrophotometrischen Detektor bei 254 nm nung und Erfassung von Anionen gemäß der Erfin-

erhalten worden ist, sowie eine Kurve, welche man 5 dung, während die Fig. 8 und 9 Trennungen und

mit einem thermischen Detektor gewonnen hat. Das die Erfassung gemäß der Erfindung von Kationen

System, welches im Beispiel der Fig. 8 zu trennen zeigen.

war, hatte einen Leitelektrolyten 0,01 M (CH.,)₄NC1 Durch die Auswahl des Gegenions, das puffernde in Methanol, gesättigt mit Sulfanilsäure und der auf Eigenschaften aufweist, ist es möglich, Zonen von ph 4,4 (wie es mittels einer gewöhnlichen, wasserent- io Probenkomponenten zu erfassen, die als solche kein haltenden Kalomel-KCl-Elektrode angezeigt wurde) Absorptionsvermögen aufweisen,
durch (CH₃J₄NOH eingestellt war. Der Endelektro- Insbesondere kann man ein derartiges Gegenion lyt ist 0,2 M Zinkazetat in Methanol, und als Gegen- wählen, das unterschiedliche molare Absorptionsion wird Sulfanilsäure verwendet. Die Bezeichnun- vermögen bei sauren und basischen Bedingungen bei gen in der Figur bedeuten: 15 einigen Wellenlängen innerhalb des UV-Bereiches

aufweist. Demgemäß wird die spektrophotomelrische

1 _ /_rH \ VT₊ 9 _ XtTj + ■> _ v+ 4 _ xj_a+ Erfassung innerhalb des UV-Bereiches von Sub-

1 - ^H₃;₄iM , j. INn₄ ,j rv , η ™ , _{stanzen ermöglichti die nicht} uv-absorbierend

5 = Ba²⁺, 6 = Li⁺, 7 = Mg*+, 8 = Ca⁸⁺, sind. Wie schon envähnt, kann das Verfahren ge-

9 ₌ Za²⁺. ^{20 mäl}^ ^^er Erfindung auch zur spektrophotometrischen

Erfassung von Probenzonen verwendet werden, bei denen nur einige ein Absorptionsvermögen zeigen.

Die Konzentration des Na⁺ beträgt 0,0015 M und Des weiteren kann die Erfindung vorteilhaft bei der

die der anderen Probenionen 0,03 M. Erfassung von Probenzonen nach der isotacho-

Das in der F i g. 9 dargestellte Beispiel betrifft die 25 phoretischen Trennung von einer Probenmischung

Trennung der gleichen Ionen wie im Beispiel der verwendet werden, wo jede Probenkomponente bei

F i g. 8 in einem Methanolsystem. Im Beispiel der einigen Wellenlängen eine Absorption zeigt, wobei

Fig. 9 ist der Leitelektrolyt 0,0089 M NaCl jedoch die spektrophotometrische Erfassung gemäß

+ 0,007 M NaOCOCH₃ in Methanol, gesättigt mit der Erfindung mit noch einer anderen geeigneten

Sulfanilsäure und mit einem pH von 5,0 (wie er ge- 30 ausgewählten Wellenlänge ein bedeutend klareres

messen wurde mit einer gewöhnlichen, wasserhaltigen Ergebnis sich erzielen läßt.

Kalomel-KCl-Elektrode). Der Endelektrolyt und das Der Unterschied im molaren Absorptionsvermögen

Gegenion waren die gleichen wie im Beispiel der beim Gegenion bei sauren und basischen Bedingun-

F i g. 8. Die spektrophotometrische Ablesung wurde gen kann natürlich mittels des Spektrophotometers,

bei 254 nm durchgeführt. 35 das bei der Messung verwendet wird, aufgezeichnet

Die Figuren zeigen, daß bei der spektrophoto- werden. Der geringste Unterschied im Absorptionsmetrischen Erfassung, welche gemäß der vorliegen- vermögen, welcher bisher bei den bekannten Instruden Erfindung ermöglicht wird, die Auflösung be- menten aufgezeichnet werden kann, beträgt etwa deutend höher ist als bei der thermischen Erfassung. 10~³ bis 10~⁶ Einheiten. Messungen von geringeren

Demgemäß zeigt F i g. 7 eine isotachophoretische 40 Unterschieden im Absorptionsvermögen durch noch

Trennung in einem Wassersystem, während die genauere Instrumente sind natürlich denkbar.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche: in der Säule stationär gehalten vorstehend erwähnten schwedischen

1. Verfahren zur spektrophotometrischen Er- i™ kommen, sind prinzipiell thermische

fassung innerhalb eines Wellenlängenbere.ches 5 Anwenüig ^^ ^ _{gegrundet smd},

von Zonengrenzen, welche bei der isotacho- ^^Wärmeentwicklung in den verschiedenen

d dab α d W

fassung innerhalb eines Wellenlängenbere.c ^^ ^ _{geg md},

von Zonengrenzen, welche bei der isotacho- ^^Wärmeentwicklung in den verschiedenen phoretischen Trennung erhalten werden da- dab α _{hiedlich ist} und daß die Warme-

durch gekennzeichnet, daß das Gegen- Jonen ^ _R._{chtung vom} Le.telektroly zum

ion so ausgewählt wird, daß seine molaren Ab- SjJ^^JL hin anwächst. Eine weitere Untersorptionsve^ögen bei sauren und basischen Be- Endelekraiy dingungen innerhalb dieses Wellenlangenbereiches sich unterscheiden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wellenlängenbereich im UVBih lit

kenne, UV-Bcreich liegt.

_{Rchtung vom} Le.y

jJ^^J hin anwächst. Eine weitere Unter-Endelekraiy ^^ ^ _{spekt ophotomet}

^s»2^ng _Erfassung der verschiedenen Zonen LetzteS Verfahren sieht eine raschere Messung als das tens ν ^ ^ _{das notwendlgerw}eise bei der

««« _eine Zeit von etwa 5 Sekunden bean-

¹⁵ Sit Darüber hinaus ermöglicht die spektropCometrische Erfassung eine bedeutend größere AufSng als die thermische Erfassung in einem fokhen Grad, daß die Genauigkeit um das 50- bis

inofache größer ist. Vorbedingung bei der spektro-

¹⁰ IZ ome-Sen Erfassung ist jedoch, daß die verihSen geuennten Ionenarten ein Absorption* ^SChl »Z_n aufweisen Die Anzahl von Substanzen,

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spektro- vermog _innerhalb des sichtbaren Spektrums

photometrischen Erfassung innerhalb eines Wellen- ^^IC£_bs ^J _orptionsvermögen aufweisen, ist sehr klein längenintervalls von Zonengrenzen, welche bei der *5 ein α i _{jbt es jedoch e}ine große Anzahl

isotachophoretischen Trennung erhalten werden. "«■ » » ^_{n wekhe} innerhalb des UV-Bereiches

Bei der Isotachophorese wird eine Trennung einer von " _{tionsvermögen} aufweisen. Daher ist die ionisierten Probe, welche Ionen einer bestimmten *"_ktroohotometrische Erfassung innerhalb des Polarität enthält, durchgeführt, indem man die spc £ _{jm allgeme}inen bevorzugter verwend-Probe in eine Säule einbringt, die zwischen zwei 30 υ chemischen Gebieten, beispielsweise

Elektroden angeordnet ist. Des weiteren befinde ?f η« Biochemie, ist es folglich von Vorteil, mit sich in der Säule ein Leitelektrolyt, der ui1 derι Teil Verfassung zu arbeiten. Häufig ist es jedoch erder Säule eingebracht ist, der zwischen der Fror« ^ Substanzen isotachophoretisch zu trennen, und der Elektrode vorhanden ist, gegen die die ™ · _{ine UV}-Absorbenten sind. Gewöhnionen wandern, wenn an die Elektroden eine Span- 35 *^e'^cn*]~ derartige isotachophoretische Trennnung angelegt wird. Dieser Leitelektrolyt enthalt hch_f £;^rdcn _hsdlf_{d mit} Trennungen von UV-abIonen von der gleichen Polarität, jedoch mit einer erfahren ao ^^^ _{durchgeführt}. _{Es kan}n höheren Beweglichkeit als die Probenionen. Des wei- sormere _{k daß cine} Anzahl von Subteren befindet sich in der Säule ein Endelektrolyt, jedoch_η*^^Γ ,_{edi lich ein paar} uV-absorbieder in den Teil der Säule eingebracht ist, der zwi- ₄o stanzen- _Isotacho_Phorese getrennt werden sehen der Probe und der anderen Elektrode hegt. ""JJ₁ ¹¹¹Jj, vorstehenden Verfahren erlauben dann Dieser Endelektrolyt enthält Ionen von der gleichen ™^£_rophotometrische Erfassung in derartigen Polarität, jedoch mit einer geringeren Beweglichkeit eine ^peKtrop

als die der Probenionen. Über die gesamte Säule l-aner men . . _{es daher) dn} Verfahren

hin ist eine Ionenart eingebracht welche eine en - « ^Ζ*^^^^ Erfassung von Zonen gegengesetzte Polarität aufweist. Diese Ionen wer- zur SP«J™P · _{welche kein} Absorptions-

lena^ sogenannte Gegenionen bezeichne, Das ge- ^^"SiSn?» daß man die raschere eignete Gegenion hat puffernde Eigenschaften. Die Y5™J|_{h des} Meßverfahrens und ein größeres Isotachophorese ist im einzelnen.η AnalyticaChemica ™™_e ^g _{rmö mit} Hilfe der spektrophoto-Acta 38 (1967), S. 233 bis 237, unter dem Titel ₅o Auno^verm^g _{Vergleich zur} ,hermischen

»Displacement Electrophoresis« beschrieben. Außer- ^m _r ^e™_n ^e"_rS

dem ist die Isotachophorese aus dem schwedischen ^Er^_e ^S _s ^UJ^lg _A ^e _u ^r _f ^na _{abe wird bei} dem Verfahren der ein-Patent 340 376 bekannt. genannten Art erfindungsgemäß dadurch ge-

Bei der isotachophoretischen Trennung von Ionen gangs gena _m ^ _{mt wird) daß sein}

werden zwischen den Zonen, weiche von den Ionen 55 k»t, eau ^_{0n bei sauren} und basi-

gebildet werden, scharfe Grenzen erhalten Beii der "^ _U ^P _{en innerna},_b des WeUenlängen-Durchführung einer isotachophoretischen Trennung f ¹^¹ „"^„„^cheidet.

können verschiedene Arten von Detektoren an der ^be™^ich«? J¹™ . _{es bei der} Erfindung, daß auch Säule angeordnet werden, um die erhaltenen Zonen- ^"^^ng bei Substanzen, die nicht UV-

grenzen zu erfassen. Hierbei wird durch diese Erfas- 60 e.ne ^f ^⁸ _durchgeführt werden kann und sung ein Erfordernis erfüllt, namhch daß, nachdem absorb.^rcna .^ , h ^^ ^ _{ein grö}.