DE2443950B2

DE2443950B2 - Verfahren zur bestimmung des anomalen verhaltens von saeugetier-zellen

Info

Publication number: DE2443950B2
Application number: DE19742443950
Authority: DE
Inventors: Michael; Shinitzky Meir; Rehovoth Inbar (Israel)
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1973-09-14
Filing date: 1974-09-13
Publication date: 1976-12-02
Also published as: FR2244175A1; IL43224A0; DE2443950A1; IL43224A; CA1008266A; GB1481605A; US3971952A; JPS5075869A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des anomalen Verhaltens von Säugetier-Zellen in vitro durch Messung ihrer Eigenschaften im Vergleich zu den Eigenschaften von normalen Zellen des gleichen Typs.

Nach heutiger Lehrmeinung spielt die Dynamik der Zelloberflächenmembranen eine bedeutsame Rolle bei den Regelmechanismen der Zellen. Dazu gehört insbesondere die Möglichkeit, daß die Membrankomponenten eine thermische Bewegung ausführen können, do Die dynamischen Eigenschaften der Zelloberflächenmembranen werden in erster Linie durch die Mikroviskosität ihrer Lipoid-Schicht bestimmt; dieser Begriff wurde zum ersten Mal von Shinitzky et al (Biochemistry, 10, 2106 bis 2113 [1971]) in Verbindung (>? mit Fluoreszenz-Polarisations-Untersuchungen im Kohlenwasserstoffbereich von synthetischen Mizellen eingeführt. Ähnliche Untersuchungen wurden später an den strömungsmechanischen Eigenschaften von Li- posomen (Cogan et al Biochemistry, 12, 521 bis 528 [1973]) und an isolierten biologischen Membranen (R u d y und G i 11 e r, Biochim, Biophys. Ac» a 288,231 bis 236 [1972]) durchgeführt Die bei diesen Untersuchungen angewendeten Methoden beruhen auf Fluoreszenz-Polarisations-Messungen einer fluoreszierenden Probe die in den analysierten Bereich eingebettet wurde. Die Mikroviskosität der Lipoid-Schicht von Zellobertlächenmembranen kann aber auch nach anderen physikalischen Methoden, zum Beispiel durch Kernresonanz (NMR) oder Elektronenspinresonanz (ESR) bestimmt werden (vgL z. B. E. 01 d f i e 1 d und D. Chapman, Fed. Eur. Biochem. Soc. Lett. 21, 303 bis 306 Γ1972]· M.T. Flanagan und TR. Hesketh, Biochim. Biophys. Acta 298, 535 bis 545 [1973]; W. L. Hubbell und H. M. McConnell,J. Amer. Chem. Soc. 93, 314 bis 326 [1971]; und die Übersichten von H.M. Mc'ConneU und B. Gaffney in Quater. Rev Biophys. 3. 91 bis 136f 1970], und von C G i t) e r in Anna Rev. Biophys. Bioeng. 1.51 bis 92 [1972]).

Aus der deutschen Offenlegungsschrift 17 73 809 ist ein Verfahren /ur Feststellung des anomalen Verhaltens von Säugetier-Zellen in vitro bekannt, bei dem die Geschwindigkeit der Diffusionsbewegung radioaktiv markierter Kationen durch die Zelloberfiachenmembran hindurch gemessen und mit den Werten von normaler, Zellen des gleichen Typs verglichen wird. Damit im es zwar möglich, die lonentransportgeschwin digkeit durch die Zellmembranen hindurch zu bestimmen, die Mikroviskosität der Lipoid-Schicht der Zeiloberflächenmembran, die ein empfindlicher und zuverlässiger Anzeiger für bösartige Umwandlungsprozesse in Säugetier-Zellen darstellt, kann damit jedoch nicht gemessen werden, zumal aufgrund der Kompli ziertheit der physiologisch-chemischen Vorgänge, die sich innerhalb einer Zelle abspielen, bisher nicht bekannt ist, welche Zusammenhänge zwischen der Kationentransportgeschwindigkeit durch die Zellmembran hindurch und der Mikroviskosität der Lipoid-Schicht der Zelloberflächenmembran bestehen.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Bestimmung des anomalen Verhaltens von Säugetier-Zellen, insbesondere menschlichen Zellen in vitro anzugeben, mit dessen Hilfe es möglich ist, unter Anwendung gebräuchlicher physikalischer Untersuchungsmethoden zuverlässige Aussagen über Anomalitäten in Säugetier-Zellen zu machen.

Es wurde nun gefunden, daß das anomale Verhalten von Säugetier-Zellen, insbesondere von menschlichen Zellen, wie es bevorzugt durch innerhalb der Zelle ablaufende bösartige Umwandlungsprozesse hervorgerufen wird, mit deutlichen Veränderungen der Mikroviskosität der Lipoid-Schicht der Zelloberflächenmembran einhergeht. Es hat sich nämlich gezeigt, daß die Lipoid-Schicht der Zelloberflächenmembran von anomalen Zellen dünnflüssiger ist, d. h. eine geringere Viskosität aufweist, als diejenige von normalen Zellen des gleichen Typs. So konnte beispielsweise nachgewiesen werden, daß die Mikroviskosität der Lipoid-Schicht der Oberflächenmembran von bösartigen Lymphom-Zellen bei Mäusen nur etwa halb so groß ist wie diejenige von normalen Lymphozyten des gleichen Mäusestamms. Ähnliche Ergebnisse wurden bei lymphatischen Leukämie-Zellen von Menschen, die an chronischer lymphatischer Leukämie unter akuter lymphoplastischer Leukämie litten, erhalten.

Die vorstehend genannte Aufgabe kann bei einem

erfahren des eingangs genannten Typs erfindungsge-"*edadurch gelöst werden, daß die Mikroviskosität der • id-Schicht der Zelloberflächenmembran gemessen iff der dabei erhaltene Wert mit demjenigen von Gnaden Zellen des gleichen Typs verglichen wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es auf Jroduzierbare und äußerst zuverlässige Weise mög-Sl bösartige Veränderungen in Säugetier-Zellen, rTesondere menschlichen Zellen, frühzeitig und mit Saw Empfindlichkeit zu erkennen, noch bevor ₎₀ μ Serlich erkennbare Veränderungen oder wesentliche i derungen des Blutbildes, insbesondere in bezug auf "Τ _Anzahl der Blutkörperchen, auftreten. Dadurch stellt Η« erfindungsgemäße Verfahren ein wertvolles diagnoriscnes Hilfsmittel dar, mit dessen Hilfe es möglich ist, das Auftreten von Tumoren in Säugetieren, insbesonde- Menschen, früher als dies nach den bisher bekannten Methoden möglich war, festzustellen und damit die Aussichten für eine frühzeitige und wirksame Behandlung zu verbessern. 2C

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich die Mikroviskosität der Lipoid-Schicht der Zelloberflächenmembran nach irgendeinem der bekannten physikalischen Verfahren, beispielsweise durch Fluoreszenz-Polarisations-Analyse, Kernresonanz- i_: oder Flektrospinresonanz-Spektroskopie. zu bestimmen Zur Durchführung dieser Messungen wird in der Regel ein elektromagnetisches Signal verwendet, das für bestimmte Atome, Atomgruppen oder Moleküle, die natürliche Bestandteile der Lipoid-Schichten sind.. spezifisch j_st. Es können aber auch Signale verwendet werden die künstlich in die Lipoid-Schichten eingeführt werden! wie z. B. markierte Moleküle, die selektiv in den Kohlenwasserstoffbereich der Lipoid-Schicht eingeführt werden. Als Markierungsstoffe können insbesondere radioaktive Substanzen wie Radioisotope verwendet werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform des Verfahrens der Erfindung wird die Mikroviskosität der Lipoid-Schicht der Oberflächenmembran von Säuge- ,. tier-Zellen durch Fluoreszenz-Polarisations-Analyse einer fluoreszierenden Verbindung, die in die Lipoid-Schicht eingeführt wird, bestimmt. Dieses Verfahren beruht auf der Technik, wie sie von S h i η i t ζ k y et al in »Biochemistry« 10, 2106 bis 2113 (1971), beschrieben worden ist. Dabei wird eine Suspension der zu untersuchenden Zellen, in denen die Lipoid-Schicht der Oberflächenmembran mit einer geeigneten fluoreszierenden Verbindung, vorzugsweise 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien oder einem Niedrig-alkyldenvat davon, behandelt worden ist, einer planpolarisierten Erregerstrahlung einer geeigneten Wellenlänge ausgesetzt, wonach die Intensitäten der Fluoreszenz-Emission der untersuchten Zelle gemessen werden, die bestimmt werden nachdem die Emissionsstrahlung durch einen Polarisa'tionsapparat (Polarisator) gefrhrt worden ist, dessen Polarisationsrichtung parallel bzw. senkrecht zur Polarisationsrichtung der Anregungsstrahlung ausgerichtet ist

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens der Erfindung kann die Emissionsstrahlung auch gleichzeitig durch ein Paar von Polansationsapparaten (Polarisatoren) geführt werden, deren Polansationsrichtung parallel bzw. senkrecht zur Polansationsrichtung der Anregungsstrahlung ist.

Die dabei gemessenen Intensitäten können unter Anwendung der nachfolgend angegebenen Gleichuneen in Beziehung zur Größe der Fluoreszenz-Polansation P, der Fluoreszenz-Anisotropie r und zur Gesamtintensität Fder Fluoreszenz gesetzt weiden:

ρ _

^l» -

I±

I, - h

i,y/ix+l

2J_x

F = I₁₁ +2Z_x= IAI₁₁ /Ϊj.+2);

dabei sind i_lt und Ij_ die Fluoreszenz-Intensitäten, die durch einen Polarisator festgestellt werden, der parallel bzw. senkrecht zu der Polarisationsrichtung des Erregerstrahls orientiert ist.

Die Rotations-Depolarisation einer Fluoreszenz verursachenden Substanz kann durch die Perrin-GIeichung beschrieben werden:

■i- - , ₊ cm -f

dabei sind /-und r„ die gemessenen und die Begrenzungs-Ruoreszenz-Anisotropien, Γ ist die absolute Temperatur, r ist die Lebensdauer des angeregten Zustandes, und η ist die Mikro-Viskosität des Mediums. C(r) ist ein Parameter, der sich auf die molekulare Form der fluoreszierenden Substanz bezieht und hat für jeden Wert ;· einen spezifischen Wert. Für jede spezifische Sonde kann eine Eichkurve gemäß der oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden, wobei rjr gegen Tv/η für jede spezifische Probe aufgetragen wird; diese Kurven können wiederum zur Ableitung der Mikro-Viskosität η mit Hilfe der bestimmten Werte für /·. Tund r verwendet werden.

Wie oben angezeigt wurde, wird die Fluoreszenz-Anid nen Werten für / ///

sotropie r von den gemessenen Werten für I₁₁ Iij_ abgeleitet; aus der Definition für r ergibt sich, daß es von einem einzigen gemessenen Parameter, nämlich dem Verhältnis //, /lj_ abgeleitet werden kann. Dieses Verhältnis kann direkt unter Verwendung von zwei Detektoren oder unter der Verwendung eines einzigen Detektors und zwei abwechselnden Erregungsstrahlen gemessen werden, die im rechten Winkel zueinander polarisiert sind.

Die durch dieses Verfahren erhaltene Mikro-Viskosität stellt den harmonischen Mittelwert der effektiven Viskositäten dar, die einen Widerstand gegen die Drehung des Sonden-Moleküls in alle möglichen ι Richtungen leisten; dieser Mittelwert wird in absoluten makroskopischen Einheiten, also beispielsweise poise, ausgedrückt.

In der Praxis hat sich herausgestellt, daß es nicht notwendig ist, die gemessenen Werte für 1// und /^ oder /// IIj_ in Mikro-Viskositäts-Werte umzuwandeln, um das anomale Verhalten von Zellen festzustellen. Die Unterscheidung der anomalen Zellen von den normalen kann mit dem gleichen' Zuverlässigkeitsgrad erreicht werden, indem die I₁₁ H₁ -Verhältnisse, die aus den Messungen der untersuchten Zellproben erhalten wurden, mit denen verglichen werden, die von normalen Zellen erhalten werden. Das so ermittelte Verhältnis /;/ /Ij_ oder der davon abgeleitete Wert für r sind bei einer konstanten Temperatur Absolutwerte und können als Kriterium für Anomalie dienen. Dies wird im folgenden an Hand der Tabellen erläutert, die in den Ausführungsbeispielen enthalten sind.

Fluoreszierende Moleküle, die für den Einsatz als

Sonden bei der oben beschriebenen Fluoreszenz-Polarisationstechnik geeignet sind, sollten nach einer bevorzugten Ausführungsform eine reine Kohlenwasserstoff-Struktur haben, damit sie in den Kohlenwasserstoff-Bereich der Lipoid-Schicht eindringen und dort eingebettet bleiben können. Gemäß der vorliegenden Erfindung hat sich herausgestellt, daß geeignete Sonden, die bei der oben beschriebenen Fluoreszenz-Polarisations-Technik eingesetzt werden können, Substanzen der Gruppe sind, die aus l,6-Diphenyl-l,3,5-hexatrien (im folgenden als »DHP« bezeichnet) und den niedrigeren Alkyl-Derivaten dieser Substanz besteht.

Aufgrund seiner geeigneten Spektral-Charakteristiken wird insbesondere DHP bevorzugt. Diese Verbindung, die bisher nicht als Sonde bei Fluoreszenz-Untersuchungen eingesetzt worden ist, hat ein starkes Absorptions-Maximum (ε « 80,000M-¹ cm¹) bei ungefähr 350 nm und gutgetrennte Absorptions- und Emissionsspektren; dadurch werden sowohl die Möglichkeit der Übertragung der Anregungsenergie von einem DPH-Molekül zu einem anderen als auch der Beitrag von gestreuten Anregungs-Lichtstrahlen zu dem Fluoreszenz-Signal verringert. Diese beiden Effekte sind die hauptsächlichen Fehlerquellen bei Fluoreszenz-Polarisationsmessungen; es hat sich herausgestellt, daß sie bei mit DPH markierten Systemen vernachlässigbar sind. Das starke Absorptions-Maximum und die hohe Fluoreszenz-Quantenausbeute (0,8 in Hexan bei 25°C) erleichtert die Messung eines Fluoreszenz-Signals bei Konzentrationen, die bis herab zu 10~⁸ M reichen. DPH zeigt im gereinigten, schweren, flüssigen Paraffin bei einer Konzentration von 2 χ 10~^e M bei 25°C eine Lebensdauer des angeregten Zustandes von r = 10,5 ns.

Wie sich aufgrund seiner Kohlenwasserstoff-Struktur erwarten läßt, ist DPH in Wasser praktisch unlöslich. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß klare und stabile Dispersionen von DPH, die praktisch frei von Fluoreszenz sind, erhalten werden können, wenn eine DPH-Lösung in Tetrahydrofuran in ein stark gerührtes, wäßriges Medium eingeblasen wird. Es hat sich gemäß der Erfindung weiterhin herausgestellt, daß DPH in die Lipoid-Schicht der Zelloberflächen-Membranen eindringt, wie es durch einen steilen Anstieg der Fluoreszenz-Intensität der Suspension belegt wird, der nach ungefähr 60 Minuten den Gleichgewichtszustand erreicht, wenn eine wäßrige Zeil-Suspension mit ungefähr dem gleichen Volumen der oben erwähnten DPH-Dispersion gemischt wurde, und die Mischung bei 25° C stehengelassen wurde. Nach einer Abschätzung wurde ein DPH-Molekül auf ungefähr 1000 Lipoid-Moleküle in die Lipoid-Schicht der Membranen eingebaut

Die Fluoreszenz-Signale von DPH enthaltenden Systemen nehmen gemäß den experimentellen Ergeb nissen mit der Zeitspanne ab, während der sie den Anregangslichtstrahlen ausgesetzt sind Wird das Anregungslicht für Intervalle von 15 bis 30 Sekunden abgeschaltet so behielt das System sein ursprüngliches Fluoreszenz-Signal bei. Dieser Effekt beruht wahrscheinlich auf reversiblen Foto-Isomerisationen des DPH von dem Aufbau, bei dem nur die trans-lsomeren vorliegen, zu alternativen Strukturen. Um diesen Effekt zu vermeiden, wurden die Messungen in Zeitintervallen durchgeführt die 10 Sekunden nicht überstiegen.

Die Fluoreszenz-Polarisations-Messungen gemäß den oben beschriebenen AusfGhrungsformen der Erfindung können mit irgendeiner geeigneten Vorrichtung durchgeführt werden, die eine Quelle für polarisierte Lichtstrahlung, nach einer bevorzugten Ausführungsform im Bereich von 200 bis 700 nm, wenigstens ein Meßsystem, das einen Polarisationsapparat aufweist, und eine Einrichtung enthält, um die Intensität der Lichtstrahlen zu messen, die durch den Polarisationsapparat geführt werden. Die Vorrichtung sollte weiterhin eine Anordnung aufweisen, um die gegenseitige Orientierung der Polarisationsapparate beliebig ändern zu können, damit die Fluoreszenz-Intensitäten in

ίο gekreuzter und in paralleler Richtung zu der Polarisationsrichtung des Anregungsstrahls gemessen werden können.

Zu diesem Zweck ist eine Vorrichtung entwickelt worden, die im folgenden unter Bezugnahme auf die

ι j schematische Zeichnung näher erläutert wird.

Die einzige Figur stellt schematisch eine Vorrichtung dar, mit der genaue Messungen der Fluoreszenz-Polarisation durchgeführt werden können; dabei wird ein von einer Lichtquelle i abgegebener Strahl Anregungslicht durch eine Quarzlinse 3, einen Monochromator 4, eine zweite, als Kollimator dienende Quarzlinse 5, einen keilförmigen Depolarisator 6 und einen Glan-Thompsoii-Polarisationsapparat 7, insbesondere ein Polarisationsprisma, geführt. Die von dem Polarisationsapparat 7 ausgehenden, polarisierten Anregungs-Lichtstrahlen verlaufen durch eine zylindrische Quarz-Küvette oder Testrohr 9, das die zu untersuchende Probe enthält; das Testrohr befindet sich in einem Thermostaten 8. Ein Meßsystem 11 weist einen Glan-Thompson-Polarisationsapparat 12, insbesondere ein Polarisationsprisma, eine Quarzlinse Ϊ3, ein Grenz- oder Sperrfilter 14 und einen Fotovervielfacher 15 auf. Der Polarisationsapparat 12 ist so ausgerichtet, daß seine Polarisationsebene in vertikaler Richtung (senkrecht zu der Papierebene der Zeichnung) liegt; die gesamte Meßanordnung ist auf einer kreisförmigen Schiene 10 angebracht, so daß sie um den Mittelpunkt der Probenküvette 9 drehbar ist. damit die Fluoreszenz-Emission bei unterschiedlichen Winkeln zu dem Anregungslichtstrahl gemessen werden kann. Eine als Ausgleichseinrichtung dienende Fotodiode 2 ist in der Nähe der Lichtquelle 1 vorgesehen und dient dazu. Fluktuationen der Lichtintensität der Quelle zu korrigieren. Die Vorrichtung weist weiterhin eine Steuereinheit 16 auf. die Energiequellen 17 für den Fotovervielfacher 15 und für die Fotodiode 2 und eine Ausleseeinheit 18 enthält.

Beim Betrieb wird die Probe in der Probenküvette 9 angeordnet, während der Thermostat 8 auf die gewünschte Temperatur gebracht wird. Die Probe wird den Anregungslichtstrahlen von der Lichtquelle 1. die beispielsweise eine Quecksilber- oder eine Xenon- Quecksilber-Lichtbogenlampe sein kann, ausgesetzt Die Anregungslichtstrahlen von der Quelle werden durch die Linse 3 auf einen Monochromator 4 mit hoher Intensität fokussiert. Der monochromatische Strahl wird durch die Linse ausgerichtet insbesondere parallel gemacht und durch einen Doppelkeil-Depolarisationsapparat 6 auf den Glan-Thompson-Polarisationsapparat 7 geführt der in unterschiedlichen Orientierungen genau eingestellt werden kann. Die Fluoreszenz-Emission von der angeregten Probe verläuft durch den vertikal orientierten Polarisationsapparat 12 und wird durch die Linse 13 auf den Fotovervielfacher 15 fokussiert. Das Grenzfilter 14 dient dazu, gestreute Anregungs-Lichtstrahlen auszufiltern und nicht durchzulassen; das Filter 14 wird in Abhängigkeit von der Wellenlänge des Anregungslichtes ausgewählt Das Ausgangssignal des Fotovervielfachers IS wird auf die

Steuereinheit 16 gegeben, wo es mit dem Signal von der als Ausgleichseinrichtung dienenden Fotodiode 2 verglichen wird. Das kompensierte Signal wird verstärkt und kann an der Ausleseeinheit 18 ausgelesen oder aufgezeichnet werden. s

Der Depolarisationsapparat 6 dient dazu, jede Polarisation der Anregungsslrahlung zu eliminieren, bevor sie durch den Polarisationsapparat 7 geführt wird, damit die Intensität des polarisierten Strahls, der die Probe anregt, unabhängig von der Orientierung des _]0 Polarisationsapparates 7 ist. Die Depolarisations-Vorrichtung kann durch Drehung in eine Stellung eingestellt werden, in der die gemessene Fluoreszenz-Intensität einer vollständig depolarisierten Lösung (beispielsweise 10-^:M Akridin-Hydrochlorid in Methanol) gleich ist, ,<; wenn der Polarisationsapparat 7 für das Anregungslicht vertikal oder horizontal orientiert ist (während der Polarisationsapparat 12 für das Meßlicht vertikal orientiert ist). Wenn der Depolarisationsapparat so justiert ist, lassen sich Abweichungen von weniger als 1% über den gesamten Anregungsbereich erreichen; bei Bedarf können diese Abweichungen noch korrigiert werden.

Die Intensität der Fluoreszenz wird einmal gemessen, wenn der Polarisationsapparat 7 für die Anregungs- _2<i strahlen vertikal ausgerichtet ist (d. h„ wenn seine Polarisierungsrichtung parallel zu der Polarisationsrichtung des Polarisationsapparates 12 ist), um den Wert für /// zu erhalten. Weiterhin wird die Intensität nochmals gemessen, wenn der Polarisationsapparat 7 für das ^₀ Anregungslicht horizontal ausgerichtet ist, um den Wert \j_ zu erhalten.

Um die Fehler möglichst gering zu halten oder ganz zu vermeiden, die durch gestreutes oder Streulicht verursacht werden, wenn die Probe eine trübe, also dickflüssige Lösung oder Suspension ist, wird die Meßanordnung 11 längs der Schiene 10 zu einem Winkel gedreht, bei dem das Verhältnis der Intensität der Fluoreszenz zu der Streulicht-Intensität besonders groß, möglichst maximal ist: die Messungen werden dann bei diesem Winkel durchgeführt. Dieser optimale Winkel wird mit Hilfe einer nicht mit einer Markierung versehenen Bezugsprobe von gleicher Trübung bestimmt, die keine Fluoreszenz zeigt: dabei sind der Polarisationsapparat 7 für die Anregungsstrahlung und der Polarisationsapparat 12 für die Meßstrahlung beide vertikal ausgerichtet. Es ist auch möglich, die I^ und /// -Messungen in bezug auf den Anteil an gestreutem Licht zu korrigieren, indem die mit der obenerwähnten Bezugslösung erhaltenen Auslesewerte verwendet werden.

Die Fluoreszenz-Polarisation kann auch mit einem Instrument gemessen werden, das von Weber und Ba b1ou ζ i a n (J. Biol.Chem. 241. 2558 [1966]) ähnelt: dabei ist die Anregungseinheit, die Bauteile aufweist, die den Bauteilen 1 und 3 bis 7 in der Zeichnung entsprechen, im wesentlichen identisch mit der hier beschriebenen, während die abgegebene Fluoreszenz-Strahlung gleichzeitig durch zwei unabhängige, kreuzpolarisierte Meßkanäle gemessen wird; diese Kanäle ähneln dem Meßsystem 11 in der Zeichnung und sind so angeordnet daß sie einander auf einer Linie gegenüberliegen, die senkrecht zu der Richtung des Anregungsstrahls ist. Bei einem dieser Kanäle passiert das emittierte Licht einen Polarisationsapparat, wobei die f,₅ Polarisationsrichtung senkrecht zu der Polarisationsebene des Anregungsstrahls ist. während das Licht in dem anderen Kanal durch einen PoJarisationsapparat geführt wird, der parallel zu dieser Ebene gerichtet ist. Diese Ausgestaltung ermöglicht die Verwendung einer viereckigen, insbesondere quadratischen Proben-Küvette und die direkte Ablesung oder Aufzeichnung des Verhältnisses /// /Ij_ , beispielsweise mit einem Verhältnis- oder Quotient-Digitalvoltmeter. Wie oben festgestellt wurde, kann dieses Verhältnis I₁₁ /Ij_ als direktes Kriterium für die Bösartigkeit der Zellen dienen, wie in den folgenden Beispielen aufgezeigt wird. Bei einem Instrument von diesem Typ kann selbstverständlich auf die als Ausgleichseinrichtung dienende Fotodiode 2 verzichtet werden.

Bei einer alternativen Ausführungsform der Vorrichtung, mit der das Verhältnis /// /lj_ direkt abgelesen werden könnte, sind ein einziger Meßkanal (11 in der Figur) und zwei Anregungskanäle vorgesehen, die dem oben beschriebenen ähneln; jeder Anregungskanal strahlt polarisiertes Anregungslicht aus, wobei die Polarisationseinrichtungen in den beiden Kanälen senkrecht zueinander sind. Die Probe wird abwechselnd und intermittierend dem einen oder dem anderen dieser beiden Anregungsstrahlen mittels einer herkömmlichen Zerhackereinrichtung, beispielsweise einem mit Ausschnitten versehenen Spiegel, ausgesetzt, wobei das von dem Fotovervielfacher 15 erhaltene Signal auf seine Wechselstrom- und seine Gleichstrom-Komponenten analysiert wird, wodurch das Verhältnis /,/ /lj_ direkt abgelesen werden kann.

Unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens und der Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenz-Polarisation einer DPH-Sonde, die in die Lipoid-Schicht eingeleitet ist. wurde eine große Anzahl von Bestimmungen des /// /lj_ -Verhältnisses mit Lymphozyten von Mäusen, und zwar sowohl von normalen als auch von leukämischen durchgeführt. Das für normale Zellen von verschiedenen Mäusestämmen bei 25°C ermittelte Verhältnis lag immer im Bereich von 1.75 + 0.02; es war gleich für normale Lymphozyten, die den Lymphdrüsen, der Thymusdrüse oder dem Knochenmark der Mäuse entnommen wurden. Dagegen lagen die Ij₁ /h_ -Verhältnisse, die mil Lympnom-Zellen von Mäusen des gleichen Stammes erhalten wurden, die mit Aszites-Tumor infiziert waren, alle im Bereich 1.55 ±0.02. Die davon abgeleiteten Mikroviskositäten η bei 25°C betrugen (in poise) 2.8 bzw. 1,6 für die normalen Lymphozyien-Zellen bzw. die Lymphom-Zellen. Ein ähnlicher Unterschied wurde auch bei menschlichen Lymphozyten beobachtei und für die Feststellung von chronischer lymphatischer Leukämie und akuter lymphoblastischer Leukämie angewandt Es stellte sich heraus*, daß das mit normaler Lymphozyten, die vom peripheren Blut normale! Spender erhalten wurden, gemessene /// /lj_ -Verhältnis 1,86 ± 0,03 (Mittel von ungefähr 40 Spendern) betrug während ein Wert 1,71 ±0,05 bei leukämischen Zeller gemessen wurde, die dem peripheren Blut von Patienter (Mittel von ungefähr 40 Patienten) entnommen wurden die an chronischer lymphatischer Leukämie litten. Die jeweiligen Mikroviskositäten bei 25°C wurden füi normale Lymphozyten zu 3,7 poise und für leukämische Zellen zu Z5 poise berechnet. Fluoreszenz-Polarisa tionsmessungen wurden auch mit ieukämischen Zeller durchgeführt, die dem peripheren Blut von Patienten (^ Fälle) entnommen wurden, die an akuter lymphoblasti scher Leukämie litten. Die gemessenen /// /ij -Verhält nisse betrugen alle ungefähr 1,67, während die Mikroviskositäten bei 25'C ungefähr 22 poise betrugen

Die oben beschriebenen Ergebnisse, insbesondere ihre Reproduzierbarkeit, und der relativ schmale

Abweichungsbereich sowohl bei normalen Zellen als auch bei bösartigen, zeigen die Zuverlässigkeit des Verfahrens nach der Erfindung für die Feststellung von bösartigen Umbildungen in Säugetier-Zellen. Es soll noch darauf hingewiesen werden, daß in einigen Fällen bei Patienten, die an chronischer lymphatischer Leukämie litten, die Veränderung der Mikroviskosität der Lipoid-Schicht bereits mehrere Monate vor dem Auftreten von wesentlichen Änderungen im Blutbild, insbesondere der Zahl der Blutkörperchen, beobachtet ι ο werden konnte. Weiterhin dauerte in einem Fall einer untersuchten akuten lymphoblastischen Leukämie die Verringerung der Mikroviskosität der Lipoid-Schicht sogar nach der vollen Remission der akuten Leukämie noch an, die sich als Folge einer Behandlung ergab, bei der Bluttransfusionen im großen Ausmaß stattgefunden haben. Die Mikroviskosität blieb auf dem niedrigen Wert, obwohl das Blutbild, insbesondere die Zahl der Blutkörperchen, und die Morphologie normal zu sein schienen.

Der wesentliche Lipoid-Parameter, der die Mikroviskosität bestimmt (und damit den aufgezeichneten Wert für die Fluoreszenz-Polarisation mit DPH steuert), ist das Verhältnis von Cholesterin zu Phospholipid »C/P-Verhältnis«. Hierzu wird auf C ο g a η et al, Biochemistry, 12, 521-528 (1070), R. A. Cooper, Semin. Hematol. Vol. 7, 296-322 (1970) und lnbar und Shinitzky, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. 1974 verwiesen. Damit liefert also die Messung mit DPH ein Mittel für indirekte Bestimmungen in dem gemessenen System (intakte Zellen, isolierte Membranen, Lipoid-Dispersion, Seren). Das C/P-Verhältnis bietet also eine empfindliche Anzeige für irgendwelche Unregelmäßigkeiten oder Störungen im Lipoid-Stoffwechsel bzw. -Umsatz.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Normale Lymphozyten werden den Lymphdrüsen, der Thymusdrüse und dem Knochenmark von ausge wachsenen Mäusen entnommen, während bösartige Lymphom-Zellen von ausgewachsenen Mäusen erhalten wurden, die 10—14 Tage vorher intraperitoneal jeweils mit ungefähr 10⁵ Zellen einer Aszites-Form eines Lymphoms geimpft wurden, das durch einen Moloney-Virus erzeug» wurde. Für jedes Experiment wurden

Tabelle 1

Τ"

frisch entnommene normale Lymphozyten oder Lymphom-Zellen dreimal mit einer 0.15 M wäßrigen KCl-Lösung gewaschen und in einer 0,15-M-KCI-Lösung suspendiert.

Eine wäßrige Dispersion von DPH wurde vorbereitet, indem 0,1 ml einer 2 χ 10-³-M-DPH-Lösung in Tetrahydrofuran in 100 ml einer stark gerührten wäßrigen 0.15-M-KCI-Lösung eingeblasen wurden. Das Umrühren bzw. Schütteln der Dispersion wurde bei 25^CC 15 Minuten lang durchgeführt, wodurch eine klare, stabile, wäßrige Dispersion von 2 χ 10-"-M-DPH erhalten wurde, die praktisch frei von Fluoreszenz war.

Eine Volumeneinheit der Zeil-Suspension von 0,15 M wäßriger KCl-Lösung, die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, (ungefähr 5 χ 10* bis 2,5 χ 10⁷ Zellen/ml) wurde mit einer Volumeneinheil der DPH-Dispersion gemischt und bei 25°C stehen gelassen. Der Eindringung der DPH in die Zellmembran folgte ein steiler Anstieg der Intensität der Fluoreszenz, wobei die Fluoreszenz-Intensität nach ungefähr 60 Minuten den Gleichgewichtszustand erreichte und nicht weiter anstieg. Die mit einer Markierung versehenen Zellen wurden dann zweimal mit einer 0,15-M-KCl-Lösung gewaschen, in dieser Lösung suspendiert und sofort für die Fluoreszenz-Messungen eingesetzt.

Die Fluoreszenz-Polarisation und -Intensität wurden mit einem Instrument gemessen, wie es oben beschrieben wurde. Die Probe wurde mit einer Strahlung im 366 nm Band angeregt (die Strahlung wurde durch einen 500-W-Quecksilber-Lichtbogen erzeugt), wobei die Strahlen durch einen Glan-Luft-Polarisationsapparat geführt wurden. Eine 2 N-Natriumnitrit-Lösung wurde als Grenzfilter für Wellenlängen unterhalb 390 nm in dem Meßkanal verwendet.

Bei allen Fluoreszenz-Messungen wurde die Temperatur der Probe mit einem Bad gesteuert, das durch einen Thermostat eingeregelt wurde. Die Temperatur der Probe wurde mit einem Thermometer, das in die analysierte Lösung eingetaucht wurde, mn einer Genauigkeit von 0,3⁰C gemessen. Die mit DPH versetzten bzw. markierten Proben wurden den Anregungslichtstrahlen weniger als 10 Sekunden lang ausgesetzt, um die Möglichkeit zu vermeiden, das DPH reversibel bleicht oder entfärbt. Vor jeder Messung wurden die Zeil-Suspensionen leicht gerührt bzw. geschüttelt, um eine isotrope Verteilung sicherzustellen.

Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt.

Normale Lymphozyten und leukämische Zellen von Mäusen

Zellen

Stamm

Organ Zahl der Fluoreszenzpolansation von untersuch- DPH bei 25° C
ten Proben

Mikroviskosität bei 25⁰C (poise)

Normale Lymphozyten Leukämische Zellen

A/J
C57BI

CS7B1
(nudes)

A/]

Lymphdrüsen Thymusdrüse Knochenmark

Lymphdrüsen Thymusdrüse Knochenmark 17 18 25

15 25 14

1.75 ±0,02 0,273 0,200 2,8

Lymphdrüsen Aszites-Tumor

U5±0,02 0,216 0.160 1.6

Beispiel 2
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde für von Patienten erhalten wurden, die an chronischer

Fluoreszenz-Polarisationsmessungen von mit DPH versetzten normalen Lymphozyten, die aus dem peripheren Blut normaler menschlicher Spender isoliert wurden, sowie auf ähnliche Weise versetzten leukämischen Zellen verwendet, die aus dem peripheren Blut lymphatischer Leukämie und akuter lymphoblastischer Leukämie litten.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt.

Zellen

Ursprung

Zahl der Fluoreszenzpolarisation von

untersuchten DPH bei 25°C

Proben Mikroviskosität bei 25°C (poise)

Normale Lymphozyten

Chronisch lymphatische
leukämische Zellen
Akut lymphoblastische,
leukämische Zellen

Peripheres Blut von
normalen Spendern
Peripheres Blut von
leukämischen Patienten

Peripheres Blut von
leukämischen Patienten

38 1,86 ±0,03 0.301 0,223 3,7

38 1.71 ±0.05 0,261 0,191 2.5

1,67

0.250 0,182

Fluoreszenz-Polarisations Messungen mit ZeIl-Suspensionen sind anfällig bzw. empfindlich gegen experimentelle Fehler, die von der Streu-Depolarisation der Fluoreszenz und vom Eindringen des Hintergrundlichtes in die Emissionskanäle herrühren. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß bei der Verwendung von DPH als Fluoreszenz-Sonde diese Fehler leicht bestimmt oder sogar ganz vermieden werden können. Werden die mit DPH versetzten bzw. markierten Zeil-Suspensionen fortschreitend mit einer 0.15 M wäßrigen KCl-Lösung verdünnt, so wird ein konstanter Wert für Pbei Konzentrationen von ungefähr 7 χ IO^b Lymphozyten/ml und ungefähr 2 χ 10~⁶ Lymphom-Zellen/ml erreicht. Bei diesen Zeil-Konzentrationen ist deshalb die Strcu-Dcpolarisation der Fluoreszenz vernachlässigbar, während bei allen untersuchten Systemen der Beitrag des Uniergrundlichtes zu dem Fluoreszenz-Signal, wie durch Bezugs-Suspensionen mit nichtversetzten Zellen überprüft wurde, weniger als 3°/c betrug. Deshalb wurden bei den meisten Fluoreszenz-Messungen Konzentrationep in dem oben erwähnter Bereich verwendet, wobei keine Korrekturen für der Beitrag der Streu-Depolarisation und des Untergrund lichtes zu den gemessenen Werten durchgeführ wurden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung des anomalen Verhaltens von Säugetier-Zellen in vitro durch Messung ihrer Eigenschaften im Vergleich zu den Eigenschaften von normalen Zellen des gleichen Typs, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroviskosität der Lipoid-Schicht der Zelloberflächenmembran gemessen und der dabei erhaltene Wert mit demjenigen von normalen Zellen des gleichen Typs verglichen wird.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekenn zeichnet, daß in die Lipoid-Schicht der Zeiloberflächenmembran eine fluoreszierende Verbindung eingeführt wird, daß die so markierten Zellen einer polarisierten Anregungsstrahlung ausgesetzt werden und daß die Fluoreszenzpolarisation der von der Probe emittierten Strahlung gemessen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Fluoreszenzpolarisation der von den markierten Zellen emittierten Strahlung nach Durchgang der Fluoreszenzemission durch einen Polarisationsapparat, dessen Polarisationseinrichtung parallel bzw. senkrecht zur Polarisationsrichtung der Anregungsstrahlung ist, die Fluoreszenzintensitäten /„ und \j_ gemessen, daraus der Wert für /,/ //j_ errechnet und dieser mit dem bei normalen Zellen des gleichen Typs erhaltenen entsprechenden Wen verglichen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3. dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis /// //^ direkt gemessen w-rd unter Verwendung von zwei Meßkanälen oder von zwei alternierenden Anregungskanälen, deren Polarisationsrichtungen senkrecht zueinander sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zum Markieren der Zellen als fluoreszierende Verbindung 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien oder ein Niedrig-alkylderivat davon verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Markieiung der Zellen in der Weise durchführt, daß man eine Suspension der Zellen mit einer wäßrigen Dispersion von 1,6-Diphenyl-l,3,5-hexatrien mischt und die Mischung anschließend sich selbst überläßt.