DE2443950A1 - Verfahren zur feststellung des anomalen verhaltens von saeugetier-zellen - Google Patents
Verfahren zur feststellung des anomalen verhaltens von saeugetier-zellenInfo
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Description
YEDA EESEAECH AlID DEVELOPMENT CO., LTD.
Weizmann Institue of Science, Eehovoth, Israel
Verfahren zur Feststellung des anomalen Verhaltens von Säugetier- Zellen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Feststellung des anomalen Verhaltens von Säugetier-Zellen in vitro.
Dieses Verfahren läßt sich insbesondere bei menschlichen Zellen anwenden.
Weiterhin bezieht die Erfindung sich auf Veränderungen in dem fluiden Zustand der Lipoid-Schicht der Membranen
der Zellen-Oberfläche, die den bösartigen Umwandlungen
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von normalen Zellen zugeordnet sind. Die Erfindung schafft dadurch ein diagnostisches Hilfsmittel,
um das Auftreten von Tumoren in Säugetieren, beispielsweise Menschen,.festzustellen.
Nach der heutigen Lehrmeinung spielt die Dynamik der Zellenoberfläche-Membranen eine wesentliche
Rolle bei den Regelmechanismen der Zellen; dazu gehört insbesondere die, Möglichkeit, daß die
Membran-Komponenten eine thermische Bewegung durchführen können; dieser Effekt wird üblicherweise
als " Membran-Fluidität " , also flüssiger Zustand der Membran, bezeichnet. Die dynamischen
Eigenschaften der Ze.llenoberfläche-Membranen werden
in der Hauptsache durch die Pluidität, also den flüssigen Zustand / ihrer Lipoid-Schicht bestimmt.
Die Fluidität der LipaLd-Schicht kann
als Mikro-Viskosität dieser Schicht ausgedrückt werden; dieser Begriff wurde durch Shinitzky et
al ( Biochemistry, Io, 21o6-2113 (1971)) in Verbindung
mit Fluoreszenz - Polarisations-Untersuchungen am Kohlenwasserstoffbereich von
synthetischen Mizellen eingeführt. Ähnliche Untersuchungeu wurden später an den sfcrömungsmechanischen
Eigenschaften von Liposomen ( Cogan et al, Biochemistry, 12, 521-528 (1973)) und
an isolierten biologischen Membranen ( " Geister " = " ghosts " ) ( Rudy und Gitier» Biochim, Biophys. Acta
288, 231-236 ( 1972 )) durchgeführt. Die bei
den oben erwähnten Untersuchungen verwendeten Techniken beruhten auf Fluoreszenz-Polarisations-Messungen
einer fluoreszierenden Probe, die in den analysierten
Bereich eingebettet wurde. Die Fluidi-
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tats-Eigenschaften der Lipoid-Schicht von Zellmembranen
können jedoch in Einheiten der MikroViskosität oder anderer , zugeordneter Parameter
mit Hilfe von anderen physikalischen Methoden, wie beispielsweise NMR ( Kernresonanzspektrokospie
) oder ESR ( Elektronenspinresonanz ) bestimmt werden; beispielsweise wird auf folgende
Veröffentlichungen verwiesen: E. Oldfie^d
und D. Chapman, Fed.Eur. Biochem. Soc. Lett.21,
303-306 (1972); M.T. Flanagan und T.R. Hesketh,
Biochim. Biophys. Acta 298, 535-5^5 ( 1973); W.L.
Hubbell und H.M. McConnell, J.Amer.Chem. Soc.
93, 314-326 (1971); und die Übersichten von
ι
H.M.Mc Connell und B.Gaffney in Quater«Rev.
H.M.Mc Connell und B.Gaffney in Quater«Rev.
Biophys. 3, 91-136 (I97o) und von C. Gitler in
Annu.Rev. Biophys. Bioeng. I1 51-92 (1972 ).
Der Erfindung liegt. die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Feststellung des anomalen Verhaltens
von Säugetier-Zellen in vitro zu schaffen, bei dem sich die gebräuchlichen physikalischen
Untersuchungsverfahren anwenden lassen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Fluidität oder eine zugeordnete Eigenschaft
der Lipoid-Schicht der Zelloberflächen-Membran gemessen wird.und daß das so erhaltene Meßergebnis
mit dem von normalen Zellen des gleichen Typs verglichen wird.
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Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß anomales Verhalten von Säugetier-Zellen,
wie es insbesondere durch bösartige Umwandlungen verursacht wird, mit merklichen Veränderungen der
Fluidität der Lipoid-Schicht der Oberflächen-Membran der Zellen verbunden ist. Bei Untersuchungen
hat sich herausgestellt, daß die Lipoid-Schicht von anomalen Zellen dünnflüssiger ist
und eine geringere Viskosität hat als die normalen Zellen des gleichen Typs. Durch Experimente
wurde beispielsweise bestätigt, daß die Mikro-Viskosität der Lipoid-Schicht der Oberflächenmembran
von bösartigen Lymphom-Zellen von Mäusen fast halb so groß ist wie die von
normalen Lymphozyten von dem gleichen Mäusestamm . Ähnliche Ergebnisse wurden mit lymphatischen
Leukämie-Zellen von menschlichen Patienten erhalten, die an chronischer lymphatischer
Leukämie oder akuter lymphoblastischer Leukämie litten.
Die Erfindung schafft also ein Verfahren zur Feststellung des anomalen Verhaltens von
Säugetier-Zellen, bei dem die Fluidität, also der flüssige Zustand, oder eine diesem
zugeordnete Eigenschaft der Lipoid-Schicht der Zelloberflächen-Membran gemessen und das
dadurch erhaltene Meßergebnis mit dem von normalen Zellen des gleichen Typs verglichen
wird.
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_ 5 —
Vie o"ben angedeutet wurde, kann die Fluidität,
also der flüssige Zustand, der Lipoid-Schicht der Zelloberflächen-Membran bestimmt werden,
indem eine dieser zugeordnete oder davon'abhängige Eigenschaft durch irgendein geeignetes
physikalisches Verfahren, wie beispielsweise Fluoreszenz-Polarisations-Analyse, Kernresonanzspektrokospie
und Elektronenspin-Resonanz gemessen wird. Bei dieser Messung kann elektromagnetisches
Signal verx^endet werden, das spezifisch für bestimmte Atome, Gruppen von
Atomen oder Moleküle ist, die natürliche Bestandteile der Lipoid-Schichten sind. Als
Alternative hierzu könnten Signale eingesetzt werden, die von geeigneten, sogenannten "Sonden"
(Prüfverbindungen) ausgehen; damit werden geeignete, mit einer Markierung versehene Moleküle
bezeichnet, die selektiv in den Kohlenwasserstoff bereich der Lipoid-Schicht eingeführt v/erden;
als Markierung können insbesondere radioaktive Substanzen, wie beispielsweise Radio-Isotope,
verwendet werden. Die gemessenen Werte der beobachteten, der Pluidität zugeordneten Eigenschaften
können dann in die Mikro-Viskosität oder den Kehrwert
der Fluidität, umgerechnet werden; andererseits
können jedoch die gemessenen Werte als solche für den Vergleich mit den entsprechenden
Werten verwendet werden, die bei Messungen an anderen Zellen erhalten wurden.
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Gemäß einer Ausfuhrungsform der Erfindung
wird die Fluidität der Lipoid-Schicht der Oberflächen-Membran von Säugetier-Zellen
durch die Fluoreszenz-Polarisationsanalyse einer fluoreszierenden Sonde bestimmt , die
in die Lipoid-Schicht eingebettet wird. Dieses Verfahren beruht auf der Technik,
die von Shinitzky et al ( Biochemistry Io, 2I06-2113 (1971 )geschrieben worden isty
dabei wird eine Suspension der Zellen, deren Membran-Lipoid-Schichten mit einer geeigneten,
fluoreszierenden Sonde versetzt worden sind, einer planpolarisierten Erregerstrahlung mit
geeigneter Wellenlänge ausgesetzt, wobei die Intensitäten der fluoreszierenden Emission
der Probe gemessen werden, nachdem die emittierten Strahlen durch einen Polarisationsapparat
oder Polarisator geführt wurden, der parallel bz\ir. senkrecht zu der Polarisationsrichtung
der Erregerstrahlen ausgerichtet ist; als Alternative hierzu kann die Emissionsstrahlung
gleichzeitig durch ein Paar von Polarisationsapparaten oder Polarisatoren geführt werden,
die parallel bzw. senkrecht zu dieser Richtung ausgerichtet sind. Die gemessenen Intensitäten
können, durch die folgenden Gleichungen in Beziehung zu der Größe der Fluoreszenz-Polarisation
P , der Fluoreszenz-Anisotropie r und zu der Gesamtintensität F der Fluoreszenz gesetzt werden:
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p = It/ --Ii _ I // /I-t -1
I,, + I^ I // /Ij. +1
r _ I // - I ^t _ I // /I x - 1
I,, + 21 α I,, /1^+2
F = I „ +2I^ = Ix(I „
dabei sind I „ und lj_ die Fluoreszenz-Intensitäten,
die durch einen Polarisator festgestellt werden, der parallel bzw. senkrecht zu der Polarisationsrichtung
des Erregerstrahls orientiert ist.
Die Rotations-Depolarisation einer Fluoreszenz verursachenden Substanz kann durch die Perrin Gleichung
beschrieben werden:
+ C (r) —2
dabei sind r und r die gemessenen und die Begrenzungs-Fluoreszenz-Anisotropien,
T ist die absolute Temperatur, ~C ist die Lebensdauer des
angeregten Zustandes, und T^ ist die Mikro-Viskosität
des Mediums. C (r) ist ein arameter, der sich auf.die molekulare Form der fluoreszierenden
Su]jstanz bezieht und hat für jeden
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Wert r einen spezifischen Wert. Für jede spezifische
Sonde kann eine Eichkurve gemäß der oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden, wobei
r / r gegen T χ / Ti für jede spezifische Probe
aufgetragen wird; diese Kurven können wiederum zur Ableitung der Mikro-Viskosität T^ mit Hilfe
der bestimmten Werte für r, T und ~ζ~ verwendet
werden.
Wie oben gezeigt wurde, wird die Fluoreszenz-Anisotropie
r von den gemessenen Werten für E // /* M abgeleitet; aus der Definition für r
ergibt sich, daß es von einem einzigen gemessenen Parameter , nämlich dem Verhältnis I // / I _/_·
abgeleitet werden kann. Dieses Verhältnis kann direkt unter Verwendung von zwei Detektoren
oder unter der Verwendung eines einzigen Detektors und zwei abwechselnden Erregungsstrahlen gemessen
werden, die im rechten Winkel zueinander polarisiert sind.
Die durch dieses Verfahren erhaltene Mikro-Viskosität stellt den harmonischen Mittelwert der
effektiven Viskositäten dar, die einen Widerstand gegen die Drehung des Sonden - Moleküls in alle
möglichen Richtungen leisten; dieser Mittelwert wird in absoluten makrokospischen Einheiten ,
also beispielsweise POiSe7 ausgedrückt.
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In der Praxis hat sich herausgestellt, daß es nicht notwendig ist, die gemessenen Werte für I ^ und I^
oder 1 /j / I j_ in Mikro-Viskdsitäts-Werte umzuwandeln,
um das anomale Verhalten von Zellen festzustellen. Die Unterscheidung der anomalen Zellen
von den normalen kann mit dem gleichen Zuverlässigkeitsgrad erreicht werden, indem die I // /I j_
- Verhältnisse» die aus den Messungen der untersuchten Zellproben erhalten wurde^ mit denen verglichen
. werden, die von normalen Zellen erhalten werden. Das so ermittelte Verhältnis I if / "Lj^ oder
der davon abgeleitete Wert für r sind bei einer konstanten Temperatur Absolutwerte und können
als Kriterium für Anomalie dienen. Dies wird im folgenden anhand der Tabellen erläutert
die in den Ausführungsbeispielen enthalten sind.
Fluoreszierende Moleküle, die für den Einsatz
als " Sonden bei der oben beschriebenen Fluoreszenz-Polarisationstechnik
geeignet sind, sollten nach einer bevorzugten Ausführungsform eine reine Kohlenwasserstoff-Struktur haben, damit sie
in den Kohlenwasserstoff-Bereich der Lipoid-Schicht
eindringen und dort eingebettet bleiben können. Gemäß der vorliegenden Erfindung hat sich herausgestellt,
daß geeignete Sonden, die bei der oben beschriebenen Fluoreszenz-Polaristations-Technik
eingesetzt werden können, Substanzen der Gruppe sind, die aus 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien ( im
folgenden als " DPH IT bezeichnet ) und den niedrigeren
Alkyl-Derivaten dieser Substanz besteht.
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Aufgrund seiner geeigneten Spektral-Charakteristiken wird insbesondere DPH bevorzugt.
Diese Verbindung, die bisher nicht als Sonde bei Fluoreszenz-tlntersuchungen eingesetzt worden
ist, hat ein starkes Absorptions-Maximum
( £ ~ ßo, ooo M~ cm" ) bei ungefähr 350 nm
und gut-getrennte Absorptions-und Emissionspektren;
dadurch werden sowohl die Möglichkeit der Übertragung der Anregungsenergie von einem DPH-Molekül
zu einem anderen als auch der Beitrag von gestreuten Anregungs-Lichtstrahlen zu dem Fluoreszenz-Signal
verringert. Diese beiden Effekte sind die hauptsächlichen Fehlerquellen bei Fluoreszenz-Polarisationsmessungen;
es hat sich herausgestellt, daß sie bei mit DPH markierten Systemen vernachlässigtoar sind. Das starke Absorptions-Maximura
und die hohe Fluoreszenz-Quanten'ausbeute
( o.j-S in Hexan bei 25 C) erleichtert die Messung
eines Fluoreszenz-Signals bei Konzentra -
tionen, die bis herab zu Ιο" Μ reichen. DPH
zeigt im gereinigten, schweren,flüssigen Paraff.inbei einer Konzentration von 2 χ lo~ M bei 25 C
eine Lebensdauer des angeregten Zustandes von "T =s I0.5
Wie sich aufgrund seiner Kohlenwasserstoff- Struktur erwarten läßt, ist DPH in Wasser praktisch
unlöslich. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß klare und stabile Dispersionen von DPH1 die
praktisch frei von Fluoreszenz sind, erhalten werden können, wenn eine DPH - Lösung in Tetrahydrofuran
in ein stark gerührtes, wässriges Medium eingeblasen wird. Es hat sicli gemäß der
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Erfindung weiterhin herausgestellt, daß DPH in die Lipoid-Schicht der Zelloberflächen-Membranen
eindringt, wie es durch einen steilen Anstieg der Fluoreszenz-Intensität der Suspension belegt wird,
der nach ungefähr 60 Minuten den Gleichgewichtszustand
erreicht, wenn eine wässrige Zeil-Suspension mit ungefähr de™ gleichen Volumen der oben
erwähnten DPH-Dispersion gemischt wurde, und die Mischung bei 25 C stehen gelassen wurde. Nach
einer Abschätzung wurde ein DPH-Molekül auf ungefähr
looo Lipoid-Moleküle in die Lipoid-Schicht der Membranen eingebaut.
Die Fluoreszenz-Signale von DPH enthaltenden Systemen
nehmen gemäß der experimentellen Ergebnisse mit der Zeitspanne ab, während der sie den Anregungslichtstrahlen
ausgesetzt sind. Wird das Anregungslicht für Intervalle von 15 bis 3o Sekunden abgeschaltet, so
behielt das System sein ursprüngliches Fluoreszenz-Signal bei. Dieser Effekt beruht wahrscheinlich
auf reversiblen Foto-Isomerisationen des DPH von dem Aufbau, bei dem nur die trans-Isomeren vorliegen,
zu alternativen Strukturen. TJm diesen Effekt zu vermeiden, wurden die Messungen in Zeitintervallen
durchgeführt, die 10 Sekunden nicht überstiegen.
Die Fluoreszenz-Polarisations-Messungen gemäß den oben beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung
können mit irgendeiner geeigneten Vorrichtung durchgeführt werden, die eine Quelle für polarisierte
Lichtstrahlung, nach einer bevorzugten Ausführungs-
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form im Bereich von 2oo bis 7oo nm , wenigstens
ein Meßsystem, das einen. Polarisationsapparat aufweist, und eine Einrichtung enthält, um die
Intensität der Lichtstrahlen zu messen, die durch den Polarisationsapparat geführt werden. Die
Vorrichtung sollte weiterhin eine Anordnung aufweisen, um die gegenseitige Orientierung
der Polarisationsapparate beliebig ändern zu können, damit die Fluoreszenz-Intensitäten
in gekreuzter und in paralleler Richtung zu der Polarisationsrichtung des Anregungstrahli"
gemessen werden können.
Zu diesem Zweck ist eine Vorrichtung entwickelt worden, die im folgenden unter Bezugnahme auf
die beiliegende, schematische Zeichnung näher erläutert wird.
Die einzige Figur stellt schematisch eine Vorrichtung dar, mit der genaue Messungen der Fluoreszenz-Polarisation
durchgeführt werden können; dabei wird ein von einer Lichtquelle 1 abgegebener Strahl Anregungslicht durch eine Quarzlinse
3 j einen Monochromator 4, eine zweite, als
Kollimator dienende Quarzlinse 5» einen keilförmigen
Depolarisator 6 und einen Glan-Thompson-Polarisationsapparat 7>
insbesondere ein Polarisationsprisma, geführt. Die von dem Polarisationsapparat 7 ausgehenden,polarisierten Anregungs-Lichtstrahlen
verlaufen durch eine zylindrische
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Quarz-Küvette oder Testrohr 9, das die zu untersuchende
Probe enthält; das Testrohr befindet sich in einem Thermostaten 8. Ein Meßsystem 11 weist
einen Glan-Thompson-Polarisationsapp-arat 12 , insbesondere
ein Polarisationsprisma , eine Quarlinse 13, ein Grenz- oder Sperrfilter l4 und
einen Fotovervielfacher 15 auf. Der Polarisationsapparat 12 ist so ausgerichtet, daß seine Polarisationsebene
in vertikaler Richtung ( senkrecht zu der Papierebene der Zeichnung ) liegt; die
gesamte Meßanordnung ist auf einer kreisförmigen Schiene 10 angebracht, so daß sie um den Mittelpunkt
der Probenküvette 9 drehbar ist, damit die Fluoreszenz-Emission bei unterschiedlichen
Winkeln zu dem Anregungslicht-strahl gemessen werden kann. Eine als Ausgleichseinrichtung
dienende Fotodiode 2 ist in der Nähe der Lichtquelle 1 vorgesehen und dient dazu, Fluktuationen
der Lichtintensität der Quelle zu korrigieren. Die Vorrichtung weist weiterhin eine
Steuereinheit l6 auf, die Energiequellen 17 für den Fotovervielfacher 15 und für die
Fotodiode 2 und eine Ausleseeinheit l8 enthält.
Beim Betrieb wird die Probe in der Probenküvette angeordnet, während der Thermostat 8 auf die gewünschte
Temperatur gebracht wird. Die Probe wird den Anregungslichtstrahlen von der Lichtquelle 1,
die beispielsweise eine Quecksilber-oder eine Xenon-Quecksilber- Lichtbogenlampe sein kann,
ausgesetzt. Die Anregungslichtstrahlen von der Quelle werden durch die Linse 3 auf einen Mono
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- Ik -
chromator 4 mit hoher Intensität fokussiert.
Der monochromatische Strahl wird durch die Linse ausgerichtet, insbesondere parallel gemacht, und
durch einen Doppelkeil-Depolarisationsapparat 6 auf den Glan-Thompson-Polarisationsapparat 7 geführt
, der in unterschiedlichen Orientierungen genau eingestellt werden kann. Die Fluoreszenz-Emission
von der angeregten Probe verläuft durch den vertikal orientierten Polarisationsapparat
12 und wird durch die Linse 13 auf den Fotovervielfacher
15 fokussiert. Das Grenzfilter l4 dient dazu, gestreute Anregungs-Lichtstrahlen
auszufiltern und nicht durchzulassen; das Filter lk wird in Abhängigkeit von der Wellenlänge des
Anregungslichtes ausgewählt. Das Ausgangssignal
des Fotovervielfachers 15 wird auf die Steuereinheit l6 gegeben, wo es mit dem Signal von der
als Ausgleichseinrichtung dienenden Fotodiode 2 verglichen wird. Das kompensierte Signal wird
verstärkt und kann an der Ausleseeinheit l8 ausgelesen oder aufgezeichnet werden.
Der Depolarisationsapparat 6 dient dazu, jede Polarisation der Anregungstrahlung zu eliminieren, bevor sie durch den Polarisationsapparat
7 geführt wird, damit die Intensität des polarisierten Strahls~, der die Probe anregt,
unabhängig von der Orientierung des Polarisationsapparates 7 ist. Die Depolarisations-Yorrichtung
kann durch Drehung in eine Stellung eingestellt werden, in der die gemessene Fluoreszenz-Intensität
einer vollständig depolarisierten
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Lösung ( beispielsweise 1O~5 M Akridin-Hydrochlorid
in Methanol ) gleich ist, wenn der Polarisationsapparat 7 für das Anregungslicht vertikal oder horizontal
orientiert ist ( während der Polarisationsapparat 12 für das Meßlicht vertikal orientiert
ist ) . Wenn der D ep ο lari sat ions app ar at so justiert ist, lassen sich Abweichungen von weniger als 1 %
über den gesamten Anregungsbereich erreichen; bei Bedarf können diese Abweichungen noch korrigiert
werden.
Die Intensität der Fluoreszenz wird einmal gemessen, wenn der Polarisationsapparat 7 für die Anregungsstrahlen vertikal ausgerichtet ist ( d.h., wenn seine
Polarisationsrichtung parallel zu der Polarisationsrichtung des Polarisationsapparates 12 ist ), um den
Wert für I ^ zu erhalten weiterhin wird die Intensität nochmals gemessen, wenn der Polarisationsapparat 7 für das Anregung sucht horizontal ausgerichtet
ist, um den Wert I _^ zu erhalten.
Um die Fehler möglichst gering zu halten oder ganz zu vermeiden, die durch gestreutes oder Streulicht
verursacht werden, wenn.die Probe eine trübe, also dickflüssige Lösung oder Suspension ist, wird die
Meßanordnung 11 längs der Schiene io zu einem Winkel gedreht, bei dem das Verhältnis der Inten sität
der Fluoreszenz zu -der Streulicht-Intensität besonders groß, möglichst maximal ist; die Messungen
werden dann bei diesem Winkel durchgeführt. Dieser optimale Winkel wird mit Hilfe einer nicht mit einer
Markierung versehenen Bezugsprobe von gleicher Trübung bestimmt, die keine Fluoreszenz zeigt; dabei
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sind der Polarisationsapparat 7 für die Anregungsstrahlung und der Polarisationsapparat 12 für die
Meßstrahlung beide vertikal ausgerichtet. Es ist auch möglich, die I j_ - und Ί. f/ - Messungen in
Bezug auf den Anteil an gestreutem Licht zu korrigieren , indem die mit der oben erwähnten Bezugslösung erhaltenen Auslesewerte verwendet werden.
Die Fluoreszenz-Polarisation kann auch mit einem Instrument gemessen werden, das dem von Weber
und Bablouzian ( J.Biol.Chem.241, 2558 (1966))
ähnelt; dabei ist die Anregungseinheit , die Bauteile aufweist, die den Bauteilen 1 und 3
bis 7 in der beigefügten Zeichnung entsprechen, im wesentlichen identisch mit der hier beschriebenen,
während die abgegebene Fluoreszenz-Strahlung gleichzeitig durch zwei unabhängige, kreuzpolarisierte
Meßkanäle gemessen wird; diese Kanäle ähneln dem Meßsystem 11 in der beiliegenden Zeichnung und sind
so angeordnet, daß sie einander auf einer Linie gegenüberliegen, die senkrecht zu der Richtung
des Anregungsstrahls ist. Bei einem dieser Kanäle passiert das emittierte Licht einen Polarisationsapparat, wobei die Polarisationsrichtung senkrecht
zu der Polarisationsebene des Anregungsstrahls ist, während das Licht in dem anderen Kanal durch einen
Polarisationsapparat geführt wird, der parallel zu dieser Ebene gerichtet ist. Diese Ausgestaltung
ermöglicht die Verwendung einer viereckigen, insbesondere quadratischen Pr ob en-» Küvette und die
direkte Ablesung oder Aufzeichnung des Verhältnisses
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- 37 -
!///!_/, » beispielsweise mit einem Verhältnisoder
Quotient-Digitalvoltmeter. Wie oben festgestellt wurde, kann dieses Verhältnis I if /Ij.
als direktes Kriterium für die Bösartigkeit der Zellen dienen, wie in den folgenden Beispielen
aufgezeigt wird. Bei einem Instrument von diesem Typ kann selbstverständlich auf die als Ausgleichseinrichtung
dienende Fotodiode 2 verzichtet werden.
Bei einer alternativen Ausführungsform der Vorrichtung, mit der das Verhältnis I lt /I _/_ direkt
abgelesen werden könnte, sind ein einziger Meßkanal ( 11 in der Figur ) und zwei Anregungskanäle
vorgesehen, die dem oben beschriebenen ähneln; jeder Anregungskanai strahlt polarisiertes Anregungslicht
aus, wobei die Polarisationsrichtungen in den beiden Kanälen senkrecht .zueinander sind.
Die Probe wird abwechselnd und intermittierend dem einen oder dem anderen dieser beiden Anregungsstrahlen
mittels einer herkömmlichen Zerhackereinrichtung, beispielsweise einem mit Ausschnitten versehenen Spiegel, ausgesetzt, wobei
das von dem Fotovervielfacher 15 erhaltene Signal auf seine Wechselstrom- und seine Gleichstrom-Komponenten
analysiert wird, wodurch das Verhältnis """ H ^ JL direkt abgelesen werden kann.
Unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens und der Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenz-Polarisation
einer DPH-Sonde, die in die Lipoid-Schicht eingebettet ist, wurde eine große Anzahl
von Bestimmungen des I t/ /I j_ - Verhältnisses
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mit Lymphozyten von Mäusen, und zwar sowohl von normalen als auch von leukämischen durchgeführt.
Das für normale Zellen von verschiedenen Mäusestämmen bei 25 C ermittelte Verhältnis lag
immer im Bereich von 1,75 + o,o2 ; es war gleich für normale Lymphozyten, die dein Lymphdrüsen,
der Thymusdrüse oder dem Knochenmark der Mäuse entnommen wurden. Dagegen lagen die
"L11ZHj- - Verhältnisse, die mit LymphotB-Zellen
von Mäusen des gleichen Stamms erhalten wurden, die mit Aszites-Tumor infiziert wa-i*en. , alle
im Bereich 1,55 + o.o2 . Die davon abgeleiteten MikroViskositäten ?2. bei- 25 C betrugen ( in poise )
2.8 bzw. 1.6 für die normalen Lymphozyten-Zellen bzw. die Lymphom-Zellen. Ein ähnlicher Unterschied
wurde auch bei menschlichen Lymphozyten beobachtet und für die Feststellung von chronischer lymphatischer
Leukämie und akuter lymphoblastischer Leukämie angewandt. Es stellte sich heraus,
daß das mit normalen Lymphozyten, f die vom
peripheren Blut normaler Spender erhalten wurden, gemessene I if /I j_ - Verhältnis 1.86 +
O.O3 ( Mittel von ungefähr 4OSpendern ) betrug,
während ein Wert I.71 ^_ 0.05 bei leukämischen
Zellen gemessen wurde, die dem peripheren Blut von Patienten ( Mittel von ungefähr 40 Patienten )
entnommen wurden, die an chronischer lymphatischer Leukämie litten. Die jeweiligen Milcroviskositäten
bei 25 C wurden für normale Lymphozyten zu 3.7 poise und für leukämische Zellen zu 2.5 poise berechnet.
Fluoreszenz-Polarisationsmessungen wurden auch mit leukäraischen Zellen durchgeführt, die dem
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peripheren Blut von ^atienten ( k Fälle ) entnommen
wurden , die an akuter lymphoblastischer
Leukämie litten. Die gemessenen I ,/ /I χ - Verhältnisse
betrugen alle ungefähr 1,67 ι während die Mikroviskositäten bei 25° C ungefähr 2.2 poise
betrugen.
Die oben beschriebenen Ergebnisse, insbesondere ihre
Reproduzierbarkeit, und der relativ schmale Abweichungsbereich sowohl bei normalen Zellen als auch
bei bösartigen , zeigen die Zuverlässigkeit des Verfahrens nach der Erfindung für die Feststellung
von bösartigen Umbildungen in Säugetier-Zellen. Es soll noch darauf hingewiesen werden, deß in
einigen Fällen bei Patienten, die an chronischer lymphatischer Leukämie litten, die Veränderung der
Mikroviskosität der Lipoid-Schicht bereits mehrere Monate vor dem Auftreten von wesentlichen Änderungen
im Blutbild, insbesondere der Zahl der Blutkörperchen, beobachtet werden konnte. Weiterhin dauerte
in einem Fall einer untersuchten akuten lymphoblastischen
Leukämie die Verringerung der Mikroviskosität
der Lipoid-Schicht sogar nach der vollen Remission der akuten Leukämie noch an, die sich als
Folge einer Behandlung ergab, bei der Bluttransfusionen
im großen Ausmaß stattgefunden haben. Die Mikroviskosität blieb auf dem niedrigen Wert, obwohl das
Blutbild, insbesondere die Zahl der Blutkörperchen, und die Morphologie normal zu sein schienen.
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Der wesentliche Lipoid-Parameter, der die Fluidität
bestimmt ( und damit den aufgezeichneten Wert für die Fluoreszenz-Polarisation mit DPH steuert ), ist
das Verhältnis von Cholesterin zu Phospholipid 11 C/P - Verhältnis ". Hierzu wird auf Cogan et al,
Biochemistry, 12, 521-528 (I07o), R.A. Cooper,
Semin. Hetnätol.Vol. 7,296-322 (1970) und Inbar und Shinitzky, Proc.Natl.Acad. Sei. U.S. 197^ verwiesen.
Damit liefert also die Messung mit DPH ein Mittel für indirekte Bestimmungen in dem gemessenen System
( intakte Zellen, isolierte Membranen, Lipoid-Dispersion , Seren ). Das C/P- Verhältnis bietet also
eine empfindliche Anzeige für irgendwelche Unregelmässigkeiten oder Störungen im Lipoid-Stoffwechsel
bzw. - Umsatz.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen
erläutert, die jedoch keine Begrenzung des Erfindungsgedankens darstellen sollen.
Normale Lymphozyten wurden den Lymphdrüsen, der Thymusdrüse und dem Knochenmark von ausgewachsenen
Mäusen entnommen, während bösartige Lymphom-Zellen von ausgewachsenen Mäusen erhalten wurden, die
10 - l4 Tagevorher intraperitoneal jeweils mit ungefähr 10 Zellen einer Aszites - Form eines
Lymphoms geimpft wurden,, das durch einen Moloney-Virus erzeugt wurde. Für jedes Experiment wurden
frisch entnommene normale Lymphozyten oder Lymphom-Zellen dreimal mit einer 0.15 M wäsaigen KCl-Lösung
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gewaschen und in einer 0.15 M - KCl - Lösung suspendiert.
Eine wässrige Dispersion von DPH wurde vorbereitet,
indem ο, 1 ml einer 2 χ 10 - M DPH-Lösung in
Tetrahydrofuran in 100 ml einer stark gerührten wässrigen 0.15 M KCT-Lösung eingeblasen wurden.
Das Umrühren bzw. Schütteln der Dispersion wurde bei 25 C 15 Minuten lang durchgeführt, wodurch eine klare, stabile
, wässrige Dispersion von 2 χ Io M DPH erhalten wurde, die praktisch frei von Floureszenz war.
Eine Volumeneinheit der Zeil-Suspension in 0.15 M wässriger KCl-Lösung , die nach dem oben beschriebenen
Verfahren erhalten wurde, ( ungefähr 5^1° bis
x Io Zellen / ml ) wurde mit einer Volumeneinheit
der DPH-Dispersion gemischt und bei 25 C stehen gelassen. Der Eindringung der DPH in die Zellmembran
folgte ein steiler Anstieg der Intensität der Fluoreszenz, wobei die Fluoreszenz-Intensität nach ungefähr
60 Minuten den Gleichgewichtszustand erreichte und nicht weiter anstieg. Die mit einer Markierung
versehenen Zellen wurden dann zweimal mit einer 0.15 M KCl-Lösung gewaschen, in'dieser Lösung suspendiert
und sofort für die Fluoreszenz-Messungen eingesetzt.
Die Fluoreszenz-Polarisation und - Intensität wurden mit einem Instrument gemessen, wie es oben beschrieben
wurde. Die Probe wurde mit einer Strahlung im 366 nm Band angeregt ( die Strahlung wurde durch
50981 3/0827
2U3950
einen 500 W Quecksilber-Lichtbogen erzeugt ) angeregt,
wobei die Strahlen durch einen Glan-Luft-Polarisationsapparat
geführt wurden. Eine 2 N Natriumnitrat-Lösung wurde als Grenzfilter für
Wellenlängen unterhalb. 390 nm in dem Meßkanal
verwendet.
Bei alleü Fluoreszenz-Messungen wurde die Temperatur
der Probe mit einem Bad gesteuert, das durch einen Thermostat eingeregelt wurde. Die Temperatur
der Probe wurde mit einem Thermometer , das in die analysierte Lösung eingetaucht wurde, mit
ο
einer Genauigkeit von. o.3 C gemessen. Die tnit DPH versetzten bzw. markierten Proben wurden den Anregungslichtstrahlen weniger als 10 Sekunden lang ausgesetzt, um die Möglichkeit zu vermeiden, daß DPH reversibel bleicht oder entfärbt. Vor jeder Messung wurden die Zeil-Suspensionen leicht gerührt bzw. geschüttelt, um eine isotrope Verteilung sicherzustellen,
einer Genauigkeit von. o.3 C gemessen. Die tnit DPH versetzten bzw. markierten Proben wurden den Anregungslichtstrahlen weniger als 10 Sekunden lang ausgesetzt, um die Möglichkeit zu vermeiden, daß DPH reversibel bleicht oder entfärbt. Vor jeder Messung wurden die Zeil-Suspensionen leicht gerührt bzw. geschüttelt, um eine isotrope Verteilung sicherzustellen,
Die Ergebiiisse dieser Untersuchung sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt«
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| Tabelle 1 | Stamm | Normale Lymphozyten und leukäraische Zellen von Mäusen | Zahl der unter suchten Proben |
Fluoreszenz- polarisation von DPH bei 25 °C |
P | r | 0,.2OO | Mikrοviskosität bei 25° C ( poise ) |
|
| Zellen | A/J | Organ | 17 | 1 // /1X | 0,273 | O1IoO | 2,8 | ||
| Normale Lyrapho- zyten |
C57B1 | Lymphdrüsen | 18 | 1,751 °»02 | 0., 2l6 | 1,6 | |||
| Leukä- mische Zellen |
C57Bl (nudes) |
Thymu s drü s e | 25 | L1 55^0,02 | |||||
| A/J | Knochenmark | 15 | |||||||
| CT C |
Lymphdrüsen | 25 | |||||||
| C£ CC |
Thymus drüs e | 14 | |||||||
| Ca. | Knochenmark | 10 | |||||||
| α N |
Lyraphdrüs en | 163 | |||||||
| »*. | Aszites-Tumor | ||||||||
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde für Fluoreszenz-Polarisationsmessungen von mit
DPH versetzten normalen Lymphozyten, die aus dem peripheren Blut normaler menschlicher
Spender isoliert wurden, sowie auf ähnliche Weise versetzten leukämischen Zellen verwendet,
die aus dem peripheren Blut von Patienten erhalten wurden, die an chronischer lymphatischer
Leukämie und akuter lymphoblastischer Leukämie litten.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengest eilt.
| Zellen | Ursprung | Zahl der unt er-■ suchten Proben |
Fluoreszenz- Polarisation von DPH bei 25° C |
P | r | Mikro- viskosität bei 25°C (poise) η. |
| Formale Lympho- zyten |
Peripheres Blut von normalen Spendern |
38 | \ /1X | 0,301 | 0,223 | 3,7 |
| Chronisch lymphatische leukämische Zellen |
Peripheres Blut von leukämischen Patienten |
38 | 1,86+0,03 | 0,261 | 0,191 | 2,5 |
| Akub lym- phoblasti- sehe, leu kämische Zellen |
Peripheres Blut von leukämischen Patienten |
4 | 1,711.0,05 | 0,250 | 0,182 | 2,2 |
| 1,67 |
509813/082 7
Fluoreszenz-Polarisations-Messungen mit Zeil-Suspensionen sind anfällig bzw. empfindlich
gegen experimentelle Fehler, die von der Streu-Depolarisation der Fluoreszenz und vom Eindringen
des Hintergrundlichtes in die Emissionskanäle „herrühren. Es hat sich jedoch herausgestellt,
daß bei der Verwendung von DPH als Fluoreszenz-Sonde diese Fehler leicht bestimmt oder sogar
ganz vermieden werden können.. Werden die mit DPH versetzten bzw. markierten Zeil-Suspensionen
fortschreitendmit einer 0.15 M wässrigen KCl-Lösung
verdünnt, so wird ein konstanter Wert für P bei Konzentrationen von ungefähr 7 x
Lymphozyten/ml und ungefähr 2 χ lo~ Lymphora-Zellen
/ ml erreicht. Bei diesen Zeil-Konzentrationen ist deshalb die Streu-Depolarisation
der Fluoreszenz vernachlässigbar, während bei allen untersuchten System der
Beitrag des Untergrundlichtes zu dem Fluoreszenz-Signal, wie durch Bezugs- Suspensionen
mit nicht-versetzten Zellen überprüft wurde, weniger als 3 % betrug. Deshalb wurden bei den
meisten Fluoreszenz-Messungen Konzentrationen in dem oben erwähnten Bereich verwendet, wobei
keine Korrekturen für den Beitrag der Streu-Depolarisation und des Untergrundlichtes zu
den gemessenen Werten durchgeführt wurden.
- Patentansprüche-
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Claims (8)
1.) Verfahren zur Peststellung des anomalen Verhaltens
von Säugetier-Zellen in vitro,d a d ü r c h gekennzeichnet, daß die Pluidität oder
eine davon abgeleitete Eigenschaft der Lipoid-Schicht
der Zelloberflächenmembran gemessen und die dadurch erhaltene Messung mit der von normalen
Zellen des gleichen Typs verglichen wird.
2· Verfahren . nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Fluidität oder die zugeordnete Eigenschaft bei intakten Zellen gemessen wird.
3· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine fluoreszierende
Verbindung in die Lipoid-Schicht der Zelloberflächen-Membran
eingeführt wird, daß die so markierten Zellen polarisierter Anregungsstrahlung
ausgesetzt werden, und daß die Fluoreszenz-Polarisation der Strahlung gemessen wird, die
von der Probe emittiert wird.
4:. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet,
daß die Fluoreszenz-Polarisation bestimmt wird, indem die Fluoreszenz-Intensitäten I μ und I_^
gemessen werden, nachdem die Fluoreszenz-Emission durch einen Polarisationsapparat geführt wird,
dessen Polarisationsrichtung parallel bzw. senkrecht zu der Polarisationsrichtung der Anregui%s-
50981 3/0827
Strahlung ist, und daß daraus der Wert für ·*■ // /■"·,/- at>Seleitet wird, der mit einem
entsprechenden Wert verglichen wird, der aus Messungen an normalen Zellen erhalten wird.
5. Verfahren nach Anspruch k, dadurch gekennzeichnet,
daß das Verhältnis ~L ,, /Xj. direkt unter
Verwendung von zwei Meßkanälen oder von zwei alternierenden Anregungskanälen, deren Polarisationsrichtungen
senkrecht zueinander sind, gemessen wird.
ι»
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5»
dadurch gekennzeichnet, daß die zur Markierung verwendete fluoreszierende Verbindung 1,6 Diphenyl
- 1,3»5 ~ &exatrien oder ein niedrigeres
Alkyl - Derivat davon ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die zu messenden Zellen mit der Markierung versehen werden, indem eine Suspension
der Zellen mit einer wässrigen Dispersion von 1,6 - Diphenyl - 1,3>5 - bexatrien gemischt
wird und die Mischung anschließend sich selbst überlassen wird.
8. Vorrichtung zur Durchführung von Fluoreszenz* Polarisationsmessungen, dadurch gekennzeichnet,
daß sie bei dem Verfahren nach einem der Ansprüche 3-7 eingesetzt wird.
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as .
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL43224A IL43224A (en) | 1973-09-14 | 1973-09-14 | Fluorescence polarization measurements |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2443950A1 true DE2443950A1 (de) | 1975-03-27 |
| DE2443950B2 DE2443950B2 (de) | 1976-12-02 |
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ID=11047351
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| FR (1) | FR2244175A1 (de) |
| GB (1) | GB1481605A (de) |
| IL (1) | IL43224A (de) |
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- 1974-09-13 FR FR7431129A patent/FR2244175A1/fr not_active Withdrawn
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| E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
| EHJ | Ceased/non-payment of the annual fee |