KR100194407B1 - 혈액에서 백혈구 소집단의 감별과 정성을 위한 자동유출 세포 계산기에 사용되는 시약제와 그 이용방법 - Google Patents

혈액에서 백혈구 소집단의 감별과 정성을 위한 자동유출 세포 계산기에 사용되는 시약제와 그 이용방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈액시료에서 적어도 하나이상의 백혈구 소집단을 자동적으로 감별할 수 있도록 한 시약제와 방법에 관련된다.
이 시약제로 인해 단일단계에서 사포닌과 SDS의 작용으로 적혈구를 용해시킬 뿐 아니라 백혈구 소집단의 차등 염색을 확실하게 하고 동시에 클라졸 블랙 알코올, 계면활성제 그리고 보호제를 포함한 다양한 성분물의 복합제 작용으로 세포의 모양과 특징을 보존하는 것이 가능하다.
본 발명에 따르는 시약제는 다른 형태의 자동 유출 세포계산 분석기에도 적용될 수 있다.

Description

혈액에서 백혈구 소집단의 감별과 정성을 위한 자동 유출 세포 계산기에 사용되는 시약제와 그 이용방법
제1도는 정상 혈액 샘플로 본 발명의 방법에 따라 얻어진 대표적인 히스토그램이다.
본 발명은 자동 유출 세포계산기를 사용하여 백혈구 소집단의 분류와 셈을 하여 혈액의 구성을 분석하고 더 구체적으로 적어도 한 개의 백혈구 소집단의 정성을 위한 방법과 시약에 관련된다.
진단을 할 때 상이한 백혈구 집단을 정확하게 가려내는 것은 중요한 것으로 인식되어 왔다. 더욱이 비정상적인 백혈구 비율의 발생은 특정 질병과 관련이 될 수 있다(면역반응, 염증성 작용, 신생물 또는 백혈병의 출현 등).
물리적인 적혈구 분리(침전 또는 응고)와 백혈구의 원형질과 핵의 차등 염색하여 현미경하에서 형태를 관측하는 것으로 구성된 일반적인 분석으로 백혈구의 모든 형태 예로 과립세포(호염부, 호산구, 호중구)와 무과립세포(단핵세포, 임파세포)가 확인이 되었다. 이런 방법도 믿을만한 결과가 얻을 수 있으나 시간이 많이 걸리고, 차동 기구사용이 어려움이 있다.
백혈구 집단을 자동 계산할 수 있는 많은 기구가 시판되고 있으며 각 기구의 원리에 적절하게 조절되어 개발된 많은 시약과 염색약이 있다.
예를 들면, 세포질의 차등 용해 후에 세포의 크기를 결정하는데 저항성 변화나 광학 회절을 측정할 수도 있으며 또한 상이한 세포형태에 특이적염색(효소적 또는 다른) 방법으로 실행하거나 다른 파장에서 세포의 광학밀도와 크기를 측정하는 것도 가능하다.
자동화로 인한 문제점중 하나는 적혈구와 작은 백혈구를 혼돈할 가능성이 있는데 이는 현미경 관찰시에는 발생하지 않는 것이다. 적혈구 전체를 용해하는 것은 시료 혈액이 기구에 들어가기 전에 일어나야 하고 동시에 백혈구는 보존되어야 한다. 반응 혼합물은 상이한 백혈구 형태와 히스토그램에서 뚜렷한 위치로 나눌 수 있도록 구분하기 위한 하나 이상의 시약이 포함되어야 한다.
특허 WO 8505684(Coulter Electronics Inc)에서는 2단계의 시약 포함집단 즉 사포닌에 의한 적혈구의 특이적 용해와 글루타알데히드에 의한 백혈구의 고정(그로 인한 보존)으로 설명한다. 상이한 백혈구 형태의 구분은 페녹시-2-에탄올과 같은 시약을 첨가하여 특정 집단이 특이하게 염색되어 형광계에 의해 확인될 수 있다. 이러한 효과적인 믿을만한 공정은 다소 복잡하나 Coulter CounterR기구에 적절하고 미국특허 3,502,974에 설명되어 있다.
다른 방법, 예를 들어 미국특허 3,740,143에 설명된 것은 TechniconR기구에 특히 적절한데 각 세포형태와 평행하게 처리되는 몇몇 반응과 적혈구 용해 처리와 백혈구 고정 과정이 따르는 특이적 반응에 관련된다. 이 특이적 반응은 조직학적 염색(호염성 세포를 위한 neutral red)과 효소적 염색(호산성 세포와 호중성 세포의 과산화효소 함량측정을 위한 클로로나프톨 이용과 나프톨 부티레이트를 이용한 단세포내의 지방 분해 효소 함량)을 포함한다.
일반적으로 말하면 상이한 시약을 사용하여 여러 단계로 구성된 방법과 매우 복잡한 기구를 사용하면 상당히 상세하고 믿을만한 분석 결과를 얻는다. 복잡하고 분석 비용이 매우 많기 때문에 통상적인 진단을 위해서는 동등한 분별력과 동등한 신뢰성을 보장하는 단순한 과정이 바람직하다.
출원인은 단일 반응에서 적혈구를 용해시키고 백혈구를 보호 고정하고 호산성 세포의 염색과 히스토그램상의 상이한 백혈구 소집단의 효과적인 분리가 되는 성분물을 개발하였다. 본 발명에 따르는 성분물을 사용한 방법은 특히 신속하고 어떤 형태의 자동 계산 기구에도 적절하다.
더 특별히 본 발명에 따르는 시약은 적어도 하나의 적혈구 용해 시약 더 구체적으로는 사포닌과 쇼듐 도데실설페이트(SDS) 그리고 다양한 백혈구 집단의 차등 염색할 수 있는 시약 특히 농도가 50 내지 650㎎/ℓ인 클라졸블랙을 포함한다. 시약의 다른 성분물은 세포의 자연 상태와 모양을 보호하고 광학적 감지에 의해 생리적 염의 pH가 7.0 내지 12.0을 유지하고 3가 또는 4가 암모니움염, 1차, 2차 또는 3차 알코올과 계면활성제, 세포구조 보존시약과 알킬렌글리콜을 포함하도록 고안되었다.
클라졸 블랙(에익블랙 또는 포름블랙으로 인지되는)은 1937년 식물 조직학(Cannon, H.G., Nature, 139,549)에서 사용된 이후 통상적인 시약으로 현미경하에서 호산구 세포의 특이적 염색 관측을 위해 사용되었다(이때 이용된 방법과 시약은 M. Piette, Ann. Biol. Clin. 1961, 19, 729-734 and K. Lawrence, Am. J. Clin. Pathol. 1981, 76, 810-812에 설명되어 있다).
클라졸 블랙(650㎎/ℓ)을 사용하는 일반적인 조건이 자동 광 변환 장치로 감지하는데에는 전혀 적합하지는 않는데, 호산구 세포가 너무 검게 되고 다른 세포는 상대적으로 투명하게 된다. 사용을 위한 새로운 조건이 개발되어 왔고 반응에서 시약의 농도를 감소시키고 온도를 증가시키는 개선이 이루어졌다.
본 발명에 따르는 시약은 적절하게 클라졸 블랙이 100㎎/ℓ가 된다. 출원인은 이와 같은 조건하에서 호산구 세포가 뚜렷하게 염색되고 더욱이 다른 과립세포가 고정되어 구별하기가 쉽다. 모든 백혈구 집단에 약간씩 염색이 되는데 반응이 길어질 경우 사라지게 된다.
시약의 상이한 구성물 사이의 최상의 균형을 찾기 위해서는 출원인은 수용액의 글루타알데히드를 첨가하여 저항성에 의해 측정될 때 세포 크기 구분이 개선되었다. 그러나, 글루타알데히드는 적혈구 용해로 인해 기질의 크기를 증가시켰다. 이러한 인공적인 효과는 SDS를 첨가함으로써 백혈구의 모양에 손상이 없을 정도의 농도에서 적혈구의 파괴를 가속시키는 SDS로 인해 수정될 수 있는 잇점이 있다. 더욱이 3가 또는 4가의 암모니아염의 첨가로 세포 부집단 사이의 식별이 개선되었고, 적혈구 기질의 파괴에 도움이 된다. 도데실트리메틸 암모니움 클로리드가 용이하게 사용될 수 있다. 브롬마이드와 아이오딘을 사용하여도 같은 결과를 얻을 수 있다. 유사하게 3가 또는 4가의 염이 만들어질수 있고 적절한 알킬 라디칼은 C12와 C14이다. 도데실 디(또는 트리)메틸 암모니움 할로겐(Cl, Br 또는 I) 또는 테트라도데실 디(트리)-메틸암모니움이 단독 또는 연합으로 선택될 수 있다.
본 발명에 따르는 시약은 선택적으로 계면활성제를 포함할 수도 있는데 예를 들면 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스테르, 더 구체적으로 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노라우레이트(트윈 20R)와 폴리에틸렌 솔비탄 모노리에이트(트윈 80R)에서 선택된 계면활성제가 포함된다.
더욱이, 세포 구조의 보호 효과가 있는 알킬렌글리콜을 첨가하면 무엇보다도 매체의 분산이 제한될 때 광학판독에 효과적이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 시약은 다음의 성분물을 포함한다.
- 사포닌 : 농도 100-700㎎/ℓ
- SDS : 농도 100-400㎎/ℓ
- 클라졸 블랙 : 농도 100㎎/ℓ 이하
- 생리염 또는 염화나트륨 1.3-9.5g/ℓ 포함한 염 혼합물 또는 황산나트륨 15-20g/ℓ 포함한 염 혼합물 또는 탄산나트륨 400-700g/ℓ 포함한 염 혼합물
- 3가 또는 4가 암모늄염 : 부피에 대해 최종 농도비가 0.03-0.1%
- 1차, 2차 또는 3차 알코올(적당하게는 이소프로필 알코올) : 부피에 대해 최종비가 2-13%
- 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스테르 수용액 : 부피에 대해 최종비가 0.2-2%
- 글루타알데히드 또는 포름알데히드 수용액 : 부피에 대해 최종비가 0.1-0.8%
- 에틸렌글리콜 또는 프로필렌글리콜 : 부피에 대해 최종비가 2-13%
이방법은 적절한 분석기를 사용하여 흡수력 또는 저항성 또는 이들을 연합한 변수를 측정함으로써 백혈구 사이를 식별하고 감지하여 이 측정된 데이타를 백혈구 소집단의 분포를 시각적으로 나타내는 히스토그램 또는 메트릭스 형태로 기록한다.
제1도에서는 정상 혈액시료로 본 발명의 방법에 따라 얻어진 히스토그램이다. 히스토그램의저부위(상부위와 동일)에서 상이한 집단에 따른 각 부위를 제한하였다 :
다음의 실시예는 발명의 범위에 제한을 두지 않고 발명의 구체예의 형태를 설명한다.
[실시예]
다양한 성분물의 하기 농도는 시약 1리터 제조시에 기준하여 계산되었다 :
이 시약은 출원인 이름으로 된 프랑스특허 89.14120에 설명한 것과 같은 분석기에 사용된다. 그러나 같은 방법으로 백혈구 집단 자동 계산용으로 어떤 형태의 장치에도 사용될 수 있다.
장치에는 혈액의 시료 2㎕와 시약 1㎖을 접촉시켜 시작한다. 이 혼합물의 온도가 40 내지 65℃로 조정된 일전온도 조절실에서 생성된다.
정상 혈액 시료의 히스토그램이 제1도에 나타나있다.

Claims (15)

  1. 자동 유출 세포계산 분석기를 사용하여 다음의 성분물 : - 적어도 하나이상의 적혈구 용해제; - 클라졸 블랙; - 적어도 하나이상의 생리염; - 적어도 하나이상의 3가 또는 4가 암모늄염; - 알코올; - 계면활성제; - 보호제; - 알킬렌글리콜을 포함한 것을 특징으로 하여 최소한 1개의 백혈구 소집단을 정성하는 것을 특징으로 하는 시약제.
  2. 제1항에 있어서, 적혈구 용해제가 사포닌과 쇼듐 도데실 설페이트(SDS)에서 각기 단독 또는 복합하여 선택하는 것을 특징으로 하는 시약제.
  3. 제2항에 있어서, 사포닌 농도가 시약 1 리터당 100 내지 700mg인 것을 특징으로 하는 시약제.
  4. 제2항에 있어서, 쇼듐 도데실설페이트의 농도가 시약 1 리터당 100 내지 400mg인 것을 특징으로 하는 시약제.
  5. 제1항에서 제4항중 어느 한 항에 있어서, 클라졸 블랙 농도가 시약제 1 리터당 50 내지 650mg인 것을 특징으로 하는 시약제.
  6. 제5항에 있어서, 클라졸 블랙 농도가 100㎎/ℓ이하인 것을 특징으로 하는 시약제.
  7. 제1항에 있어서, 염화나트륨, 황산나트륨 그리고 탄산나트륨 각기 단독 또는 연합하여 된것에서 선택된 생리염을 pH가 7 내지 12.0을 유지하기 위해 포함하는 것을 특징으로 하는 시약제.
  8. 제7항에 있어서, 염화나트륨 농도가 시약제 1 리터당 1.3 내지 9.5g인것을 특징으로 하는 시약제.
  9. 제7항에 있어서, 황산나트륨 농도가 시약제 1 리터당 15 내지 20g인것을 특징으로 하는 시약제.
  10. 제7항에 있어서, 탄산나트륨 농도가 시약제 1 리터당 400 내지 700mg인것을 특징으로 하는 시약제.
  11. 제1항에 있어서, 적어도 하나이상의 3가 또는 4가 암모늄염이 시약제 부피에 대해 최종비가 0.03% 내지 0.10%로 포함된 것을 특징으로 하는 시약제.
  12. 제1항에 있어서, 알코올이 1차, 2차 그리고 3차 알코올에서 선택되고 그 농도가 시약제 부피당 최종비가 2 내지 13%로 포함된 것을 특징으로 하는 시약제.
  13. 제1항에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스테르 수용액으로 시약제 부피에 대해 최종비가 0.2 내지 2%인 것을 특징으로 하는 시약제.
  14. 제1항에 있어서, 보호시약이 글루타알데히드 수용액 또는 포름알데히드 수용액에서 선별되어 시약제 중량에 대해 최종비가 0.1 내지 0.8%인 것을 특징으로 하는 시약제.
  15. 제1항에 있어서, 알킬렌글리콜에서 선별되어 시약제 중량에 대해 최종비가 2 내지 13%인 것을 특징으로 하는 시약제.
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