CN109655607B

CN109655607B - 红细胞裂解试剂及其应用

Info

Publication number: CN109655607B
Application number: CN201910075063.6A
Authority: CN
Inventors: 刘丽萍; 于鸫; 迟晨
Original assignee: Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Current assignee: Guangdong Weishi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: CN109655607A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种红细胞裂解试剂及其应用。该红细胞裂解试剂为包含以下组分的水溶液：NH₄ ⁺/NH₃、Na⁺、蔗糖和/或海藻糖、螯合剂、Triton X‑100和/或Tween 20、SDS。使用该试剂裂解时间短、裂解完全、临床符合率高。

Description

红细胞裂解试剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种红细胞裂解试剂及其应用。

背景技术

红细胞也称红血球(RBC)，是血液中数量最多的一种血细胞，也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介，同时还具有免疫功能。红细胞中含有血红蛋白，因而使血液呈红色。但是在利用现代临床诊断方法对血液样品进行诊断检测时，红细胞对许多诊断检测存在干扰作用，这就需要先把红细胞从血液样品中分离出去，然后再进一步对样品进行检测。

在血液样本的检测时，红细胞的存在会对许多诊断会产生干扰，需要从血液样本中先行分离出去，一般采用先裂解再分离的方法；当需要测量红细胞内物质含量时，也需要将红细胞裂解，以释放出待测物质。通过细胞破裂的细胞裂解方法可以分类成机械方法和非机械方法。机械方法包括超声破碎、使用匀浆器的破坏、使用例如弗氏压碎器等的挤压、减压、粉碎等。非机械方法包括化学方法、热方法、酶促方法等。目前，使用红细胞裂解液是一种去除红细胞最简便易行的非机械方法，即用红细胞裂解液改变红细胞的渗透压，造成红细胞胀大破裂，而白细胞因其细胞膜的离子转运通道不同而不受影响，从而达到既不损伤白细胞又能充分的去除红细胞，并能分离富集血液中的白细胞的作用。经红细胞裂解液裂解得到的白细胞中不含红细胞，可进一步用于核酸的分离和提取等。

然而现有技术中很多常规的红细胞裂解试剂在实际应用中都存在裂解效果不够好的缺陷，例如或是分离细胞纯度差，或是裂解效率不够高等。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种红细胞裂解试剂，其为包含以下组分的水溶液：

NH₄ ⁺/NH₃、Na⁺、蔗糖和/或海藻糖、螯合剂、Triton X-100和/或Tween 20、SDS。

本发明所提供的红细胞裂解试剂能够快速简便的裂解含有红细胞的样品(例如全血)，由临床数据证明裂解效果理想。

本发明的第二目的在于提供如上所述的试剂在裂解红细胞中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种裂解红细胞的方法，包括：

a)提供包含红细胞的样品；

b)将所述样品与如上所述的试剂接触，从而裂解红细胞；和

c)任选地去除红细胞碎片。

该方法裂解时间短、裂解完全、临床符合率高。

本发明的第四目的在于提供一种试剂盒，其包含如上所述的试剂。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施方式中裂解液裂解时间分析结果；

图2为本发明一个实施方式中所配制的裂解液与市售的BioRad D10裂解液的裂解效果比较；从图中可见二者拟合效果很好；

图3为本发明一个实施方式中所配制的裂解液A与市售的BioRad D10裂解液的裂解效果比较；从图中可见二者拟合效果较差。

具体实施方式

本发明涉及一种红细胞裂解试剂，其为包含以下组分的水溶液：

NH₄ ⁺/NH₃、Na⁺、蔗糖和/或海藻糖、螯合剂、Triton X-100和/或Tween20、SDS。

在一些实施方式中，所述试剂在裂解红细胞过程中的最终浓度在以下范围内：

-NH₄ ⁺/NH₃0.15M-0.4M，

-Na⁺0.01M-0.03M，

-蔗糖和/或海藻糖1w/v％-5w/v％，

-螯合剂0.1nM-0.5nM，

-Triton X-100和/或Tween 20 1v/v％-10v/v％，以及

-SDS1w/v％-8w/v％。

-NH₄ ⁺/NH₃0.25M-0.3M，

-Na⁺0.015M-0.025M，

-蔗糖和/或海藻糖2w/v％-4w/v％，

-螯合剂0.2nM-0.4nM，

-Triton X-100和/或Tween 20 3v/v％-8v/v％，以及

-SDS 3w/v％-6w/v％。

所述试剂中的成分的浓度为“裂解红细胞过程中的最终浓度”，或能够稀释为该浓度的母液(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍浓缩的母液)。

在一些实施方式中，“水溶液”中的水为反渗水(Reverse osmosis Water)、蒸馏水(Distilled Water)、去离子水(Deionized Water)、反渗水(Reverse osmosis Water)。

在一些实施方式中，NH₄ ⁺/NH₃以氯化铵的形式存在。NH₄ ⁺/NH₃的终浓度一般为0.15M-0.4M，还可以选择0.25M、0.3M、0.35M。氯化铵在水中水解出NH₃而进入细胞，后又水解成铵离子使细胞内渗透压升高，导致红细胞吸水破裂。

在一些实施方式中，Na⁺以氯化钠的形式存在，Na⁺的终浓度一般为0.01M-0.03M，还可以选择0.015M、0.02M、0.025M。

蔗糖、海藻糖，或蔗糖以及海藻糖之和的终浓度一般为1w/v％-5w/v％，还可以选择2w/v％、3w/v％、4w/v％。

蔗糖、海藻糖的主要作用之一是起到保护作用，以免裂解过程中反应体系条件改变对其他待测物质造成影响。

螯合剂的终浓度一般为0.1nM-0.5nM，还可以选择0.2nM、0.3nM、0.4nM。

Triton X-100、Tween 20，或Triton X-100以及Tween 20之和的终浓度一般为1v/v％-10v/v％，还可以选择2v/v％、3v/v％、4v/v％、5v/v％、6v/v％、7v/v％、8v/v％、9v/v％。

Triton X-100/Tween 20主要作为细胞破膜剂起作用。

SDS的终浓度一般为1w/v％-8w/v％，还可以选择2w/v％、3w/v％、4w/v％、5w/v％、6w/v％、7w/v％。

在一些实施方式中，所述试剂还包括缓冲组分。

如本文使用的术语“缓冲液/缓冲组分”指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH7–pH9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如，Mohan，Buffers，Aguideforthepreparationanduseofbuffersinbiologicalsystems，CALBIOCHEM，1999)。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。

在一些实施方式中，所述缓冲组分选自HCO₃ ^-，例如KHCO₃或NaHCO₃，其在裂解红细胞过程中的最终浓度为5mM-50mM，也可以选择10mM、20mM、30mM、40mM。

螯合剂是络合离子的试剂，其降低它们的浓度。通常，离子是金属离子，诸如Ca、Mg、Fe、Zn和Cu，但也可以络合非金属离子，诸如P。通过与多价(金属)离子形成稳定的水溶性络合物，螯合剂通过阻断(金属)离子的正常反应性而防止不期望的相互作用。合适的螯合剂的实例包括EGTA(乙二醇四乙酸)、BAPTA(1，2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、EDTA(乙二胺四乙酸)和NTA(N，N-双(羧基甲基)甘氨酸)。

在一些实施方式中，所述螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐；

在一些实施方式中，EDTA的盐可以选自EDTA·Na₂或EDTA·K₂。

在一些实施方式中，所述试剂的pH＝8.0-8.5。例如8.1、8.2、8.3、8.4；

在一些实施方式中，所述试剂在裂解红细胞过程中的pH＝8.0-8.5，例如8.1、8.2、8.3、8.4。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的试剂在裂解红细胞中的应用。

为了提供血液样品，血液需要取自受试者。特别是对于哺乳动物，这可以方便地通过从受试者取静脉血来进行。静脉血可以通过静脉穿刺从哺乳动物获得，其中通常仅是血液的小样品，例如3ml至10ml样品，足以在本公开中使用。血液最通常获得自前侧前臂(肘部内折内侧)上的肘正中静脉。该静脉位于靠近皮肤表面，并且没有大神经供应。工业化国家中的大多数血液收集用由塑料轴套、皮下针和真空管组成的真空管系统进行。然而，也可以通过技术人员已知的任何其它方法获得血液。

分离血液之后，可以处理血液，例如通过添加抗凝血剂。已经获得且任选进一步处理之后，血液可以立即用于分析或进行储存，如本领域技术人员已知。本公开中的特征“血液产品”是指衍生自血液的产品，其中已经处理血液以获得血液产品。实例包括具有添加剂(诸如肝素)的血液，包装的红血细胞，红细胞浓缩物，血小板浓缩物，粒细胞浓缩物，血液干细胞制备物等。

在一些实施方式中，包含红细胞的样品的可选来源包括具有红血细胞作为“污染物”的活检样品、骨髓、尿、粪便或体液。

在一些实施方式中，所述试剂用于从包含红细胞的样品检测、浓缩或分离除了红细胞以外的细胞。

在一些实施方式中，所述包含红细胞的样品为血液样品。

在一些实施方式中，其中除了红细胞以外的细胞是白细胞、循环内皮细胞或循环肿瘤细胞。

根据本发明的一方面，本发明还涉及裂解红细胞的方法，包括：

a)提供包含红细胞的样品；

b)将所述样品与如上所述的试剂接触，从而裂解红细胞；和

c)任选地去除红细胞碎片。

在一些实施方式中，所述样品是包含红细胞和其它细胞的样品；

在一些实施方式中，所述包含红细胞的样品为血液样品；

在一些实施方式中，所述血液样品与所述试剂的体积比为1:(20-100)；体积比也可以为1:30、1:40、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80或1:90。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括：

d)从包含红细胞的样品检测或分离除了红细胞以外的细胞；

在一些实施方式中，除了红细胞以外的细胞是白细胞、循环内皮细胞或循环肿瘤细胞。

根据本发明的一方面，本发明还涉及试剂盒，其包含如上所述的试剂。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于去除红细胞碎片的试剂。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于实施上述方法的说明书。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1配制方法

按下述浓度配制

-NH₄Cl 0.15M，

-NaCl0.03M，

-蔗糖5w/v％，

-EDTA 0.1nM，

-Triton X-100 1v/v％，

-SDS 8w/v％，以及

-NaHCO₃ 50mM。

配制方法为，将各成分加入超纯水中，定容到1L，充分混匀溶解用HCl或NaOH调节pH 8.0。

2应用

选用全血样本，在不同裂解时间下用荧光免疫层析法进行测试，参考系统为BioRad D-10高效液相色谱法。

取10μL全血，加入490μL裂解液中，分别颠倒混匀裂解5～300s，裂解均能得到澄清透明液体，之后在糖化血红蛋白免疫层析试纸条上进行层析，用荧光检测仪读取测试结果。

3效果评价

其结果如图1所示。从图可知，不同样本在5S之内都可以达到裂解完全的效果(现有产品需要1～2min)，各测试点CV＜5％。

实施例2

1配制方法

按下述浓度配制

-NH₄Cl 0.4M，

-NaCl0.01M，

-海藻糖1w/v％，

-EDTA·Na₂ 0.5nM，

-Tween 20 10v/v％，

-SDS 8w/v％，以及

-NaHCO₃ 5mM。

配制方法为，将各成分加入超纯水中，定容到1L，充分混匀溶解用HCl或NaOH调节pH 8.5。

2应用

由于糖化血红蛋白的检测前提为红细胞裂解完全，因此用糖化血红蛋白层析法检测与高效液相色谱法的临床数据对比，可以间接反应出裂解的完全性和裂解液效果的稳定性。

选取64例BioRad D10定标的糖化血红蛋白新鲜全血样本，各取10μL全血，加入490μL裂解液中，分别颠倒混匀裂解10s，裂解均能得到澄清透明液体，之后在糖化血红蛋白免疫层析试纸条上进行层析，用荧光检测仪读取测试结果。

实施例3

1配制方法

按下述浓度配制

-NH₄Cl 0.25M，

-NaCl0.02M，

-蔗糖3w/v％，

-EDTA·K₂ 0.3nM，

-Tween 20 5v/v％，

-SDS 4w/v％，以及

-NaHCO₃ 30mM。

配制方法为，将各成分加入超纯水中，定容到1L，充分混匀溶解用HCl或NaOH调节pH 8.2。

采用裂解液A与本发明裂解液进行糖化血红蛋白裂解比对。

其中，裂解液A的配方与配置方法与实施例3中的上述组分相同，区别仅在于成分中不含有蔗糖和SDS。

2应用

裂解时间

A)50倍裂解，分别同等力度颠倒晃动裂解10s，观察裂解液A中仍有片状红细胞残留，本发明裂解液澄清透明无残留情况。

B)50倍裂解，分别同等力度颠倒晃动裂解，用计时器记录达到澄清透明的时间，裂解液A达到完全澄清透明用时3’40”，本发明裂解液达到完全澄清透明用时8s。

(2)裂解效果

选取64例BioRad D10定标的糖化血红蛋白新鲜全血样本，各取10μL全血，加入490μL裂解液中，分别颠倒混匀裂解，其中裂解液A 4min、本发明裂解液10s，裂解均能得到澄清透明液体，之后在糖化血红蛋白免疫层析试纸条上进行层析，用荧光检测仪读取测试结果。

测试结果如图2和3所示。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.红细胞裂解试剂，其为包含以下组分的水溶液：

NH₄ ⁺/NH₃、Na⁺、蔗糖和/或海藻糖、螯合剂、Triton X-100和/或Tween 20、SDS；

所述试剂在裂解红细胞过程中的最终浓度在以下范围内：

- NH₄ ⁺/NH₃0.15 M - 0.4M，

- Na⁺0.01 M - 0.03 M，

- 蔗糖和/或海藻糖 1 w/v %-5 w/v %，

- 螯合剂 0.1 nM - 0.5 nM，

- Triton X-100和/或Tween 20 1 v/v %-10 v/v %，以及

- SDS 1 w/v %-8 w/v %。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括缓冲组分。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述缓冲组分选自HCO₃ ^-，其在裂解红细胞过程中的最终浓度为5mM-50mM。

4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述螯合剂是乙二胺四乙酸或其盐。

5.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂的pH=8.0-8.5。

6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述试剂在裂解红细胞过程中的pH=8.0-8.5。

7.权利要求1~6任一项所述的试剂在裂解红细胞中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂用于从包含红细胞的样品检测、浓缩或分离除了红细胞以外的细胞，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述包含红细胞的样品为血液样品。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，除了红细胞以外的细胞是白细胞或循环内皮细胞。

11.裂解红细胞的方法，包括：

a) 提供包含红细胞的样品；

b) 将所述样品与权利要求1~6任一项所述的试剂接触，从而裂解红细胞。

12.根据权利要求11所述的裂解红细胞的方法，其特征在于，所述方法还包括：c)去除红细胞碎片。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述样品是包含红细胞和其它细胞的样品。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述包含红细胞的样品为血液样品。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述血液样品与所述试剂的体积比为1:（20-100）。

16.根据权利要求11~15任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：

d) 从包含红细胞的样品检测或分离除了红细胞以外的细胞；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，除了红细胞以外的细胞是白细胞或循环内皮细胞。

18.试剂盒，其包含权利要求1~6任一项所述的试剂。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于去除红细胞碎片的试剂。

20.根据权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于实施权利要求11~17任一项所述方法的说明书。