CN112504793A - 用于渗透和固定血细胞的试剂及分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于渗透和固定血细胞的试剂及分析方法，试剂包括固定溶液、渗透溶液以及清洗溶液；固定溶液包括体积浓度为1％～20％的跨细胞膜转运化合物、以及质量浓度为0.1mg/ml～10mg/ml的糖类化合物，所述固定溶液还包括物质的量浓度为0.3mol/L～12.3mol/L的脂肪醛类化合物、亚胺类化合物、脲类化合物和恶唑烷类化合物中的一种或者多种；渗透溶液包括质量浓度为0.01％～10％表面活性剂、以及质量浓度为0.2％～15％蛋白质或者氨基酸。该试剂能有效裂解红细胞、透化白细胞膜，但不会实质性的破坏白细胞膜表面标记、形态和光散射性质等细胞特性，并允许抗体或其他感兴趣的组分进入细胞，细胞内容物保存良好，通过流式细胞仪对细胞内蛋白质、核酸、酶、细胞因子、病毒颗粒等进行分析。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分子分析技术领域，更具体地说，它涉及用于渗透和固定血细胞的试剂及分析方法。
背景技术
对血细胞分化表型的分析用于评估生物体的疾病状态和其它健康状况是细胞分子分析领域的最新的发展趋势，在国外已经能够提供商用试剂盒用于对细胞内和细胞表面的靶标进行详细分析。对细胞表面靶抗原染色，利用现有的单克隆抗体标记技术是很容易实现的，例如通过使用特异性细胞表面标记物来识别白细胞的特殊亚群，利用流式细胞技术，对所述特异性结合剂标记的细胞进行分析，检测并区分多种标记和细胞的物理特性，如细胞的大小和颗粒度。但对细胞内靶表位的标记，通常需要对细胞进行特殊的预处理，如对目标细胞打孔，使细胞膜对于大分子荧光标记的抗体能自由进入，与存在于细胞质或细胞核中的特定分子特异性结合，来识别所述细胞的功能特性，期间渗透和固定细胞就显得非常重要。之前用于载玻片或者悬液中细胞的渗透方法是通过在低温(-20℃)下用醇稀释来处理细胞,该方法的优点细胞内靶抗原保持良好,但步骤复杂且需要低温,对细胞形态改变极大，破坏细胞的表面抗原决定簇。因此，急需寻找一个方法，在对细胞进行特殊处理的同时，使不同细胞群的细胞结构能维持原有形态，保持各自的特征性光散射性能，并且胞质蛋白保存在自身细胞内不流失，通俗来讲，就是不改变细胞内外的抗原靶点和保持原有的细胞形态。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明在于提供用于渗透和固定血细胞的试剂及分析方法，其能有效裂解红细胞、透化白细胞膜，但不会实质性的破坏白细胞膜表面标记、形态和光散射性质等细胞特性，并允许抗体或其他感兴趣的组分进入细胞，细胞内容物保存良好，通过流式细胞仪对细胞内蛋白质、核酸、酶、细胞因子、病毒颗粒等进行分析。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：用于渗透和固定血细胞的试剂，包括固定溶液、渗透溶液以及清洗溶液；
所述固定溶液包括体积浓度为1％～20％的跨细胞膜转运化合物、以及质量浓度为0.1mg/ml～10mg/ml的糖类化合物，所述固定溶液还包括物质的量浓度为0.3mol/L～12.3mol/L的脂肪醛类化合物、亚胺类化合物、脲类化合物和恶唑烷类化合物中的一种或者多种；其中，所述跨细胞膜转运化合物为含硫或者醇类有机化合物；
所述渗透溶液包括质量浓度为0.01％～10％表面活性剂、以及质量浓度为0.2％～15％蛋白质或者氨基酸；其中，所述表面活性剂包括脱氧胆酸钠、Brij、NP40、NP9、Tween20、月桂酰肌氨酸钠、二异丁基萘磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠和皂素的一种或多种。
作为优选，所述脂肪醛类化合物为C1–C5的脂族醛，包括甲醛、多聚甲醛、、丙烯醛、丙二醛、乙二醛或者戊二醛；所述亚胺类化合物包括碳二亚胺或者马来酰亚胺；所述脲类化合物包括咪唑烷基脲，重氮烷基脲或者乙内酰脲。
作为优选，所述跨细胞膜转运化合物包括二甲基亚砜、环丁砜、聚乙二醇或者乙二醇。
作为优选，所述糖类化合物包括海藻糖、麦芽糖、葡萄糖、壳聚糖、硫酸葡聚糖。
作为优选，所述表面活性剂为二异丁基萘磺酸钠。
作为优选，所述渗透剂中的蛋白质包括脱脂奶粉、酪蛋白、人血清白蛋白或者牛血清白蛋白；所述氨基酸包括甘氨酸、精氨酸或者赖氨酸。
分析方法，用于渗透细胞膜并且保留细胞内外表位以用于流式细胞术分析，使用上述所述的试剂，其步骤包括如下：
1)将细胞膜表面标记物结合样品中的细胞组分10～15min，然后用所述固定剂固定细胞，以实现对蛋白质、脂蛋白、核酸分子的部分交联；
2)洗涤含有细胞的样品，将含有细胞的样品与所述渗透试剂混合形成样品混合物；
3)将步骤2)中的所述混合物孵育5～10min使细胞膜能渗透大分子物质，同时保留细胞组分用于与细胞内标记物结合；
4)将所述细胞内标记物加入样品混合物中，将样品混合物再孵育10～15min，以使得细胞标记物与被保留的细胞组分相结合，再用流式细胞术分析样品混合物。
作为优选，所述细胞内标记物抗原位点为MPO、Lysozyme、IFN-γ或者IL-4。
作为优选，所述细胞膜表面抗原为细胞分化抗原。
作为优选，所述细胞标记物是细胞膜表面抗原位点和细胞内抗原位点的特异性抗体。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种新的固定和渗透细胞的试剂及分析方法，固定渗透后可再现地裂解红细胞并不会破坏目标细胞的性质，能保持白细胞的抗原特性如表面标记、细胞形态和光散射性质，允许抗体或其他成分通过细胞膜进入细胞内，且细胞内容物不被溢出，固定后细胞虽然处于死亡状态，但在细胞分析过程中表现出与“活细胞”相似的性质，基于光散射特性的细胞类型分化仍然是完整的；
2、本发明所述的固定和渗透细胞的试剂适用于与外周血、骨髓或组织中的血细胞一起使用，尤其是外周血白细胞，包括但不限于单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞；
3、本发明提供了一种渗透细胞膜并且保留细胞内外表位以用于流式细胞术分析的方法，通过特定细胞外表面标记物识别细胞的特定亚群，以及通过存在于细胞质中的特定分子识别所述细胞的功能特性。
附图说明
图1为本发明的试剂使用FITC-MPO抗体染色健康受试者外周血细胞；
图2为人外周血细胞PMA刺激后用本发明试剂处理的全血细胞前向角和侧向角散点图以及细胞内因子IFN-γ和IL-4多参数散点图。
具体实施方式
本发明提供了用于渗透和固定血细胞的试剂，固定后不会破坏细胞的细胞性质，如表面标记、细胞形态和光散射性质，并允许抗体或其他成分通过细胞膜进入细胞内，且细胞内容物不被溢出，固定后细胞虽然处于死亡状态，但在细胞分析过程中表现出与“活细胞”相似的性质，基于光散射特性的细胞类型分化仍然是完整的。
本发明所述的用于渗透和固定血细胞的试剂适用于与外周血、骨髓或组织中的血细胞一起使用，尤其是外周血白细胞，包括但不限于单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞。
本发明目的在于提供一种渗透细胞膜并且保留细胞内外表位以用于流式细胞术分析的方法，通过特定细胞外表面标记物识别细胞的特定亚群，以及通过存在于细胞质中的特定分子识别所述细胞的功能特性。
上述用于渗透和固定血细胞的试剂包括固定溶液、渗透溶液以及清洗溶液，该三种溶液单独进行使用。
在细胞标记物结合于样品中的细胞组分一段时间之后用固定溶液处理细胞，以实现对蛋白质、脂蛋白、核酸分子的至少部分交联；固定溶液包括体积浓度为1％～20％的跨细胞膜转运化合物、以及质量浓度为0.1mg/ml～10mg/ml的糖类化合物，固定溶液还包括物质的量浓度为0.3mol/L～12.3mol/L的脂肪醛类化合物、亚胺类化合物、脲类化合物和恶唑烷类化合物中的一种或者多种；其中，跨细胞膜转运化合物为含硫或者醇类有机化合物；脂肪醛类化合物为C1–C5的脂族醛，包括甲醛、多聚甲醛、丙烯醛、丙二醛、乙二醛或者戊二醛；亚胺类化合物包括碳二亚胺或者马来酰亚胺；脲类化合物包括咪唑烷基脲，重氮烷基脲或者乙内酰脲，优选脲类化合物，可以是烷基脲，尤其是重氮烷基脲。脲类化合物或者醛类化合物用于保存细胞形态以及固定细胞内组分，含有脲类化合物的固定溶液对血细胞有稳定保护作用，不管是红细胞还是白细胞，为了有效的分离白细胞，因此，采用低渗的介质以增加红细胞的渗透脆性，最好是在弱酸性的低渗介质中。
其中，固定溶液中的糖类化合物包括海藻糖、麦芽糖、葡萄糖、壳聚糖、硫酸葡聚糖、蔗糖或者乳糖。作为优选，糖类化合物为多糖，尤其是硫酸化多糖，其使用可避免包括细胞、核酸的聚集，在固定剂中的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml，优选1mg/ml的分子量为500000的硫酸葡聚糖。
其中，固定溶液中的跨细胞膜转运化合物包括二甲基亚砜、环丁砜、聚乙二醇或者乙二醇，这些化合物能降低脂质单分子膜表面电位，使细胞膜对低分子量的化合物更具渗透性，促进细胞内蛋白质向细胞膜方向聚集，促进化合物进入细胞质内，同时防止细胞膨胀，以期降低背景噪声，提高信噪比，优选的二甲基亚砜，在促进细胞膜转运的同时不易产生细胞膜融合，对光散射的影响较小；合适的浓度范围约为1％到20％，进一步的，优选浓度为5％到10％(v/v)。
另外，上述固定溶液的pH为3～9，优选为pH4～8；进一步优选为偏中性，最优选pH为6～7。在特定条件下，固定溶液的pH为6.8，固定溶液的低渗性优选通过存在70mM NaCl的浓度获得。
使含有细胞的样品与细胞渗透剂混合形成样品混合物；混合物孵育足够的时间使细胞膜能渗透大分子物质；同时保留细胞组分用于与细胞内标记物结合，渗透剂包含能够有效裂解红细胞、透化细胞膜且能很好的暴露细胞内表位的一种或多种化合物。
上述渗透溶液包括质量浓度为0.01％～10％表面活性剂、以及质量浓度为0.2％～15％蛋白质或者氨基酸；其中，表面活性剂包括脱氧胆酸钠、Brij、NP40、NP9、Tween20、月桂酰肌氨酸钠、二异丁基萘磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠或者皂素的一种或多种，其用于增加细胞膜的通透性；作为优选，渗透溶液中的表面活性剂为阴离子表面活性剂，特别为二异丁基萘磺酸钠，其能使细胞膜渗透大约200KD到1000KD的大分子物质，这些大分子物质通常是用于结合并检测细胞内、外特殊表位的荧光标记的单克隆抗体，表面活性剂的浓度以适合这种大分子物质的进入为佳，避免提取过多地细胞脂质物，影响细胞光散射特性，浓度可以在0.01％～10％之间，尤其在0.1％至5％之间，在优选条件下，渗透溶液包含1.2％的二异丁基萘磺酸钠。其中，蛋白质包括酪蛋白、人血清白蛋白或者牛血清白蛋白；氨基酸包括甘氨酸、精氨酸或者赖氨酸，氨基酸或者蛋白质对白细胞起到保护作用；另外，固定溶液中的脲类化合物可缓慢释放甲醛，为了减少醛类导致的非特应性结合增加和荧光淬灭，渗透溶液中加入至少一个官能团能够与甲醛的缺电子性官能团反应，其从氨基酸，烷基胺，多胺，伯胺，仲胺，铵盐或它们的组合中选择，优选甘氨酸或者乙酸铵。在酸性条件下，甘氨酸能有效保护分析细胞的结构完整性和亚细胞成分，甚至对抗高浓度阴离子表面活性剂的强变性作用。具体表现在偏酸环境下，红细胞裂解后的淋巴细胞、单核细胞的侧散射值趋于变高；甘氨酸的浓度低于0.2％(w/v)的细胞处理组合物对于保护细胞结构和细胞抗原来说几乎是无效的。
作为优选，渗透溶液中还包含乙酸铵或者铵化合物，用于促进红细胞的溶血，其既能中和甲醛残留物，又能自由进入红细胞胞内，破坏醛化的红细胞，浓度为15Mm。渗透溶液的pH优选为弱酸性，pH为3至8，特别是5至6。在特定条件下，渗透剂的pH约为5.5，在酸性PH条件下，能减少阴离子表面活性剂的负电荷，有利于疏水相互作用，产生额外的细胞固定，从而减少对白细胞破坏。渗透溶液的缓冲溶液可选自MES、ADA、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液，优选通过使用30mM的MES有机液来缓冲渗透剂的pH。缓冲溶液优选是近似等渗的，例如通过使用0.15M的氯化钠生理盐浓度作为溶剂，等渗溶液也为后续分析中使用的细胞结构和抗体提供保护功能。
在固定和透化之后，为了有效清除红细胞影，本发明的方法中使用的清洗溶液包含有商品名为0.1％(W/V)泊洛沙姆188(分子量8400)的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、1.5％(W/V)牛血清白蛋白(BSA)，在洗涤溶液中加入血清是因为固定细胞通常会出现自发荧光和抗体的非特异性结合，血清中含有的蛋白质能起封闭作用，减少非特异性染色。清洗溶液pH为3～8，优选pH为5～6的溶液。
分析方法，用于渗透细胞膜并且保留细胞内外表位以用于流式细胞术分析，使上述所述的试剂，其步骤包括如下：
1)将细胞膜表面标记物结合样品中的细胞组分10～15min，然后用所述固定剂固定细胞，以实现对蛋白质、脂蛋白、核酸分子的部分交联；其中，细胞膜表面抗原为细胞分化抗原(CD分子)；
2)洗涤含有细胞的样品，将含有细胞的样品与所述渗透试剂混合形成样品混合物；
3)将步骤2)中的所述混合物孵育5～10min使细胞膜能渗透大分子物质，同时保留细胞组分用于与细胞内标记物结合；其中，细胞内标记物抗原位点为MPO、Lysozyme、IFN-γ或者IL-4；
4)将所述细胞内标记物加入样品混合物中，将样品混合物再孵育10～15min，以使得细胞标记物与被保留的细胞组分相结合，再用流式细胞术分析样品混合物；其中，细胞标记物是细胞膜表面抗原位点和细胞内抗原位点的特异性抗体。
本发明试剂和方法固定的细胞保持足够的光散射特性，能够明显区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。固定细胞后允许抗体自由进入细胞内，和已固定在细胞内的相应抗原结合，并不被游离出细胞，而且，固定细胞上的细胞表面分子是完整的，它能被一个或多个抗体分子免疫染色。
为了观察固定渗透后细胞膜表面抗原和细胞内抗原表达的完整性和特异性，我们比较了固定细胞和非固定细胞单克隆抗体免疫染色的细胞靶内、外抗原的表达，以及试剂中的某些特殊成分对荧光标记抗体结合物的影响。对于一些特殊细胞因子(IL-4、IFN-γ)胞内表达需预先用体外激活剂佛波酯(PMA)10ng/ml、离子霉素(Ionomycin)500ng/ml、蛋白转运抑制剂(BFA)10mg/ml作用4-6h。整个步骤染色操作方法如下：将100ul EDTA作为抗凝剂的等分全血(刺激或未刺激的)分别置于反应管中，并将10ul相应抗体(CD2、CD3、CD4、CD14、CD19单克隆抗体)或对照抗体(鼠IgG2a抗体)添加至反应管中，室温暗处15分钟后，不固定细胞管加入氯化铵溶解试剂2ml，以溶解红细胞，室温暗处孵育10-15分钟，以血液变成澄清透亮为准，加入2ml PBS(1X)，震荡混匀，300g(约1200rpm)离心5分钟，弃上清，加入0.5-1ml PBS(1X)重悬细胞，流式细胞上样分析。固定细胞管加入200ul固定溶液，室温暗处孵育15分钟，加入2ml清洗溶液，震荡混匀，250g(约1000rpm)离心5分钟，弃上清，重悬反应管细胞，加入渗透溶液200ul，同时加入细胞内标记抗体(anti-vimentin、anti-gelsolin、MPO、lysozyme、IL-4、IFN-γ)，室温暗处孵育15分钟，加入2ml清洗溶液C，震荡混匀，300g(约1200rpm)离心5分钟，弃上清，0.5-1ml清洗溶液C重悬细胞，流式细胞上样分析。
具体的实施例，试剂组成包括：
固定溶液：pH 6.8，12％(W/V)重氮烷基脲、7％(W/V)二甲基亚砜、70mM氯化钠、5mM磷酸氢二钠、5mM磷酸二氢钠、0.1％(W/V)硫酸葡聚糖；
渗透溶液：pH 5.5、30mM二异丁基萘磺酸钠、140mM氯化钠、30mM MES、30mM乙酸铵、2％(W/V)甘氨酸、0.05％(V/V)Proclin300；
清洗溶液：pH 7.2、5mM磷酸氢二钠、1.75mM磷酸二氢钠、130mM氯化钠、0.1％(W/V)泊洛沙姆188、1.5％(W/V)牛血清白蛋白。
图1显示的本发明试剂使用FITC-MPO抗体染色健康受试者外周血细胞。表明用本发明试剂处理的全血细胞前向角和侧向角散点图，1b为空白对照，1c显示的是本发明试剂处理的全血细胞中淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞胞内MPO抗原的表达，该数据表明，MPO抗原在正常全血细胞的中性细胞胞内具有特异性，而淋巴细胞不表达，单核细胞中强度表达。
图2显示的是人外周血细胞PMA刺激后用本发明试剂处理的全血细胞前向角和侧向角散点图，使用APC标记的CD3抗体细胞膜染色，FITC标记的IFN-γ和PE标记的IL-4抗体进行细胞内染色的多参数散点图。
实施例1，非固定细胞和固定细胞表面抗原标记
表1提供了使用本发明的试剂处理的18例健康受试者全血细胞膜表面标记，结果表明，抗体与固定细胞的非特应性结合略高于非固定细胞，但不会产生大量的非特异性荧光(阴性对照)，并不足以干扰细胞表面标记抗原的检测，用本发明试剂处理的细胞还能保持足够的光散射特性，以便能够区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，并且细胞膜抗原依然具有完整性和特异性。但是，现有技术中使用10％甲醛固定细胞时，会增加细胞的非特异性结合(阴性对照)，同时改变淋巴细胞上CD2表位的结合(阳性表达下降)，CD4在单核细胞表面本身表达很低，用10％甲醛处理后，使部分CD4的单核细胞表达缺失，说明高浓度甲醛固定会影响细胞膜表面的抗原决定簇。高浓度甲醛易挥发，不利于实验技术人员和实验室环境，其次甲醛会增加细胞的非特异性结合，降低标记抗体结合物的荧光强度，降低细胞表达的信噪比。本申请中使用重氮烷基脲作为主要固定剂，虽有缓释醛，但试剂成分中的铵盐或氨类物质中和残留醛。同时甲醛含量过高会导致红细胞溶血不完全，有红细胞影存在，前向和侧向散点图上显示细胞融合现象。
表1
实施例2，非固定细胞和固定渗透细胞靶内抗原标记
实验方法依据上述提及步骤操作，18例健康受试者全血细胞靶内标记，表内结果是一些代表性细胞靶内抗原的平均阳性表达和信号噪声比(P/N)。该P/N是用单克隆抗体标记细胞靶内分子的特殊表达与同型对照抗体处理的相应分子的平均荧光强度(MFI)比值进行计算，结果表明，用本发明固定渗透剂处理细胞，细胞胞内蛋白被固定并保留在适当位置，标记有荧光的大分子抗体可渗透入胞内与相应蛋白质抗原结合，二甲基亚砜有助于改善细胞靶内抗原的检测，用本发明试剂处理的细胞靶内抗原标记可提高检测的灵敏度。
表2
NA＝Not applicable(不适用)
实施例3，评价不同浓度的阴离子表面活性剂BX、氨基酸Glycine和不同PH值条件下对中性粒细胞胞内MPO及Lysozyme表达的影响，数据表明，Glycine能减少重氮烷基脲释放的甲醛所导致标记抗体结合物的荧光淬灭，提高检测的信噪比，同时1.2％的BX浓度和PH5.5的酸性条件对于细胞染色更具敏感性。
表3
实施例4，为了比较不同渗透剂对6例ALL白血病细胞表达的影响，我们制备了五种不同的细胞渗透剂，其表面活性剂分别为NaLS、Tween20、Saponin、SDS、BX，所用浓度之前进行最佳滴定，是用于固定渗透细胞的最适浓度。对于白血病样本而言，髓性细胞相关分子MPO和Lysozyme在AML病例中阳性多数表达，但在ALL病例中，其淋巴细胞群体不表达或极少表达MPO和Lysozyme，在四中不同的细胞渗透剂中，Tween20、Saponin和NaLS出现了大量表达，应视为非特异性染色的假阳性，相比于SDS,含有BX成分的渗透剂，MPO和Lysozyme在ALL细胞上的阳性表达率最少和最小的P/N。结果表明，对于渗透剂的研究，应考虑所用渗透试剂作用细胞产生的非特异性干扰。
表4：不同渗透剂对急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞上MPO和Lysozyme的表达
实施例5
白血病的诊断基于形态学、细胞化学、细胞遗传学、免疫学标准。造血细胞最特异、最原始的谱系标记存在于细胞质中，利用渗透试剂对造血细胞胞内抗原的流式细胞测定，对于白血病的诊断有实际意义，特别是MPO、Lysozyme用来区分急性髓细胞性白血病(AML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)的诊断和监测有很大价值。我们使用商用和本发明试剂对28例FAB分类的急性白血病患者骨髓细胞MPO和Lysozyme的相关表达情况。结果表明，本发明渗透试剂的特异性和有效性等同于商用试剂，但敏感性稍有差异。P/N：抗体标记的阳性细胞和同型对照抗体标记的细胞平均荧光强度的比值。
表5：商用和自制试剂对FAB分类的白血病患者骨髓细胞MPO和Lysozyme的相关表达
本具体实施例中的指定方向仅仅是为了便于表述各部件之间位置关系以及相互配合的关系。以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.用于渗透和固定血细胞的试剂，其特征是，包括固定溶液、渗透溶液以及清洗溶液；
所述固定溶液包括体积浓度为1％～20％的跨细胞膜转运化合物、以及质量浓度为0.1mg/ml～10mg/ml的糖类化合物，所述固定溶液还包括物质的量浓度为0.3mol/L～12.3mol/L的脂肪醛类化合物、亚胺类化合物、脲类化合物和恶唑烷类化合物中的一种或者多种；其中，所述跨细胞膜转运化合物为含硫或者醇类有机化合物；
所述渗透溶液包括质量浓度为0.01％～10％表面活性剂、以及质量浓度为0.2％～15％蛋白质或者氨基酸；其中，所述表面活性剂包括脱氧胆酸钠、Brij、NP40、NP9、Tween20、月桂酰肌氨酸钠、二异丁基萘磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠和皂素的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的用于渗透和固定血细胞的试剂，其特征是：所述脂肪醛类化合物为C1–C5的脂族醛，包括甲醛、多聚甲醛、、丙烯醛、丙二醛、乙二醛或者戊二醛；所述亚胺类化合物包括碳二亚胺或者马来酰亚胺；所述脲类化合物包括咪唑烷基脲，重氮烷基脲或者乙内酰脲。
3.根据权利要求1所述的用于渗透和固定血细胞的试剂，其特征是：所述跨细胞膜转运化合物包括二甲基亚砜、环丁砜、聚乙二醇或者乙二醇。
4.根据权利要求1所述的用于渗透和固定血细胞的试剂，其特征是：所述糖类化合物包括海藻糖、麦芽糖、葡萄糖、壳聚糖、硫酸葡聚糖。
5.根据权利要求1所述的用于渗透和固定血细胞的试剂，其特征是：所述表面活性剂为二异丁基萘磺酸钠。
6.根据权利要求1所述的用于渗透和固定血细胞的试剂，其特征是：所述渗透剂中的蛋白质包括脱脂奶粉、酪蛋白、人血清白蛋白或者牛血清白蛋白；所述氨基酸包括甘氨酸、精氨酸或者赖氨酸。
7.分析方法，用于渗透细胞膜并且保留细胞内外表位以用于流式细胞术分析，其特征在于，使用权利要求1～6中任一项所述的试剂，其步骤包括如下：
1)将细胞膜表面标记物结合样品中的细胞组分10～15min，然后用所述固定剂固定细胞，以实现对蛋白质、脂蛋白、核酸分子的部分交联；
2)洗涤含有细胞的样品，将含有细胞的样品与所述渗透试剂混合形成样品混合物；
3)将步骤2)中的所述混合物孵育5～10min使细胞膜能渗透大分子物质，同时保留细胞组分用于与细胞内标记物结合；
4)将所述细胞内标记物加入样品混合物中，将样品混合物再孵育10～15min，以使得细胞标记物与被保留的细胞组分相结合，再用流式细胞术分析样品混合物。
8.根据权利要求7所述的分析方法，其特征是：所述细胞内标记物抗原位点为MPO、Lysozyme、IFN-γ或者IL-4。
9.根据权利要求7所述的分析方法，其特征是：所述细胞膜表面抗原为细胞分化抗原。
10.根据权利要求7所述的分析方法，其特征是：所述细胞标记物是细胞膜表面抗原位点和细胞内抗原位点的特异性抗体。
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