JP6053818B2 - 白血球の細胞内標的及び細胞外標的の標識方法 - Google Patents
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Description
(a)
(i)少なくとも白血球と赤血球とを含む細胞組成物と、
(ii)前記白血球の細胞内のタンパク質、リポタンパク質及び核酸を架橋可能な1つ以上の薬剤を含む第1溶液と、の組合せ物を形成する工程と、
(b)前記組合せ物に、前記白血球の透過化、前記赤血球の溶解、及び前記第1溶液中の前記1つ以上の薬剤の架橋活性の中和が可能な1つ以上の薬剤を含む第2溶液を添加する工程であって、
前記第2溶液の添加体積は前記組合せ物の総体積の1〜10倍であることを特徴とする工程と、
(c)前記第2溶液の添加と同時に又は前記第2溶液の添加に続いて、白血球の細胞外標的に特異的に結合する少なくとも1つの結合因子、及び白血球の細胞内標的に特異的に結合する少なくとも1つの結合因子を添加する工程であって、
前記結合因子のそれぞれは検出可能因子(detectable agent)を含む工程と、
(d)前記組合せ物に第3溶液を添加する工程であって、前記第3溶液の添加体積は、前記第3溶液が添加される前記組合せ物の総体積以上である、工程と、を含む、方法に関する。
(a)濃度5%〜15%(v/v)のホルムアルデヒドを含む第1溶液と、
(b)
(i)濃度1〜100mMの塩化アンモニウム(NH4Cl)と、
(ii)濃度0.05%〜0.5%(w/v)のN−ラウロイルサルコシンナトリウムと、を含む第2溶液と、
(c)
(i)濃度0.01%〜1%(v/v)のホルムアルデヒドと、
(ii)濃度0.01%〜0.5%(w/v)のN−ラウロイルサルコシンナトリウムと、を含む第3溶液と、を含む。
他の実施形態では、本発明のキットは、
(a)フローサイトメトリーによって検出可能な標識を含む少なくとも1つの結合因子であって、前記結合因子は白血球の細胞外標的に特異的に結合する、結合因子と、
(b)フローサイトメトリーによって検出可能な標識を含む少なくとも1つの結合因子であって、前記結合因子は白血球の細胞内標的に特異的に結合する、結合因子と、を更に含み、
前記細胞外結合因子及び前記細胞内結合因子は別々の管で提供されるか、又は、前記第2溶液の成分として提供され、
結合因子及び各検出可能な標識は上に定義したとおりである。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
白血球の細胞内標的及び細胞外標的の標識方法であって、
(a)
(i)少なくとも白血球と赤血球とを含む細胞組成物と、
(ii)前記白血球の細胞内のタンパク質、リポタンパク質及び核酸を架橋可能な1つ以上の薬剤を含む第1溶液と、の組合せ物を形成する工程と、
(b)前記組合せ物に、前記白血球の透過化、前記赤血球の溶解、及び前記第1溶液中の前記1つ以上の薬剤の架橋活性の中和が可能な1つ以上の薬剤を含む第2溶液を添加する工程であって、
前記第2溶液は、
(i)0.05%〜0.5%(w/v)の量の界面活性剤と、
(ii)濃度1〜100mMの第四級アンモニウム塩又はアミンを含有する化合物と、を含み、
前記第2溶液のpHは6.5以下であり、
前記第2溶液の添加体積は前記組合せ物の総体積の1〜10倍である工程と、
(c)前記第2溶液の添加と同時に又は前記第2溶液の添加に続いて、白血球の細胞外標的に特異的に結合する少なくとも1つの結合因子、及び白血球の細胞内標的に特異的に結合する少なくとも1つの結合因子を添加する工程であって、
前記結合因子のそれぞれは検出可能因子を含む工程と、
(d)前記組合せ物に第3溶液を添加する工程であって、前記第3溶液の添加体積は、前記第3溶液が添加される前記組合せ物の総体積以上である工程と、を含む、方法。
(項目2)
前記細胞組成物は、全血、骨髄、及び腹水からなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目3)
工程(a)で得られた組合せ物を工程(b)に先立って5〜20分インキュベートする、項目1又は項目2に記載の方法。
(項目4)
工程(c)で得られた組合せ物を工程(d)に先立って15〜60分インキュベートする、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記第1溶液の添加後、工程(a)の前記1つ以上の薬剤が、前記組合せ物中に0.5%〜2%(v/v)の量で含有される、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
工程(a)の1つ以上の薬剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される、項目1〜5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記第2溶液は、
(i)前記細胞組成物中に含有される白血球の大部分が溶解されないままで、前記細胞組成物中に含有される実質的に全ての赤血球の溶解をもたらすのに適合した量の界面活性剤と、
(ii)工程(a)の前記1つ以上の薬剤を中和する中和剤と、を含む、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
工程(b)において、前記第2溶液の添加体積は前記組合せ物の総体積の4〜8倍である、項目1〜7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
工程(d)に先立って遠心分離工程が行われない、項目1〜8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
工程(b)の後にも工程(c)の後にも、遠心分離工程を行わない、項目1〜9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
項目1〜10のいずれか一項に記載の方法を行うためのキットであって、
(a)ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される化合物を含む第1溶液と、
(b)
(i)第四級アンモニウム塩又はアミンを含有する化合物と、
(ii)界面活性剤と、を含む第2溶液と、
(c)
(i)ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される化合物と、
(ii)界面活性剤と、を含む第3溶液と、を含む、キット。
(項目12)
(a)前記第1溶液は濃度5%〜15%(v/v)のホルムアルデヒドを含み、
(b)前記第2溶液は、
(i)濃度1〜100mMの塩化アンモニウム(NH 4 Cl)と、
(ii)濃度0.05%〜0.5%(w/v)のN−ラウロイルサルコシンナトリウムと、を含み、
(c)前記第3溶液は、
(i)濃度0.01%〜1%(v/v)のホルムアルデヒドと、
(ii)濃度0.01%〜0.5%(w/v)のN−ラウロイルサルコシンナトリウムと、を含む、項目11に記載のキット。
(項目13)
前記キットは、
(a)フローサイトメトリーによって検出可能な標識を含む少なくとも1つの結合因子であって、前記結合因子は白血球の細胞外標的に特異的に結合する、結合因子と、
(b)フローサイトメトリーによって検出可能な標識を含む少なくとも1つの結合因子であって、前記結合因子は白血球の細胞内標的に特異的に結合する、結合因子と、を更に含み、
前記細胞外結合因子及び前記細胞内結合因子は別々の管で提供されるか、又は、前記第2溶液の成分として提供される、項目11又は項目12に記載のキット。
PE標識抗ZAP−70抗体を用いた、正常なヒトの全血の染色
当該技術分野において既知である方法(「Intraprep」)、及び、付加的な洗浄工程を伴う又は伴わない本発明の方法(「INCA(洗浄あり)」及び「INCA(洗浄なし)」)により、PE標識抗ZAP−70抗体を用いて、正常なヒトの全血を染色し、続いてフローサイトメトリーにより分析した。溶液1、2、及び3並びに用いた方法は、実施例4に一致する。図2は、側方散乱に対する抗体(FL2)を用いたそれぞれの染色を示す。本発明に係る方法では、先行技術の方法と比較して等しい量の細胞が染色され、RMFI(相対平均蛍光強度(信号対雑音比に対する尺度))は30(INCA(洗浄あり))及び15(INCA(洗浄なし))で、染色されていない細胞からより明確な分離を示した。
FITC標識抗CD4抗体及びAlexa647標識抗FoxP3抗体を用いた、正常なヒトの全血の染色
当該技術分野において既知である方法(「Intraprep」)、及び、付加的な洗浄工程を伴う又は伴わない本発明の方法(「INCA(洗浄あり)」及び「INCA(洗浄なし)」)により、FITC標識抗CD4抗体及びAlexa647標識抗FoxP3抗体を用いて、正常なヒトの全血を染色し、続いてフローサイトメトリーにより分析した。図3は、抗FoxP3抗体(FL4)による細胞内の染色に対する、抗CD4抗体(FL1)によるそれぞれの染色を示す。当該技術分野において既知である方法では、細胞の0.36%というわずかな集団が染色されただけだったが、付加的な洗浄工程を含む本発明の方法では、4.3%という実質的な集団が染色された。
様々な細胞内抗体を用いた、正常なヒトの全血の染色
上述したように、当該技術分野において既知である方法(「Intraprep」)、及び、付加的な洗浄工程を伴う又は伴わない本発明の方法(「INCA(洗浄あり)」及び「INCA(洗浄なし)」)により、様々な細胞内抗体を用いて、正常なヒトの全血を染色した。それぞれの染色の結果を下の表1に示す。
洗浄工程なしでの、ヒトの全血の染色
次のヒトの全血試料を、Krome Orange標識抗CD45抗体、FITC標識抗CD5抗体、APC標識抗CD19抗体、又はPE標識抗ZAP−70抗体で染色した。抗CD19抗体が細胞外エピトープに対するものである一方で、抗ZAP−70抗体は細胞内エピトープに対するものである。
実施例4の変形例
本発明の方法が、多くの条件下で問題なく使用できる、確実性のある方法かどうかを明らかにするため、実施例4で開示した溶液1、2、及び3のいくつかの変形例について試験を行った。
付加的な洗浄工程の影響
付加的な洗浄工程が、上で得られた結果に対して何らかの悪影響を与えているかどうかを明らかにするため、更なる洗浄工程を追加した場合において、実施例4の条件を変化させた。
pHの変化の影響
本発明に係るシステム及び方法の成果で使用された溶液のpH値の違いの影響を示すために、溶液2のpHを変化させた、ある実験的な設定を選定した。
Claims (14)
- 白血球の細胞内標的及び細胞外標的を標識するインビトロの方法であって、
(a)
(i)少なくとも白血球と赤血球とを含む細胞組成物と、
(ii)前記白血球の細胞内のタンパク質、リポタンパク質及び核酸を架橋可能な1つ以上の薬剤を含む第1溶液と、の組合せ物を形成する工程と、
(b)前記組合せ物に、前記白血球の透過化、前記赤血球の溶解、及び前記第1溶液中の前記1つ以上の薬剤の架橋活性の中和が可能な1つ以上の薬剤を含む第2溶液を添加する工程であって、
前記第2溶液は、
(i)0.05%〜0.5%(w/v)の量の界面活性剤と、
(ii)濃度1〜100mMの第四級アンモニウム塩又はアミンを含有する化合物と、を含み、
前記第2溶液のpHは6.5以下であり、
前記第2溶液の添加体積は前記組合せ物の総体積の1〜10倍である工程と、
(c)前記第2溶液の添加と同時に又は前記第2溶液の添加に続いて、前記白血球の細胞外標的に特異的に結合する少なくとも1つの結合因子、及び前記白血球の細胞内標的に特異的に結合する少なくとも1つの結合因子を添加する工程であって、
前記結合因子のそれぞれは検出可能因子を含む工程と、
(d)前記組合せ物に、固定剤と界面活性剤とを含む第3溶液を添加する工程であって、前記第3溶液の添加体積は、前記第3溶液が添加される前記組合せ物の総体積以上である工程と、を含む、方法。 - 前記細胞組成物は、全血、骨髄、及び腹水からなる群から選択される、請求項1に記載のインビトロの方法。
- 工程(a)で得られた組合せ物を工程(b)に先立って5〜20分インキュベートする、請求項1又は請求項2に記載のインビトロの方法。
- 工程(c)で得られた組合せ物を工程(d)に先立って15〜60分インキュベートする、請求項1〜3のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
- 前記第1溶液の添加後、工程(a)の前記1つ以上の薬剤が、前記組合せ物中に0.5%〜2%(v/v)の量で含有される、請求項1〜4のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
- 工程(a)の1つ以上の薬剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
- 前記第2溶液は、前記細胞組成物中に含有される白血球の大部分が溶解されないままで、前記細胞組成物中に含有される実質的に全ての赤血球を溶解し、工程(a)の前記第1溶液中の前記1つ以上の薬剤の前記架橋活性を中和する、請求項1〜6のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
- 工程(b)において、前記第2溶液の添加体積は前記組合せ物の総体積の4〜8倍である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
- 工程(d)に先立って遠心分離工程が行われない、請求項1〜8のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
- 工程(b)の後にも工程(c)の後にも、遠心分離工程を行わない、請求項1〜9のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法を行うためのキットであって、
(a)ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される化合物を含む第1溶液と、
(b)
(i)第四級アンモニウム塩又はアミンを含有する化合物と、
(ii)界面活性剤と、を含む第2溶液と、
(c)
(i)ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される化合物と、
(ii)界面活性剤と、を含む第3溶液と、を含む、キット。 - (a)前記第1溶液は濃度5%〜15%(v/v)のホルムアルデヒドを含み、
(b)前記第2溶液は、
(i)濃度1〜100mMの塩化アンモニウム(NH4Cl)と、
(ii)濃度0.05%〜0.5%(w/v)のN−ラウロイルサルコシンナトリウムと、を含み、
(c)前記第3溶液は、
(i)濃度0.01%〜1%(v/v)のホルムアルデヒドと、
(ii)濃度0.01%〜0.5%(w/v)のN−ラウロイルサルコシンナトリウムと、を含む、請求項11に記載のキット。 - 前記キットは、
(a)フローサイトメトリーによって検出可能な標識を含む少なくとも1つの細胞外結合因子であって、前記結合因子は白血球の細胞外標的に特異的に結合する、細胞外結合因子と、
(b)フローサイトメトリーによって検出可能な標識を含む少なくとも1つの細胞内結合因子であって、前記結合因子は白血球の細胞内標的に特異的に結合する、細胞内結合因子と、を更に含み、
前記細胞外結合因子及び前記細胞内結合因子は別々の管で提供されるか、又は、前記第2溶液の成分として提供される、請求項11又は請求項12に記載のキット。 - アミンを含有する前記化合物は、グリシン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、又はエタノールアミンを含む、請求項11に記載のキット。
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