JP6053818B2 - 白血球の細胞内標的及び細胞外標的の標識方法 - Google Patents

Description

本発明は、白血球の細胞内標的及び細胞外標的の標識方法、並びに前記方法を行うためのキットに関する。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）等の結合因子（binding agent）を用いた白血球の染色は、基礎研究並びに様々な診断用途の両方においてルーチン的に行われる重要な作業である。例えば、細胞質に存在する特定の分子による細胞の機能特性の識別と同時に、特定の細胞外表面マーカーによる白血球の特定のサブセットの識別を行うため、白血球の細胞内マーカーの染色と同時に細胞外マーカーの染色が必要になることが非常に多い。

例えばｍＡｂを用いて白血球の細胞内を染色し、かつ、フローサイトメトリーによるそれらの分析を可能とするためには、結合因子が結合すべき細胞表面及び細胞内部の両方で、白血球の構造の元々の状態を維持したままで、試料中に存在する白血球を透過化すること、及び赤血球を溶解することが必要である。通常、この目標は界面活性剤及び／又はアルコールを使用することで達成される。ホルムアルデヒド又はアルコール等を使用した固定化工程が行われると、赤血球は白血球よりも界面活性剤に対して抵抗性が低いことから、赤血球が溶解され、透過化された白血球を分析することができる。

白血球の細胞外染色及び細胞内染色の多くの方法が同一の原理に基づいている。詳細には、細胞の表面マーカーがまず染色され、続いて、結合しなかった結合因子を全て除去するために、１つ以上の洗浄工程を行う（即ち、細胞を遠心分離し、上澄みを捨ててから、新たな緩衝液にそれらを再懸濁する）。その後、細胞を固定し、続いて固定剤を除去する１つ以上の洗浄工程を再度行い、透過化し、再度洗浄してから、細胞内結合因子で染色し、最後に再度洗浄する。

しかしながら、これらの手順は時間がかかる（合計で最大２〜３時間）だけでなく、極めて手間がかかる。更に、少なくとも２度の遠心分離工程が必須であり、この手順の自動化がほとんど不可能になっている。加えて、遠心分離は細胞の構造に害を与える場合があるため、遠心分離されなかった細胞と比較して、細胞の光散乱信号を劣化させる場合がある。更に加えて、遠心分離では、細胞の消失と細胞の凝集が必ず引き起こされる。決定的なことには、細胞外結合因子と細胞内結合因子とは別々に使用し、かつ適用しなければならず、簡便に結合因子のカクテルを使用することができない。

それ故、本発明の根底にある技術的問題は、速く、手間があまりかからず、いかなる遠心分離工程も伴わず、結合因子のカクテルの使用が可能で、かつ容易に自動化できる、白血球の細胞内標的及び細胞外標的の改善された標識方法を提供することである。

上記技術的問題に対する解決策は、特許請求の範囲において特徴付けられた実施形態によって達成される。

詳細には、本発明は、白血球の細胞内標的及び細胞外標的の標識方法であって、
（ａ）
（ｉ）少なくとも白血球と赤血球とを含む細胞組成物と、
（ｉｉ）前記白血球の細胞内のタンパク質、リポタンパク質及び核酸を架橋可能な１つ以上の薬剤を含む第１溶液と、の組合せ物を形成する工程と、
（ｂ）前記組合せ物に、前記白血球の透過化、前記赤血球の溶解、及び前記第１溶液中の前記１つ以上の薬剤の架橋活性の中和が可能な１つ以上の薬剤を含む第２溶液を添加する工程であって、
前記第２溶液の添加体積は前記組合せ物の総体積の１〜１０倍であることを特徴とする工程と、
（ｃ）前記第２溶液の添加と同時に又は前記第２溶液の添加に続いて、白血球の細胞外標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合因子、及び白血球の細胞内標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合因子を添加する工程であって、
前記結合因子のそれぞれは検出可能因子（detectable agent）を含む工程と、
（ｄ）前記組合せ物に第３溶液を添加する工程であって、前記第３溶液の添加体積は、前記第３溶液が添加される前記組合せ物の総体積以上である、工程と、を含む、方法に関する。

場合によっては、本明細書において、本発明の方法はＩＮＣＡ（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｏ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ａｓｓａｙ（細胞内無遠心分離アッセイ））法と呼ばれる。

一実施形態では、染色すべき白血球を含有する細胞組成物は、懸濁状態で細胞を含有する生体液である。他の実施形態では、細胞組成物は、全血、骨髄、腹水、頭部流体（cephalic fluids）、解離したリンパ節、及び他の解離した組織からなる群から選択される。更なる実施形態では、細胞組成物は全血である。

一実施形態によると、本発明の方法の工程（ａ）で得られた組合せ物を、工程（ｂ）に先立って、５〜２０分インキュベートし、他の実施形態では、１０〜１５分インキュベートする。一実施形態によると、工程（ａ）で使用した白血球の細胞内のタンパク質、リポタンパク質及び核酸を架橋可能な１つ以上の薬剤は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される。一実施形態では、第１溶液の添加後、前記１つ以上の薬剤が前記組合せ物中に０．５％〜２％（ｖ／ｖ）の量で含有され、前記第１溶液中には５％〜１５％（ｖ／ｖ）の量で含有される。なお、この場合、本発明の方法の工程（ａ）は、細胞組成物中に含有される細胞を固定するために行われていることに留意すべきである。

一実施形態では、本発明の方法の工程（ｂ）で添加される、前記白血球の透過化、前記赤血球の溶解、及び前記第１溶液中の前記１つ以上の薬剤の架橋活性の中和が可能な１つ以上の薬剤を含む、第２溶液は、（ｉ）細胞組成物中に含有される白血球の大部分が溶解されないままで、細胞組成物中に含有される実質的に全ての赤血球の溶解をもたらすのに適合した量の界面活性剤と、（ｉｉ）工程（ａ）の前記１つ以上の薬剤を中和する中和剤と、を含む。一実施形態によると、前記界面活性剤はＣ_１２タイプのアルカン残基を含有しており、他の実施形態によると、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムを含有しており、一実施形態によると、界面活性剤は、前記第２溶液中に０．０５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の量で含有され、他の実施形態によると、０．１％〜０．３％（ｗ／ｖ）の量で含有される。更に、一実施形態によると、前記中和剤は第四級アンモニウム塩又はアミンを含有する化合物であり、他の実施形態によると、塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、及びエタノールアミンからなる群から選択される化合物であり、更なる実施形態では、塩化アンモニウムである。一実施形態では、前記中和剤は前記第２溶液中に濃度１〜１００ｍＭで含有され、他の実施形態では、濃度５〜２０ｍＭである。一実施形態では、前記第２溶液のｐＨは６．５以下である。他の実施形態では、本発明の方法の工程（ｂ）で添加される前記第２溶液の添加体積は、工程（ａ）で得られた組合せ物の総体積の１〜１０倍であり、他の実施形態では、４〜８倍であり、更なる実施形態では、６倍である。なお、この場合、本発明の方法の工程（ｂ）は、工程（ａ）で添加した前記第１溶液中の前記１つ以上の薬剤の架橋活性を中和するため、並びに、細胞組成物に含有される白血球を透過化し、かつ、赤血球を溶解するために行われることに留意すべきである。

本発明の方法の工程（ｃ）は工程（ｂ）と同時に行われてもよい。詳細には、工程（ｃ）で添加される結合因子は、工程（ｂ）で添加される第２溶液に既に含有されていてよい。あるいは、前記結合因子は、前記第２溶液の添加に続いて添加されてもよく、この場合、細胞外結合因子及び細胞内結合因子は結合因子のカクテルとして一緒に添加されてもよいし、又は別々に添加されてもよい。結合因子は、一実施形態では分子染色剤（molecular stain）であり、他の実施形態では抗体であり、更に他の実施形態ではモノクローナル抗体である。更に、前記結合因子に含まれる検出可能因子は特に限定されず、好適な検出可能因子は当該技術分野において既知である。前記検出可能因子は、一実施形態によると、ビオチン、酵素、及び、蛍光部分又は化合物からなる群から選択され、他の実施形態によると、蛍光部分又は化合物である。工程（ｄ）に先立って、工程（ｃ）で得られた組合せ物を、一実施形態では、１５〜６０分インキュベートし、他の実施形態では、３０〜４５分インキュベートする。なお、この場合、本発明の方法の工程（ｃ）は、細胞組成物中に含有される白血球を染色するために行われていることに留意すべきである。

本発明の方法の工程（ｄ）では、前記組合せ物に（即ち、工程（ｃ）で得られた組合せ物に）添加される第３溶液は、一実施形態によると、（ｉ）固定剤（一実施形態では、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される固定剤）、及び（ｉｉ）界面活性剤（一実施形態によると、Ｃ_１２タイプのアルカン残基を含有しており、他の実施形態によると、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムを含有している界面活性剤）を含む。一実施形態では、上記固定剤は、０．０１％〜１％（ｖ／ｖ）の量で、上記界面活性剤は０．０１％〜０．５％（ｗ／ｖ）の量で、第３溶液中に含有されている。他の実施形態では、第３溶液は、デキストラン硫酸及びＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（直線的な式（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ_・Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｘを有する、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン・ブロックコポリマー）からなる群から選択される化合物を更に含む。一実施形態によると、前記更なる化合物は、第３溶液中に０．１％（ｗ／ｖ）の量で含有される。

一実施形態では、本発明の方法は、工程（ｄ）に先立った、又は、工程（ｂ）若しくは工程（ｃ）の後の、遠心分離工程（例えば、前記白血球の精製のための遠心分離工程等）、又は、任意の付加的な洗浄工程を一切含まない。

他の実施形態では、本発明の方法は工程（ｄ）の後に１つの洗浄工程（即ち、細胞を遠心分離し、上澄みを捨て、工程（ｄ）で使用される好適な体積の第３溶液に細胞を再懸濁する工程）を含む。この洗浄工程により、信号対雑音比を改善でき（かなり薄い染色を操作する場合に、とりわけ有用である）、更に、細胞が濃縮される。

他の実施形態では、本発明の方法は、白血球上に結合した結合因子を検出する工程を更に含み、一実施形態によると、本工程はフローサイトメトリーによって行われる。

更なる実施形態では、本発明の方法における、全ての方法の工程が室温で行われる。

より更なる実施形態では、本発明の方法は自動化された方法である。

他の態様では、本発明は、第１溶液、第２溶液、及び第３溶液（ここで、前記第１溶液、第２溶液、及び第３溶液は上に定義したとおりである）を含む、本発明の方法を行うためのキットに関する。

ある特定の一実施形態では、本発明のキットは、
（ａ）濃度５％〜１５％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドを含む第１溶液と、
（ｂ）
（ｉ）濃度１〜１００ｍＭの塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）と、
（ｉｉ）濃度０．０５％〜０．５％（ｗ／ｖ）のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムと、を含む第２溶液と、
（ｃ）
（ｉ）濃度０．０１％〜１％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドと、
（ｉｉ）濃度０．０１％〜０．５％（ｗ／ｖ）のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムと、を含む第３溶液と、を含む。
他の実施形態では、本発明のキットは、
（ａ）フローサイトメトリーによって検出可能な標識を含む少なくとも１つの結合因子であって、前記結合因子は白血球の細胞外標的に特異的に結合する、結合因子と、
（ｂ）フローサイトメトリーによって検出可能な標識を含む少なくとも１つの結合因子であって、前記結合因子は白血球の細胞内標的に特異的に結合する、結合因子と、を更に含み、
前記細胞外結合因子及び前記細胞内結合因子は別々の管で提供されるか、又は、前記第２溶液の成分として提供され、
結合因子及び各検出可能な標識は上に定義したとおりである。

本発明の方法及びキットの特定の実施形態では、上記第１溶液、第２溶液、及び第３溶液は、緩衝物質（例えば、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等）、塩（例えば、塩化ナトリウム等）、血清又は血清成分（例えば、ウシ血清アルブミン等）、及び防腐剤（例えば、Ｐｒｏｃｌｉｎ（５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン））等の好適な追加成分を、好適な濃度で、更に含有してもよい。

本発明は、白血球の細胞内標的及び細胞外標的の改善された標識方法、並びに前記方法を行うための各キットを有利に提供する。詳細には、溶液を添加するそれぞれの工程に関して、適切な試薬組成物及び希釈率を選定することにより、時間と手間のかかる遠心分離工程を全て省略することを可能にする。これにより、手順が著しく高速化され、加えて、細胞の構造が守られ、その結果、遠心分離された細胞と比較して、例えば光散乱特性等が改善される。更に、穏やかな固定化工程により、白血球の表面構造がそのまま維持され、かつ、残存する固定剤は透過化の間は不活性であるため、固定化後であっても細胞を細胞外結合因子を用いて染色可能である。したがって、本発明の方法により、細胞外結合因子と細胞内結合因子との各混合物を含むカクテルの使用が可能となる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
白血球の細胞内標的及び細胞外標的の標識方法であって、
（ａ）
（ｉ）少なくとも白血球と赤血球とを含む細胞組成物と、
（ｉｉ）前記白血球の細胞内のタンパク質、リポタンパク質及び核酸を架橋可能な１つ以上の薬剤を含む第１溶液と、の組合せ物を形成する工程と、
（ｂ）前記組合せ物に、前記白血球の透過化、前記赤血球の溶解、及び前記第１溶液中の前記１つ以上の薬剤の架橋活性の中和が可能な１つ以上の薬剤を含む第２溶液を添加する工程であって、
前記第２溶液は、
（ｉ）０．０５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の量の界面活性剤と、
（ｉｉ）濃度１〜１００ｍＭの第四級アンモニウム塩又はアミンを含有する化合物と、を含み、
前記第２溶液のｐＨは６．５以下であり、
前記第２溶液の添加体積は前記組合せ物の総体積の１〜１０倍である工程と、
（ｃ）前記第２溶液の添加と同時に又は前記第２溶液の添加に続いて、白血球の細胞外標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合因子、及び白血球の細胞内標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合因子を添加する工程であって、
前記結合因子のそれぞれは検出可能因子を含む工程と、
（ｄ）前記組合せ物に第３溶液を添加する工程であって、前記第３溶液の添加体積は、前記第３溶液が添加される前記組合せ物の総体積以上である工程と、を含む、方法。
（項目２）
前記細胞組成物は、全血、骨髄、及び腹水からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
工程（ａ）で得られた組合せ物を工程（ｂ）に先立って５〜２０分インキュベートする、項目１又は項目２に記載の方法。
（項目４）
工程（ｃ）で得られた組合せ物を工程（ｄ）に先立って１５〜６０分インキュベートする、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記第１溶液の添加後、工程（ａ）の前記１つ以上の薬剤が、前記組合せ物中に０．５％〜２％（ｖ／ｖ）の量で含有される、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
工程（ａ）の１つ以上の薬剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記第２溶液は、
（ｉ）前記細胞組成物中に含有される白血球の大部分が溶解されないままで、前記細胞組成物中に含有される実質的に全ての赤血球の溶解をもたらすのに適合した量の界面活性剤と、
（ｉｉ）工程（ａ）の前記１つ以上の薬剤を中和する中和剤と、を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
工程（ｂ）において、前記第２溶液の添加体積は前記組合せ物の総体積の４〜８倍である、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
工程（ｄ）に先立って遠心分離工程が行われない、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
工程（ｂ）の後にも工程（ｃ）の後にも、遠心分離工程を行わない、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法を行うためのキットであって、
（ａ）ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される化合物を含む第１溶液と、
（ｂ）
（ｉ）第四級アンモニウム塩又はアミンを含有する化合物と、
（ｉｉ）界面活性剤と、を含む第２溶液と、
（ｃ）
（ｉ）ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される化合物と、
（ｉｉ）界面活性剤と、を含む第３溶液と、を含む、キット。
（項目１２）
（ａ）前記第１溶液は濃度５％〜１５％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドを含み、
（ｂ）前記第２溶液は、
（ｉ）濃度１〜１００ｍＭの塩化アンモニウム（ＮＨ _４ Ｃｌ）と、
（ｉｉ）濃度０．０５％〜０．５％（ｗ／ｖ）のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムと、を含み、
（ｃ）前記第３溶液は、
（ｉ）濃度０．０１％〜１％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドと、
（ｉｉ）濃度０．０１％〜０．５％（ｗ／ｖ）のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムと、を含む、項目１１に記載のキット。
（項目１３）
前記キットは、
（ａ）フローサイトメトリーによって検出可能な標識を含む少なくとも１つの結合因子であって、前記結合因子は白血球の細胞外標的に特異的に結合する、結合因子と、
（ｂ）フローサイトメトリーによって検出可能な標識を含む少なくとも１つの結合因子であって、前記結合因子は白血球の細胞内標的に特異的に結合する、結合因子と、を更に含み、
前記細胞外結合因子及び前記細胞内結合因子は別々の管で提供されるか、又は、前記第２溶液の成分として提供される、項目１１又は項目１２に記載のキット。

当該技術分野において既知である方法（「Ｉｎｔｒａｐｒｅｐ」及び「ＶｅｒｓａＬｙｓｅ／Ｆｉｘ」）、及び本発明の方法（「ＩＮＣＡ」）を行うために必要な時間と作業の量を示す、作業量の比較。それぞれの帯は５分間の時間を表し、薄い灰色の帯はインキュベーション時間、暗い灰色の帯は作業時間を示す。 当該技術分野において既知である方法（「Ｉｎｔｒａｐｒｅｐ」）、及び付加的な洗浄工程を伴う又は伴わない本発明の方法（「ＩＮＣＡ（洗浄あり）」及び「ＩＮＣＡ（洗浄なし）」）による、ＰＥ標識抗ＺＡＰ−７０抗体を用いた、正常なヒト全血の染色。ドットプロットは、側方散乱に対する抗体（ＦＬ２）による細胞内染色を示す。 当該技術分野において既知である方法（「Ｉｎｔｒａｐｒｅｐ」）、及び付加的な洗浄工程を伴う又は伴わない本発明の方法（「ＩＮＣＡ（洗浄あり）」及び「ＩＮＣＡ（洗浄なし）」）による、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体及びＡｌｅｘａ６４７標識抗ＦｏｘＰ３抗体を用いた、正常なヒトの全血の染色。ドットプロットは、抗ＦｏｘＰ３抗体（ＦＬ４）による細胞内の染色に対する、抗ＣＤ４抗体（ＦＬ１）による表面の染色を示す。

次に、本発明を、限定する意図なく、次の実施例によって更に説明する。

（実施例１）：
ＰＥ標識抗ＺＡＰ−７０抗体を用いた、正常なヒトの全血の染色
当該技術分野において既知である方法（「Ｉｎｔｒａｐｒｅｐ」）、及び、付加的な洗浄工程を伴う又は伴わない本発明の方法（「ＩＮＣＡ（洗浄あり）」及び「ＩＮＣＡ（洗浄なし）」）により、ＰＥ標識抗ＺＡＰ−７０抗体を用いて、正常なヒトの全血を染色し、続いてフローサイトメトリーにより分析した。溶液１、２、及び３並びに用いた方法は、実施例４に一致する。図２は、側方散乱に対する抗体（ＦＬ２）を用いたそれぞれの染色を示す。本発明に係る方法では、先行技術の方法と比較して等しい量の細胞が染色され、ＲＭＦＩ（相対平均蛍光強度（信号対雑音比に対する尺度））は３０（ＩＮＣＡ（洗浄あり））及び１５（ＩＮＣＡ（洗浄なし））で、染色されていない細胞からより明確な分離を示した。

（実施例２）：
ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体及びＡｌｅｘａ６４７標識抗ＦｏｘＰ３抗体を用いた、正常なヒトの全血の染色
当該技術分野において既知である方法（「Ｉｎｔｒａｐｒｅｐ」）、及び、付加的な洗浄工程を伴う又は伴わない本発明の方法（「ＩＮＣＡ（洗浄あり）」及び「ＩＮＣＡ（洗浄なし）」）により、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体及びＡｌｅｘａ６４７標識抗ＦｏｘＰ３抗体を用いて、正常なヒトの全血を染色し、続いてフローサイトメトリーにより分析した。図３は、抗ＦｏｘＰ３抗体（ＦＬ４）による細胞内の染色に対する、抗ＣＤ４抗体（ＦＬ１）によるそれぞれの染色を示す。当該技術分野において既知である方法では、細胞の０．３６％というわずかな集団が染色されただけだったが、付加的な洗浄工程を含む本発明の方法では、４．３％という実質的な集団が染色された。

（実施例３）：
様々な細胞内抗体を用いた、正常なヒトの全血の染色
上述したように、当該技術分野において既知である方法（「Ｉｎｔｒａｐｒｅｐ」）、及び、付加的な洗浄工程を伴う又は伴わない本発明の方法（「ＩＮＣＡ（洗浄あり）」及び「ＩＮＣＡ（洗浄なし）」）により、様々な細胞内抗体を用いて、正常なヒトの全血を染色した。それぞれの染色の結果を下の表１に示す。

結果からは、本発明の方法が、先行技術の方法と比べて、少なくとも同等の染色をもたらし、多くの場合ではより優れた染色をもたらすことが示されている。

（実施例４）：
洗浄工程なしでの、ヒトの全血の染色
次のヒトの全血試料を、Ｋｒｏｍｅ Ｏｒａｎｇｅ標識抗ＣＤ４５抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ５抗体、ＡＰＣ標識抗ＣＤ１９抗体、又はＰＥ標識抗ＺＡＰ−７０抗体で染色した。抗ＣＤ１９抗体が細胞外エピトープに対するものである一方で、抗ＺＡＰ−７０抗体は細胞内エピトープに対するものである。

次の溶液が調製され、本実施例で使用された。

本発明を使用して、細胞内エピトープ及び細胞外エピトープが染色できるのかどうかをわかるようにするため、ヒトの全血試料（ＷＢＳ）を次の手法で処理した。

まず、５０μＬのＷＢＳを５μＬの溶液１と組合せて、１５分間インキュベートした。その後、それぞれ１０μＬの既に示した標識済み抗体と共に、３００μＬの溶液２を添加した。４０分のインキュベーションの後、３０００μＬの溶液３を添加し、その混合物をボルテックスした。

上記混合物の分析を、フローサイトメーター装置を使用して行った。細胞内及び細胞外の両方のエピトープの染色に成功したことが示された。上で概説した洗浄工程を有する方法と、上で概説した洗浄工程を有さない方法との比較からは、違いを見出すことはできなかった。両方の方法で十分な染色が示された。

（実施例４ａ）：
実施例４の変形例
本発明の方法が、多くの条件下で問題なく使用できる、確実性のある方法かどうかを明らかにするため、実施例４で開示した溶液１、２、及び３のいくつかの変形例について試験を行った。

それぞれの場合において、５０μＬのＷＢＳを５μＬの溶液１（Ｒ１）と組合せて、１５分間インキュベートした。その後、それぞれ１０μＬの既に示した標識済み抗体と共に、３００μＬの溶液２（Ｒ２）を添加した。３０分インキュベーションした後、３０００μＬの溶液３（Ｒ３）を添加し、その混合物をボルテックスした。

下の表２に示されているように、溶液１の量を変化させた、又は溶液２の成分の濃度を変化させた、かつ／又は、溶液３の成分の濃度を変化させた、設定を選定した。様々な設定において、いくつかの試薬の濃度を、基準試料から＋２０％又は−２０％だけ変化させた。基準例は表２及び表３の実験番号１である。

次の表では、溶液１をＲ１と呼び、溶液２をＲ２と呼び、溶液３をＲ３と呼ぶ。

上の実験設定で、基準実験番号１と比較したときの、細胞内エピトープ及び細胞外エピトープの検出における信号対雑音比の偏差に関する試験を行った。

次の表３は、３つの細胞内標的及び２つの細胞外標的に関する信号対雑音値を示す。使用された結合体は、抗ＭＰＯ−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ７９ａ−ＰＥ、抗ＣＤ３−ＥＣＤ（ＩＯＴｅｓｔ３カクテルＰＮ ＩＭ３４６４Ｕ）、及び抗ＣＤ１４−ＰＣ７（ＰＮ Ａ２２３３１）であった。

理解できるように、表２で概説した実験的変形例の全てにおいて、信号対雑音比に関し、等しく良好に機能した。したがって、本発明は、細胞内エピトープ及び細胞外エピトープの検出のための、確実性のあるシステム及び方法を提供し、このシステム及び方法は、様々な濃度の緩衝成分を含む、非常に様々な緩衝剤組成物にわたって良好に機能する。

（実施例５）：
付加的な洗浄工程の影響
付加的な洗浄工程が、上で得られた結果に対して何らかの悪影響を与えているかどうかを明らかにするため、更なる洗浄工程を追加した場合において、実施例４の条件を変化させた。

詳細には、上の実施例４で概説した溶液１、２、及び３を調製し、標識済み抗体を用いたヒトの全血試料（ＷＢＳ）を染色するために、次の方法を行った。

まず、５０μＬのＷＢＳを５μＬの溶液１と組合せて、１５分間インキュベートした。その後、それぞれ１０μＬの既に示した標識済み抗体と共に、３００μＬの溶液２を添加した。４０分のインキュベーションの後、３０００μＬの溶液３を添加し、その混合物をボルテックスした。最後に、上に加えて、細胞懸濁液を遠心分離し（５００ｇ、５分）、上澄みを捨て、細胞のペレットを５００μＬの溶液３に再懸濁した。

上記方法を使用して得られた結果と、実施例４で得られた結果とに違いはなかった。それ故、付加的な洗浄工程は、得られた結果に対して、本質的な影響を何ら与えていない。これにより、本発明に係るシステム及び方法に、様々なパラメータにわたる確実性があることが、再度示される。

（実施例６）：
ｐＨの変化の影響
本発明に係るシステム及び方法の成果で使用された溶液のｐＨ値の違いの影響を示すために、溶液２のｐＨを変化させた、ある実験的な設定を選定した。

この実験的な設定に関しては、実施例４ａの表２で与えられる基準実験番号１に対する概説のように、溶液１、２、及び３の変形例を使用して、実施例４で概説したような、ヒトの全血試料の染色方法を行った。詳細には、信号対雑音比が溶液２のｐＨの変化により劇的に影響を受けるかどうかに関して判定した。ＰＥ標識抗ＺＡＰ−７０抗体を使用することによって、ヒトの全血試料の染色を行った。

下の表４から理解できるように、溶液２のｐＨをｐＨ ６．００からｐＨ ６．９１に変化させたときに、信号対雑音比は著しくは異ならなかった。

Claims (14)

1. 白血球の細胞内標的及び細胞外標的を標識するインビトロの方法であって、
   （ａ）
   （ｉ）少なくとも白血球と赤血球とを含む細胞組成物と、
   （ｉｉ）前記白血球の細胞内のタンパク質、リポタンパク質及び核酸を架橋可能な１つ以上の薬剤を含む第１溶液と、の組合せ物を形成する工程と、
   （ｂ）前記組合せ物に、前記白血球の透過化、前記赤血球の溶解、及び前記第１溶液中の前記１つ以上の薬剤の架橋活性の中和が可能な１つ以上の薬剤を含む第２溶液を添加する工程であって、
   前記第２溶液は、
   （ｉ）０．０５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の量の界面活性剤と、
   （ｉｉ）濃度１〜１００ｍＭの第四級アンモニウム塩又はアミンを含有する化合物と、を含み、
   前記第２溶液のｐＨは６．５以下であり、
   前記第２溶液の添加体積は前記組合せ物の総体積の１〜１０倍である工程と、
   （ｃ）前記第２溶液の添加と同時に又は前記第２溶液の添加に続いて、前記白血球の細胞外標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合因子、及び前記白血球の細胞内標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合因子を添加する工程であって、
   前記結合因子のそれぞれは検出可能因子を含む工程と、
   （ｄ）前記組合せ物に、固定剤と界面活性剤とを含む第３溶液を添加する工程であって、前記第３溶液の添加体積は、前記第３溶液が添加される前記組合せ物の総体積以上である工程と、を含む、方法。
2. 前記細胞組成物は、全血、骨髄、及び腹水からなる群から選択される、請求項１に記載のインビトロの方法。
3. 工程（ａ）で得られた組合せ物を工程（ｂ）に先立って５〜２０分インキュベートする、請求項１又は請求項２に記載のインビトロの方法。
4. 工程（ｃ）で得られた組合せ物を工程（ｄ）に先立って１５〜６０分インキュベートする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
5. 前記第１溶液の添加後、工程（ａ）の前記１つ以上の薬剤が、前記組合せ物中に０．５％〜２％（ｖ／ｖ）の量で含有される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
6. 工程（ａ）の１つ以上の薬剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
7. 前記第２溶液は、前記細胞組成物中に含有される白血球の大部分が溶解されないままで、前記細胞組成物中に含有される実質的に全ての赤血球を溶解し、工程（ａ）の前記第１溶液中の前記１つ以上の薬剤の前記架橋活性を中和する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
8. 工程（ｂ）において、前記第２溶液の添加体積は前記組合せ物の総体積の４〜８倍である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
9. 工程（ｄ）に先立って遠心分離工程が行われない、請求項１〜８のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
10. 工程（ｂ）の後にも工程（ｃ）の後にも、遠心分離工程を行わない、請求項１〜９のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を行うためのキットであって、
    （ａ）ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される化合物を含む第１溶液と、
    （ｂ）
    （ｉ）第四級アンモニウム塩又はアミンを含有する化合物と、
    （ｉｉ）界面活性剤と、を含む第２溶液と、
    （ｃ）
    （ｉ）ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される化合物と、
    （ｉｉ）界面活性剤と、を含む第３溶液と、を含む、キット。
12. （ａ）前記第１溶液は濃度５％〜１５％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドを含み、
    （ｂ）前記第２溶液は、
    （ｉ）濃度１〜１００ｍＭの塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）と、
    （ｉｉ）濃度０．０５％〜０．５％（ｗ／ｖ）のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムと、を含み、
    （ｃ）前記第３溶液は、
    （ｉ）濃度０．０１％〜１％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドと、
    （ｉｉ）濃度０．０１％〜０．５％（ｗ／ｖ）のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムと、を含む、請求項１１に記載のキット。
13. 前記キットは、
    （ａ）フローサイトメトリーによって検出可能な標識を含む少なくとも１つの細胞外結合因子であって、前記結合因子は白血球の細胞外標的に特異的に結合する、細胞外結合因子と、
    （ｂ）フローサイトメトリーによって検出可能な標識を含む少なくとも１つの細胞内結合因子であって、前記結合因子は白血球の細胞内標的に特異的に結合する、細胞内結合因子と、を更に含み、
    前記細胞外結合因子及び前記細胞内結合因子は別々の管で提供されるか、又は、前記第２溶液の成分として提供される、請求項１１又は請求項１２に記載のキット。
14. アミンを含有する前記化合物は、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はエタノールアミンを含む、請求項１１に記載のキット。