KR20140100536A - 백혈구의 세포내 및 세포외 표적의 표지 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 백혈구의 세포내 및 세포외 표적의 표지 방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 백혈구의 세포내 및 세포외 표적을 표지하기 위한 방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
결합제, 예를 들어, 모노클로널 항체(mAb)를 사용한 백혈구의 염색은 기초 연구 및 다양한 진단 응용 둘 모두에서 통상적으로 수행되는 중요한 작업이다. 때때로, 백혈구의 세포외 및 세포내 마커는 예를 들어, 특이적 세포외 표면 마커에 의해 특정 서브셋(subset)의 백혈구를 확인하고, 세포질에 존재하는 특이적 분자에 의해 세포의 기능적 특징을 확인하기 위하여 염색되어야 한다.
예를 들어, mAb를 사용하여 백혈구를 세포내 염색하고, 이들을 유세포분석(flow cytometry)에 의해 분석가능하게 만들기 위하여, 시료에 존재하는 백혈구를 투과화(permeabilizing)시키고 적혈구를 용해시키면서, 결합제가 결합되어야 하는 세포 표면 및 세포 내부 둘 모두에서 백혈구의 구조의 고유 상태를 유지시키는 것이 필요하다. 이러한 목적은 흔히 세제 및/또는 알코올의 사용에 의해 달성된다. 예를 들어, 포름알데히드 또는 알코올을 사용한 고정 단계 후에, 적혈구는 백혈구보다 세제에 대한 저항성이 더 낮아서, 적혈구의 용해와 투과화된 백혈구의 분석을 가능하게 한다.
백혈구의 세포외 및 세포내 염색을 위한 많은 방법은 동일한 원리에 기초한다. 특히, 세포의 표면 마커를 먼저 염색하고, 이어서, 1회 이상의 세척 단계(들)(즉, 세포를 원심분리하고, 상청액을 폐기한 다음, 이들을 신선한 완충제에 재현탁화시킴)를 행하여, 임의의 미결합 결합제를 제거한다. 그 다음, 세포를 고정시키고, 이어서 다시 1회 이상의 세척 단계를 행하여, 고정제를 제거하고, 투과화시키고, 다시 세척한 다음, 세포내 결합제로 염색하고, 최종적으로 다시 세척한다.
그러나, 이들 절차는 총 최대 2 내지 3시간의 기간으로, 시간이 많이 걸릴 뿐 아니라, 상당히 노동 집약적이다. 게다가, 적어도 2회의 의무적인 원심분리 단계가 존재하여, 절차의 자동화를 거의 불가능하게 만든다. 더욱이, 원심분리는 세포의 구조에 유해할 수 있으며, 이에 따라, 원심분리되지 않은 세포에 비하여 세포의 광산란 신호가 악화된다. 더욱이, 원심분리는 항상 세포의 소실 및 세포 응집을 야기한다. 마지막으로, 세포외 및 세포내 결합제가 따로 사용되고 적용되어야 하며, 이는 편리하게 결합제 칵테일을 사용하지 못하게 한다.
이에 따라, 본 발명의 근본적인 기술적 문제는 신속하고, 그다지 노동 집약적이지 않으며, 어떠한 원심분리 단계도 피하고, 결합제 칵테일의 사용을 가능하게 하며, 용이하게 자동화될 수 있는, 백혈구의 세포내 및 세포외 표적을 표지하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 문제에 대한 해결은 특허청구범위에서 특성화된 실시형태에 의해 달성된다.
특히, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 백혈구의 세포내 및 세포외 표적의 표지 방법에 관한 것이다:
(a) (i) 적어도 백혈구 및 적혈구를 포함하는 세포 조성물, 및
(ii) 상기 백혈구의 세포내 단백질, 지단백질 및 핵산을 교차결합시킬 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 포함하는 제1 용액의 조합물을 형성하는 단계;
(b) 상기 백혈구를 투과화시키고, 상기 적혈구를 용해시키며, 상기 제1 용액 중의 상기 하나 이상의 제제(들)의 교차결합 활성을 중화시킬 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 포함하는 제2 용액을 상기 조합물에 첨가하는 단계로서,
첨가되는 상기 제2 용액의 부피가 상기 조합물의 총 부피의 1 내지 10배인 것을 특징으로 하는 단계;
(c) 상기 제2 용액의 첨가와 동시에 또는 그 이후에, 백혈구의 세포외 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합제 및 백혈구의 세포내 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합제를 첨가하는 단계로서,
각각의 상기 결합제가 검출가능한 제제를 포함하는 단계; 및
(d) 제3 용액을 상기 조합물에 첨가하는 단계로서, 첨가되는 상기 제3 용액의 부피가 제3 용액이 첨가되는 상기 조합물의 총 부피와 같거나 그보다 더 큰 단계.
일부 예에서, 본 발명의 방법은 본 명세서에서 INCA 방법(원심분리기 미사용 세포내 검정(Intracellular No Centrifuge Assay))으로 지칭된다.
일 실시형태에서, 염색될 백혈구를 포함하는 세포 조성물은 현탁액 중에 세포를 포함하는 생물학적 유체이다. 다른 실시형태에서, 세포 조성물은 전혈, 골수, 복막액, 두부 유체(cephalic fluid), 해리 림프절 및 다른 해리 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 실시형태에서, 세포 조성물은 전혈이다.
일 실시형태에 따르면, 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 수득된 조합물을 단계 (b) 전에 5 내지 20분 동안, 다른 실시형태에서는 10 내지 15분 동안 인큐베이션시킨다. 일 실시형태에 따르면, 단계 (a)에서 사용되는 백혈구의 세포내 단백질, 지단백질 및 핵산을 교차결합시킬 수 있는 하나 이상의 제제(들)는 포름알데히드, 파라포름알데히드 및 글루타르알데히드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 상기 제제(들)는 제1 용액의 첨가 후에, 상기 조합물에 0.5% 내지 2%(v/v)의 양으로 포함되고, 상기 제1 용액에 5% 내지 15%(v/v)의 양으로 포함된다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법의 단계 (a)가 세포 조성물에 포함된 세포를 고정시키기 위해 수행되는 것을 주목해야 한다.
일 실시형태에서, 상기 백혈구를 투과화시키고, 상기 적혈구를 용해시키고, 상기 제1 용액 중의 상기 하나 이상의 제제(들)의 교차결합 활성을 중화시킬 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 포함하는, 본 발명의 방법의 단계 (b)에서 첨가되는 제2 용액은 (i) 세포 조성물에 포함된 실질적으로 모든 적혈구의 용해를 달성하면서, 세포 조성물에 포함된 대부분의 백혈구가 용해되지 않도록 조정된 양의 세제, 및 (ii) 단계 (a)의 상기 제제(들)를 중화시키기 위한 중화제를 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 상기 세제는 C12-형 알칸 잔기를 포함하며, 다른 실시형태에 따르면, 나트륨 N-라우로일 사르코신을 포함하고, 세제는 일 실시형태에 따르면, 상기 제2 용액에 0.05% 내지 0.5%(w/v)의 양으로 포함되고, 다른 실시형태에 따르면, 0.1% 내지 0.3%(w/v)의 양으로 포함된다. 게다가, 일 실시형태에 따르면, 상기 중화제는 4차 암모늄 염 또는 아민 함유 화합물이고, 다른 실시형태에 따르면, 염화암모늄(NH4Cl), 글리신, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris) 및 에탄올아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이고, 추가의 실시형태에서는 이는 염화암모늄이다. 일 실시형태에서, 상기 중화제는 상기 제2 용액에 1 내지 100 mM의 농도로 포함되고, 다른 실시형태에서는 5 내지 20 mM의 농도로 포함된다. 일 실시형태에서, 상기 제2 용액은 pH가 6.5 이하이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 (b)에서 첨가되는 상기 제2 용액의 첨가 부피는 단계 (a)에서 수득되는 조합물의 총 부피의 1 내지 10배, 다른 실시형태에서는 4 내지 8배, 추가의 실시형태에서는 6배이다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법의 단계 (b)가 백혈구를 투과화시키고, 세포 조성물에 포함되는 적혈구를 용해시키기 위해, 그리고, 단계 (a)에서 첨가되는 상기 제1 용액 중의 상기 하나 이상의 제제(들)의 교차결합 활성을 중화시키기 위해 수행되는 것을 주목해야 한다.
본 발명의 방법의 단계 (c)는 단계 (b)와 동시에 수행될 수 있다. 특히, 단계 (c)에서 첨가되는 결합제는 단계 (b)에 첨가되는 제2 용액 중에 이미 포함되어 있을 수 있다. 대안적으로, 상기 결합제는 상기 제2 용액의 첨가 이후에 첨가될 수 있으며, 세포외 및 세포내 결합제는 결합제 칵테일로서 함께, 또는 따로 첨가될 수 있다. 일 실시형태에서, 결합제는 분자 염색제(molecular stain)이며, 다른 실시형태에서는 항체이고, 추가의 실시형태에서는 모노클로널 항체이다. 추가로, 상기 결합제에 포함되는 검출가능한 제제는 특히 제한되지 않으며, 적절한 검출가능한 제제는 당업계에 공지되어 있다. 일 실시형태에 따르면, 상기 검출가능한 제제는 비오틴, 효소 및 형광 모이어티(moiety) 또는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되며, 다른 실시형태에 따르면, 이는 형광 모이어티 또는 화합물이다. 일 실시형태에서, 단계 (c)에서 수득된 조합물을 단계 (d) 이전에, 15 내지 60분 동안 인큐베이션시키고, 다른 실시형태에서는 30 내지 45분 동안 인큐베이션시킨다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법의 단계 (c)가 세포 조성물 중에 포함된 백혈구를 염색시키기 위해 수행되는 것을 주목해야 한다.
일 실시형태에 따르면, 본 발명의 방법의 단계 (d)에서, 상기 조합물, 즉, 단계 (c)에서 수득된 조합물에 첨가되는 제3 용액은 (i) 일 실시형태에서, 포름알데히드, 파라포름알데히드 및 글루타르알데히드로 이루어진 군으로부터 선택되는 고정제, 및 (ii) 일 실시형태에 따르면, C12-형 알칸 잔기를 포함하고, 다른 실시형태에 따르면, 나트륨 N-라우로일 사르코신을 포함하는 세제를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 고정제는 제3 용액에 0.01% 내지 1%(v/v)의 양으로 포함되며, 상기 세제는 0.01% 내지 0.5%(w/v)의 양으로 포함된다. 다른 실시형태에서, 제3 용액은 선형 화학식 (C3H6O.C2H4O)x를 갖는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머인 플루로닉(Pluronic) F-68 및 덱스트란 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 추가로 포함한다. 일 실시형태에 따르면, 상기 추가의 화합물은 제3 용액에 0.1%(w/v)의 양으로 포함된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 예를 들어, 단계 (d) 전에, 또는 단계 (b) 또는 단계 (c) 후에, 상기 백혈구를 정제하기 위한 어떠한 원심분리 단계도 포함하지 않거나, 어떠한 추가의 세척 단계도 포함하지 않는다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 단계 (d) 후에 1회의 세척 단계, 즉, 세포를 원심분리하고, 상청액을 폐기하고, 적절한 부피의, 단계 (d)에서 사용된 제3 용액에 세포를 재현탁화시키는 단계를 포함한다. 이러한 세척 단계는 흐릿한(rather dim) 염색을 작업 대상으로 하는 경우 특히 유용하게 신호 대 잡음 비를 개선시킬 수 있고, 추가로 세포를 농축시킨다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 따라, 유세포분석에 의해, 백혈구 상의 결합된 결합제를 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법의 모든 방법 단계는 실온에서 수행한다.
심지어 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 자동화 방법이다.
다른 태양에서, 본 발명은 제1 용액, 제2 용액 및 제3 용액을 포함하는, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이며, 여기서, 상기 제1, 제2 및 제3 용액은 상기 정의된 바와 같다.
특정 일 실시형태에서, 본 발명의 키트는
(a) 5% 내지 15%(v/v)의 농도의 포름알데히드를 포함하는 제1 용액;
(b) (i) 1 내지 100 mM 농도의 염화암모늄(NH4Cl), 및
(ii) 0.05% 내지 0.5%(w/v) 농도의 나트륨 N-라우로일 사르코신을 포함하는 제2 용액; 및
(c) (i) 0.01% 내지 1%(v/v) 농도의 포름알데히드, 및
(ii) 0.01% 내지 0.5%(w/v) 농도의 나트륨 N-라우로일 사르코신을 포함하는 제3 용액을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 키트는
(a) 유세포분석에 의해 검출가능한 표지를 포함하는 적어도 하나의 결합제로서, 상기 결합제가 백혈구의 세포외 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합제; 및
(b) 유세포분석에 의해 검출가능한 표지를 포함하는 적어도 하나의 결합제로서, 상기 결합제가 백혈구의 세포내 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합제를 추가로 포함하며;
상기 세포외 및 세포내 결합제는 개별 튜브 내에 또는 상기 제2 용액의 성분으로서 제공되며,
결합제 및 각각의 검출가능한 표지는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 방법 및 키트의 특정 실시형태에서, 상기 제1, 제2 및 제3 용액은 적절한 농도의 적절한 추가의 성분, 예를 들어, 완충제 물질, 예를 들어, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 또는 인산염-완충 염수(PBS); 염, 예를 들어, 염화나트륨; 혈청 또는 혈청 성분, 예를 들어, 소 혈청 알부민; 및 보존제, 예를 들어, 프로클린(Proclin)(5-클로로-2-메틸-4-아이소티아졸린-3-온)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 유리하게는 백혈구의 세포내 및 세포외 표적을 표지하는 개선된 방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 각각의 키트를 제공한다. 특히, 각각의 용액 첨가 단계에 관한 적절한 시약 조성 및 희석률을 선택함으로써, 시간과 노동이 소모되는 모든 원심분리 단계가 생략될 수 있다. 이는 절차의 속도를 상당히 높이고, 또한 세포의 구조를 보호하여, 예를 들어, 광산란 특성이 원심분리된 세포에 비하여 개선되게 한다. 더욱이, 약한 고정 단계는 백혈구의 표면 구조를 온전하게 유지시키고, 남아 있는 고정제는 투과화 동안 불활성화되어, 세포가 심지어 고정 후에도 세포외 결합제로 염색될 수 있게 한다. 따라서, 본 발명의 방법은 세포외 및 세포내 결합제의 각각의 혼합물을 포함하는 칵테일의 사용을 가능하게 한다.
도면은 다음을 보여준다:
도 1:
본 발명이 속한 분야에 공지되어 있는 방법("Intraprep" 및 "VersaLyse/Fix") 및 본 발명의 방법("INCA")을 수행하기 위해 필요한 시간과 작업의 양을 보여주는 작업량(workload) 비교. 각각의 막대는 5분의 시간을 나타내며; 연회색 막대는 인큐베이션 시간을 보여주고, 진회색 막대는 작업 시간을 보여준다.
도 2:
본 발명이 속한 분야에 공지되어 있는 방법("Intraprep") 및 추가의 세척 단계가 있거나 없는 본 발명의 방법("INCA 세척" 및 "INCA 세척 부재")에 의한, 정상 인간 전혈의 PE-표지 항-ZAP-70 항체로의 염색. 점도표는 항체(FL2)로의 세포내 염색 대 측방 산란을 보여준다.
도 3:
본 발명이 속한 분야에 공지되어 있는 방법("Intraprep") 및 추가의 세척 단계가 있거나 없는 본 발명의 방법("INCA 세척" 및 "INCA 세척 부재")에 의한 정상 인간 전혈의 FITC-표지 항-CD4 항체 및 Alexa647-표지 항-FoxP3 항체로의 염색. 점도표는 항-CD4 항체(FL1)로의 표면 염색 대 항-FoxP3 항체(FL4)로의 세포내 염색을 보여준다.
도 1:
본 발명이 속한 분야에 공지되어 있는 방법("Intraprep" 및 "VersaLyse/Fix") 및 본 발명의 방법("INCA")을 수행하기 위해 필요한 시간과 작업의 양을 보여주는 작업량(workload) 비교. 각각의 막대는 5분의 시간을 나타내며; 연회색 막대는 인큐베이션 시간을 보여주고, 진회색 막대는 작업 시간을 보여준다.
도 2:
본 발명이 속한 분야에 공지되어 있는 방법("Intraprep") 및 추가의 세척 단계가 있거나 없는 본 발명의 방법("INCA 세척" 및 "INCA 세척 부재")에 의한, 정상 인간 전혈의 PE-표지 항-ZAP-70 항체로의 염색. 점도표는 항체(FL2)로의 세포내 염색 대 측방 산란을 보여준다.
도 3:
본 발명이 속한 분야에 공지되어 있는 방법("Intraprep") 및 추가의 세척 단계가 있거나 없는 본 발명의 방법("INCA 세척" 및 "INCA 세척 부재")에 의한 정상 인간 전혈의 FITC-표지 항-CD4 항체 및 Alexa647-표지 항-FoxP3 항체로의 염색. 점도표는 항-CD4 항체(FL1)로의 표면 염색 대 항-FoxP3 항체(FL4)로의 세포내 염색을 보여준다.
본 발명은 이제 하기의 실시예에서 추가로 예시되지만, 이에 제한되지 않을 것이다.
실시예
실시예 1:
정상 인간 전혈의 PE-표지 항-ZAP-70 항체로의 염색
정상 인간 전혈을 본 발명이 속한 분야에 공지되어 있는 방법("Intraprep") 및 추가의 세척 단계가 있거나 없는 본 발명의 방법("INCA 세척" 및 "INCA 세척 부재")에 의해 PE-표지 항-ZAP-70 항체로 염색한 다음, 유세포분석에 의해 분석하였다. 용액 1, 2 및 3, 및 사용된 방법은 실시예 4에 상응한다. 도 2는 항체(FL2)로의 각각의 염색 대 측방 산란을 보여준다. 본 발명에 따른 방법은 종래 기술의 방법과 비교하여 같은 양의 세포를 염색하였으며, 염색되지 않은 세포로부터의 보다 명백한 분리를 보였으며, RMFI(신호 대 잡음 비에 대한 척도인 상대 평균 형광 세기)는 30(INCA 세척) 및 15(INCA 세척 부재)였다.
실시예 2:
정상 인간 전혈의 FITC-표지 항-CD4 항체 및 Alexa647-표지 항-FoxP3 항체로의 염색
정상 인간 전혈을 본 발명이 속한 분야에 공지되어 있는 방법("Intraprep") 및 추가의 세척 단계가 있거나 없는 본 발명의 방법("INCA 세척" 및 "INCA 세척 부재")에 의해 FITC-표지 항-CD4 항체 및 Alexa647-표지 항-FoxP3 항체로 염색한 다음, 유세포분석에 의해 분석하였다. 도 3은 항-CD4 항체(FL1)로의 각각의 염색 대 항-FoxP3 항체(FL4)로의 세포내 염색을 보여준다. 본 발명이 속한 분야에 공지되어 있는 방법은 세포 중 0.36%의 적은 집단만을 염색시킨 한편, 추가의 세척 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 4.3%의 상당한 집단을 염색시켰다.
실시예 3:
정상 인간 전혈의 다양한 세포내 항체로의 염색
정상 인간 전혈을 상기 기재된 바와 같이, 본 발명이 속한 분야에 공지되어 있는 방법("Intraprep") 및 추가의 세척 단계가 있거나 없는 본 발명의 방법("INCA 세척" 및 "INCA 세척 부재")에 의해 다양한 세포내 항체로 염색하였다. 각각의 염색의 결과는 하기 표 1에 나타나 있다.
결과는 본 발명의 방법이 종래 기술의 방법과 적어도 유사하고, 많은 경우에 뛰어난 염색을 제공하는 것을 보여준다.
실시예 4:
세척 단계 없이 인간 전혈의 염색
하기에서, 인간 전혈 시료를 크로메 오렌지(Krome Orange)-표지 항-CD45 항체, FITC-표지 항-CD5 항체, APC-표지 항-CD19 항체 또는 PE-표지 항-ZAP-70 항체로 염색하였다. 항-CD19 항체는 세포외 에피토프에 대해 유도되는 한편, 항-ZAP-70 항체는 세포내 에피토프에 대해 유도된다.
하기의 용액을 제조하고, 이러한 실시예에서 사용하였다:
용액 1: 포름알데히드 5.5% wt/vol
Na2HPO4 3mM
NaH2PO4 3mM
NaCl 47mM
pH 6.8
용액 2: NaCl 140mM
NH4Cl 10mM
MES 20mM
NaLS 0.15%
BSA 0.5%
프로클린 300 0.05%
pH 6.3
용액 3: Na2HPO4 11mM
NaH2PO4 29mM
NaCl 260mM
NaLS 0.05%
플루로닉 F68 0.1%
포름알데히드 0.5% wt/vol
pH 7.2
세포내 및 세포외 에피토프가 본 발명을 사용하여 염색될 수 있는 지를 보여주기 위하여, 인간 전혈 시료(WBS)를 하기의 방식으로 처리하였다.
먼저, 50 ㎕의 WBS를 5 ㎕의 용액 1과 합하고, 15분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 300 ㎕의 용액 2를 지정된 10㎕의 각각의 표지된 항체와 함께 첨가하였다. 40분의 인큐베이션 후에, 3000 ㎕의 용액 3을 첨가하고, 혼합물을 와류시켰다.
상기 혼합물의 분석을 유세포분석 장치를 사용하여 수행하였다. 세포내 및 세포외 에피토프 둘 모두가 성공적으로 염색된 것으로 나타났다. 세척 단계를 갖는 상기 약술된 방법을 세척 단계를 포함하지 않는 상기 약술된 방법과 비교할 때 차이를 관찰할 수 없었다. 둘 모두의 방법은 충분한 염색을 보였다.
실시예 4a:
실시예
4의 변형
본 발명의 방법이 많은 조건에 대하여 성공적으로 사용될 수 있는 강력한 방법인지를 알아내기 위하여, 실시예 4에 개시된 용액 1, 2 및 3의 몇몇 변형을 시험하였다.
각각의 경우에, 50 ㎕의 WBS를 5 ㎕의 용액 1(R1)과 합하고, 15분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 300 ㎕의 용액 2(R2)를 10 ㎕의 지정된 각각의 표지된 항체와 함께 첨가하였다. 30분의 인큐베이션 후에, 3000 ㎕의 용액 3(R3)을 첨가하고, 혼합물을 와류시켰다.
본 명세서에서 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 용액 1의 양을 달라지게 하거나, 용액 2의 성분의 농도를 달라지게 하고/거나 용액 3의 성분의 농도를 달라지게 하는 설정을 선택하였다. 다양한 설정에서, 몇몇 시약의 농도를 참조 시료로부터 + 또는 - 20%까지 변경시켰다. 참조예는 표 2 및 3에서 실험 번호 1이다.
하기의 표에서, 용액 1은 R1로 표기되며, 용액 2는 R2로 표기되고, 용액 3은 R3으로 표기된다.
상기 실험 설정을 참조 실험 번호 1과 비교하는 경우, 세포내 및 세포외 에피토프의 검출에서의 이들의 신호 대 잡음 비의 편차에 대하여 시험하였다.
하기의 표 3은 3가지 세포내 표적 및 2가지 세포외 표적에 관한 신호/잡음 값을 제공한다. 사용된 컨쥬게이트는 항-MPO-FITC, 항-CD79a-PE, 항-CD3-ECD(IOTest3 칵테일 PN IM3464U), 및 항-CD14-PC7(PN A22331)이었다.
관찰되는 바와 같이, 표 2에 약술된 모든 실험 변형은 신호 대 잡음 비에 관하여 동등하게 잘 작용되었다. 따라서, 본 발명은 다양한 농도의 완충제 성분을 포함하는 매우 다양한 완충제 조성에 대하여 잘 작용하는, 세포내 및 세포외 에피토프를 검출하기 위한 강력한 시스템 및 방법을 제공한다.
실시예
5:
추가의 세척 단계의 영향
추가의 세척 단계가 상기 수득된 결과에 대하여 임의의 부정적인 영향을 갖는 지를 알아내기 위하여, 추가의 세척 단계를 부가한 점에서 실시예 4의 조건을 달라지게 하였다.
특히, 상기 실시예 4에 약술된 바와 같은 용액 1, 2 및 3을 제조하고, 인간 전혈 시료(WBS)를 표지된 항체로 염색하기 위한 하기의 방법을 수행하였다.
먼저, 50 ㎕의 WBS를 5 ㎕의 용액 1과 합하고, 15분 동안 인큐베이션시켰다. 다음으로, 300 ㎕의 용액 2를 10 ㎕의 지정된 각각의 표지된 항체와 함께 첨가하였다. 40분의 인큐베이션 후에, 3000 ㎕의 용액 3을 첨가하고, 혼합물을 와류시켰다. 마지막으로, 상기에 더하여, 세포 현탁액을 원심분리하고(500 g, 5분), 상청액을 폐기하고, 세포 펠렛을 500 ㎕의 용액 3 중에 재현탁화시켰다.
상기 방법을 사용하여 수득된 결과는 실시예 4에서 수득된 결과와 상이하지 않았다. 따라서, 추가의 세척 단계는 달성된 결과에 대하여 어떠한 본질적인 영향도 갖지 않는다. 이는 본 발명에 따른 시스템 및 방법이 다양한 파라미터에 대하여 강력함을 다시 보여주는 것이다.
실시예 6:
pH 변화의 영향
본 발명에 따른 시스템 및 방법의 결과에 대한 사용되는 용액의 pH 값의 차이의 영향을 보여주기 위하여, 용액 2의 pH를 달라지게 한 실험 설정을 선택하였다.
실험 설정에 관하여, 실시예 4에 약술된 바와 같은 인간 전혈 시료의 염색 방법을 실시예 4a의 표 2에 제공된 참조 실험 번호 1에 대해 약술된 바와 같은 용액 1, 2 및 3의 변형을 사용하여 수행하였다. 특히, 신호 대 잡음 비가 용액 2의 pH의 변화에 의해 대폭적으로 영향을 받는 지에 대해 결정하였다. 인간 전혈 시료의 염색을 PE-표지 항-ZAP-70 항체를 사용하여 행하였다.
하기 표 4로부터 얻을 수 있는 바와 같이, 용액 2의 pH가 pH 6.00에서 pH 6.91로 달라지는 경우, 신호 대 잡음 비는 상당히 달라지지 않았다.
Claims (13)
- 하기의 단계를 포함하는 백혈구의 세포내 및 세포외 표적의 표지 방법:
(a) (i) 적어도 백혈구 및 적혈구를 포함하는 세포 조성물, 및
(ii) 상기 백혈구의 세포내 단백질, 지단백질 및 핵산을 교차결합시킬 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 포함하는 제1 용액의 조합물을 형성하는 단계;
(b) 상기 백혈구를 투과화(permeabilizing)시키고, 상기 적혈구를 용해시키고, 상기 제1 용액 중의 상기 하나 이상의 제제(들)의 교차결합 활성을 중화시킬 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 포함하는 제2 용액을 상기 조합물에 첨가하는 단계로서,
상기 제2 용액이
(i) 0.05% 내지 0.5%(w/v)의 양의 세제, 및
(ii) 1 내지 100 mM 농도의 4차 암모늄 염 또는 아민 함유 화합물을 포함하며,
상기 제2 용액은 pH가 6.5 이하이고,
첨가되는 상기 제2 용액의 부피가 상기 조합물의 총 부피의 1 내지 10배인 단계;
(c) 상기 제2 용액의 첨가와 동시에 또는 그 이후에, 백혈구의 세포외 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합제 및 백혈구의 세포내 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합제를 첨가하는 단계로서, 각각의 상기 결합제가 검출가능한 제제를 포함하는 단계; 및
(d) 제3 용액을 상기 조합물에 첨가하는 단계로서, 첨가되는 상기 제3 용액의 부피가 제3 용액이 첨가되는 상기 조합물의 총 부피와 같거나 그보다 더 큰 단계. - 제1항에 있어서, 세포 조성물이 전혈, 골수 및 복막액(peritoneal fluid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (a)에서 수득되는 조합물이 단계 (b) 전에 5 내지 20분 동안 인큐베이션되는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 수득되는 조합물이 단계 (d) 전에 15 내지 60분 동안 인큐베이션되는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 용액의 첨가 후에, 단계 (a)의 제제(들)가 상기 조합물에 0.5% 내지 2%(v/v)의 양으로 포함되는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 하나 이상의 제제(들)가 포름알데히드, 파라포름알데히드 및 글루타르알데히드로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 용액이
(i) 세포 조성물에 포함된 실질적으로 모든 적혈구의 용해를 달성하면서, 세포 조성물에 포함된 대부분의 백혈구가 용해되지 않도록 조정된(adapted) 양의 세제, 및
(ii) 단계 (a)의 상기 제제(들)를 중화시키기 위한 중화제를 포함하는 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 첨가되는 상기 제2 용액의 부피가 상기 조합물의 총 부피의 4 내지 8배인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 원심분리 단계가 단계 (d) 전에 수행되지 않는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 원심분리 단계가 단계 (b) 후에 또는 단계 (c) 후에 수행되지 않는 방법.
- (a) 포름알데히드, 파라포름알데히드 및 글루타르알데히드로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 제1 용액;
(b) (i) 4차 암모늄 염 또는 아민 함유 화합물, 및
(ii) 세제를 포함하는 제2 용액; 및
(c) (i) 포름알데히드, 파라포름알데히드 및 글루타르알데히드로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물, 및
(ii) 세제를 포함하는 제3 용액을 포함하는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트. - 제11항에 있어서,
(a) 제1 용액이 5% 내지 15%(v/v)의 농도의 포름알데히드를 포함하고;
(b) 제2 용액이
(i) 1 내지 100 mM 농도의 염화암모늄(NH4Cl), 및
(ii) 0.05% 내지 0.5%(w/v) 농도의 나트륨 N-라우로일 사르코신을 포함하며;
(c) 제3 용액이
(i) 0.01% 내지 1%(v/v) 농도의 포름알데히드, 및
(ii) 0.01% 내지 0.5%(w/v) 농도의 나트륨 N-라우로일 사르코신을 포함하는 키트. - 제11항 또는 제12항에 있어서, 키트가
(a) 유세포분석(flow cytometry)에 의해 검출가능한 표지를 포함하는 적어도 하나의 결합제로서, 상기 결합제가 백혈구의 세포외 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합제; 및
(b) 유세포분석에 의해 검출가능한 표지를 포함하는 적어도 하나의 결합제로서, 상기 결합제가 백혈구의 세포내 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합제를 추가로 포함하며;
상기 세포외 및 세포내 결합제가 개별 튜브 내에 또는 상기 제2 용액의 성분으로서 제공되는 키트.
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