JP3170176B2 - 薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法 - Google Patents
薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法Info
- Publication number
- JP3170176B2 JP3170176B2 JP11822095A JP11822095A JP3170176B2 JP 3170176 B2 JP3170176 B2 JP 3170176B2 JP 11822095 A JP11822095 A JP 11822095A JP 11822095 A JP11822095 A JP 11822095A JP 3170176 B2 JP3170176 B2 JP 3170176B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- drug resistance
- cells
- detecting
- surface antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は薬剤耐性を獲得した癌細
胞を高感度かつ特異的に検出する方法及び当該検出方法
に用いるキットに関する。
胞を高感度かつ特異的に検出する方法及び当該検出方法
に用いるキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】抗癌剤を癌患者に投与すると最初は腫瘍
が縮小して有効であるが、次第に有効性がなくなって、
最終的には抗癌剤を投与しても無効で病勢が進行する現
象がしばしば認められる。この様に、当初は奏効した抗
癌剤が長期治療のうちに次第に効かなくなったり、再発
や転移などの場合には、もはや如何なる抗癌剤も無効に
なってしまうことが多い。例えば、急性白血病患者に抗
腫瘍剤が初めて投与され一時的な完全寛解を達成したそ
の時点から、白血病細胞に出現してくる薬剤耐性は極め
て重大な問題となっている。また、対象症例と薬剤使用
経験とが蓄積されるにつれて、化学療法後再増殖する腫
瘍細胞は過去に一度も暴露されていない複数の抗腫瘍剤
に対しても耐性化することが頻繁に観察されている。こ
れが臨床的多剤耐性現象であり、白血病のみならず造血
器腫瘍一般について日常臨床の場であまねく遭遇する大
きな障害である。このような抗癌剤耐性腫瘍の薬剤耐性
を克服することが、今後の抗癌化学療法の治療成績向上
に重要であり、そのためにも薬剤耐性レベルを再現性を
もって検出できる方法論の確立が望まれている。
が縮小して有効であるが、次第に有効性がなくなって、
最終的には抗癌剤を投与しても無効で病勢が進行する現
象がしばしば認められる。この様に、当初は奏効した抗
癌剤が長期治療のうちに次第に効かなくなったり、再発
や転移などの場合には、もはや如何なる抗癌剤も無効に
なってしまうことが多い。例えば、急性白血病患者に抗
腫瘍剤が初めて投与され一時的な完全寛解を達成したそ
の時点から、白血病細胞に出現してくる薬剤耐性は極め
て重大な問題となっている。また、対象症例と薬剤使用
経験とが蓄積されるにつれて、化学療法後再増殖する腫
瘍細胞は過去に一度も暴露されていない複数の抗腫瘍剤
に対しても耐性化することが頻繁に観察されている。こ
れが臨床的多剤耐性現象であり、白血病のみならず造血
器腫瘍一般について日常臨床の場であまねく遭遇する大
きな障害である。このような抗癌剤耐性腫瘍の薬剤耐性
を克服することが、今後の抗癌化学療法の治療成績向上
に重要であり、そのためにも薬剤耐性レベルを再現性を
もって検出できる方法論の確立が望まれている。
【０００３】多剤耐性のメカニズムは、耐性獲得細胞の
細胞質膜上に分子量約１７万のいわゆるＰ糖蛋白が多数
出現し（Ｐ：ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）、それがポン
プの役割をしていろいろな種類の抗癌剤を細胞内からエ
ネルギーを使って積極的に追い出してしまうためである
ことが明らかにされた（Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎ
ｄ Ｌｉｎｇ，Ｖ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５
４，１２７０１−１２７０５（１９７９），Ｐａｓｔａ
ｎ，Ｉ．ａｎｄ Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｍ．，Ｎ．Ｅｎ
ｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１６，１３８８−１３９３（１
９８７）。従ってＰ糖蛋白の過剰発現を検出すれば薬剤
耐性獲得癌細胞を検出できると考えられた。
細胞質膜上に分子量約１７万のいわゆるＰ糖蛋白が多数
出現し（Ｐ：ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）、それがポン
プの役割をしていろいろな種類の抗癌剤を細胞内からエ
ネルギーを使って積極的に追い出してしまうためである
ことが明らかにされた（Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎ
ｄ Ｌｉｎｇ，Ｖ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５
４，１２７０１−１２７０５（１９７９），Ｐａｓｔａ
ｎ，Ｉ．ａｎｄ Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｍ．，Ｎ．Ｅｎ
ｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１６，１３８８−１３９３（１
９８７）。従ってＰ糖蛋白の過剰発現を検出すれば薬剤
耐性獲得癌細胞を検出できると考えられた。
【０００４】しかしながら、Ｐ糖蛋白は正常組織の一部
にも発現し、代謝物の分泌、有害物の排出などの機能を
もっていると推察されている。これらの組織由来の癌が
一般に薬剤抵抗性であるのはこのＰ糖蛋白によると考え
られている（Ｆｏｊｏ，Ａ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，２
６５−２６９（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７７３５−７７３８（１
９８７）。従って、Ｐ糖蛋白の測定は高感度でかつ正確
でなければならない。
にも発現し、代謝物の分泌、有害物の排出などの機能を
もっていると推察されている。これらの組織由来の癌が
一般に薬剤抵抗性であるのはこのＰ糖蛋白によると考え
られている（Ｆｏｊｏ，Ａ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，２
６５−２６９（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７７３５−７７３８（１
９８７）。従って、Ｐ糖蛋白の測定は高感度でかつ正確
でなければならない。
【０００５】このＰ糖蛋白の測定法として、Ｐ糖蛋白を
コードする遺伝子であるｍｄｒ１のｍＲＮＡの発現のノ
ーザンブロッティングによる検出法〔Ｇｏｌｄｓｔｅｉ
ｎ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｎｓｔ．，８１：１１６−１２４（１９８
９）〕、ｍｄｒ１のｍＲＮＡのリバーストランスクリプ
ターゼ法によるＰＣＲ法での検出法〔Ｎｏｏｍａｎ，
Ｋ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１５２−１５６（１９９
０）〕等があるが、測定手段が煩雑であったり、ごく少
量混在する末梢幹細胞がｍｄｒ１のｍＲＮＡを発現して
いるため、末梢血の単核球分画からかなりのｍＲＮＡが
検出されることから、ＰＣＲ法によるｍｄｒ１検出は実
際的ではないと考えられている。
コードする遺伝子であるｍｄｒ１のｍＲＮＡの発現のノ
ーザンブロッティングによる検出法〔Ｇｏｌｄｓｔｅｉ
ｎ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｎｓｔ．，８１：１１６−１２４（１９８
９）〕、ｍｄｒ１のｍＲＮＡのリバーストランスクリプ
ターゼ法によるＰＣＲ法での検出法〔Ｎｏｏｍａｎ，
Ｋ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１５２−１５６（１９９
０）〕等があるが、測定手段が煩雑であったり、ごく少
量混在する末梢幹細胞がｍｄｒ１のｍＲＮＡを発現して
いるため、末梢血の単核球分画からかなりのｍＲＮＡが
検出されることから、ＰＣＲ法によるｍｄｒ１検出は実
際的ではないと考えられている。
【０００６】また、Ｐ糖蛋白に対する抗体を用いた免疫
学的測定法も報告されている〔Ｉｔｏ．Ｙ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，６３：１５３４−１５３８（１９
８９），Ｋｕｗａｚｕｒｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ
ｃｅｒ，６６：８６８−８７３（１９９０），Ｓａｔ
ｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏ
ｌ．，７５：３４０−３４５（１９９０）〕が、抗癌剤
による治療成績と相関する場合や全く相関性がない場合
があり、正確な判断ができないものであった。
学的測定法も報告されている〔Ｉｔｏ．Ｙ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，６３：１５３４−１５３８（１９
８９），Ｋｕｗａｚｕｒｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ
ｃｅｒ，６６：８６８−８７３（１９９０），Ｓａｔ
ｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏ
ｌ．，７５：３４０−３４５（１９９０）〕が、抗癌剤
による治療成績と相関する場合や全く相関性がない場合
があり、正確な判断ができないものであった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】このような従来のＰ糖
蛋白測定法による結果が実際の薬剤耐性を反映していな
いのは、測定方法の感度及び特異性に起因するものと考
えられる。従って、本発明の目的は感度及び特異性が高
く、信頼性の高い薬剤耐性獲得癌細胞の検出法を提供す
ることにある。
蛋白測定法による結果が実際の薬剤耐性を反映していな
いのは、測定方法の感度及び特異性に起因するものと考
えられる。従って、本発明の目的は感度及び特異性が高
く、信頼性の高い薬剤耐性獲得癌細胞の検出法を提供す
ることにある。
【０００８】
【課題を解決するために手段】そこで本発明者らは癌細
胞に由来するＰ糖蛋白のみを正確に検出するための方法
を開発すべく種々研究した結果、被検細胞に、癌細胞膜
表面抗原検出を目的として用いる抗体、細胞表面抗原を
損なわずに細胞の形態を固定し、かつ細胞膜透過性を亢
進させる細胞固定剤、及び薬剤耐性関連蛋白に対する抗
体の三者を反応させ、任意の癌細胞膜表面抗原で癌細胞
集団を特定し、薬剤耐性関連蛋白に陽性な細胞を検出す
れば、薬剤耐性獲得癌細胞が極めて高感度かつ特異的に
検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
胞に由来するＰ糖蛋白のみを正確に検出するための方法
を開発すべく種々研究した結果、被検細胞に、癌細胞膜
表面抗原検出を目的として用いる抗体、細胞表面抗原を
損なわずに細胞の形態を固定し、かつ細胞膜透過性を亢
進させる細胞固定剤、及び薬剤耐性関連蛋白に対する抗
体の三者を反応させ、任意の癌細胞膜表面抗原で癌細胞
集団を特定し、薬剤耐性関連蛋白に陽性な細胞を検出す
れば、薬剤耐性獲得癌細胞が極めて高感度かつ特異的に
検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明は、被検細胞に、癌細胞
膜表面抗原検出を目的として用いる抗体、細胞表面抗原
を損なわずに細胞の形態を固定し、かつ細胞膜透過性を
亢進させる細胞固定剤、及び薬剤耐性関連蛋白に対する
抗体を反応させ、癌細胞膜表面抗原で癌細胞集団を特定
した後薬剤耐性関連蛋白に対して陽性な細胞を検出する
ことを特徴とする薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法を提供
するものである。
膜表面抗原検出を目的として用いる抗体、細胞表面抗原
を損なわずに細胞の形態を固定し、かつ細胞膜透過性を
亢進させる細胞固定剤、及び薬剤耐性関連蛋白に対する
抗体を反応させ、癌細胞膜表面抗原で癌細胞集団を特定
した後薬剤耐性関連蛋白に対して陽性な細胞を検出する
ことを特徴とする薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法を提供
するものである。
【００１０】また、本発明は癌細胞膜表面抗原検出を目
的として用いる抗体、細胞表面抗原を損なわずに細胞の
形態を固定し、かつ細胞膜透過性を亢進させる細胞固定
剤、及び薬剤耐性関連蛋白に対する抗体を含有する薬剤
耐性獲得癌細胞検出用キットを提供するものである。
的として用いる抗体、細胞表面抗原を損なわずに細胞の
形態を固定し、かつ細胞膜透過性を亢進させる細胞固定
剤、及び薬剤耐性関連蛋白に対する抗体を含有する薬剤
耐性獲得癌細胞検出用キットを提供するものである。
【００１１】本発明に用いられる癌細胞膜表面抗原検出
を目的として用いる抗体としては、種々の癌細胞膜表面
マーカー解析用の抗体として用いられている抗体であれ
ば特に制限されないが、モノクローナル抗体が望まし
い。ここで、癌細胞膜表面抗原としては、検出しようと
する癌細胞に特異的な膜表面抗原であれば特に制限され
ず、例えば白血病細胞の場合にはＣＤ４５、ＣＤ２、Ｃ
Ｄ３、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１
９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＨＬＡ
−ＤＲ等が挙げられる。これらの癌細胞膜表面抗原検出
を目的として用いる抗体は、抗原抗体反応した細胞のみ
を検出する必要があることから、検出可能な標識を行う
のが好ましい。かかる標識としてはペイジニンクロロフ
ィルプロテイン（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ Ｃｈｌｏｒｏｐ
ｈｙｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰｅｒＣＰ）、Ｃｙ−ｃｈ
ｒｏｍｅ、ＦＩＴＣ、ＰＥなどが挙げられる。
を目的として用いる抗体としては、種々の癌細胞膜表面
マーカー解析用の抗体として用いられている抗体であれ
ば特に制限されないが、モノクローナル抗体が望まし
い。ここで、癌細胞膜表面抗原としては、検出しようと
する癌細胞に特異的な膜表面抗原であれば特に制限され
ず、例えば白血病細胞の場合にはＣＤ４５、ＣＤ２、Ｃ
Ｄ３、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１
９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＨＬＡ
−ＤＲ等が挙げられる。これらの癌細胞膜表面抗原検出
を目的として用いる抗体は、抗原抗体反応した細胞のみ
を検出する必要があることから、検出可能な標識を行う
のが好ましい。かかる標識としてはペイジニンクロロフ
ィルプロテイン（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ Ｃｈｌｏｒｏｐ
ｈｙｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰｅｒＣＰ）、Ｃｙ−ｃｈ
ｒｏｍｅ、ＦＩＴＣ、ＰＥなどが挙げられる。
【００１２】細胞固定剤としては、細胞表面抗原を損な
わずに細胞の形態を固定し、かつ細胞膜透過性を亢進さ
せる試薬であれば特に制限されないが、例えば次の一般
式（１）：
わずに細胞の形態を固定し、かつ細胞膜透過性を亢進さ
せる試薬であれば特に制限されないが、例えば次の一般
式（１）：
【００１３】
【化１】R1R2R3R4R5-Ar-X ……（１）
【００１４】〔式中、Ａｒは炭化水素環又は複素環の芳
香族基を示し、ＸはSO3R6、SO2NR6R7、COOR6、CN、O
R6、OCOR6又はOCONR6R7を示し、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ
4 及びＲ5 は同一又は異なってH、NO2、CONR6R7、COR6、
X、OR6、Ar又はCF3を示し、Ｒ6 及びＲ7 はH、炭素数１
〜６のアルキル基又はフェニル基を示す〕で表わされる
芳香族化合物を含有する細胞固定剤が挙げられる。
香族基を示し、ＸはSO3R6、SO2NR6R7、COOR6、CN、O
R6、OCOR6又はOCONR6R7を示し、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ
4 及びＲ5 は同一又は異なってH、NO2、CONR6R7、COR6、
X、OR6、Ar又はCF3を示し、Ｒ6 及びＲ7 はH、炭素数１
〜６のアルキル基又はフェニル基を示す〕で表わされる
芳香族化合物を含有する細胞固定剤が挙げられる。
【００１５】上記一般式（１）で表わされる芳香族化合
物のうち、好ましいものとしては、２，４−ジニトロベ
ンゼンスルホンアミド、２，４−ジニトロフェノール、
３，５−ジニトロサリチル酸、２，４−ジニトロ安息香
酸、５−スルホサリチル酸、２，５−ジヒドロキシ−
１，４−ベンゼンジスルホン酸、３，５−ジニトロ安息
香酸、８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸、４−
ニトロフェノール、３，５−ジニトロサリシルアルデヒ
ド、３，５−ジニトロアニリン、パラトルエンスルホン
酸、２−メシチレンスルホン酸、２−（トリフルオロメ
チル）安息香酸、３，５−ジニトロベンゾニトリル、
２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸、２，６−ジニト
ロベンゼンスルホン酸、３，５−ジニトロベンゼンスル
ホン酸等が挙げられる。
物のうち、好ましいものとしては、２，４−ジニトロベ
ンゼンスルホンアミド、２，４−ジニトロフェノール、
３，５−ジニトロサリチル酸、２，４−ジニトロ安息香
酸、５−スルホサリチル酸、２，５−ジヒドロキシ−
１，４−ベンゼンジスルホン酸、３，５−ジニトロ安息
香酸、８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸、４−
ニトロフェノール、３，５−ジニトロサリシルアルデヒ
ド、３，５−ジニトロアニリン、パラトルエンスルホン
酸、２−メシチレンスルホン酸、２−（トリフルオロメ
チル）安息香酸、３，５−ジニトロベンゾニトリル、
２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸、２，６−ジニト
ロベンゼンスルホン酸、３，５−ジニトロベンゼンスル
ホン酸等が挙げられる。
【００１６】この細胞固定剤には上記一般式（１）の芳
香族化合物以外にアミンとの反応性化合物、例えばホル
ムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデ
ヒド、アクロレイン、グリオキサル、マロンアルデヒ
ド、ジアセチル、ポリアルデヒド、カルボジイミド、ジ
イソシアネート、ジアゾニウム化合物、ジイミドエステ
ル、マレイミド、ベンゾキノンあるいはクロム、水銀、
オスミウムの三酸化物、塩化パラジウム、ウランなどの
錯体を配合することが好ましい。これらのアミンとの反
応性化合物としては、グルタルアルデヒド、アクロレイ
ン、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどのア
ミン反応性アルデヒドが特に好ましい。
香族化合物以外にアミンとの反応性化合物、例えばホル
ムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデ
ヒド、アクロレイン、グリオキサル、マロンアルデヒ
ド、ジアセチル、ポリアルデヒド、カルボジイミド、ジ
イソシアネート、ジアゾニウム化合物、ジイミドエステ
ル、マレイミド、ベンゾキノンあるいはクロム、水銀、
オスミウムの三酸化物、塩化パラジウム、ウランなどの
錯体を配合することが好ましい。これらのアミンとの反
応性化合物としては、グルタルアルデヒド、アクロレイ
ン、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどのア
ミン反応性アルデヒドが特に好ましい。
【００１７】更にこの細胞固定剤には、ジメチルスルホ
キシド、スルホラン、１−メチル−２−ピロリドン、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール
などの細胞膜透過性促進剤を配合するのが好ましい。
キシド、スルホラン、１−メチル−２−ピロリドン、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール
などの細胞膜透過性促進剤を配合するのが好ましい。
【００１８】更にまた、この細胞固定剤には、両性界面
活性剤又は非イオン界面活性剤を配合することが好まし
く、当該界面活性剤としては、例えば葉酸ナトリウム、
デオキシコレート、ＣＨＡＰＳ、サポニン、エチレンオ
キシドのポリマー（例えばエトキシル化アルコール、エ
トキシル化アルキルフェノール、エトキシル化アミン及
びアミド）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル類
（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
（ツイーン２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノ
パルミテート（ツイーン４０）、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノオレエート（ツイーン８０））、ポリオキ
シエチレンアルキルエーテル類（例えばポリオキシエチ
レン（２３）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレンエ
ーテルＷ−１（ｐｏｌｙｏｘ）など）が挙げられる。
活性剤又は非イオン界面活性剤を配合することが好まし
く、当該界面活性剤としては、例えば葉酸ナトリウム、
デオキシコレート、ＣＨＡＰＳ、サポニン、エチレンオ
キシドのポリマー（例えばエトキシル化アルコール、エ
トキシル化アルキルフェノール、エトキシル化アミン及
びアミド）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル類
（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
（ツイーン２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノ
パルミテート（ツイーン４０）、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノオレエート（ツイーン８０））、ポリオキ
シエチレンアルキルエーテル類（例えばポリオキシエチ
レン（２３）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレンエ
ーテルＷ−１（ｐｏｌｙｏｘ）など）が挙げられる。
【００１９】特に好ましい細胞固定剤は、前記一般式
（１）の芳香族化合物、アミン反応性アルデヒド、細胞
膜透過性促進剤及び非イオン界面活性剤を含有する組成
物であり、とりわけ好ましい細胞固定剤はジメチルスル
ホキシド、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸ナトリ
ウム、ホルムアルデヒド及び非イオン界面活性剤を含有
する組成物である。
（１）の芳香族化合物、アミン反応性アルデヒド、細胞
膜透過性促進剤及び非イオン界面活性剤を含有する組成
物であり、とりわけ好ましい細胞固定剤はジメチルスル
ホキシド、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸ナトリ
ウム、ホルムアルデヒド及び非イオン界面活性剤を含有
する組成物である。
【００２０】このような細胞固定剤としては、例えば市
販品であるＰｅｒｍｅａ Ｆｉｘ（オーソ社製）を用い
ることができる。この細胞固定剤を用いることにより、
薬剤耐性関連蛋白に対する抗体が、細胞内部に容易に浸
透できるため、細胞内部の薬剤耐性関連蛋白と反応す
る。一方、この細胞固定剤処理によって細胞表面抗原は
損なわれないので、癌細胞膜表面抗原検出を目的として
用いる抗体と当該膜表面抗原との反応もまた高感度に行
われる。
販品であるＰｅｒｍｅａ Ｆｉｘ（オーソ社製）を用い
ることができる。この細胞固定剤を用いることにより、
薬剤耐性関連蛋白に対する抗体が、細胞内部に容易に浸
透できるため、細胞内部の薬剤耐性関連蛋白と反応す
る。一方、この細胞固定剤処理によって細胞表面抗原は
損なわれないので、癌細胞膜表面抗原検出を目的として
用いる抗体と当該膜表面抗原との反応もまた高感度に行
われる。
【００２１】また、薬剤耐性関連蛋白に対する抗体とし
ては、例えばＰ糖蛋白に対する抗体が挙げられるが、Ｐ
糖蛋白に対するモノクローナル抗体が好ましい。このＰ
糖蛋白に対する抗体としては、ジャーナル オブ クリ
ニカル オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇ
ｙ），ｖｏｌ．３，３１１−３１５（１９８５）記載の
抗体、特公平４−３０２７８号公報記載のＭＲＫ４、Ｍ
ＲＫ１６、ＭＲＫ１７等が挙げられるが、このうちＭＲ
Ｋ１６が特に好ましい。これらのＰ糖蛋白に対する抗体
は、前記癌細胞膜表面抗原に対する抗体に用いた標識と
は異なる検出可能な標識を行うのが好ましく、当該標記
としては、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，
ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈ
ｒｉｎ，ＰＥ）等が挙げられる。
ては、例えばＰ糖蛋白に対する抗体が挙げられるが、Ｐ
糖蛋白に対するモノクローナル抗体が好ましい。このＰ
糖蛋白に対する抗体としては、ジャーナル オブ クリ
ニカル オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇ
ｙ），ｖｏｌ．３，３１１−３１５（１９８５）記載の
抗体、特公平４−３０２７８号公報記載のＭＲＫ４、Ｍ
ＲＫ１６、ＭＲＫ１７等が挙げられるが、このうちＭＲ
Ｋ１６が特に好ましい。これらのＰ糖蛋白に対する抗体
は、前記癌細胞膜表面抗原に対する抗体に用いた標識と
は異なる検出可能な標識を行うのが好ましく、当該標記
としては、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，
ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈ
ｒｉｎ，ＰＥ）等が挙げられる。
【００２２】本発明方法に用いられる被検細胞として
は、薬剤耐性が疑われる癌患者の細胞が含まれている種
々の体液が挙げられ、具体的には血液、骨髄液、腹水、
リンパ液、関節内液及びこれらから得られる分画成分が
挙げられる。
は、薬剤耐性が疑われる癌患者の細胞が含まれている種
々の体液が挙げられ、具体的には血液、骨髄液、腹水、
リンパ液、関節内液及びこれらから得られる分画成分が
挙げられる。
【００２３】被検細胞と癌細胞膜表面抗原検出を目的と
して用いる抗体、細胞固定剤及び薬剤耐性関連蛋白に対
する抗体との反応順序は特に制限されないが、被検細胞
に癌細胞膜表面抗原検出を目的として用いる抗体を反応
させた後、細胞固定剤を反応させ、次いで薬剤耐性関連
蛋白に対する抗体を反応させるのが好ましい。
して用いる抗体、細胞固定剤及び薬剤耐性関連蛋白に対
する抗体との反応順序は特に制限されないが、被検細胞
に癌細胞膜表面抗原検出を目的として用いる抗体を反応
させた後、細胞固定剤を反応させ、次いで薬剤耐性関連
蛋白に対する抗体を反応させるのが好ましい。
【００２４】本発明方法を実施するには、被検細胞浮遊
液に標識された癌細胞膜表面抗原検出を目的とする抗
体、細胞固定剤及び標識された薬剤耐性関連蛋白に対す
る抗体を反応させた後、両者の抗体の標識体が結合した
細胞のみを例えばフローサイトメーターにより検出する
ことにより行うのが好ましい。
液に標識された癌細胞膜表面抗原検出を目的とする抗
体、細胞固定剤及び標識された薬剤耐性関連蛋白に対す
る抗体を反応させた後、両者の抗体の標識体が結合した
細胞のみを例えばフローサイトメーターにより検出する
ことにより行うのが好ましい。
【００２５】被検細胞浮遊液が血液等の場合には、予め
赤血球溶血操作（例えばＮＨ4Ｃｌ溶液処理）、非特異
的反応のブロッキング（例えばマウス血清の添加）を行
った後、細胞数を調整しておくのが好ましい。
赤血球溶血操作（例えばＮＨ4Ｃｌ溶液処理）、非特異
的反応のブロッキング（例えばマウス血清の添加）を行
った後、細胞数を調整しておくのが好ましい。
【００２６】被検細胞と癌細胞膜表面抗原検出を目的と
して用いる抗体との反応は、通常暗所にて室温で２０〜
３０分間インキュベーションすることにより行われる。
反応後、未反応の抗体を除去するため細胞を洗浄してお
くのが好ましい。
して用いる抗体との反応は、通常暗所にて室温で２０〜
３０分間インキュベーションすることにより行われる。
反応後、未反応の抗体を除去するため細胞を洗浄してお
くのが好ましい。
【００２７】細胞と細胞固定剤との反応は、通常暗所に
て室温で４０分間インキュベーションすることにより行
われる。反応後、未反応の細胞固定剤を除去するため細
胞を洗浄するのが好ましい。
て室温で４０分間インキュベーションすることにより行
われる。反応後、未反応の細胞固定剤を除去するため細
胞を洗浄するのが好ましい。
【００２８】細胞と薬剤耐性関連蛋白に対する抗体との
反応は、暗所にて室温で２０〜３０分間インキュベーシ
ョンすることにより行われる。反応後、未反応の抗体を
除去するため細胞を洗浄するのが好ましい。
反応は、暗所にて室温で２０〜３０分間インキュベーシ
ョンすることにより行われる。反応後、未反応の抗体を
除去するため細胞を洗浄するのが好ましい。
【００２９】反応が終了した段階では、癌細胞膜表面抗
原検出を目的として用いる抗体のみが任意の反応を示し
た細胞（癌細胞）、薬剤耐性関連蛋白に対する抗体のみ
が結合した細胞（薬剤耐性関連蛋白陽性細胞）、並びに
癌細胞膜表面抗原により特定された癌細胞集団に薬剤耐
性関連蛋白に対する抗体が結合した細胞（薬剤耐性関連
蛋白陽性の癌細胞集団）が反応系に存在するので、この
中から薬剤耐性関連蛋白陽性の癌細胞集団のみを検出す
る。この検出手段としては、測定データを癌細胞膜表面
抗原検出を目的として用いる抗体側方散乱光（ＳＳＣ）
パラメーターを用いたドット・プロットに展開し、癌細
胞膜表面抗原によって特定された癌細胞集団（例えばＣ
Ｄ４５弱陽性集団）のみにゲイティングを行い〔臨床血
液 ３５：１０，１１７３（１９９４）〕、ゲイト内細
胞の薬剤耐性関連蛋白陽性率を算出する方法が挙げられ
る。通常、測定データは前方散乱光（ＦＳＣ）−側方散
乱光（ＳＳＣ）表示によってゲイト設定が行われるが、
このゲイト設定では良好な結果が得られない場合があ
る。
原検出を目的として用いる抗体のみが任意の反応を示し
た細胞（癌細胞）、薬剤耐性関連蛋白に対する抗体のみ
が結合した細胞（薬剤耐性関連蛋白陽性細胞）、並びに
癌細胞膜表面抗原により特定された癌細胞集団に薬剤耐
性関連蛋白に対する抗体が結合した細胞（薬剤耐性関連
蛋白陽性の癌細胞集団）が反応系に存在するので、この
中から薬剤耐性関連蛋白陽性の癌細胞集団のみを検出す
る。この検出手段としては、測定データを癌細胞膜表面
抗原検出を目的として用いる抗体側方散乱光（ＳＳＣ）
パラメーターを用いたドット・プロットに展開し、癌細
胞膜表面抗原によって特定された癌細胞集団（例えばＣ
Ｄ４５弱陽性集団）のみにゲイティングを行い〔臨床血
液 ３５：１０，１１７３（１９９４）〕、ゲイト内細
胞の薬剤耐性関連蛋白陽性率を算出する方法が挙げられ
る。通常、測定データは前方散乱光（ＦＳＣ）−側方散
乱光（ＳＳＣ）表示によってゲイト設定が行われるが、
このゲイト設定では良好な結果が得られない場合があ
る。
【００３０】
【発明の効果】本発明によれば、細胞膜表面抗原検出を
目的として用いる抗体、薬剤耐性関連蛋白に対する抗体
及び細胞固定剤の三者を組合わせて使用することによ
り、癌細胞内に存在する薬剤耐性関連蛋白の測定が可能
となり、薬剤耐性獲得癌細胞を高感度かつ特異的に検出
することが可能となった。
目的として用いる抗体、薬剤耐性関連蛋白に対する抗体
及び細胞固定剤の三者を組合わせて使用することによ
り、癌細胞内に存在する薬剤耐性関連蛋白の測定が可能
となり、薬剤耐性獲得癌細胞を高感度かつ特異的に検出
することが可能となった。
【００３１】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるもので
はない。
するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるもので
はない。
【００３２】実施例１ （１）癌細胞膜表面抗原に対する抗体ＦＩＴＣ標識ＣＤ
４５モノクローナル抗体（ＨＬｅ１：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた。
４５モノクローナル抗体（ＨＬｅ１：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた。
【００３３】（２）Ｐ糖蛋白に対する抗体ＭＲＫ１６モ
ノクローナル抗体（協和メディクス）をＣｙ３ Ｆｌｕ
ｏｒｏＬｉｎｋ−Ａｂ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｉｔｔｓｂ
ｕｒｇｈ，ＰＡ．）にてＣｙ３標識して用いた。
ノクローナル抗体（協和メディクス）をＣｙ３ Ｆｌｕ
ｏｒｏＬｉｎｋ−Ａｂ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｉｔｔｓｂ
ｕｒｇｈ，ＰＡ．）にてＣｙ３標識して用いた。
【００３４】（３）細胞膜表面及び細胞内Ｐ糖蛋白の染
色 採取した骨髄液又は末梢血０．１mlを、リン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ：０．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナト
リウムを含む）３mlにて１回洗浄した後、細胞濃度をＰ
ＢＳで１×１０6ｃｅｌｌ／mlに調整した。次に１．０
％マウス血清（ＩＣＮ Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ．）ＰＢＳを０．
１ml添加し、４℃にて１０分間インキュベーションを行
い、非特異反応のブロッキングをした後、ＦＩＴＣ標識
ＣＤ４５モノクローナル抗体を０．０１ml添加し、室
温、遮光下で３０分間インキュベーションを行った。イ
ンキュベーション終了後、遠心分離（１１００ｒｐｍ，
５分）により細胞を集め、細胞を３mlのＰＢＳで１回洗
浄した。次いで、細胞固定用試薬（ＰｅｒｍｅａＦｉｘ
TM：Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ．）を２ml添加し、室温、遮
光下で４０分間反応させて、細胞の固定と細胞膜透過処
理を行った。反応終了後、２mlのＰＢＳで１回洗浄操作
を行った後、Ｃｙ３標識ＭＲＫ１６抗体（０．１mg／m
l）を０．０１ml添加し、室温、遮光下で３０分間反応
させた。なお、対照標品としてＣｙ３マウスＩｇＧ2a抗
体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ
ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓ
ｅ，ＣＡ．）を用いた。反応終了後、細胞を３mlのＰＢ
Ｓに浮遊させ、室温、遮光下で６０分間静置し、細胞内
部の洗浄を行った。標識細胞の測定はフローサイトメー
ター（ＦＡＣＳｃａｎ：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ）を用いて測定した。
色 採取した骨髄液又は末梢血０．１mlを、リン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ：０．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナト
リウムを含む）３mlにて１回洗浄した後、細胞濃度をＰ
ＢＳで１×１０6ｃｅｌｌ／mlに調整した。次に１．０
％マウス血清（ＩＣＮ Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ．）ＰＢＳを０．
１ml添加し、４℃にて１０分間インキュベーションを行
い、非特異反応のブロッキングをした後、ＦＩＴＣ標識
ＣＤ４５モノクローナル抗体を０．０１ml添加し、室
温、遮光下で３０分間インキュベーションを行った。イ
ンキュベーション終了後、遠心分離（１１００ｒｐｍ，
５分）により細胞を集め、細胞を３mlのＰＢＳで１回洗
浄した。次いで、細胞固定用試薬（ＰｅｒｍｅａＦｉｘ
TM：Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ．）を２ml添加し、室温、遮
光下で４０分間反応させて、細胞の固定と細胞膜透過処
理を行った。反応終了後、２mlのＰＢＳで１回洗浄操作
を行った後、Ｃｙ３標識ＭＲＫ１６抗体（０．１mg／m
l）を０．０１ml添加し、室温、遮光下で３０分間反応
させた。なお、対照標品としてＣｙ３マウスＩｇＧ2a抗
体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ
ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓ
ｅ，ＣＡ．）を用いた。反応終了後、細胞を３mlのＰＢ
Ｓに浮遊させ、室温、遮光下で６０分間静置し、細胞内
部の洗浄を行った。標識細胞の測定はフローサイトメー
ター（ＦＡＣＳｃａｎ：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ）を用いて測定した。
【００３５】（４）薬剤耐性獲得癌細胞の検出 測定データはｌｉｓｔ ｍｏｄｅにて取り込んだ。測定
データをＣＤ４５−ＳＳＣパラメーターを用いたドット
・プロットに展開し、ＣＤ４５弱陽性細胞集団（腫瘍細
胞集団）のみにゲイティングを行い、ゲイト内細胞のＭ
ＲＫ１６陽性率を算出した。陽性領域の設定はネガティ
ブ・コントロールを用いて行った。その結果を図に示し
た。すなわち、図１はフローサイトメトリー法による前
方散乱光（ＦＳＣ）−側方散乱光（ＳＳＣ）表示による
ゲート設定した結果を示す。図２は、図１によるゲート
内細胞をＣＤ４５−ＳＳＣ表示法に展開し、ゲート設定
した図を示す。図１及び図２のＣＤ４５−ＳＳＣ表示で
のゲイティングにより、ＣＤ４５弱陽性細胞が明確に区
別され、白血病細胞群のみに選択的にゲート設定が可能
となった。
データをＣＤ４５−ＳＳＣパラメーターを用いたドット
・プロットに展開し、ＣＤ４５弱陽性細胞集団（腫瘍細
胞集団）のみにゲイティングを行い、ゲイト内細胞のＭ
ＲＫ１６陽性率を算出した。陽性領域の設定はネガティ
ブ・コントロールを用いて行った。その結果を図に示し
た。すなわち、図１はフローサイトメトリー法による前
方散乱光（ＦＳＣ）−側方散乱光（ＳＳＣ）表示による
ゲート設定した結果を示す。図２は、図１によるゲート
内細胞をＣＤ４５−ＳＳＣ表示法に展開し、ゲート設定
した図を示す。図１及び図２のＣＤ４５−ＳＳＣ表示で
のゲイティングにより、ＣＤ４５弱陽性細胞が明確に区
別され、白血病細胞群のみに選択的にゲート設定が可能
となった。
【００３６】図３は細胞固定剤を用いない以外は前記と
同様に反応を行った場合の、図２のゲイティング内にお
けるＭＲＫ１６陽性率を示す図であり、図４は本発明に
よる図２のゲイティング内の細胞についてのＭＲＫ１６
陽性率算出結果を示す図である。この結果から、細胞固
定剤を用いない場合は、ＭＲＫ１６抗体が細胞内部に浸
透できないため、Ｐ糖蛋白の正確な測定がなし得ず、細
胞固定剤を用いた本発明方法によればＭＲＫ１６抗体が
細胞内部に容易に浸透し、細胞内のＰ糖蛋白の測定が可
能となった。そして、図２及び図４の結果を併せて考慮
すれば、本発明方法によって癌細胞であって、かつＰ糖
蛋白陽性の細胞のみが特異的に検出できることがわか
る。
同様に反応を行った場合の、図２のゲイティング内にお
けるＭＲＫ１６陽性率を示す図であり、図４は本発明に
よる図２のゲイティング内の細胞についてのＭＲＫ１６
陽性率算出結果を示す図である。この結果から、細胞固
定剤を用いない場合は、ＭＲＫ１６抗体が細胞内部に浸
透できないため、Ｐ糖蛋白の正確な測定がなし得ず、細
胞固定剤を用いた本発明方法によればＭＲＫ１６抗体が
細胞内部に容易に浸透し、細胞内のＰ糖蛋白の測定が可
能となった。そして、図２及び図４の結果を併せて考慮
すれば、本発明方法によって癌細胞であって、かつＰ糖
蛋白陽性の細胞のみが特異的に検出できることがわか
る。
【図１】フローサイトメトリーによるＦＳＣ−ＳＳＣ表
示によりゲート設定した結果を示す図である。
示によりゲート設定した結果を示す図である。
【図２】フローサイトメトリーによる図１によるゲート
内細胞をＣＤ４５−ＳＳＣ表示に展開しゲート設定した
結果を示す図である。
内細胞をＣＤ４５−ＳＳＣ表示に展開しゲート設定した
結果を示す図である。
【図３】細胞固定剤を用いない場合の図２によりゲイテ
ィングされた細胞についてのＭＲＫ１６陽性率を示す図
である（左側がコントロール、右側が試験群）。
ィングされた細胞についてのＭＲＫ１６陽性率を示す図
である（左側がコントロール、右側が試験群）。
【図４】図２によりゲイティングされた細胞についての
本発明方法によるＭＲＫ１６陽性率を示す図である（左
側がコントロール、右側が試験群）。
本発明方法によるＭＲＫ１６陽性率を示す図である（左
側がコントロール、右側が試験群）。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平６−78792（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−254691（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−309138（ＪＰ，Ａ) 特表 平10−506881（ＪＰ，Ａ) 国際公開96／4313（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/574 G01N 33/53
Claims (3)
- 【請求項１】 被検細胞に、癌細胞膜表面抗原検出を目
的として用いる抗体、細胞表面抗原を損なわずに細胞の
形態を固定し、かつ細胞膜透過性を亢進させる細胞固定
剤、及び薬剤耐性関連蛋白に対する抗体を反応させ、癌
細胞膜表面抗原で癌細胞集団を特定した後薬剤耐性関連
蛋白に対して陽性な細胞を検出することを特徴とする薬
剤耐性獲得癌細胞の検出方法。 - 【請求項２】 薬剤耐性関連蛋白が、Ｐ糖蛋白である請
求項１記載の検出方法。 - 【請求項３】 癌細胞膜表面抗原検出を目的として用い
る抗体、細胞表面抗原を損なわずに細胞の形態を固定
し、かつ細胞膜透過性を亢進させる細胞固定剤、及び薬
剤耐性関連蛋白に対する抗体を含有する薬剤耐性獲得癌
細胞検出用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11822095A JP3170176B2 (ja) | 1995-05-17 | 1995-05-17 | 薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11822095A JP3170176B2 (ja) | 1995-05-17 | 1995-05-17 | 薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08313528A JPH08313528A (ja) | 1996-11-29 |
| JP3170176B2 true JP3170176B2 (ja) | 2001-05-28 |
Family
ID=14731201
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11822095A Expired - Fee Related JP3170176B2 (ja) | 1995-05-17 | 1995-05-17 | 薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3170176B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2253965C (en) * | 1997-11-22 | 2003-01-21 | Robert A. Levine | Method for the detection, identification, enumeration and confirmation of circulating cancer cells and/or hematologic progenitor cells in whole blood |
| US20130178503A1 (en) * | 2010-06-01 | 2013-07-11 | Biotheryx Inc. | Methods of treating hematologic malignancies using 6-cyclohexyl-1-hydroxy-4-methyl-2(1h)-pyridone |
| EP2607899B1 (en) * | 2011-12-21 | 2016-08-10 | Beckman Coulter, Inc. | Method for labeling intracellular and extracellular targets of leukocytes |
| JP6948778B2 (ja) | 2016-10-26 | 2021-10-13 | シスメックス株式会社 | 細胞情報取得方法および細胞情報取得装置 |
-
1995
- 1995-05-17 JP JP11822095A patent/JP3170176B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08313528A (ja) | 1996-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Han et al. | Human kidney injury molecule-1 is a tissue and urinary tumor marker of renal cell carcinoma | |
| Witzig et al. | Detection of circulating cytokeratin-positive cells in the blood of breast cancer patients using immunomagnetic enrichment and digital microscopy | |
| Bostick et al. | Prognostic significance of occult metastases detected by sentinel lymphadenectomy and reverse transcriptase–polymerase chain reaction in early-stage melanoma patients | |
| Brawer | Prostate‐specific antigen: Current status | |
| Rempel et al. | SPARC: a potential diagnostic marker of invasive meningiomas | |
| Peterson et al. | Ascites analysis by a microfluidic chip allows tumor-cell profiling | |
| Achten et al. | T-cell/histiocyte–rich large B-cell lymphoma: a distinct clinicopathologic entity | |
| McNeel et al. | A transient increase in eosinophils is associated with prolonged survival in men with metastatic castration-resistant prostate cancer who receive sipuleucel-T | |
| Bogusz et al. | Quantitative immunofluorescence reveals the signature of active B-cell receptor signaling in diffuse large B-cell lymphoma | |
| EP1937831B1 (en) | Use of n-myristoyltransferase on non-tumor tissue for cancer diagnosis | |
| Nakata et al. | Clinical significance of serum soluble intercellular adhesion molecule 1 in gastric cancer | |
| Murakami et al. | Circulating aminopeptidase N/CD13 is an independent prognostic factor in patients with non–small cell lung cancer | |
| EP3402515B1 (en) | Improved methods for monitoring immune status of a subject | |
| Harbeck | Immunophenotyping of bronchoalveolar lavage lymphocytes | |
| Imoto et al. | Immunohistochemical Detection of α-Fetoprotein, Carcinoembryonic Antigen, and Ferritin in Formalin-Paraffin Sections from Hepatocellular Carcinoma. | |
| JP3170176B2 (ja) | 薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法 | |
| JP2021523351A (ja) | レンバチニブ及びｐｄ−１アンタゴニストを含む組み合わせ療法のためのバイオマーカー | |
| Oh et al. | PD-L1 detection—pearls and pitfalls associated with current methodologies focusing on entities relevant to dermatopathology | |
| Prok et al. | Thyroid transcription factor–1 staining is useful in identifying brain metastases of pulmonary origin | |
| Weiel et al. | The use of fluorescence in situ hybridization to confirm PRKACA gene rearrangement in fibrolamellar hepatocellular carcinoma: A validation study | |
| CN109116023A (zh) | 一种肺癌标志物抗-mmp12自身抗体及其应用 | |
| Müller et al. | Improved flow‐cytometric detection of low P‐glycoprotein expression in leukaemic blasts by histogram subtraction analysis | |
| JP7162398B2 (ja) | 早期膵がん検出アッセイ | |
| Zipf et al. | Enumeration of cytoplasmic μ immunoglobulin positive acute lymphoblastic leukemia cells by flow cytometry: comparison with fluorescence microscopy | |
| Eguchi et al. | The prognostic potential of fragmented CK18 serum levels in HCC patients reflecting disease progression and overall hepatocyte damage |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |