CN104011542A - 用于标记白细胞的细胞内靶标和细胞外靶标的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于标记白细胞的细胞内靶标和细胞外靶标的方法，以及用于执行所述方法的试剂盒。

Description

用于标记白细胞的细胞内靶标和细胞外靶标的方法
本发明涉及用于标记白细胞的细胞内靶标和细胞外靶标的方法，以及用于执行所述方法的试剂盒。
用诸如单克隆抗体(mAb)的结合剂将白细胞染色是在基础研究以及多种诊断应用中常规执行的重要任务。例如通常必须对白细胞的细胞外以及细胞内标记物进行染色，以便通过特定细胞外表面标记物识别白细胞的特殊亚群，以及通过存在于细胞质中的特定分子识别所述细胞的功能特性。
为了用如mAb在细胞内将白细胞染色并使得它们可通过流式细胞术进行分析，有必要将白细胞透化并将存在于样品中的血红细胞裂解，同时使位于结合剂应当结合至的细胞表面和细胞内部两者处的白细胞的结构维持天然状态。该目标通常通过使用洗涤剂和/或醇类而实现。在使用如甲醛或醇类的固定步骤之后，血红细胞对洗涤剂的抵抗性较白细胞弱，从而允许血红细胞裂解并对透化的白细胞进行分析。
对白细胞进行细胞外染色和细胞内染色的多种方法基于相同的原理。具体地讲，首先将细胞的表面标记物染色，接着进行一个或多个洗涤步骤(即将细胞离心，弃去上清液，然后将它们重悬于新鲜的缓冲液中)，以便移除任何未结合的结合剂。然后将细胞固定，再次进行一个或多个洗涤步骤以移除固定剂，将细胞透化，再次洗涤，随后用细胞内结合剂进行染色，最后再次洗涤。
然而，这些工序不仅耗时(总持续时间最长至2到3小时)，而且十分耗费劳动力。此外，存在至少两个强制离心步骤，使得工序的自动化几乎不可能。此外，离心可能对细胞的结构不利，从而与未经离心的细胞相比，细胞的光散射信号变差。另外，离心始终导致细胞损失和细胞成团。最后，细胞外结合剂和细胞内结合剂必须独立地使用和施加，从而阻止了方便地使用结合剂混合物(cocktail)。
因此，本发明相关的技术问题是提供用于标记白细胞的细胞内靶标和细胞外靶标的改进方法，该方法快速且不那么耗费劳动力，避免了任何离心步骤，允许使用结合剂混合物，并且能够轻松地自动化。
上述技术问题的解决方案通过权利要求中表征的实施例实现。
具体地讲，本发明涉及用于标记白细胞的细胞内靶标和细胞外靶标的方法，该方法包括以下步骤：
(a)形成以下物质的组合：
(i)细胞组合物，所述细胞组合物包含至少白细胞和血红细胞，以及
(ii)第一溶液，所述第一溶液包含能够交联所述白细胞的细胞内蛋白、脂蛋白和核酸的一种或多种试剂；
(b)将第二溶液添加到所述组合中，所述第二溶液包含能够透化所述白细胞、裂解所述血红细胞并中和所述第一溶液中的所述一种或多种试剂的交联活性的一种或多种试剂，
其特征在于，所述第二溶液的添加体积介于所述组合的总体积的1倍和10倍之间；
(c)在添加所述第二溶液的同时或在添加所述第二溶液之后添加特异性地结合到白细胞的细胞外靶标上的至少一种结合剂，以及特异性地结合到白细胞的细胞内靶标上的至少一种结合剂，
其中所述结合剂中的每一种包括可检测试剂；以及
(d)将第三溶液添加到所述组合中，其中所述第三溶液的添加体积等于或大于所述第三溶液添加到其中的所述组合的总体积。
在一些情况下，本发明的方法在本文中被称为INCA法(细胞内无离心测定法)。
在一个实施例中，含有待染色的白细胞的细胞组合物是在悬浮液中含有细胞的生物流体。在另一个实施例中，细胞组合物选自全血、骨髓、腹膜液、脑液、分离的淋巴结和其他分离的组织。在更进一步的实施例中，细胞组合物为全血。
根据一个实施例，在本发明方法的步骤(b)之前，将在步骤(a)中获得的组合温育5至20分钟，在另一个实施例中，温育10至15分钟。根据一个实施例，步骤(a)中使用的能够交联白细胞的细胞内蛋白、脂蛋白和核酸的一种或多种试剂选自甲醛、低聚甲醛和戊二醛。在一个实施例中，在添加第一溶液之后，所述一种或多种试剂以0.5％至2％(v/v)的量包含在所述组合中，并且以介于5％和15％(v/v)之间的量包含在所述第一溶液中。在这个语境中，应当指出的是，执行本发明方法的步骤(a)是为了将包含在细胞组合物中的细胞固定。
在一个实施例中，在本发明方法的步骤(b)中添加的包含一种或多种能够透化所述白细胞、裂解所述血红细胞并中和所述第一溶液中的所述一种或多种试剂的交联活性的试剂的第二溶液包含：(i)含量适于实现将细胞组合物中所包含的基本上所有的血红细胞裂解、而细胞组合物中所包含的大多数白细胞不被裂解的洗涤剂，以及ii)用于中和步骤(a)的所述一种或多种试剂的中和剂。根据一个实施例，所述洗涤剂包含C12型烷烃残基，根据另一个实施例，其包含N-月桂酰基肌氨酸钠，其中根据一个实施例，洗涤剂以0.05％至0.5％(w/v)的量包含在所述第二溶液中，根据另一个实施例，其以0.1％至0.3％(w/v)的量包含在所述第二溶液中。另外，根据一个实施例，所述中和剂为季铵盐或含胺的化合物，根据另一个实施例，所述中和剂为选自氯化铵(NH4Cl)、甘氨酸、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)以及乙醇胺的化合物，其中在更进一步的实施例中，所述中和剂为氯化铵。在一个实施例中，所述中和剂以1至100mM的浓度包含在所述第二溶液中，在另一个实施例中，以5至20mM的浓度包含在所述第二溶液中。在一个实施例中，所述第二溶液的pH为6.5或更低。在另一个实施例中，本发明方法的步骤(b)中所添加的所述第二溶液的添加体积介于步骤(a)中获得的组合的总体积的1倍和10倍之间，在另一个实施例中，介于其4倍和8倍之间，并且在更进一步的实施例中，为其6倍。在这个语境中，应当指出的是，执行本发明方法的步骤(b)是为了将细胞组合物中所包含的白细胞透化并使血红细胞裂解，以及为了中和步骤(a)中添加的所述第一溶液中的所述一种或多种试剂的交联活性。
本发明方法的步骤(c)可以与步骤(b)同时执行。具体地讲，步骤(c)中添加的结合剂可已包含在步骤(b)中添加的第二溶液中。或者，所述结合剂可以在添加所述第二溶液之后添加，其中细胞外结合剂和细胞内结合剂可作为结合剂混合物一起添加，或单独地添加。在一个实施例中，所述结合剂为分子染色剂，在另一个实施例中其为抗体，在更进一步的实施例中其为单克隆抗体。另外，对包括在所述结合剂中的可检测试剂没有特别限制，其中合适的可检测试剂是本领域中已知的。根据一个实施例，所述可检测试剂选自生物素、酶以及荧光部分或荧光化合物，其中，根据另一个实施例，其为荧光部分或荧光化合物。在一个实施例中，在步骤(d)之前，将在步骤(c)中获得的组合温育15至60分钟，在另一个实施例中，温育30至45分钟。在这个语境中，应当指出的是，执行本发明方法的步骤(c)是为了将包含在细胞组合物中的白细胞染色。
根据一个实施例，在本发明方法的步骤(d)中添加到所述组合(即，添加到在步骤(c)中所获得的组合中)的第三溶液包含(i)固定剂，其在一个实施例中选自甲醛、低聚甲醛和戊二醛，以及(ii)洗涤剂，其根据一个实施例包含C12型烷烃残基，根据另一个实施例，其包含N-月桂酰基肌氨酸钠。在一个实施例中，上述固定剂以介于0.01％和1％(v/v)之间的量包含在第三溶液中，并且上述洗涤剂以0.01％至0.5％(w/v)的量。在另一个实施例中，第三溶液还包含选自硫酸葡聚糖和Pluronic F-68的化合物，所述Pluronic F-68为具有线性式(C3H6O.C2H4O)x的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。根据一个实施例，所述另外的化合物以0.1％(w/v)的量包含在第三溶液中。
在一个实施例中，本发明的方法在步骤(d)之前、或步骤(b)或步骤(c)之后不包含任何离心步骤(如，用于纯化所述白细胞)，或任何额外的洗涤步骤。
在另一个实施例中，本发明的方法在步骤(d)之后包括一个洗涤步骤，即，将细胞离心、弃去上清液以及将细胞重悬于合适体积的步骤(d)中所用的第三溶液中的步骤。该洗涤步骤可以改善信噪比(在处理相当暗淡的染色时这尤其有用)，并将细胞进一步浓缩。
在另一个实施例中，本发明的方法还包括根据一个实施例通过流式细胞术检测结合在白细胞上的结合剂的步骤。
在另一个实施例中，本发明方法的所有方法步骤均在室温下进行。
在一个更进一步的实施例中，本发明的方法是自动方法。
在另一方面，本发明涉及用于执行本发明方法的试剂盒，其包括第一溶液、第二溶液和第三溶液，其中所述第一溶液、第二溶液和第三溶液如上文所限定。
在一个具体实施例中，本发明的试剂盒包括：
(a)第一溶液，所述第一溶液包含浓度介于5％和15％(v/v)之间的甲醛；
(b)第二溶液，所述第二溶液包含：
(i)浓度为1至100mM的氯化铵(NH4Cl)，和
(ii)浓度为0.05％至0.5％(w/v)的N-月桂酰基肌氨酸钠；以及
(c)第三溶液，所述第三溶液包含：
(i)浓度介于0.01％和1％(v/v)之间的甲醛，和
(ii)浓度为0.01％至0.5％(w/v)的N-月桂酰基肌氨酸钠。
在另一个实施例中，本发明的试剂盒还包括：
(a)包含可通过流式细胞术检测的标记的至少一种结合剂，其中所述结合剂特异性地结合到白细胞的细胞外靶标上；以及
(b)包含可通过流式细胞术检测的标记的至少一种结合剂，其中所述结合剂特异性地结合到白细胞的细胞内靶标上；
其中所述细胞外结合剂和细胞内结合剂在单独的管中提供，或作为所述第二溶液的组分提供，并且
其中结合剂和相应可检测标记如上文所限定。
在本发明的方法和试剂盒的某些实施例中，上述第一溶液、第二溶液和第三溶液还可包含适当浓度的适当额外组分，诸如缓冲物质，如2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)或磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)；盐，如氯化钠；血清或血清组分，如牛血清白蛋白；以及防腐剂，如Proclin(5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)。
本发明有利地提供用于标记白细胞的细胞内靶标和细胞外靶标的改进方法，以及用于执行所述方法的相应试剂盒。具体地讲，对于添加溶液的各步骤，通过选择适当的试剂组合物和稀释比，可以省略所有的耗时且耗力的离心步骤。这显著地加快工序的速度，此外保护了细胞的结构，使得(如)与离心的细胞相比，光散射性质有所改善。另外，温和的固定步骤使白细胞的表面结构保持完整，并且剩余的固定剂在透化期间失活，使得细胞甚至在固定之后也能够用细胞外结合剂进行染色。因此，本发明的方法能够使用包括细胞外结合剂和细胞内结合剂的相应拌合物(mix)的混合物。
附图示出：
图1：
显示执行本领域已知的方法(“Intraprep”和“VersaLyse/Fix”)和本发明方法(“INCA”)所需的时间量和工作量的工作负荷比较。每格代表5分钟的时间；浅灰格显示温育时间，深灰格显示工作时间。
图2：
通过本领域已知的方法(“Intraprep”)和本发明方法(采用额外的洗涤步骤，或者不采用额外的洗涤步骤(“INCA洗涤”和“INCA不洗涤”))使用PE标记的抗ZAP-70抗体将正常人全染色。点状图示出使用抗体进行细胞内染色(FL2)相对于侧向散射的关系。
图3：
通过本领域已知的方法(“Intraprep”)和本发明方法(采用额外的洗涤步骤，或者不采用额外的洗涤步骤(“INCA洗涤”和“INCA不洗涤”))使用FITC标记的抗CD4抗体和Alexa647标记的抗FoxP3抗体将正常人全血染色。点状图示出使用抗CD4抗体进行表面染色(FL1)相对于使用抗FoxP3抗体进行细胞内染色(FL4)的关系。
现将在以下实例中对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实例。
实例
实例1：
使用PE标记的抗ZAP-70抗体将正常人全血染色
通过本领域已知的方法(“Intraprep”)和本发明方法(采用额外的洗涤步骤，或者不采用额外的洗涤步骤(“INCA洗涤”和“INCA不洗涤”))使用PE标记的抗ZAP-70抗体将正常人全血染色，随后通过流式细胞术进行分析。溶液1、2和3以及所用的方法与实例4的对应。图2示出了使用抗体进行相应染色(FL2)相对于侧向散射的关系。与现有技术方法相比，根据本发明的方法将等量的细胞染色，并显示与未染色细胞的更清晰分离，其中RMFI(相对平均荧光强度，其为信噪量的量度)为30(INCA洗涤)和15(INCA不洗涤)。
实例2：
使用FITC标记的抗CD4抗体和Alexa647标记的抗FoxP3抗体将正常 人全血染色
通过本领域已知的方法(“Intraprep”)和本发明方法(采用额外的洗涤步骤，或者不采用额外的洗涤步骤(“INCA洗涤”和“INCA不洗涤”))使用FITC标记的抗CD4抗体和Alexa647标记的抗FoxP3抗体将正常人全血染色，随后通过流式细胞术进行分析。图3示出使用抗CD4抗体进行相应染色(FL1)相对于使用抗FoxP3抗体进行细胞内染色(FL4)的关系。本领域中已知的方法仅将细胞的0.36％的小群体染色，而包含额外洗涤步骤的本发明方法将4.3％的大量群体染色。
实例3：
使用各种细胞内抗体将正常人全血染色
通过本领域已知的方法(“Intraprep”)和本发明方法(如上所述，采用额外的洗涤步骤，或者不采用额外的洗涤步骤(“INCA洗涤”和“INCA不洗涤”))使用各种细胞内抗体将正常人全血染色。相应染色的结果在下表1中示出。
结果显示，本发明方法提供的染色结果至少能与现有技术方法可比，且在多数情况下比现有技术方法的更优越。
表1：染色质量
抗体 Intraprep INCA洗涤 INCA不洗涤
CD125-PE ++ ++ +
APO2.7-PE + ++ ++
DAP-12-PE + ++ +
FoxP3-Alexa647 - ++ -
Tia-1-PE ++ ++ ++
ZAP-70-PE + ++ +
MPO-FITC ++ + +
Lactoferrin-PE ++ + +
CD79a-PE + ++ ++
IFNg-PE ++ ++ +
TNFa-PE ++ ++ +
CyclinA2-FITC - ++ ++
TdT-FITC - ++ ++
++：最佳情况
+：非最佳，但染色能用
-：未充分染色
实例4：
不采用洗涤步骤将人全血染色
在下文中，使用克罗梅橙(Krome Orange)标记的抗CD45抗体、FITC标记的抗CD5抗体、APC标记的抗CD19抗体或PE标记的抗ZAP-70抗体将人全血样品染色。虽然抗CD19抗体针对的是细胞外表位，但是抗ZAP-70抗体针对的是细胞内表位。
制备了以下溶液并用于该实例：
为了说明细胞内表位和细胞外表位是否能够使用本发明染色，采用以下方式对人全血样品(WBS)进行处理。
首先，将50μl WBS与5μl溶液1混合，并温育15分钟。随后添加300μl溶液2，连同指示的各10μL的标记抗体。在温育40分钟后，添加3000μl溶液3，并涡旋混合物。
使用流式细胞仪设备对上述混合物执行分析。结果显示，细胞内表位和细胞外表位两者均被成功染色。当将上面概述的具有洗涤步骤的方法与如上面概述的不包含洗涤步骤的方法相比时，未能看出差异。两种方法均显示出充分染色。
实例4a：
实例4的变型
为了查明本发明的方法是否是能够成功地用于多种条件的稳健方法，测试了实例4中所公开的溶液1、2和3的若干变型。
在每种情况下，将50μl WBS与5μl溶液1(R1)混合，并温育15分钟。随后添加300μl溶液2(R2)，连同指示的各10μL的标记抗体。在温育30分钟后，添加3000μl溶液3(R3)，并涡旋混合物。
如本文下方的表2中所示，对设定进行选择，其中或者改变溶液1的量，或者改变溶液2的成分的浓度，和/或改变溶液3的成分的浓度。在各种设定中，若干试剂的浓度较之参考样品改变了+或-20％。参考实例是表2和表3中的实验编号1。
在下表中，将溶液1称为R1，将溶液2称为R2，并将溶液3称为R3。
表2：溶液1、2和3的变型
针对在检测细胞内表位和细胞外表位的过程中与参考实验编号1相比的信噪比偏差，测试了上述实验设定。
下面的表3提供了有关3个细胞内靶标和2个细胞外靶标的信号/噪声值。使用的缀合物为抗MPO-FITC、抗CD79a-PE、抗CD3-ECD(IOTest3与PN IM3464U混合物)和抗CD14-PC7(PN A22331)。
表3：表2的设定的信噪比
可以看出，表2中概述的所有实验变型在信噪比方面表现同样出色。因此，本发明提供了用于检测细胞内表位和细胞外表位的稳健系统和方法，其对包含各种浓度的缓冲成分的众多缓冲组合物均表现良好。
实例5：
额外洗涤步骤的影响
为了查明额外的洗涤步骤是否对上文获得的结果具有任何负面影响，添加另外的洗涤步骤对实例4的条件进行改变。
具体地讲，制备如上面的实例4中所概述的溶液1、2和3，然后执行下面的使用标记抗体将人全血样品(WBS)染色的方法。
首先，将50μl WBS与5μl溶液1混合，并温育15分钟。随后添加300μl溶液2，连同指示的各10μL的标记抗体。在温育40分钟后，添加3000μl溶液3，并涡旋混合物。最后，除上述之外，还将细胞悬浮液离心(500g,5min)，弃去上清液，然后将细胞沉淀物重悬于500μl的溶液3中。
使用上述方法获得的结果与实例4中获得的结果没有差异。因此，额外的洗涤步骤对获得的结果不具有任何本质影响。这再一次显示根据本发明的系统和方法对于各种参数而言均是稳健的。
实例6：
pH变化的影响
为了说明所用溶液pH值的差异对根据本发明的系统和方法的结果的影响，对实验设定进行选择，其中对溶液2的pH进行改变。
就实验设定而言，用于如实例4中所概述将人全血样品染色的方法采用如针对实例4a的表2中给出的参考实验编号1所概述的溶液1、2和3的变型执行。具体地讲，确定所述信噪比是否受溶液2pH变化的显著影响。通过使用PE标记的抗ZAP-70抗体完成对人全血样品的染色。
如可从下表4所得出，当溶液2的pH从pH6.00变化到pH6.91时，所述信噪比没有显著差异。
表4：溶液2pH的变化
裂解pH 6.00 6.12 6.26 6.35 6.46 6.60 6.74 6.91
RMFI 34.3 33.4 35.9 35.9 33.6 30.9 28.0 26.9

Claims (13)

1.一种用于标记白细胞的细胞内靶标和细胞外靶标的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)形成以下物质的组合：
(i)细胞组合物，所述细胞组合物包含至少白细胞和血红细胞，以及
(ii)第一溶液，所述第一溶液包含能够交联所述白细胞的细胞内蛋白、脂蛋白和核酸的一种或多种试剂；
(b)将第二溶液添加到所述组合中，所述第二溶液包含能够透化所述白细胞、裂解所述血红细胞并中和所述第一溶液中的所述一种或多种试剂的交联活性的一种或多种试剂，
其中所述第二溶液包含：
(i)量为0.05％至0.5％(w/v)的洗涤剂，和
(ii)浓度为1至100mM的季铵盐或含胺的化合物，
其中所述第二溶液的pH为6.5或更低，并且
其中所述第二溶液的添加体积介于所述组合的总体积的1倍和10倍之间；
(c)在添加所述第二溶液的同时或在添加所述第二溶液之后添加特异性地结合到白细胞的细胞外靶标上的至少一种结合剂，以及特异性地结合到白细胞的细胞内靶标上的至少一种结合剂，
其中所述结合剂的每一种包括可检测试剂；以及
(d)将第三溶液添加到所述组合中，其中所述第三溶液的添加体积等于或大于所述第三溶液添加到其中的所述组合的总体积。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞组合物选自全血、骨髓和腹膜液。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)之前，将在步骤(a)中获得的所述组合温育5至20分钟。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之前，将在步骤(c)中获得的所述组合温育15至60分钟。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在添加所述第一溶液之后，步骤(a)的所述一种或多种试剂以0.5％至2％(v/v)的量包含在所述组合中。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(a)的一种或多种试剂选自甲醛、低聚甲醛和戊二醛。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第二溶液包含：
(i)含量适于实现将所述细胞组合物中所包含的基本上所有的血红细胞裂解，而所述细胞组合物中所包含的大多数白细胞不被裂解的洗涤剂，以及
(ii)用于中和步骤(a)的所述一种或多种试剂的中和剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中，所述第二溶液的添加体积介于所述组合的总体积的4倍和8倍之间。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之前不执行离心步骤。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之后或步骤(c)之后不执行离心步骤。
11.一种用于执行根据权利要求1至10中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)第一溶液，所述第一溶液包含选自甲醛、低聚甲醛和戊二醛的化合物；
(b)第二溶液，所述第二溶液包含：
(i)季铵盐或含胺的化合物，和
(ii)洗涤剂；以及
(c)第三溶液，所述第三溶液包含：
(i)选自甲醛、低聚甲醛和戊二醛的化合物，和
(ii)洗涤剂。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中
(a)所述第一溶液包含浓度介于5％和15％(v/v)之间的甲醛；
(b)所述第二溶液包含：
(i)浓度为1至100mM的氯化铵(NH4Cl)，和
(ii)浓度为0.05％至0.5％(w/v)的N-月桂酰基肌氨酸钠；以及
(c)所述第三溶液包含：
(i)浓度介于0.01％和1％(v/v)之间的甲醛，和
(ii)浓度为0.01％至0.5％(w/v)的N-月桂酰基肌氨酸钠。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括：
(a)包含可通过流式细胞术检测的标记的至少一种结合剂，其中所述结合剂特异性地结合到白细胞的细胞外靶标上；以及
(b)包含可通过流式细胞术检测的标记的至少一种结合剂，其中所述结合剂特异性地结合到白细胞的细胞内靶标上；
其中所述细胞外结合剂和所述细胞内结合剂在单独的管中提供，或作为所述第二溶液的组分提供。
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