CN101115388B - 细胞透化和稳定试剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种细胞透化和稳定试剂及其使用方法。该试剂含有:N-酰基肌氨酸或其盐;pH调节剂,将试剂的pH调节至大约4~6的范围;和一种水介质;该试剂具有低离子强度,这由其电导率小于9.0mS/cm所确定。该试剂进一步含有牛血清白蛋白和甘油。该试剂可以进一步包括烷基硫酸盐表面活性剂。当用该试剂孵育细胞时,试剂渗透过细胞膜,使得胞内标记物渗透细胞膜,引起胞内蛋白质在细胞膜内聚集,同时保留细胞组分使其与细胞标记物结合,以便接着通过流式细胞术进行分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞透化和稳定试剂及其用于制备含有细胞的样品以分析细胞组分的使用方法。背景技术
在分子水平上分析细胞内部组分是人们的迫切要求。最近出现了数种探针和抗体,其通常可用于常规研究并且指示胞内结构。这些探针和抗体,因为它们的大分子特性使其本身不能通过细胞膜渗入细胞。因此需要对细胞进行处理,以便使细胞膜变得可渗透(透化级)。这种处理会造成外部类脂膜的重大改性,并且取决于所使用的方法,可以导致细胞形态的丧失,或者甚至导致整个细胞的死亡。
标准的透化方法包括在显微镜载玻片上或者在悬浮液中,通过在低温(-20℃)下用醇稀释来处理细胞。该方法的优点在于分子结构和胞内靶抗原保存得很好。但除步骤复杂并且使用低温之外,在处理的末尾,细胞形态基本上被改变了。
有几种透化方法使用了细胞固定术,其使用脂族醛对蛋白质进行化学修饰,这会导致蛋白质的交联和聚集。通过用醇或表面活性剂处理,实现了细胞透化。脂族醛固定术因为透化后细胞的形态保存优良而特别为人所知。然而,从蛋白质分子水平上讲,许多抗原位点被固定方法破坏。
在有机溶剂、醇类、弱碱和弱酸组成的组中通常会找到用于使细胞渗透化的试剂。这些试剂使细胞膜透化,然而它们通常不能使细胞形态稳定化。
因此人们渴望有一种用于细胞透化的试剂,其会在透化后仍能保护细胞的形态,并且不会改变细胞内外的抗原位点。发明内容
在一种实施方式中,本发明的目的在于提供一种细胞透化和稳定试剂,其包括N-酰基肌氨酸或其由下述分子结构式表示的盐:R1-CO-N(CH3)CH2COOX1,其中R1是具有8~18碳原子的烷基或亚烷基团,而X1是H、Na+或K+;pH调节剂,将所述试剂的pH调节至小于7;以及一种水介质。该试剂具有低离子强度,这由其电导率小于9.0mS/cm所确定。优选N-酰基肌氨酸是N-月桂酰肌氨酸或其盐,试剂的pH范围是大约4~6,并且电导率小于1.2mS/cm。
优选该透化和稳定试剂进一步包括牛血清白蛋白和甘油,以增强细胞膜的渗透性,并且使表面活性剂稳定化。
任意地,该透化和稳定试剂可以进一步包含由下述分子结构式表示的阴离子表面活性剂:R2-O-SO3X2;其中R2是具有8~18碳原子的烷基或亚烷基团;而X2是Na+、K+、NH4 +或NH2C(CH2OH)3。阴离子表面活性剂优选三(十二烷基)硫酸盐。
在另一种实施方式中,本发明的目的在于提供一种渗透过细胞膜并且保留细胞的细胞组分以用于流式细胞术分析的方法。该方法包括如下步骤:使含有细胞的样品与细胞透化和稳定试剂混合以形成样品混合物;样品混合物孵育足够的时间以便渗透过细胞膜;促使胞内蛋白质在细胞膜内聚集,同时保留细胞组分用于与细胞标记物结合;将细胞标记物加入样品混合物,并且将样品混合物再孵育一段时间,以使得细胞标记物与被保留的细胞组分相结合。该方法可以进一步包括,在将细胞标记物结合于在样品混合物中的细胞组分之后固定细胞。可以在流式细胞仪上通过光散射和荧光分析来分析该样品混合物。附图说明
图1显示了pH和表面活性剂的使用对于血液不同组分中蛋白质的沉淀影响:顶部左侧,血清;顶部右侧,牛血清白蛋白;底部左侧,可溶性细胞组分;底部右侧,细胞膜组分。
图2A至2J显示了pH和表面活性剂的使用对红血球保存和透化的影响。
图3A至3J显示了pH和表面活性剂的使用对白血球保存和透化的影响。
图4A至4F显示了通过使用胎儿血红蛋白抗原(HbF)和i检测血液中F细胞和胎细胞的结果。
图5A至5F显示了通过分别使用α-微管蛋白和HbAlc抗原来检测血液中α-微管蛋白和糖化血红蛋白(HbAlc)的结果。具体实施方式
在一种实施方式中,本发明提供了一种用于制备流式细胞术分析用细胞的细胞透化和稳定试剂。该细胞透化和稳定试剂包括:(a)N-酰基肌氨酸或其由下述分子结构式表示的盐:R1-CO-N(CH3)CH2COOX1其中R1是具有8~18碳原子的烷基或者亚烷基团,而X1是H、Na+、或K+;(b)pH调节剂,将试剂的pH调节至小于7;以及(c)水介质。
该试剂具有低离子强度,这由其电导率小于9.0mS/cm所确定。
该透化和稳定试剂优选是微酸性的,pH范围为大约4~6。更优选试剂的pH是从大约4.6~5.6。优选pH调节剂是强碱或强酸,因此,可用少量化合物将pH调节至所要求范围之内。在一种优选实施方式中,使用N-酰基肌氨酸游离酸,并且使用吡咯烷这种强的有机碱、或者NaOH这种强的无机碱来将pH调节在4和6之间。如果使用N-酰基肌氨酸盐,那么可使用强酸比如HCl来调节pH。
研究发现,在使细胞受到透化和稳定试剂作用时,胞内蛋白质在细胞膜内的聚集(这对在透化以后保持细胞完整性来说是必要的)在低离子强度下更有效果。为本发明的目的,含水试剂组合物的离子强度是由试剂的电导率确定的。当离子强度过高时,例如当试剂的电导率高于9mS/cm时,该试剂不再使胞内蛋白质聚集,并且细胞会失去完整性。优选透化和稳定试剂的电导率小于1.2mS/cm。因为离子化合物比如盐是对试剂离子强度的主要贡献者,优选该试剂具有低的盐浓度。
优选细胞透化和稳定试剂可以进一步包含牛血清白蛋白(BSA)和甘油。牛血清白蛋白增强了表面活性剂在水溶液中的溶解性,因此对试剂的长期使用和储存有好处。研究发现,牛血清白蛋白和甘油组合使用会进一步增强试剂的细胞膜渗透性。
可使用游离酸形式的商品N-酰基肌氨酸以及其商品盐。优选使用游离酸形式,其不在试剂中导入金属离子。游离酸形式的N-酰基肌氨酸不溶于水。可以将其预先溶于乙醇溶液,然后将其加入水溶液中。当试剂的pH由pH调节剂调节至4~6时,N-酰基肌氨酸在溶液中呈阴离子形式。
N-酰基肌氨酸的合适例子包括N-油酰基肌氨酸、N-硬脂酰肌氨酸、N-月桂酰肌氨酸、N-十四酰肌氨酸、N-椰油基肌氨酸、及其盐。优选R1为具有12个碳原子的烷基或亚烷基团。在一种优选实施方式中,使用N-月桂酰肌氨酸。
在另一种实施方式中,细胞透化和稳定试剂可以进一步包含由下述分子结构式表示的阴离子表面活性剂:R2-O-SO3X2其中R2是具有8~18碳原子的烷基或亚烷基团;而X2是Na+、K+、NH4 +或NH2C(CH2OH)3(即,三(羟甲基)-氨基甲烷)。
优选阴离子表面活性剂的R2为具有12个碳原子的烷基或亚烷基团。合适的例子包括钠、钾、铵、以及三(羟甲基)氨基甲烷的十二烷基硫酸盐。在一种优选实施方式中,使用三(羟甲基)氨基甲烷十二烷基硫酸盐,其在下文是指三(十二烷基)硫酸盐。
N-酰基肌氨酸或其盐,或者其与烷基或亚烷基硫酸盐表面活性剂的组合,要有足够的含量使得试剂能够渗透过细胞的细胞膜,以便胞内标记物渗透,同时基本上维持细胞膜和细胞组分,使它们专一性地结合细胞标记物,以便通过流式细胞技术进行分析。研究发现,两者的表面活性剂浓度范围可以是大约0.01mM~100mM,优选0.1mM~10mM,更优选1mM~5mM。在一种实施方式中,使用2.3mM的N-月桂酰肌氨酸。在另一种实施例中,使用0.5mM的三(十二烷基)硫酸盐和2.2mM的N-月桂酰肌氨酸的混合物。
可选择地,透化和稳定化可以进一步包含有机的重量克分子渗透浓度调节剂。重量克分子渗透浓度调节剂的合适例子包括但不限于乙二醇、二甲基亚砜、糖类、或者甘油。优选使用糖类或甘油。糖类可以是多糖,比如双糖或单糖。优选使用单糖,比如(D+)葡萄糖。
此外,透化和稳定化可以进一步包含一种或多种防腐剂。其合适的例子包括抗菌剂和抗氧化剂,用于延长试剂保存期限。该防腐剂的含量应使试剂的功能不受影响。
实施例1显示了本发明的三种示例性试剂组合物。
研究发现,当本发明的细胞透化和稳定试剂与细胞混合时,其可以有效地渗透过细胞膜,该细胞膜能够使胞内标记物渗透进入细胞以用于细胞分析;并且试剂还会引起胞内蛋白质沉淀或者聚集在细胞膜内。然而同时,试剂保留着细胞组分比如胞内和细胞表面的抗原位点、DNA和RNA分子、以及细胞骨架成分。
为本发明的目的,术语“细胞组分”包括细胞膜内的细胞组分、以及在细胞膜表面上的细胞组分比如细胞表面抗原位点。而术语“胞内组分”是指细胞膜内的细胞组分,其包括但不限于,胞内蛋白质比如红血球内的血红蛋白和血红蛋白变异体、细胞骨架成分、以及DNA和RNA。所述细胞骨架成分包括但不限于微管蛋白和膜收缩蛋白。
如上所述浓度的表面活性剂具有如下特性:在微酸性的pH下会引起多肽和蛋白质聚集,这不会使胞内抗原位点变性,并且不破坏细胞膜。为了发生渗透性并且使抗体与抗原位点反应,优选在提高的pH下导入抗体。研究发现,在用细胞透化和稳定试剂处理细胞之后、以及在用固定剂固定细胞之前,细胞组分会稳定足够的时间,以便允许添加含盐物和缓冲培养基,以使抗体与胞内抗原发生反应。这些特性将在下面的实施例中详细阐明。
应当理解,本发明的细胞透化和稳定试剂中表面活性剂产生的影响基本上不同于典型地用于制备血样的表面活性剂所产生的影响,在后者的情况下表面活性剂会引起细胞溶解。在后者的情况下是破坏红血球细胞膜以释放出血红蛋白,以便用于血红蛋白测定,或者用于白血球测定。
在另一种实施方式中,本发明提供一种使用本发明的试剂来渗透细胞膜并稳定细胞组分的方法,用于在流式细胞仪上分析细胞组分。
更具体地讲,该方法包括下述步骤:使含有细胞的样品与本发明的细胞透化和稳定试剂混合以形成样品混合物;将所述样品混合物孵育足够长的时间,以渗透过细胞膜,促使胞内蛋白质在所述细胞膜内聚集,并且保留细胞组分以便与细胞标记物结合。该方法进一步包括下述步骤:将细胞标记物加入所述样品混合物,并且将样品混合物再次孵育一段时间,使得细胞标记物与受保留的细胞组分相结合。任选地,该方法可以进一步包括在细胞标记物与细胞组分结合后、将固定剂加入样品混合物以固定细胞的步骤。然后将该样品混合物导入流式细胞仪以便分析所研究的细胞组分。
在此使用的术语“细胞标记物”包括但不限于,胞内蛋白质抗原位点的特异性抗体、细胞表面抗原位点的特异性抗体、或者细胞骨架成分的特异性抗体;DNA或RNA分子的特异性核酸染料和特异性核酸探针,比如低聚核苷酸探针。优选细胞标记物用荧光染料标记。另外,对胞内组分具有特异性的细胞标记物还被称作胞内标记物。
研究发现,样品与细胞透化和稳定试剂的孵育可以在室温下进行5秒钟以上,优选大约5分钟。在添加细胞标记物后的第二次孵育可以进行大约2分钟以上,优选大约15分钟。
在显微镜载玻片上,使用本发明的细胞透化和稳定试剂的待分析细胞可以是组织细胞,或者是来源于培养物中细胞系的细胞,或者是存在于生物制品液体的细胞,特别是血细胞,并且尤其是指红血球或白血球。待分析细胞可以位于人体的组织、位于显微镜载玻片上,或者位于悬浮液中。
更具体地,本发明的细胞透化和稳定试剂可以用于血液学领域,以进行红血球细胞组分分析。更具体地讲,试剂可以用于疾病的研究和诊断,该疾病与不同形式的血红蛋白和异常形式的血红蛋白有关,例如孕妇体内胎儿出血与胎儿血红蛋白有关,或者糖尿病与乙二醇血红蛋白有关。这有可能用于检测红血球感染剂,比如疟疾。
实施例2至4显示了实施例1中组合物C的pH和透化和稳定试剂中表面活性剂的影响。
图1显示了pH和实施例1的组合物C中所含表面活性剂对于血清组分沉淀、可溶性细胞组分(胞质液)沉淀、以及如实施例2中所述细胞膜制品的沉淀的影响。就蛋白质聚集而言,在除牛血清白蛋白制品外的每个制品中显示出了酸性pH和表面活性剂之间的协同效应。在胞质液样品中,因为存在血红蛋白,协同效应非常强烈,在胞质液样品与透化试剂发生反应时聚集和沉淀很明显。在膜组分样品中,协同作用似乎相对较弱,但该结果因表面活性剂溶解细胞膜的脂质部分而被掩蔽,导致第4栏OD650(OD650?)值被低估。
图2A至2J显示了pH和实施例1中组合物C所含表面活性剂对于细胞形态维持和抗体渗透红血球的影响。
在pH 7.0并且不存在表面活性剂时,红血球显示为图2A中较上面群落,与较下方群落的血小板和碎片较好地分离。图2B显示出抗微管蛋白-荧光素N-异硫氰酸盐(FITC)抗体对红血球没有渗透性。
在pH 5.0并且不存在表面活性剂的情况下(图2C和2D),形态和渗透性与前面的情况大体相同。另一方面,图2E和2F显示了在pH 7.0并且存在表面活性剂时对红血球的破坏。
图2G和2H显示,在用实施例1中组合物C孵育血液后,红血球保存得很好。图2H中所示细胞群清楚地显示了细胞与抗微管蛋白-FITC抗体的结合,并且显示出红血球被抗微管蛋白-FITC抗体渗透的情况。图2I和2J显示了用实施例1中组合物C处理、但用偶联于FITC的同型对照抗体孵育的血液,该抗体对于任何已知的细胞组分都是非专一性的。图2J显示了细胞与对照抗体非常低的结合性或者没有结合性,这证实了抗微管蛋白-FITC抗体反应的特异性。
图3A至3J显示了pH和表面活性剂对白血球维持和渗透性的影响。在红细胞和粒细胞分离后,将单核外围细胞与pH 7.0、无表面活性剂的透化试剂混合。图3A显示方框内的淋巴细胞群落。较下方群落是血小板和碎片。在上述情况下,淋巴细胞对于抗微管蛋白抗体而言是不可穿透的,如图3B所示。
图3C和3D显示了使用pH 5.0、无表面活性剂的透化试剂得到的结果,其类似于3A和3B中观察到的情况。而图3E和3F,使用的透化试剂是pH 7.0并且含有表面活性剂。观察到淋巴细胞的破坏情况。
而图3G和3H,使用了实施例1中组合物C,其含有表面活性剂并且为pH 5.0。图3H中所示细胞清楚地显示出淋巴细胞被抗微管蛋白-FITC抗体渗透。图3I和3J显示了使用非专一性同型对照抗体所得到的结果。图3J显示了细胞与对照抗体非常低的结合性或者没有结合性,这证实了抗微管蛋白-FITC抗体反应的特异性。
实施例5显示了使用细胞透化和稳定试剂进行胎儿血红蛋白分析的方法。
图4A至4F显示胎儿红血球通过抗HbF-FITC进行胞内标记以及通过抗i-藻红蛋白(PE)进行胞外标记而被识别的情况。更具体地讲,单个的分布图是:图4A、4B和4C:在无钙时标记。图4D、4E和4F:当存在1mM钙时标记。图4A和4D:血液组分分布图。通过设置界限已经将血小板和碎片从分布图中消除。
图4B和4E:在通过FL4上CD 45-PC 5消除白血球后进入方框内的红血球群落。
图4C和4F显示了象限3内(底部左侧)的成熟红血球(HbF-,i+)、象限2内(顶部右侧)的胎儿红血球(HbF+,i+)、和象限4内(底部右侧)的F细胞(HbF+,i-)。
实施例6显示了使用本发明的细胞透化和稳定试剂、在流式细胞仪上通过荧光检测α-微管蛋白和糖化血红蛋白(HbAlc)的情况。
实验表明,本发明的透化试剂能渗透过细胞膜,引起胞内蛋白质沉淀,并且同时维持细胞组分以便特异性地结合其细胞标记物,用于使用光散射和荧光进行流式细胞术分析。
下述实施例用于说明本发明,而决不应解释为限制本发明的保护范围,本发明的保护范围通过权利要求书予以限定。应当理解,根据本公开,可以使用多种其它组分和配比。实施例1:透化试剂组合物组合物A
制备以下透化和稳定试剂组合物。
N-月桂酰肌氨酸 | 2.3mM |
吡咯烷和HCl | 调节pH至5.3的量 |
更具体地讲,首先制备出N-月桂酰肌氨酸备用液。将1.0g的N-月桂酰肌氨酸(Fluka公司)预先溶于1.5ml乙醇(96%)。将180μl吡咯烷(Aldrich公司)加入95ml去离子水中。然后将N-月桂酰肌氨酸/乙醇溶液加入吡咯烷溶液;用吡咯烷或者HCl调节pH至5.6,并且用去离子水将体积调节至100ml以形成备用液。用去离子水将试剂总体积调节至100ml。用去离子水将6.25ml备用液稀释至100ml,并用吡咯烷或HCl调节pH至5.3,从而制备出透化和稳定试剂组合物。该组合物A的电导率为0.1mS/cm。组合物B
将以下每种化合物溶解于去离子水中,制备出下述透化试剂组合物。
N-月桂酰肌氨酸 | 2.3mM |
牛血清白蛋白 | 1.1g/L |
甘油 | 1.08M |
吡咯烷和HCl | 调节pH至5.3的量 |
试剂组合物电导率为0.25mS/cm。如上所述,加入N-月桂酰肌氨酸作为备用液。组合物C
将下述每种化合物溶解于去离子水中,制备出透化试剂组合物。
N-月桂酰肌氨酸 | 2.2mM |
三(十二烷基)硫酸盐 | 0.5mM |
琥珀酸 | 4mM |
硼酸 | 40mM |
D(+)葡萄糖 | 166mM |
吡咯烷和HCl | 调节pH至5.3的量 |
试剂组合物的电导率为0.5mS/cm。如上所述,加入N-月桂酰肌氨酸作为备用液。实施例2:pH、表面活性剂、以及pH和表面活性剂的组合对红血球不同组分的沉淀的影响
将一些用0.7mM乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂处理过的血液,用于制备血清。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤另外一些用EDTA处理过的血液,并且用9倍体积的水稀释,得到细胞裂解液。将2000g细胞裂解液离心15分钟,分离出可溶性细胞组分和细胞膜组分。将含有细胞膜组分的颗粒与一体积的水混合,混合液含有5%体积的可溶性细胞组分。
在与实施例1中组合物C和下述改性试剂混合后,监测血清、可溶性细胞组分、细胞膜组分、以及作为对照的牛血清白蛋白的沉淀情况:1.改性试剂1:不添加表面活性剂(三(十二烷基)硫酸盐和N-月桂酰肌氨酸)的实施例1中组合物C,pH 7.0。2.改性试剂2:不添加表面活性剂(三(十二烷基)硫酸盐和N-月桂酰肌氨酸)的实施例1中组合物C,pH 5.0。3.改性试剂3:实施例1中组合物C,pH 7.0。4.透化试剂4:上述实施例1中组合物C(pH 5.0)。
通过将2ml如上所述专一性试剂与下述四种组分之一混和,制备出样品混合物:-0.01ml血清(A),-0.01ml牛白蛋白为15%(w/v)的制品(B),-0.1ml可溶性细胞组分(C),和-0.1ml细胞膜组分(D)。
为了确定样品混合物制备一小时后的蛋白质沉淀情况,于650nm处测量样品混合物的吸光度,在该波长下,组分的主成分血红蛋白不吸收光波。
图1显示了pH和试剂中表面活性剂对下述物质中细胞组分沉淀的影响:血清、15%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)制品;可溶性细胞组分(胞质液);以及细胞膜组分。上述每一种参照细胞组分的柱状图表用于从左到右显示了使用改性试剂1至3和透化试剂4得到的结果。
图1显示,仅有如上所述pH低的含表面活性剂的透化试剂4,会导致蛋白质聚集和沉淀。实施例3:pH、表面活性剂、以及酸性pH和表面活性剂的组合对抗体渗透进入红血球的影响
将0.01ml全血与100μl盐溶液混合,然后与2ml如实施例2中所述每种透化试剂变体混合。在孵育5分钟后,将50μl每种混合物加入50μl的PBS溶液中,该PBS溶液含有0.2%(w/v)牛血清白蛋白和偶联于FITC并抗α-微管蛋白的单克隆抗体(贝克曼考尔特公司,美国迈阿密)。α-微管蛋白是一种仅仅表达于细胞内的分子。在孵育15分钟后,将该混合物与1ml含有0.5%甲醛的PBS混合,终止反应并且固定细胞,形成用于分析的样品混合物。
将样品混合物在XL流式细胞仪(贝克曼考尔特公司,美国迈阿密)上进行分析。通过正向散射和侧向散射分析了细胞的完整性。通过FITC抗体荧光性分析了细胞的渗透性。结果如图2A至2J所示。更具体地讲,单个的分布图是:图2A和2B:用改性试剂1预孵育血液。图2C和2D:用改性试剂2预孵育血液。图2E和2F:用改性试剂3预孵育血液。图2G和2H:用透化试剂4预孵育血液。图2I和2J:用透化试剂4预孵育,与偶联于FITC的同型对照抗体发生反应。其中FS是正向光散射;SS是侧向散射;FL1、FL2和FL4是分别于525nm、575nm和675nm处测量的荧光信号。
对照样抗体是偶联于FITC的同型抗体,其对于任何已知的细胞组分都是非专一性的。
可以看出,仅仅是含有表面活性剂并且pH值低的透化试剂4具有透化和维持红血球的效果。实施例4:pH、表面活性剂、以及pH和表面活性剂的组合对抗体渗透进入白血球的影响
根据A.Boyem的方法(1968,Scand.J.Clin.Lab.Invest.,21 Suppl.97),使用A菲科尔(Ficoll,水溶性聚蔗糖),当存在EDTA时从周围血液制备出单核白血球。将1千万个细胞与100μl盐溶液混合,然后与2ml如在实施例2中描述的每种透化试剂变体混合。按照在实施例3中描述的方法对细胞进行孵育并且用抗微管蛋白-FITC抗体进行胞内标记。结果如图3A至3J所示。更具体地讲,单个的分布图是:图3A、3B:用改性试剂1预孵育细胞。图3C、3D:用改性试剂2预孵育细胞。图3E、3F:用改性试剂3预孵育细胞。图3G、3H:用透化试剂4预孵育细胞。图3I、3J:用透化试剂4预孵育细胞,与偶联于FITC的同型对照抗体发生反应。
可以看出,仅仅是含有表面活性剂并且pH值低的透化试剂4对白血球具有透化和维持效果。实施例5:透化试剂基于细胞内和细胞表面上的胎儿抗原在检测胎儿红血球中的应用
将99%(v/v)普通血液和1%(v/v)脐带血的混合物用于胎儿红血球检测。先后将100μl盐溶液和1ml组合物C加入5μl血液混合物中。在孵育10分钟后,将50μl样品混合物加入两种含有如下物质的试管中:试管A,包含50μl的含有0.2%(w/v)牛血清白蛋白和下述抗体混合物的PBS溶液:-抗胎儿血红蛋白(HbF)的偶联于FITC的单克隆抗体(法国专利No.9809006);-抗胎儿血型i的偶联于藻红蛋白的单克隆抗体(法国专利No.N°98 09006);以及-抗CD45-PC5单克隆抗体(贝克曼考尔特公司,Marseille,法国)。试管B,包含与试管A相同的组分,另外添加了10μl的10mM CaCl2。
试管A用作与HbF1反应的阴性对照,因为该反应依赖于钙离子(Ca2+)的存在。
将样品混合物在XL流式细胞仪(贝克曼考尔特公司,美国迈阿密)上进行分析。通过正向散射和侧向散射分析了细胞的完整性。使用CD45以便从分析测试中除去白血球。通过抗体的荧光性检测胎儿红血球。结果如图4A至4F所示。图4A~4C显示了由试管A得到的结果,而图4D至4E则显示了由试管B得到的结果。
由图4C和4F可以看出,成熟红血球(HbF-,i+)位于象限3内(底部左侧)、胎儿红血球(HbF+,i+)位于象限2内(顶部右侧)、而F细胞(HbF+,i-)位于象限4内(底部右侧)。
实验记录到,在缺乏钙离子的情况下,图4C象限2内没有胎儿红血球。因此,对偶联物抗体而言,红血球是可渗透的,并且在HbF抗原和抗HbF抗体之间的相互作用依赖钙离子。显然,在红血球用本发明的透化试剂孵育后,HbF抗原保持了自然状态,这通过HbF和抗体之间相互作用的钙依赖性的保持而显示出来。实施例6:红血球中α-微管蛋白和HbAlc的检测
将0.01ml全血与100μ盐溶液混合,然后再与2ml实施例1的组合物B混合。在孵育5分钟后,将50μl混合物加入50μl的PBS中,该PBS含有偶联于FITC的单克隆抗体和抗α-微管蛋白(抗微管蛋白-FITC抗体,贝克曼考尔特公司,美国迈阿密),或者含有根据Knowles等在美国专利No.4,727,036中所述方法制备出的抗HbAlc并且偶联于FITC的单克隆抗体(抗HbAlc-FITC抗体)。在孵育15分钟以后,将混合物与1ml含有0.5%甲醛的PBS混合,终止反应并固定细胞,从而形成待分析的样品混合物。
将样品混合物在XL流式细胞仪(贝克曼考尔特公司,美国迈阿密)上进行分析。通过正向散射和侧向散射分析了细胞的完整性。通过FITC抗体的荧光性分析了细胞的渗透性。结果如图5A至5F所示。更具体地讲,单个的分布图是:图5A和5B:与抗微管蛋白-FITC抗体反应。图5C和5D:与抗HbAlc-FITC抗体反应。图5E和5F:与偶联于FITC的同型对照抗体反应。
对照样抗体是偶联于FITC的同型抗体,其对于任何已知的细胞组分都是非专一性的。
如图所示,对两种抗微管蛋白-FITC抗体和抗HbAlc-FITC抗体而言,红血球是可渗透的,这使得能够在流式细胞仪上通过荧光性检测红血球中α-微管蛋白和HbAlc。
以上对本发明进行了详细描述,并且在附图上进行了图示,但不应将这些内容看作是对本发明保护范围的限制,而应是其优选实施方式的示范。然而,很明显在本发明精神和保护范围内可以作出多种改性和变化,如同在上述说明书中以及附后的权利要求的描述,并且它们在法律上讲是等价的。
Claims (17)
1.一种细胞透化和稳定试剂,包括:
(a)N-酰基肌氨酸或其由下述分子结构式表示的盐:
R1-CO-N(CH3)CH2COOX1
其中R1是具有8~18碳原子的烷基或亚烷基团,而X1是H、Na+、或K+;
(b)pH调节剂,用以调节所述试剂的pH至4~6;以及
(c)水介质;
所述试剂具有低离子强度,这由其电导率小于9.0mS/cm所确定,从而所述试剂能够使胞内蛋白质聚集。
2.如权利要求1所述的试剂,其特征在于,进一步包含由下述分子结构式表示的阴离子表面活性剂:
R2-O-SO3X2
其中R2是具有8~18碳原子的烷基或亚烷基团;而X2是Na+、K+、NH4 +或NH2C(CH2OH)3。
3.如权利要求1或2所述的试剂,其特征在于,进一步包含牛血清白蛋白。
4.如权利要求1或2所述的试剂,其特征在于,进一步含有甘油。
5.如权利要求1或2所述的试剂,其特征在于,所述电导率小于1.2mS/cm。
6.如权利要求1或2所述的试剂,其特征在于,所述N-酰基肌氨酸是N-月桂酰肌氨酸。
7.如权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述N-酰基肌氨酸的浓度范围是0.1mM~10mM。
8.如权利要求2所述的试剂,其特征在于,所述阴离子表面活性剂是三(羟甲基)氨基甲烷十二烷基硫酸盐。
9.如权利要求8所述的试剂,其特征在于,所述阴离子表面活性剂的浓度范围是0.1mM~10mM。
10.一种渗透过细胞膜并保留细胞的细胞组分以用于流式细胞术分析的方法,包括如下步骤:
(a)将含有细胞的样品与如权利要求1至9中任一项所述的细胞透化和稳定试剂相混合,以形成样品混合物;
(b)将所述样品混合物孵育足够的时间以便渗透过细胞膜,使得胞内蛋白质在所述细胞膜内聚集,并且保留细胞组分使其与细胞标记物结合;以及
(c)将所述细胞标记物加入所述样品混合物,并且将所述样品混合物再次孵育一定时间,使得所述细胞标记物与所述在步骤(b)中保留的细胞组分结合,以便接着通过流式细胞术进行分析。
11.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述细胞组分是胞内抗原位点或细胞表面抗原位点、DNA、RNA、或者细胞骨架成分。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述胞内抗原位点是血红蛋白抗原位点或者血红蛋白变体的抗原位点。
13.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述细胞骨架成分包括微管蛋白和膜收缩蛋白。
14.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述细胞标记物是所述胞内抗原位点的特异性抗体。
15.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述细胞标记物是所述DNA或RNA分子的特异性核酸探针。
16.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述细胞标记物是所述细胞表面抗原位点的特异性抗体。
17.如权利要求10所述的方法,其特征在于,进一步包括:在所述样品混合物中的所述细胞标记物结合于所述细胞组分后,固定所述细胞。
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