CN115943208A - 核酸和细胞保存剂组合物以及使用方法 - Google Patents

核酸和细胞保存剂组合物以及使用方法 Download PDF

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CN115943208A CN202180043853.1A CN202180043853A CN115943208A CN 115943208 A CN115943208 A CN 115943208A CN 202180043853 A CN202180043853 A CN 202180043853A CN 115943208 A CN115943208 A CN 115943208A
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约瑟夫·皮奇里利
克里斯托弗·魏卡特
亚历山大·M·克利巴诺夫
蒂亚·海克斯姆
布朗迪·努涅斯
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Abstract

本披露涉及核酸和细胞保存剂组合物。还描述了保存血液或其他生物样品中的核酸和/或细胞的方法，以及用于保存血液或其他生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒。

Description

核酸和细胞保存剂组合物以及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月8日提交的国际申请号PCT/US2021/012844和2020年4月20日提交的美国临时申请号63/012,637的权益、优先权，并通过援引以其全文并入。
技术领域
本披露涉及组合物、方法和试剂盒以保存血液或其他生物样品的核酸和/或细胞。
背景技术
许多基于核酸的测试用于分析DNA和RNA的序列、结构或表达的变化，以用于各种诊断目的。事实上，核酸是非侵入性生物医学研究的常见检查目标。然而，在已经采集生物样品后，该样品中的这些核酸，例如RNA和DNA，无论是细胞核酸/基因组核酸还是无细胞核酸，都开始降解。此外，在采集血液或其他生物样品的几分钟内就开始发生基因诱导和基因转录物的降解，这使得在采集样品时难以准确分析样品的基因表达。并且，一般而言，该血液或其他生物样品越新鲜，该样品的核酸的质量就越好。当要分析受试者血液或生物样品的核酸时，这就带来问题。通常情况下，血液和其他生物样品的采集地点和时间与它们的分析地点和时间不同。因此，血液或其他生物样品采集以后，需要在可以进行分析之前对其进行储存和运输。由于采集后的血液和其他生物样品中的核酸会迅速降解，因此需要一种方法来保存样品中存在的这些核酸，以确保这些样品的核酸在进行分析时具有高质量。
在血液或其他生物样品中的无细胞核酸情况下，采集和分析的不同地点和时间会导致额外的问题：细胞裂解。采集的样品中的细胞裂解可能导致无细胞核酸特征受到细胞核酸的污染，从而难以准确分析该血液或生物样品中的这些无细胞核酸。采集血液或其他生物样品后不久就会开始发生细胞裂解。当这些样品需要在进行分析之前储存较长一段时间，这就带来问题。因此，还需要保存血液和其他生物样品，使得保持其核酸的无细胞特征。
同样，针对基于细胞(例如生物样品中的循环肿瘤细胞)检测或分析的诊断应用，以完整的形式保存那些细胞非常重要。
发明内容
在第一方面，本披露涉及一种核酸和细胞保存剂组合物，其包含：
a.一种或多种渗透剂，该一种或多种渗透剂以足够产生高渗或等渗溶液的量存在；
b.一种或多种酶抑制剂；
c.任选地一种或多种代谢抑制剂；
d.任选地血浆扩容剂；以及
e.聚蔗糖；
其中该组合物不包括甘油或甘露糖醇。
在第二方面，本披露涉及一种核酸和细胞保存剂组合物，其包含：
a.一种或多种渗透剂，该一种或多种渗透剂以足够产生高渗溶液的量存在；
b.一种或多种酶抑制剂；
c.任选地一种或多种代谢抑制剂；
d.任选地血浆扩容剂；以及
e.一种或多种细胞表面重塑聚合物。
在第三方面，本披露涉及一种核酸和细胞保存剂组合物，其包含：
a.任选地一种或多种渗透剂；
b.一种或多种酶抑制剂；
c.任选地一种或多种代谢抑制剂；
d.任选地血浆扩容剂；
e.任选地一种或多种细胞表面重塑聚合物；
f.任选地一种或多种选自由以下组成的组的试剂：羟乙基淀粉、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)的聚合物、聚蔗糖、蛋白质胶体、非蛋白质合成胶体、乙烯二醇、丙二醇、水溶性聚合物和羧甲基纤维素或其盐；以及
g.任选地聚丙二醇(PPG)；
其中存在至少一种细胞表面重塑聚合物(e)或试剂(f)，前提是当细胞表面重塑聚合物(e)不存在时，该一种或多种任选的渗透剂如果存在的话以该组合物的按重量计约0.1％至约1％的量存在，该量足够产生等渗或高渗溶液；并且进一步前提是，当试剂(f)不存在时，该一种或多种任选的渗透剂如果存在的话以足够产生等渗溶液的量存在或是该组合物的按重量计的约0.1％至约1％，该量足够产生等渗或高渗溶液。
在第四方面，本披露涉及一种本披露的保存剂组合物和生物样品的组合。
在第五方面，本披露涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的方法，该方法包括将本披露的保存剂组合物与该生物样品组合的步骤。
在第六方面，本披露涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，该试剂盒包含：
a.本文披露的保存剂组合物；以及
b.任选地，所述保存剂组合物的使用说明。
在第七方面，本披露涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，该试剂盒包含：
a.任选地含有预定量的任选的抗凝剂的血液或其他生物样品采集管；
b.含有预定量的本文披露的保存剂组合物的注射器；以及
c.任选地，可附接到所述注射器的针头。
在第八方面，本披露涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，该试剂盒包含：
a.任选地含有预定量的抗凝剂的血液或其他生物样品采集管；以及
b.含有预定量的本文披露的保存剂的密封安瓿，其中所述安瓿包含可移除的封盖，并且其中所述安瓿被配置为在使用者移除封盖时接收分配装置。
在一些实施例中，该生物样品源自体液。在一些实施例中，该体液是血液。
在一些实施例中，这些核酸是无细胞(“cf”)DNA。在本披露的其他实施例中，这些核酸是细胞(即，基因组的或“g”)DNA。
在一些实施例中，这些核酸是无细胞(“cf”)RNA。在本披露的其他实施例中，这些核酸是细胞(即，基因组的或“g”)RNA。
在一些实施例中，这些细胞是干细胞、骨细胞、血细胞(例如，红细胞和/或白细胞)、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、或循环肿瘤细胞。在一些实施例中，这些细胞是实验室衍生或经修饰的细胞。
具体实施方式
定义
除非本文另有定义，否则本申请中使用的科技术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
在整个本申请及其各种实施例和方面，词语“包括/包含(comprise)”或变形，例如“包括/包含(comprises)”或“包括/包含(comprising)”将被理解为允许包括所陈述的整数或多个整数的组，但不排除任何其他整数或多个整数的组。
术语“包括(including)”或“包括(includes)”用于表示“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可以互换使用。
术语“例如(e.g.)”或“例如(for example)”后面的任何一个或多个实例并不意味着对本披露的详尽说明或限制。
除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
冠词“一个/一种(a/an)”、和“该/所述(the)”在本文中用于指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。
本文披露的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如，所陈述的“1到10”的范围应被认为包括最小值1和最大值10之间(包括最大值和最小值在内)的任何和所有子范围；也就是说，所有子范围都以最小值1或更大值开始，例如1到6.1，并以最大值10或更小值结束，例如5.5到10。当在组分的重量百分比或混合物的v/v的上下文中使用时，术语“约”意指所述数字的+/-10％。
本披露的每个实施例都可以单独使用或与本披露的一个或多个其他实施例组合使用。
本文描述了示例性方法和材料，应该理解的是也可以在各种方面和实施例的实践或测试中使用与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，而非旨在限制。
为了更容易理解本披露，首先定义某些术语。这些定义应根据本披露的其余部分如本领域普通技术人员所理解的那样来阅读。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。在整个详细描述中阐述了附加定义。
如本文所用，术语“渗透剂”是指产生高渗或等渗溶液的试剂。这些渗透剂的实例包括但不限于例如钠、钾、镁和钙盐，乳酸林格氏液，乙酸林格氏液，氨基酸，山梨糖醇，甘油，甘露糖醇，糖类(如蔗糖或葡萄糖)，酒石酸，和葡糖二酸或它们中的任何一种的盐。不希望受理论束缚，该一种或多种渗透剂用于改变血液或其他生物样品中的渗透压，导致例如水从存在于该血液或其他生物样品中的细胞中释放以抵消不平衡。这可以导致例如细胞收缩，从而使它们对细胞裂解具有更强的抵抗力，否则细胞裂解会导致该生物样品的无细胞核酸被细胞核酸污染，或者这些细胞更不容易进行测定和分析。另外，据认为该任选的血浆扩容剂将增强这种效果。
如本文所用，术语“高渗溶液”是指溶质浓度高于生理溶质浓度的溶液。高渗溶液的实例包括但不限于约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％和25％(按重量计)的NaCl溶液。
如本文所用，术语“等渗溶液”是指溶质浓度大约等于生理溶质浓度的溶液。等渗溶液的实例包括但不限于约0.5％、0.7％、和1％(按重量计)的NaCl溶液。
如本文所用，术语“酶抑制剂”是指这样的试剂，该试剂单独或在本披露的保存剂组合物中与金属离子(例如钙、镁、锰或锌)产生复合物以降低血液凝固、抑制核酸酶和/或减少酶促细胞裂解。本披露的酶抑制剂的实例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、柠檬酸、草酸盐、金精三羧酸(ATA)、酒石酸、葡糖二酸、或它们中的任何一种的盐，包括但不限于钠盐和钾盐。不希望受理论束缚，核酸酶的抑制将防止或减少该生物样品中无细胞核酸的降解。本披露的酶抑制剂抑制的酶的实例包括但不限于溶葡萄球菌酶、消解酶、蛋白酶、聚糖酶、或已知诱导细胞裂解的其他酶，从而起到保存血液或其他生物样品的细胞的作用。
如本文所用，术语“代谢抑制剂”是指这样的试剂，该试剂单独或在本披露的保存剂组合物中抑制细胞过程，例如细胞呼吸、细胞代谢和代谢功能，从而减少无细胞核酸的降解。不希望受理论束缚，本披露的代谢抑制剂被认为通过抑制细胞代谢功能并且抑制细菌生长来减缓细胞生长，从而减少无细胞核酸的降解。本披露的代谢抑制剂的实例包括但不限于叠氮化钠、硫汞撒、proclin、或双氯苯双胍已烷。
如本文所用，术语“血浆扩容剂”是指产生高胶或高渗溶液的试剂。血浆扩容剂的实例包括但不限于甘油、淀粉、蛋白质胶体(例如，白蛋白、卵清蛋白、和明胶)和非蛋白质胶体(例如，羟乙基淀粉)。不希望受理论束缚，本披露的组合物的任选的血浆扩容剂也用于增加血浆或其他生物样品中的渗透压，导致水从这些细胞中释放以抵消不平衡。这导致细胞收缩，从而使它们对细胞裂解具有更强的抵抗力，否则细胞裂解会导致该生物样品的无细胞核酸被细胞核酸污染，或者这些细胞更不容易进行测定和分析。
如本文所用，术语“细胞表面重塑聚合物”是指这样的聚合物，当以本披露的组合物中所述的量存在时，该聚合物通过共价相互作用、疏水相互作用或静电相互作用与血液或其他生物样品中的细胞表面相互作用(例如，通过与细胞表面受体结合，或通过与细胞表面上的特异性官能团反应)，从而在一些情况下引起该血液或其他生物样品中的细胞沉降。不希望受理论束缚，据认为在生物样品中的细胞沉降和/或细胞表面和聚合物的相互作用防止或减少细胞裂解和随后的细胞核酸释放到样品中，否则可能会污染(例如)样品中的无细胞核酸或完整细胞。随后可以经由本领域已知的常规方法分离和分析核酸和/或细胞。细胞表面重塑聚合物的实例包括但不限于N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和硼酸的共聚物、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)三肽聚合物衍生物、绿豆植物血球凝集素、泊咯沙姆和特征在于甘露糖-6-磷酸受体的一个或多个配体的合成糖肽(例如，具有多个丝氨酸-O-甘露糖-6-膦酸(M6Pn)残基的糖肽)。具有甘露糖-6-磷酸受体的重复配体的糖肽的实例参见Banik,Steven；Pedram,Kayvon；Wisnovsky,Simon；Riley,Nicholas；Bertozzi,Carolyn(2019):Lysosome Targeting Chimeras(LYTACs)for the Degradation of Secreted andMembrane Proteins[降解分泌蛋白和膜蛋白的溶酶体靶向嵌合体(LYTAC)].ChemRxiv.预印本.https://doi.org/10.26434/chemrxiv.7927061.v2。
如本文所用，“聚蔗糖”是指由蔗糖与表氯醇聚合形成的水溶性高分子量蔗糖聚合物。例如，聚蔗糖400和聚蔗糖70。
如本文所用，“泊咯沙姆”是指具有聚氧丙烯的中心疏水链的水溶性三嵌段共聚物，该聚氧丙烯的中心疏水链侧接聚氧乙烯的两个亲水链。泊咯沙姆的实例包括但不限于泊咯沙姆p188和泊咯沙姆p407。
如本文所用，“蛋白质胶体”是指其中一种或多种蛋白质分散在溶液中的混合物。本披露的蛋白质胶体的实例包括但不限于白蛋白、卵清蛋白、或明胶。白蛋白可以以例如人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白的形式提供。明胶的实例包括但不限于脲联明胶(例如，
Figure BDA0004007049140000071
)、琥珀酰明胶(例如，
Figure BDA0004007049140000072
)、和氧化聚明胶。
如本文所用，术语“非蛋白质胶体”是指其中一种或多种大分子或超微粒子分散在溶液中的混合物。非蛋白质胶体的实例包括但不限于支链淀粉的支链天然聚合物(如羟乙基淀粉(HES))和多糖(如葡聚糖，例如葡聚糖40和/或葡聚糖70)。
如本文所用，“水溶性聚合物”是指可溶于水溶液的聚合物。水溶性聚合物的实例包括但不限于聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚葡萄糖、聚甘氨酸、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的聚合物、二乙烯基醚-马来酸酐的聚合物、聚噁唑啉、聚磷酸盐、聚磷腈、黄原胶、果胶、壳聚糖衍生物、葡聚糖、角叉菜胶、瓜尔胶、纤维素醚、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、透明质酸、白蛋白、淀粉、或淀粉基衍生物。对于本披露的水溶性聚合物的其他非限制性实例，参见Betageri,G.V.,Kadajji,V.G.,Polymers[聚合物],2011,3,第1972-2009页。
如本文所用，术语“核酸”包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两者。RNA和/或DNA可以是直链的或支链的、单链或双链的或片段化的。RNA和DNA可以是细胞RNA(即，基因组RNA)、细胞DNA(即，基因组DNA)、无细胞RNA、无细胞DNA或其组合。核酸存在于生物样品中，特别是血液样品中。
如本文所用，术语“生物样品”是指从生物源获得的样品，包括实验室衍生或实验室修饰的细胞，该实验室衍生或实验室修饰的细胞包含核酸和/或细胞。生物样品可以是细胞样品、培养物样品或组织样品。另外，生物样品可以源自体液，例如血液、血浆、血清、尿液、唾液、粪便、母乳、眼泪、汗液、脑脊液、滑液、精液、阴道液、腹水、羊水、或细胞培养基。
如本文所用，术语“保存剂”是指添加到生物样品中的组合物，该保存剂抑制、防止、或减缓该样品中核酸的降解和/或细胞裂解。
如本文所用，术语“所处理的生物样品”是指已与如本披露中所述的保存剂组合物组合的生物样品。
如本文所用，术语“细胞”是指可以在血液或其他生物样品中存在的任何细胞。各种类型的细胞，包括但不限于干细胞、骨细胞、血细胞(例如，红细胞或白细胞)、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞(CTC)和实验室衍生和/或经修饰的细胞。
本披露的保存剂组合物
本披露的组合物可用于生物样品中核酸和/或细胞的保存和稳定。当将本披露的保存剂组合物添加到含有核酸和/或细胞的生物样品中时，与未处理的生物样品相比，该样品中核酸的降解和/或细胞裂解被降低、减缓或防止，从而允许经由本领域已知的常规技术(特别是高通量技术)对核酸和/或细胞进行后续分离和更准确的分析。另外，本披露的保存剂组合物抑制、减缓、或降低细胞裂解，从而允许样品中的无细胞核酸在很长一段时间内保持更一致的量和特性。所处理的生物样品中细胞裂解的降低也降低了核酸酶的释放，从而进一步防止或降低样品中核酸和/或细胞的降解。可由本披露的组合物保存的核酸包括RNA、DNA或其组合。RNA和DNA可以是细胞的、无细胞的或其组合，即细胞RNA、细胞DNA、无细胞RNA、无细胞DNA、或其组合。优选地，DNA和/或RNA是无细胞DNA和/或RNA。使用本披露的组合物和方法减少其裂解的这些细胞可以是但不限于干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞和实验室衍生或经修饰的细胞。
在第一方面，本披露涉及一种核酸和细胞保存剂组合物，其包含：
a.一种或多种渗透剂，该一种或多种渗透剂以足够产生高渗或等渗溶液的量存在；
b.一种或多种酶抑制剂；
c.任选地一种或多种代谢抑制剂；
d.任选地血浆扩容剂；以及
e.聚蔗糖；
其中该组合物不包含甘油或甘露糖醇。
在本披露的第一方面的一些实施例中，该一种或多种渗透剂以该组合物的按重量计约0.5％至约20％的量存在于本披露的保存剂组合物中。在一些实施例中，该渗透剂以该组合物的按重量计约1％至约15％、约1％至约20％、或约0.5％至约10％的量存在。
在本披露的第一方面的一些实施例中，该一种或多种渗透剂以足够产生高渗或等渗溶液的量存在，包括但不限于含有钠、钾、镁和钙的溶液，乳酸林格氏液，乙酸林格氏液，氨基酸，山梨糖醇，如蔗糖或葡萄糖的糖类，酒石酸，或葡糖二酸或它们中的任何一种的盐。
在本披露的第一方面的一些实施例中，该一种或多种酶抑制剂以该组合物的按重量计约0.5％至约30％、在一些方面以该组合物按重量计约0.5％至约5％、并且在其他方面以该组合物按重量计约1％至约30％的量存在于本披露的保存剂组合物中。在一些实施例中，该一种或多种酶抑制剂以该组合物的按重量计约1％至约20％的量存在。在另一个实施例中，该酶抑制剂以该组合物的按重量计约1％至约10％的量存在。
在本披露的第一方面的一些实施例中，该一种或多种酶抑制剂是乙二胺四乙酸(EDTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、柠檬酸、草酸盐、金精三羧酸(ATA)、酒石酸、葡糖二酸、或它们中的任何一种的盐。这些盐包括但不限于钠盐和钾盐或其混合物。
在本披露的第一方面的一些实施例中，该一种或多种任选的代谢抑制剂以该组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在于本披露的保存剂组合物中。在另一个实施例中，该任选的代谢抑制剂以该组合物的按重量计约0.01％至约5％的量存在。在另一个实施例中，该任选的代谢抑制剂以该组合物的按重量计约0.01％至约2％的量存在。
在本披露的第一方面的一些实施例中，该一种或多种任选的代谢抑制剂是叠氮化钠、硫汞撒、proclin或双氯苯双胍已烷。
在本披露的第一方面的一些实施例中，该任选的血浆扩容剂以该组合物的按重量计约0.5％至约40％，例如以该组合物的按重量计约0.5％、约1％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％或约40％的量存在于本披露的保存剂组合物中。
在本披露的第一方面的一些实施例中，该任选的血浆扩容剂是淀粉、蛋白质胶体(例如，白蛋白、卵清蛋白、和明胶)或非蛋白质胶体(例如，羟乙基淀粉)。
不希望受理论束缚，聚蔗糖用作拥挤试剂，迫使细胞脱离溶液，从而防止或减少细胞裂解和随后的细胞降解或细胞核酸释放到样品中，否则可能会污染(例如)样品中的无细胞核酸。随后可以经由本领域已知的常规方法分离和更准确地分析核酸和/或细胞。
在本披露的第一方面的一些实施例中，聚蔗糖以该组合物的按重量计约10％至约50％的量存在。例如，在一些实施例中，该一种或多种试剂以该组合物的按重量计约10％至约40％、或按重量计约15％至约35％、或按重量计约20％至约30％的量存在。
在本披露的第一方面的一些实施例中，本披露的保存剂组合物中的一种或多种组分可以起到保存剂组合物的其他组分中的一种或多种的作用或功能。例如，酒石酸或葡糖二酸或其盐可以作为酶抑制剂、渗透剂、或两者存在于本披露的组合物中。
在第二方面，本披露涉及一种核酸和细胞保存剂组合物，其包含：
a.一种或多种渗透剂，该一种或多种渗透剂以足够产生高渗溶液的量存在；
b.一种或多种酶抑制剂；
c.任选地一种或多种代谢抑制剂；
d.任选地血浆扩容剂；以及
e.一种或多种细胞表面重塑聚合物。
在本披露的第二方面的一些实施例中，该一种或多种渗透剂以该组合物的按重量计约1％至约30％的量存在于本披露的保存剂组合物中。在一些实施例中，该一种或多种渗透剂以该组合物的按重量计约1％至约20％的量存在。在另一个实施例中，该一种或多种渗透剂以该组合物的按重量计约1％至约10％的量存在。
在本披露的第二方面的一些实施例中，该一种或多种渗透剂以足够产生高渗溶液的量存在，包括但不限于含有钠、钾、镁和钙的溶液，乳酸林格氏液，乙酸林格氏液，氨基酸，山梨糖醇，如蔗糖或葡萄糖的糖类，酒石酸，或葡糖二酸或它们中的任何一种的盐。
在本披露的第二方面的一些实施例中，该一种或多种酶抑制剂以该组合物的按重量计约1％至约30％的量存在于本披露的保存剂组合物中。在一些实施例中，该一种或多种酶抑制剂以该组合物的按重量计约1％至约20％的量存在。在另一个实施例中，该一种或多种酶抑制剂以该组合物的按重量计约1％至约10％的量存在。
在本披露的第二方面的一些实施例中，该一种或多种酶抑制剂是酒石酸、或葡糖二酸。
在本披露的第二方面的一些实施例中，该一种或多种任选的代谢抑制剂以该组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在于本披露的保存剂组合物中。在另一个实施例中，该一种或多种任选的代谢抑制剂以该组合物的按重量计约0.01％至约5％的量存在。在另一个实施例中，该一种或多种任选的代谢抑制剂以该组合物的按重量计约0.01％至约2％的量存在。
在本披露的第二方面的一些实施例中，该一种或多种任选的代谢抑制剂是硫汞撒、proclin或双氯苯双胍已烷。
在本披露的第二方面的一些实施例中，该任选的血浆扩容剂以该组合物的按重量计约1％至约40％，例如以该组合物的按重量计约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％或约40％的量存在于本披露的保存剂组合物中。
在本披露的第二方面的一些实施例中，该任选的血浆扩容剂是淀粉、蛋白质胶体或非蛋白质胶体。在一些实施例中，该蛋白质胶体是白蛋白、卵清蛋白或明胶。在一些实施例中，该非蛋白质胶体是羟乙基淀粉。
在本披露的第二方面的一些实施例中，该一种或多种细胞表面重塑聚合物以约10wt％至约50wt％的量存在于本披露的组合物中。
在本披露的第二方面的一些实施例中，该一种或多种细胞表面重塑聚合物选自由以下组成的组：N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和硼酸的共聚物、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)三肽聚合物衍生物、绿豆植物血球凝集素、和具有甘露糖-6-磷酸受体的重复配体的合成糖肽。
在本披露的第二方面的一些实施例中，该细胞表面重塑聚合物是泊咯沙姆。在另一个实施例中，该细胞表面重塑聚合物是泊咯沙姆p188。在另一个实施例中，该细胞表面重塑聚合物是泊咯沙姆p407。
在本披露的第二方面的一些实施例中，本披露的保存剂组合物中的一种或多种组分可以起到保存剂组合物的组分中的一种或多种的作用或功能。例如，酒石酸或葡糖二酸或其盐可以作为酶抑制剂、渗透剂、或两者存在于本披露的组合物中。
在第三方面，本披露涉及一种核酸和细胞保存剂组合物，其包含：
a.任选地一种或多种渗透剂；
b.一种或多种酶抑制剂；
c.任选地一种或多种代谢抑制剂；
d.任选地血浆扩容剂；
e.任选地一种或多种细胞表面重塑聚合物；
f.任选地一种或多种选自由以下组成的组的试剂：羟乙基淀粉、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)的聚合物、聚蔗糖、蛋白质胶体、非蛋白质合成胶体、乙烯二醇、丙二醇、水溶性聚合物和羧甲基纤维素或其盐；
g.任选地聚丙二醇(PPG)；以及
其中存在至少一种细胞表面重塑聚合物(e)或试剂(f)，前提是当细胞表面重塑聚合物(e)不存在时，该一种或多种任选的渗透剂如果存在的话以该组合物的按重量计约0.1％至约1％的量存在，该量足够产生等渗或高渗溶液；并且进一步前提是，当试剂(f)不存在时，该一种或多种任选的渗透剂如果存在的话以足够产生等渗溶液的量存在或是该组合物的按重量计的约0.1％至约1％，该量足够产生等渗或高渗溶液。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该一种或多种任选的渗透剂以该组合物的按重量计约0.1％至约30％的量存在于本披露的保存剂组合物中。在一些实施例中，该渗透剂以该组合物的按重量计约0.1％至约10％、约1％至约15％、约1％至约20％的量存在。在一些实施例中，该渗透剂以该组合物的按重量计约0.1％至约1％的量存在。在一些实施例中，不存在渗透剂。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该一种或多种任选的渗透剂以足够产生等渗或高渗溶液的量存在，如所列举的，包括但不限于含有钠、钾、镁和钙的溶液，乳酸林格氏液，乙酸林格氏液，氨基酸，山梨糖醇，甘露糖醇，如蔗糖或葡萄糖的糖类，酒石酸，葡糖二酸或它们中的任何一种的盐。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该一种或多种酶抑制剂以该组合物的按重量计约0.5％至约30％、在一些方面以该组合物按重量计约0.5％至约5％、并且在其他方面以该组合物按重量计约1％至约30％的量存在于本披露的保存剂组合物中。在一些实施例中，该一种或多种酶抑制剂以该组合物的按重量计约1％至约20％的量存在。在另一个实施例中，该一种或多种酶抑制剂以该组合物的按重量计约1％至约10％的量存在。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该一种或多种酶抑制剂是乙二胺四乙酸(EDTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、柠檬酸、草酸盐、金精三羧酸(ATA)、酒石酸、葡糖二酸、或它们中的任何一种的盐。这些盐包括但不限于钠盐和钾盐或其混合物。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该一种或多种酶抑制剂是乙二胺四乙酸(EDTA)及其盐。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该一种或多种任选的代谢抑制剂以该组合物的按重量计约0.01％至约10％的量存在于本披露的保存剂组合物中。在另一个实施例中，该一种或多种任选的代谢抑制剂以该组合物的按重量计约0.01％至约5％的量存在。在另一个实施例中，该一种或多种任选的代谢抑制剂以该组合物的按重量计约0.01％至约2％的量存在。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该一种或多种任选的代谢抑制剂是叠氮化钠、硫汞撒、proclin或双氯苯双胍已烷。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该任选的血浆扩容剂以该组合物的按重量计约0.5％至约40％，例如以该组合物的按重量计约0.5％、约1％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％或约40％的量存在于本披露的保存剂组合物中。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该任选的血浆扩容剂是甘油、淀粉、蛋白质胶体(例如，白蛋白、卵清蛋白、和明胶)或非蛋白质胶体(例如，羟乙基淀粉)。在一些实施例中，该蛋白质胶体是白蛋白、卵清蛋白或明胶。在一些实施例中，该非蛋白质胶体是羟乙基淀粉。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该一种或多种任选的细胞表面重塑聚合物以约10wt％至约50wt％的量存在于本披露的组合物中。例如，在一些实施例中，该一种或多种任选的细胞表面重塑聚合物以该组合物的按重量计约10％至约40％、或按重量计约15％至约35％、或按重量计约20％至约30％的量存在。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该一种或多种细胞表面重塑聚合物选自由以下组成的组：N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和硼酸的共聚物、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)三肽聚合物衍生物、绿豆植物血球凝集素、和具有甘露糖-6-磷酸受体的重复配体的合成糖肽。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该细胞表面重塑聚合物是在血液或其他生物样品中充当细胞表面活性剂的泊咯沙姆或其他两亲性化合物。在另一个实施例中，该细胞表面重塑聚合物是泊咯沙姆p188。在另一个实施例中，该细胞表面重塑聚合物是泊咯沙姆p407。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该一种或多种任选的试剂以该组合物的按重量计约1％至约50％的量存在。例如，在一些实施例中，该一种或多种任选的试剂以该组合物的按重量计约1％至约40％、或按重量计约15％至约35％、或按重量计约20％至约30％的量存在。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该一种或多种任选的试剂是羟乙基淀粉。在本披露的第三方面的一些实施例中，该一种或多种任选的代谢抑制剂是聚蔗糖。在一些实施例中，该聚蔗糖是聚蔗糖400。在本披露的第三方面的一些实施例中，该一种或多种任选的试剂是蛋白质胶体。在一些实施例中，该一种或多种任选的试剂是非蛋白质胶体。在一些实施例中，该一种或多种任选的试剂是水溶性聚合物。
在本披露的第三方面的一些实施例中，存在一种或多种细胞表面重塑聚合物并且不存在一种或多种试剂。
在本披露的第三方面的一些实施例中，存在一种或多种试剂并且不存在一种或多种细胞表面重塑聚合物。
在本披露的第三方面的一些实施例中，存在一种或多种试剂并且也存在一种或多种细胞表面重塑聚合物。
在本披露的第三方面的一些实施例中，该任选的聚丙二醇(PPG)以该组合物的按重量计约0.1％至10％的量存在。例如，在一些实施例中，该任选的PPG以该组合物的按重量计约5％至约10％、或按重量计约1％至约5％、或按重量计约0.1％至约1％的量存在。
在本披露的第三方面的一些实施例中，本披露的保存剂组合物中的一种或多种组分可以起到保存剂组合物的组分中的一种或多种的作用或功能。例如，酒石酸或葡糖二酸或其盐可以作为酶抑制剂、渗透剂、或两者存在于本披露的组合物中。作为另外的实例，人血清白蛋白可以作为一种或多种试剂、任选的血浆扩容剂、或两者存在于本披露的组合物中。
根据本披露(例如，本披露的第一、第二、和第三方面)的保存剂组合物可以呈冻干粉剂、颗粒、片剂的形式，或作为溶液的形式存在(例如，其中保存剂组合物在合适的媒介物中重构)。冻干粉剂、颗粒、和/或片剂可以直接添加到生物样品中，或者可以在添加到生物样品中之前重构。冻干粉剂、颗粒、和/或片剂可以例如通过将该组合物溶解在合适的媒介物中来重构。合适的媒介物包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、植物来源的固定油类、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯、乙醇、丙三醇、丙二醇、和本披露的任选的血浆扩容剂。可替代地，可以将该生物样品直接添加到冻干粉剂、颗粒、片剂或重构组合物(即，溶液)中。作为另一个实例，当生物样品来源于体液时，该体液可以用作溶解保存剂组合物的可接受的媒介物。例如，保存剂组合物的冻干粉剂、颗粒、和/或片剂形式可以与体液组合，从而被该体液溶解。在一些实施例中，在将生物样品采集在管或容器中之前，该采集管或容器含有呈冻干粉剂、颗粒、片剂或溶液的保存剂组合物。
在一些实施例中，本披露的保存剂组合物呈水溶液的形式。该水溶液可以与生物样品组合，或该生物样品可以与该水溶液组合。
保存剂组合物和生物样品的组合以及保存生物样品中的核酸和/或细胞的方法
在第四方面，本披露涉及一种本披露的保存剂组合物和生物样品的组合。
在第五方面，本披露涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的方法，该方法包括将本披露的保存剂组合物与该生物样品组合的步骤。
在第四至第五方面的一些实施例中，该生物样品是细胞样品或组织样品。
在第四至第五方面的一些实施例中，该生物样品源自体液。在一些实施例中，该体液是血液、血浆、血清、尿液、唾液、粪便、母乳、眼泪、汗液、脑脊液、滑液、精液、阴道液、腹水、或羊水。在一个优选的实施例中，该生物液是血液，例如全血或其部分。该生物样品可以包括细胞，或者可以是无细胞的。
在第四至第五方面的一些实施例中，该生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、或循环肿瘤细胞。
在第四至第五方面的一些实施例中，该生物样品包含核酸，该核酸选自RNA、DNA或其组合。在一些实施例中，该核酸为无细胞RNA、无细胞DNA或其组合。在一些实施例中，该核酸为细胞RNA、细胞DNA或其组合。
生物样品可以以多种方式与本披露的保存剂组合物组合。例如，可以将生物样品采集到合适容器中，然后将保存剂组合物例如经由注射器或移液管添加到该容器中。可替代地，可以在采集生物样品之前将保存剂组合物添加到用于生物样品采集的合适容器中。在一些实施例中，将保存剂组合物添加到生物样品中。在一些实施例中，将生物样品添加到保存剂组合物中。
本披露还考虑了其中将保存剂组合物的组分同时或分开添加到生物样品中的方法。因此，在一些实施例中，本披露涉及保存生物样品中的核酸和/或细胞的方法，该方法包括以任何顺序或同时使生物样品与本披露的保存剂组合物的构成组分接触。在一些实施例中，用于采集生物样品的合适容器已经含有保存剂组合物中的一种或多种组分，并且在采集该生物样品时依次或同时将剩余组分添加到该生物样品中。例如，可以使用已经含有合适的酶抑制剂(例如，酒石酸，或EDTA或其盐，或葡糖二酸)的采血管来采集生物样品。在采集到生物样品之后，可以将剩余组分(即，渗透剂、任选的一种或多种代谢抑制剂、任选的血浆扩容剂、和一种或多种试剂)添加到生物样品中。在另一个实施例中，在已经采集到生物样品之后，将保存剂组合物的组分依次或同时添加到生物样品中。在一些实施例中，在容器用于采集样品之前，该保存剂组合物的所有必需组分以及任选地可选组分存在于该容器中。
在一些实施例中，待用于样品采集的容器含有冻干粉剂形式的保存剂组合物。在一些实施例中，待用于样品采集的容器含有颗粒形式的保存剂组合物。在一些实施例中，待用于样品采集的容器含有片剂形式的保存剂组合物。在一些实施例中，待用于样品采集的容器含有保存剂组合物和合适的媒介物。在一些实施例中，待用于样品采集的容器含有作为水溶液的保存剂组合物。在另一个实施例中，待用于血液样品采集的容器还包含抗凝剂。抗凝剂的实例包括但不限于EDTA(其也可以起到酶抑制剂的作用)、柠檬酸钠、柠檬酸茶碱腺苷双嘧达莫(CTAD)、肝素锂、肝素钠、氟化钠、酸柠檬酸-葡萄糖溶液(ACD)、和聚茴香脑磺酸钠。在一些实施例中，合适容器是抽真空的血液样品采集管。
可以与生物样品组合的保存剂组合物的量可以由本领域技术人员通过常规实验确定。在一些实施例中，保存剂组合物与生物样品的比率可以为约1:10v/v至约1:1v/v。在一些实施例中，保存剂组合物与生物样品的比率为约1:8v/v至约1:2v/v。在一些实施例中，保存剂组合物与生物样品的比率为约1:6v/v至约1:3v/v。在一些实施例中，保存剂组合物与生物样品的比率为约1:5v/v至约1:4v/v。
在已经储存生物样品之后，可以使用本领域技术人员已知的方法(包括提取、离心和色谱法)从生物样品中分离核酸和/或细胞用于分析。本领域技术人员将认识到有许多方法可用于从生物样品中分离核酸和/或细胞。
使用本披露的保存剂组合物保存的核酸和/或细胞可以在各种温度条件下储存很长一段时间后从经处理的生物样品中分离出来。在一些实施例中，已经与本披露的保存剂组合物接触的生物样品可以在环境条件下、或低温下储存至少1天、至少1周、至少2周、至少3周或至少4周。在一些实施例中，本披露的组合物允许生物样品(即，生物样品中的核酸和/或细胞)在约-20℃至约30℃的温度范围内保存很长一段时间。在一些实施例中，该保存剂组合物能够在环境温度下将生物样品(即，生物样品中的核酸和/或细胞)保存至少1周、至少2周、至少3周或至少4周。在一些实施例中，该保存剂组合物能够在环境温度下将生物样品保存至少2周。在一些实施例中，本披露的保存剂组合物能够在4℃下将生物样品(即，生物样品中的核酸和/或细胞)保存至少1周、至少2周、至少3周或至少4周。在一些实施例中，本披露的保存剂组合物能够在-20℃下将生物样品(即，生物样品中的核酸和/或细胞)保存至少1周、至少2周、至少3周或至少4周。使用本披露的组合物和方法保存的核酸(RNA和DNA)表现出良好的产率、纯度、完整性和RNA可扩增性。
用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒
根据本披露的保存剂组合物可以作为待用户接收的试剂盒的一部分提供。该试剂盒允许本披露的一种或多种保存剂组合物易于与生物样品组合，使得存在于该生物样品中的核酸和/或细胞被保存很长一段时间，例如至少1周、至少2周、至少3周或至少4周。可以提供保存剂组合物，使得在采集生物样品后将该保存剂组合物与生物样品组合。可替代地，提供该保存剂组合物，使得该保存剂组合物在采集生物样品时与该生物样品组合。
在一些实施例中，该保存剂组合物在分配装置中作为水溶液提供。在一些实施例中，该分配装置是注射器。该分配装置中保存剂的量可以是预定量，使得与生物样品组合的保存剂组合物的比率能够将该样品的核酸和/或细胞保存很长一段时间。该试剂盒可以进一步包含可附接到所述注射器的针头。在一些实施例中，该试剂盒用于保存血液样品中的核酸和/或细胞，并且进一步包含任选地含有预定量的抗凝剂的采血管。
在一些实施例中，该保存剂组合物在密封安瓿中提供，其中所述安瓿包含可移除的封盖，并且其中所述安瓿被配置为在使用者移除封盖时接收分配装置。在一些实施例中，该分配装置是移液管或注射器。在一些实施例中，该试剂盒用于保存血液样品中的核酸和/或细胞，并且进一步包含含有预定量的抗凝剂的采血管。
在另外的实施例中，该试剂盒涉及保存血液样品中的核酸和/或细胞，并且包含采血管(任选地含有预定量的抗凝剂)和本披露的保存剂组合物。
在第六方面，本披露涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，该试剂盒包含：
a.本文披露的保存剂组合物；以及
b.任选地，所述保存剂组合物的使用说明。
在第七方面，本披露涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，该试剂盒包含：
a.任选地含有预定量的任选的抗凝剂的血液或其他生物样品采集管；
b.含有预定量的本文披露的保存剂组合物的注射器；以及
c.任选地，可附接到所述注射器的针头。
在第八方面，本披露涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，该试剂盒包含：
a.任选地含有预定量的抗凝剂的血液或其他生物样品采集管；以及
b.含有预定量的本文披露的保存剂的密封安瓿，其中所述安瓿包含可移除的封盖，并且其中所述安瓿被配置为在使用者移除封盖时接收分配装置。
在第六至第八方面的一些实施例中，该生物样品是细胞样品或组织样品。
在第六至第八方面的一些实施例中，该生物样品源自体液。在一些实施例中，该体液是血液、血浆、血清、尿液、唾液、粪便、母乳、眼泪、汗液、脑脊液、滑液、精液、阴道液、腹水、或羊水。在一些实施例中，该体液是全血或其部分。该生物样品可以包括细胞，或者可以是无细胞的。
在第六至第八方面的一些实施例中，该生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、或其组合。
在第六至第八方面的一些实施例中，该生物样品包含核酸，该核酸选自RNA、DNA或其组合。在一些实施例中，该核酸为无细胞RNA、无细胞DNA或其组合。在一些实施例中，该核酸为细胞RNA、细胞DNA或其组合。
等效物
前述描述和以下实例详述了本披露的某些特定实施例，并描述了如诸位发明人所设想的实施本披露的最佳模式。然而，应当理解无论前述内容如何详细地出现在文本中，本披露都可以以多种方式实施，并且本披露应当根据所附实施例及其任何等效物来解释。
尽管已经参考多种应用、方法、化合物、和组合物描述了本披露，但是应当理解，在不背离本文披露的情况下可以进行多种改变和修改。提供以下实例以更好地说明本披露并且不旨在限制本文所呈现的教导的范围。尽管已经根据这些示例性实施例描述了本披露，但是本领域技术人员将容易理解，这些示例性实施例的许多变化和修改是可能的，而无需进行额外的实验。所有此类变化和修改都在当前披露的范围内。
实例
实例1-保存剂组合物的实施例
制备了本披露的保存剂组合物的实施例：
组合物1：按重量计2.86％的NaCl(渗透剂)、按重量计0.02％的NaN3(代谢抑制剂)、按重量计0.75％的2Na-EDTA和按重量剂0.75％的4Na-EDTA(酶抑制剂)、按重量计20.0％的聚蔗糖PM400(试剂)、以及余量的水。
组合物2：按重量计2.86％的NaCl(渗透剂)、按重量剂0.02％的NaN3(代谢抑制剂)、按重量计0.75％的2Na-EDTA和按重量剂0.75％的4Na-EDTA(酶抑制剂)、按重量计20.0％的泊咯沙姆p188(细胞表面重塑聚合物)、以及余量的水。
实例2-血浆体积的分析
将来自多个供体的血液样品采集到血液样品采集管中以评估用根据本披露的保存剂组合物处理的样品的血浆体积。通过将血液样品添加到含有2mL保存剂组合物的试管中来测试实例1的保存剂组合物。
然后将组合的保存剂组合物和血液样品在室温和425g下离心大约15分钟，从而导致采集管中沉淀物的形成。接着，在不干扰分离的组分的情况下，使用移液器将上部的血浆层(上清液)转移到单独的采集管。然后，将转移的上清液在4℃下以16,000g再次离心约15分钟以去除任何意外地转移的细胞碎片或沉淀物并且测量残留血浆的体积。该测量的体积在本文中被称为“血浆体积”。
不希望受理论束缚，预期“血浆体积”是促进本披露的方面在高通量应用中使用的一个重要因素。在那些应用中使用自动化和机器人需要一致的血浆体积(理想地3-6mL之间)。
观察到根据上述程序处理的并且保存在含有组合物1的试管中的混合物的“血浆体积”为6-6.2mL。观察到根据本程序处理的并且保存在含有组合物2的试管中的混合物的“血浆体积”为2.2-3.7mL。
实例3-分离的cfDNA和RNA完整性的分析
将来自多个供体的血液样品采集到血液样品采集管中以评估本披露的保存剂组合物的实施例保存cfDNA和RNA的能力。通过将血液样品添加到含有2mL保存剂组合物的试管中来测试实例1的保存剂组合物。
使用本领域已知的提取和分离技术从样品中分离cfDNA和RNA。一种这样的cfDNA提取方法涉及使用MagMAXTM无细胞DNA分离试剂盒。一种这样的RNA提取方法涉及使用基于贝克曼库尔特(Beckman Coulter)的RNAdvance Blood试剂盒的程序。
在第0天抽取血液，在第1天分析分离的cfDNA和RNA。对核酸的完整性进行分析以评估保存剂组合物的特性。
cfDNA完整性
cfDNA的完整性通过长DNA片段和短DNA片段的qPCR来分析，并通过长片段与短片段的比率(222bp/90bp)来表征。获得的比率在本文中被称为DNA完整性指数(DIN)。DIN是cfDNA质量的目标度量，当DIN<0.5时，该cfDNA被认为是纯的(即，血浆没有被gDNA(细胞或基因组DNA)污染)。
制备10倍稀释系列的gDNA(1ng/μL至0.01ng/μL)用于标准曲线。通过将5μL的100μM正向引物、5μL的100μM反向引物与90μL的无核酸酶的水混合，制备浓度为5μM的正向和反向引物混合物。
分别用1μL的标准品或cfDNA样品和8μL的无核酸酶的水在混合物#1进行1次反应，和1μL的引物混合物和10μL的2X PowerTrack SYBR Green主混合物(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))在混合物#2中进行1次反应来制备两种单独的混合物。将9μL的混合物#1和11μL的混合物#2添加到96孔光学板的孔中以运行实时PCR。下表列出了热循环条件。
Figure BDA0004007049140000221
RNA完整性
通过生物分析仪使用琼脂糖凝胶电泳分析样品中RNA的完整性，并通过RNA完整性指数(RIN)来表征。RIN是总RNA质量的目标度量，范围从10(高度完整的RNA)到1(完全降解的RNA)。
使用实例1的组合物保存的血液样品中cfDNA的特性：
因为观察到来自qPCR分析的长片段与短片段的比率(222bp/90bp)范围为<0.1至0.7，所以从血液样品中提取的cfDNA的完整性(即，DIN)通常很高，其中该血液样品保存在含有组合物1或2的试管中。
使用实例1的组合物保存的血液样品中RNA的特性：
因为观察到从血液样品中分离的RNA的RIN的范围为7.4至9.1，所以它们的RIN通常较高，其中该血液样品保存在含有组合物1或2的试管中。

Claims (93)

1.一种保存剂组合物，该保存剂组合物包含：
a.一种或多种渗透剂，该一种或多种渗透剂以足够产生高渗或等渗溶液的量存在；
b.一种或多种酶抑制剂；
c.任选地一种或多种代谢抑制剂；
d.任选地血浆扩容剂；以及
e.聚蔗糖；
其中该组合物不包括甘油或甘露糖醇。
2.根据权利要求1所述的保存剂组合物，其中该一种或多种渗透剂以该组合物的按重量计约0.5％至约20％的量存在于该保存剂组合物中。
3.根据权利要求1所述的保存剂组合物，其中该一种或多种渗透剂以足够产生高渗或等渗盐溶液的量存在，包括但不限于含有钠、钾、镁和钙的溶液，乳酸林格氏液，乙酸林格氏液，氨基酸，山梨糖醇，如蔗糖或葡萄糖的糖类，酒石酸，或葡糖二酸或其盐。
4.根据权利要求1所述的保存剂组合物，其中该一种或多种酶抑制剂是乙二胺四乙酸(EDTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、柠檬酸、草酸盐、金精三羧酸(ATA)、酒石酸、葡糖二酸、或它们中的任何一种的盐。
5.根据权利要求1所述的保存剂组合物，其中酶抑制剂是乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐。
6.根据权利要求1所述的保存剂组合物，其中该一种或多种任选的代谢抑制剂是叠氮化钠、硫汞撒、proclin、或双氯苯双胍已烷。
7.根据权利要求1所述的保存剂组合物，其中该任选的血浆扩容剂是淀粉、蛋白质胶体或非蛋白质胶体。
8.根据权利要求7所述的保存剂组合物，其中该蛋白质胶体是白蛋白、卵清蛋白或明胶。
9.根据权利要求7所述的保存剂组合物，其中该非蛋白质胶体是羟乙基淀粉。
10.根据权利要求1所述的保存剂组合物，其中该聚蔗糖以该组合物的按重量计约10％至约50％的量存在。
11.根据权利要求10所述的保存剂组合物，其中该聚蔗糖以该组合物的按重量计约20％至约30％的量存在。
12.根据权利要求1所述的保存剂组合物，其中该聚蔗糖是聚蔗糖400。
13.一种保存剂组合物，该保存剂组合物包含：
a.一种或多种渗透剂，该一种或多种渗透剂以足够产生高渗溶液的量存在；
b.一种或多种酶抑制剂；
c.任选地一种或多种代谢抑制剂；
d.任选地血浆扩容剂；以及
e.一种或多种细胞表面重塑聚合物。
14.根据权利要求13所述的保存剂组合物，其中该一种或多种渗透剂以该组合物的按重量计约1％至约30％的量存在于该保存剂组合物中。
15.根据权利要求13所述的保存剂组合物，其中该一种或多种渗透剂以足够产生高渗溶液的量存在，包括但不限于含有钠、钾、镁和钙的溶液，乳酸林格氏液，乙酸林格氏液，氨基酸，山梨糖醇，甘油，甘露糖醇，蔗糖，酒石酸或其盐，或葡糖二酸或它们中的任何一种的盐。
16.根据权利要求13所述的保存剂组合物，其中该一种或多种酶抑制剂以该组合物的按重量计约1％至约30％的量存在于该保存剂组合物中。
17.根据权利要求13所述的保存剂组合物，其中该一种或多种酶抑制剂是酒石酸、或葡糖二酸。
18.根据权利要求13所述的保存剂组合物，其中该一种或多种任选的代谢抑制剂是硫汞撒、proclin、或双氯苯双胍已烷。
19.根据权利要求13所述的保存剂组合物，其中该任选的血浆扩容剂是淀粉、蛋白质胶体或非蛋白质胶体。
20.根据权利要求13所述的保存剂组合物，其中该一种或多种细胞表面重塑聚合物以该组合物的按重量计约10％至约50％的量存在于该保存剂组合物中。
21.根据权利要求13所述的保存剂组合物，其中该一种或多种细胞表面重塑聚合物选自由以下组成的组：N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和硼酸的共聚物、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)三肽聚合物衍生物、绿豆植物血球凝集素、和具有甘露糖-6-磷酸受体的重复配体的合成糖肽。
22.根据权利要求13所述的保存剂组合物，其中该细胞表面重塑聚合物是泊咯沙姆。
23.根据权利要求22所述的保存剂组合物，其中该泊咯沙姆是泊咯沙姆p188。
24.根据权利要求22所述的保存剂组合物，其中该泊咯沙姆是泊咯沙姆p407。
25.一种保存剂组合物，该保存剂组合物包含：
a.任选地一种或多种渗透剂；
b.一种或多种酶抑制剂；
c.任选地一种或多种代谢抑制剂；
d.任选地血浆扩容剂；
e.任选地一种或多种细胞表面重塑聚合物；
f.任选地一种或多种选自由以下组成的组的试剂：羟乙基淀粉、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)的聚合物、聚蔗糖、蛋白质胶体、非蛋白质合成胶体、乙烯二醇、丙二醇、水溶性聚合物和羧甲基纤维素或其盐；以及
g.任选地聚丙二醇(PPG)；
其中存在至少一种细胞表面重塑聚合物(e)或试剂(f)，前提是当细胞表面重塑聚合物(e)不存在时，该一种或多种任选的渗透剂如果存在的话以该组合物的按重量计约0.1％至约1％的量存在，该量足够产生等渗或高渗溶液；并且进一步前提是，当试剂(f)不存在时，该一种或多种任选的渗透剂如果存在的话以足够产生等渗溶液的量存在或是该组合物的按重量计的约0.1％至约1％，该量足够产生等渗或高渗溶液。
26.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中该一种或多种任选的渗透剂以该组合物的按重量计约0.1％至约30％的量存在于该保存剂组合物中。
27.根据权利要求26所述的保存剂组合物，其中该一种或多种任选的渗透剂以该组合物的按重量计约0.1％至约1％的量存在于该保存剂组合物中。
28.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中不存在渗透剂。
29.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中该一种或多种任选的渗透剂以足够产生等渗或高渗溶液的量存在，如所列举的，包括但不限于含有钠、钾、镁或钙的溶液，乳酸林格氏液，乙酸林格氏液，氨基酸，山梨糖醇，甘露糖醇，如蔗糖或葡萄糖的糖类，酒石酸，葡糖二酸或它们中的任何一种的盐。
30.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中该一种或多种酶抑制剂以该组合物的按重量计约0.5％至约30％的量存在于该保存剂组合物中。
31.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中该一种或多种酶抑制剂是乙二胺四乙酸(EDTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、柠檬酸、草酸盐、金精三羧酸(ATA)、酒石酸、或葡糖二酸、或它们中的任何一种的盐。
32.根据权利要求31所述的保存剂组合物，其中该酶抑制剂是乙二胺四乙酸(EDTA)及其盐。
33.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中该一种或多种任选的代谢抑制剂是叠氮化钠、硫汞撒、proclin、或双氯苯双胍已烷。
34.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中该任选的血浆扩容剂是甘油、淀粉、蛋白质胶体或非蛋白质胶体。
35.根据权利要求34所述的保存剂组合物，其中该蛋白质胶体是白蛋白、卵清蛋白或明胶。
36.根据权利要求34所述的保存剂组合物，其中该非蛋白质胶体是羟乙基淀粉。
37.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中该一种或多种任选的细胞表面重塑聚合物选自由以下组成的组：N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和硼酸的共聚物、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)三肽聚合物衍生物、绿豆植物血球凝集素、和具有甘露糖-6-磷酸受体的重复配体的合成糖肽。
38.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中该任选的细胞表面重塑聚合物是泊咯沙姆。
39.根据权利要求38所述的保存剂组合物，其中该泊咯沙姆是泊咯沙姆p188。
40.根据权利要求38所述的保存剂组合物，其中该泊咯沙姆是泊咯沙姆p407。
41.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中该一种或多种任选的试剂以所述组合物的按重量计约10％至约50％的量存在。
42.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中该任选的试剂是羟乙基淀粉。
43.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中该一种或多种任选的试剂是聚蔗糖。
44.根据权利要求43所述的保存剂组合物，其中该聚蔗糖是聚蔗糖400。
45.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中存在一种或多种细胞表面重塑聚合物并且不存在一种或多种试剂。
46.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中存在一种或多种试剂并且不存在一种或多种细胞表面重塑聚合物。
47.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中存在一种或多种试剂并且也存在一种或多种细胞表面重塑聚合物。
48.根据权利要求25所述的保存剂组合物，其中该任选的聚丙二醇(PPG)以该组合物的按重量计约0.1％至约10％的量存在。
49.一种根据权利要求1-48中任一项所述的保存剂组合物和生物样品的组合。
50.根据权利要求49所述的组合，其中该生物样品是细胞样品或组织样品。
51.根据权利要求49所述的组合，其中该生物样品源自体液。
52.根据权利要求51所述的组合，其中该体液是血液(例如，全血或其部分)。
53.根据权利要求49所述的组合，其中该生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、或循环肿瘤细胞。
54.根据权利要求49所述的组合，其中该生物样品包含核酸，该核酸选自RNA、DNA或其组合。
55.根据权利要求54所述的组合，其中该核酸为无细胞RNA、无细胞DNA或其组合。
56.根据权利要求54所述的组合，其中该核酸为细胞RNA、细胞DNA或其组合。
57.根据权利要求49-56中任一项所述的组合，其中该保存剂组合物与该生物样品的比率为约1:10v/v至约1:1v/v。
58.根据权利要求57所述的组合，其中该保存剂组合物与该生物样品的比率为约1:5v/v至约1:4v/v。
59.根据权利要求49-58中任一项所述的组合，其中该组合物能够在环境温度下将生物样品中的这些核酸和/或细胞保存至少2周。
60.一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的方法，该方法包括将根据权利要求1-48中任一项所述的保存剂组合物与该生物样品组合的步骤。
61.根据权利要求60所述的方法，其中该生物样品是细胞样品或组织样品。
62.根据权利要求60所述的方法，其中该生物样品源自体液。
63.根据权利要求62所述的方法，其中该体液是血液(例如，全血或其部分)。
64.根据权利要求60所述的方法，其中该生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、或循环肿瘤细胞。
65.根据权利要求60所述的方法，其中该生物样品包含核酸，该核酸选自RNA、DNA或其组合。
66.根据权利要求65所述的方法，其中该核酸为无细胞RNA、无细胞DNA或其组合。
67.根据权利要求65所述的方法，其中该核酸为细胞RNA、细胞DNA或其组合。
68.根据权利要求60-67中任一项所述的方法，其中该保存剂组合物与该生物样品的比率为约1:10v/v至约1:1v/v。
69.根据权利要求68所述的方法，其中该保存剂组合物与该生物样品的比率为约1:5v/v至约1:4v/v。
70.一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，该试剂盒包含：
a.根据权利要求1-48中任一项所述的保存剂组合物；以及
b.任选地，所述保存剂组合物的使用说明。
71.根据权利要求70所述的试剂盒，其中该生物样品是细胞样品或组织样品。
72.根据权利要求70所述的试剂盒，其中该生物样品源自体液。
73.根据权利要求70所述的试剂盒，其中该体液是血液(例如，全血或其部分)。
74.根据权利要求70所述的试剂盒，其中该生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、或其组合。
75.根据权利要求70所述的试剂盒，其中该生物样品包含核酸，该核酸选自RNA、DNA或其组合。
76.根据权利要求75所述的试剂盒，其中该核酸为无细胞RNA、无细胞DNA或其组合。
77.根据权利要求75所述的试剂盒，其中该核酸为细胞RNA、细胞DNA或其组合。
78.一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，该试剂盒包含：
a.任选地含有预定量的任选的抗凝剂的血液或其他生物样品采集管；
b.含有预定量的根据权利要求1-48中任一项所述的保存剂组合物的注射器；以及
c.任选地，可附接到所述注射器的针头。
79.根据权利要求78所述的试剂盒，其中该生物样品是细胞样品或组织样品。
80.根据权利要求78所述的试剂盒，其中该生物样品源自体液。
81.根据权利要求78所述的试剂盒，其中该体液是血液(例如，全血或其部分)。
82.根据权利要求78所述的试剂盒，其中该生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、或其组合。
83.根据权利要求78所述的试剂盒，其中该生物样品包含核酸，该核酸选自RNA、DNA或其组合。
84.根据权利要求83所述的试剂盒，其中该核酸为无细胞RNA、无细胞DNA或其组合。
85.根据权利要求83所述的试剂盒，其中该核酸为细胞RNA、细胞DNA或其组合。
86.一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，该试剂盒包含：
a.任选地含有预定量的抗凝剂的血液或其他生物样品采集管；以及
b.含有预定量的根据权利要求1-48中任一项所述的保存剂组合物的密封安瓿，其中所述安瓿包含可移除的封盖，并且其中所述安瓿被配置为在使用者移除该封盖时接收分配装置。
87.根据权利要求86所述的试剂盒，其中该生物样品是细胞样品或组织样品。
88.根据权利要求86所述的试剂盒，其中该生物样品源自体液。
89.根据权利要求88所述的试剂盒，其中该体液是血液(例如，全血或其部分)。
90.根据权利要求86所述的试剂盒，其中该生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、或其组合。
91.根据权利要求86所述的试剂盒，其中该生物样品包含核酸，该核酸选自RNA、DNA或其组合。
92.根据权利要求91所述的试剂盒，其中该核酸为无细胞RNA、无细胞DNA或其组合。
93.根据权利要求91所述的试剂盒，其中该核酸为细胞RNA、细胞DNA或其组合。
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