CN106132200A - 胞外核酸的固定和分离 - Google Patents

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Abstract

本发明提供采用聚氧乙烯聚合物或乙二醇作为固定剂固定含细胞生物样本中的胞外核酸群的方法、组合物和装置。

Description

胞外核酸的固定和分离
技术领域
本技术涉及用于固定(stablize)含细胞样本，尤其是血液样本中胞外核酸群的方法和组合物，并涉及用于从相应固定的生物样本中分离胞外核酸的方法。
背景技术
已经于血液，血浆，血清和其它体液内鉴定出胞外核酸。由于它们免受核酸酶破坏的事实(例如，由于它们以蛋白脂质复合物的形式被分泌，与蛋白质结合或包含在囊泡内)，各样本中发现的胞外核酸在一定程度上难降解。在许多医疗条件、恶性肿瘤和感染过程中水平升高的胞外核酸如DNA和/或RNA的存在受到特别关注，用于筛选，诊断，预后，监测疾病进展，用于识别潜在的治疗目标，并用于监测治疗反应。另外，母体血液中升高的胎儿DNA/RNA用于，例如性别鉴定、评估染色体异常和监控妊娠相关的并发症。因此，胞外核酸在非侵入性诊断和预后中是特别有用的，并可以在许多应用领域，如非侵入产前遗传检测、肿瘤、移植医学或许多其他疾病中用作，例如诊断标志物，并因此是诊断相关的(例如来自胎儿或肿瘤的核酸)。但是，在健康人类中也发现了胞外核酸。胞外核酸的常规应用和分析方法描述于，例如WO97/035589；WO97/34015；Swarup等,FEBS Letters 581(2007)795-799；Fleischhacker Ann.N.Y.Acad.Sci.1075:40-49(2006)；Fleischhacker和Schmidt,生物化学和生物物理学学报(Biochmica et Biophysica Acta),1775,(2007),191-232；Hromadnikova等(2006)DNA和细胞生物学(DNA and Cell biology),25卷,11期,635-640页；Fan等(2010),临床化学(Clinical Chemistry),56:8中。
胞外核酸通常仅以低浓度包含在样本中。例如，游离循环的核酸以1-100ng/ml血浆的浓度存在于血浆中。此外，胞外核酸经常以500nt、300nt(当表示大小和由此的链长时，术语“nt”也还包括“bp”，在DNA情况下)或甚至更小(循环核小体)的片段循环。对于血浆中的ccfDNA，平均长度通常仅为约140-170bp。另外，假设被识别用于诊断目的的实际目标胞外核酸通常也仅代表一小部分总胞外核酸。对于ccfDNA，通常只有几千份可扩增拷贝存在于每毫升血液中，取决于例如怀孕状态或肿瘤分级。特别地，肿瘤特异性DNA片段是非常罕见的，所含浓度经常比“正常”胞外核酸背景少1000倍。这种低浓度给样本的固定和随后从固定样本分离胞外核酸带来了挑战。
除了在血清，也可能在血浆中发生的降解外，分析来自例如肿瘤或有关胎儿起源的循环、无细胞核酸(cfNA)的主要问题是样本采集后来自受损或破坏的细胞的遗传物质可能稀释胞外DNA(和RNA)。收集样本后，由于离体孵育期间，特别是样本收集后相对较短的时间内细胞破碎，细胞核酸从样本中含有的细胞释放。一旦细胞裂解开始，裂解的细胞释放大量其他的核酸，它们与胞外核酸混合，且变得越来越难以回收胞外核酸用于检测。对于血液样本，特别是白血细胞的裂解是问题，因为它们释放大量基因组DNA和RNA。红血细胞不含有基因组DNA。因此，固定全血中循环的核酸必须包括固定血细胞的机制，以便防止固定期间胞外核酸群被细胞基因组DNA和RNA污染。尤其是胞外核酸，特别是罕见目标的胞外核酸的稀释是问题，必须被阻止。这些问题在现有技术中讨论(参见例如Chiu等(2001),临床化学(Clinical Chemistry)47:9 1607-1613；Fan等(2010)和US2010/0184069)。此外，由于降解，可用胞外核酸的量和可回收利用性可在一段时间实质上减少。除了来自如肿瘤细胞或胎儿的哺乳动物胞外核酸，含细胞样本也可能包括其他受关注的核酸，它们没包含在细胞内。重要的、非限制的实例是病原体核酸，如病毒核酸。在运输和处理过程中含细胞样本如特别是血液标本中病毒核酸完整性的保护，对于随后的分析和病毒载量监测也是至关重要的。
样本收集后，胞内核酸的释放尤其是问题，如果样本包含大量细胞，例如与全血样本情况一样。因此，为了避免分别减少上述问题，通常的做法是获得样本之后基本上立即从包含在样本中的细胞分离样本的基本无细胞部分。例如，建议抽血后基本上立即从全血获得血浆和/或冷却该全血和/或所获得的血浆或血清，以维持胞外核酸的完整性，并避免胞外核酸群被从包含细胞释放的胞内核酸污染。但是，获得样本的基本无细胞部分是有问题的，分离经常是冗长耗时的多步骤的过程，因为采用仔细控制的条件防止离心期间细胞破碎(破碎过程中释放的细胞核酸能够污染胞外核酸)是重要的。至于样本处理，需要从血液直接分离如血浆也是主要缺陷，因为合适的设备在收集样本的部位不一定可用。此外，经常难以除去所有的细胞。因此，通常和一般归为“无细胞”的许多处理的样本，如血浆或血清实际仍含有在分离过程中没有去除的残余量细胞。在样本处理过程中这些细胞也可能被破坏或可能死亡，从而释放胞内核酸，特别是基因组DNA，如上所述。这些残留细胞也带来风险，在处理期间它们被破坏，使它们的核酸成分，特别是基因组(核)DNA和细胞质RNA，将与胞外循环核酸部分合并从而将它们分别污染稀释。为去除这些残留细胞以及避免/减少上述问题，众所周知以较高速度执行第二离心步骤。然而，再次，这样强大的离心机往往在获得血液的设施无法使用。此外，即使抽血后直接得到血浆，如果不能直接分离核酸，建议在-80℃冷冻以保存其内包含的核酸。这也给必须冷冻运输的样本如血浆样本的处理强加实际限制。这增加成本，而且在冷链被中断的情况下存在样本被破坏的风险。
对于血液固定化，以下技术是本领域中已知的：血液样本通常收集在含有喷雾干燥或液体EDTA(如BD真空采血管(Vacutainer)K2EDTA)的血液收集管内。EDTA螯合镁，钙和其它二价金属离子，从而抑制酶反应，如例如血液凝结或由于DNA酶的DNA降解。然而，EDTA不能有效防止储存期间胞外核酸群被释放的胞内核酸分别地稀释污染。因此，EDTA固定样本的无细胞部分中发现的胞外核酸群在储存期间改变，且被大量胞内核酸，特别是基因组DNA污染。因此，特别地，EDTA不能充分固定胞外细胞群，因为它不能避免胞外细胞群被如取血后由细胞降解和样本运输和存储期间细胞不稳定产生的基因组DNA片段污染。
已知血液收集管包含用于在样本收集点直接固定RNA基因表达谱和由此的转录组的试剂(参见例如US 6,617,170、US 7,270,953、Kruhoffer等,2007)。但是，这些方法是基于包含在样本中的细胞的立即裂解。因此，这些方法和诱导细胞裂解的其他方法不适合固定含细胞样本中的胞外核酸群，因此它们诱导胞内核酸释放，从而与胞外核酸群混合。
此外，现有技术已知用于固定含细胞样本，如血液或组织样本的方法，其固定如细胞、转录组、基因组和蛋白质组。这样的方法在如WO 2008/145710中公开。所述方法基于使用特定固定化合物，如，例如N,N-二甲基乙酰胺。但是N,N-二甲基乙酰胺是有毒试剂。因此，需要提供避免使用有毒试剂的其他固定方法。
专门着眼于固定包含在全血中的胞外核酸的方法在现有技术中是已知的。一种方法采用使用甲醛固定细胞膜从而降低细胞裂解，此外，甲醛抑制核酸酶。相应的方法在如US7,332,277和US 7,442,506中描述。为满足同时细胞固定和核酸固定的需求，基于使用甲醛释放剂开发了固定系统。相应的固定剂商购自Streck公司，名为无细胞RNA BCT(血液收集管)。在室温下，10毫升血液收集管用于保存和固定血浆中的无细胞RNA至多3天。防腐剂固定血浆中的无细胞RNA，防止在样本处理和存储期间非目标背景RNA从血液细胞释放。US2011/0111410描述使用释放甲醛组分以获得同一血液样本中细胞和DNA固定。因此，该文件描述的技术，其中固定试剂固定取血中的血液细胞，从而防止细胞RNA被无细胞RNA或球蛋白RNA污染，抑制RNA合成至少2小时，血液细胞内的细胞RNA被保留以保持血液细胞的蛋白表达图谱随取血时间基本不变。白细胞可以从相应固定的样本分离，然后从白细胞提取细胞RNA。但是，使用甲醛或释放甲醛物质具有缺陷，因为它们通过诱导核酸分子之间或蛋白和核酸之间的交联损害胞外核酸分离的有效性。用于固定血液样本的方法还在如US 2010/0184069和US2010/0209930中描述。
PCT/EP2012/070211和PCT/EP2012/068850描述了用于固定含细胞生物样本，如全血样本中胞外核酸群的不同方法。这些申请中描述的固定组合物对固定胞外细胞群有效，特别是通过阻止胞内核酸释放进入胞外核酸群。
继续需要开发和改进获得固定包含在含细胞生物样本内的胞外核酸群固定的方法，包括疑似包含细胞的样本，特别是全血、血浆或血清，从而是使得处理、相应的处置这种样本更容易。通过提供优选不损害后续的核酸分离的有效和可靠的样本固定技术，包含在这种样本中的胞外核酸的分离和检测变得更可靠，因此，胞外核酸的诊断和预后应用/使用通过这种固定技术得以改进。特别是，继续需要用于保存全血样本中，例如用于产前检查和/或用于筛选疾病，如肿瘤，特别是恶化前或恶性疾病的胞外核酸群的方案。
本发明的目的是提供固定包含在含细胞样本中的胞外群的方法和组合物。特别地，目的是克服现有技术样本固定方法的至少一个缺陷。此外，本发明的特别目的是提供适用于室温固定含细胞生物样本，特别是全血样本的方法。进一步地，本发明的目的提供样本收集容器，特别是血液收集管，能有效固定含细胞生物样本，且特别能固定包含在样本中的胞外核酸群。另外，本发明的一目的是提供固定技术，随后允许从固定样本以良好的收率分离胞外核酸。
发明内容
本发明基于意外发现聚氧乙烯聚合物，如聚乙二醇能有效固定包含胞外核酸的含细胞生物样本，特别是全血样本。发现不同分子量和各种不同浓度的聚氧乙烯聚合物，如聚乙二醇能够固定包含细胞的样本的胞外核酸群，特别能够降低收集样本后，胞外细胞群被基因组DNA，特别是片段化基因组DNA污染的风险。使用聚氧乙烯聚合物，如聚乙二醇作为固定剂降低胞外核酸群被胞内核酸，如特别是基因组DNA稀释的风险，这明显有助于在样本收集时保留胞外核酸群的图谱。固定效果强于采用其他固定剂的效果。此外，发现聚氧乙烯聚合物如优选聚乙二醇可以方便地与其他固定剂联用，如半胱天冬酶抑制剂和酰胺，以进一步提高对含细胞的样本的固定效果。有利的是，聚氧乙烯聚合物如优选的聚乙二醇不归类为有毒的、有害的或刺激性的试剂。在优选的实施方式中，采用分子量不同的两种或更多种聚氧乙烯醇(poly(oxyethylene)glycol)。优选地，分子量至少为1500的高分子量聚氧乙烯聚合物与分子量为1000或更小的低分子量聚氧乙烯聚合物联用用于固定。发现分子量不同的聚氧乙烯聚合物的适度组合，如采用高和低分子量聚氧乙烯聚合物，提供有效固定的样本，随后可以采用各种不同的标准核酸分离方法以好的收率从该样本分离胞外核酸。此外，本文描述采用乙二醇(1,2-乙二醇)作为用于含细胞样本的固定剂。乙二醇也可以与聚氧乙烯聚合物联用用于固定。
根据第一方面，提供适用于固定包含在含细胞生物样本中的胞外核酸群的方法，包括将包含细胞的样本与作为固定剂的至少一种聚氧乙烯聚合物或作为固定剂的乙二醇接触的步骤。
根据第二方面，提供用于从含细胞生物样本分离胞外核酸的方法，其中所述方法包括步骤：
a)根据本发明第一方面限定的方法固定含细胞生物样本；和
b)从固定的样本分离胞外核酸。
根据第三方面，提供适用于固定含细胞生物样本的组合物，包括：
i)作为固定剂的聚氧乙烯聚合物，或
ii)作为固定剂的乙二醇，
和选自下组的一种或多种，优选两种或多种的其他助剂(additive)：
-一种或多种伯、仲或叔酰胺；
-半胱天冬酶抑制剂；
-抗凝剂和/或螯合剂。
优选地，根据第三方面的组合物包括作为固定剂的聚氧乙烯聚合物，其优选是分子量至少为1500的高分子量聚氧乙烯聚合物，此外包括选自下组的一种或多种，优选两种或多种其他助剂：
-至少一种其他聚氧乙烯聚合物，其分子量比优选是高分子量聚氧乙烯聚合物的第一聚氧乙烯聚合物的分子量低至少100、优选至少200、至少300或至少400，其中所述其他聚氧乙烯聚合物优选是分子量为1000或更小的低分子量聚氧乙烯聚合物；
-一种或多种伯、仲或叔酰胺；
-半胱天冬酶抑制剂；
-抗凝剂和/或螯合剂。
通过固定包含在所述样本中的细胞和胞外核酸群，相应的固定组合物在固定含细胞生物样本，如血液、血浆和/或血清中是特别有效的。在固定期间，包含在含细胞生物样本内的胞外核酸群基本维持在生物样本与所述固定组合物接触时显示的状态。基因组DNA和其他胞内核酸的释放明显减少，如实施例所示。与分离自未固定样本的胞外核酸相比，分离自各固定样本的胞外核酸包括明显更少的胞内核酸，特别是片段化基因组DNA污染。各固定组合物允许在室温存储和/或处理，如运输固定的生物样本，如血液数天，而不实质损害样本，包含其内的各胞外核酸群的质量。
根据第四方面，本发明涉及第三方面的组合物用于固定含细胞生物样本，优选血液样本中的胞外核酸群。
根据第五方面，提供用于收集含细胞生物样本的收集装置，其中所述收集装置包括：
i)作为固定剂的聚氧乙烯聚合物，或
ii)作为固定剂的乙二醇，
和选自下组的一种或多种其他助剂：
-一种或多种伯、仲或叔酰胺；
-半胱天冬酶抑制剂；
-抗凝剂和/或螯合剂。
优选地，根据第五方面的收集装置包括聚氧乙烯聚合物作为固定剂，其优选是分子量至少为1500的高分子量聚氧乙烯聚合物，和还包括选自下组的一种或多种，优选两种或多种的其他助剂：
-至少一种其他聚氧乙烯聚合物，其分子量比优选是高分子量聚氧乙烯聚合物的第一聚氧乙烯聚合物的分子量低至少100、优选至少200、至少300或至少400，其中所述其他聚氧乙烯聚合物优选是分子量为1000或更小的低分子量聚氧乙烯聚合物；
-一种或多种伯、仲或叔酰胺；
-半胱天冬酶抑制剂；
-抗凝剂和/或螯合剂。
用于收集含细胞生物样本，优选血液样本的收集装置可能包括本发明第三方面所述的固定组合物。提供包括固定组合物的相应收集装置，如样本收集管的优势在于，样本一收集入相应的装置，含细胞生物样本就立即被固定。
根据第六方面，提供一种方法，包括从患者收集，优选抽取生物样本，优选血液直接进入本发明第五方面所述的容器的步骤。
根据第七方面，提供一种生产本发明第三方面所述的组合物的方法，其中，组合物的组分是混合的，优选在溶液中混合。用于本文的术语“溶液”特别指液体组合物，优选水性组合物。它可以是仅一相的均匀混合物，但溶液包括固体组分，如沉淀物也在本发明的范围内。
从以下说明书和所附权利要求，本发明的其他目的、特征、优势和方面对本发明与技术人员将变得更明显。但是。应该理解，以下说明书、所附权利要求和具体实施例，表明本申请的优选实施方式，只通过说明的方式给出。
具体实施方式
本发明涉及基于使用聚氧乙烯聚合物作为固定剂的用于固定包含在含细胞生物样本中的胞外核酸群的方法、组合物和装置和由此的技术。已经表明不同分子量和各种不同浓度的聚氧乙烯聚合物如聚乙二醇作为固定剂是有效的。此外，与其他固定剂的有利组合被描述。采用本发明的方法和组合物获得的固定作用使得能长时间在室温下存储和/或处理固定样本。
本文描述的固定技术降低包含在包含细胞的样本中的胞外核酸群被源自包含在样本中的破碎和/或死细胞的胞内核酸，特别是片段基因组DNA污染，且因此被稀释的风险。由于在获得样本时胞外核酸群的组合物被固定并因此实质上被保存，样本收集和核酸分离间隔时间可以在合适的固定期内改变，对胞外核酸群的组合物没有明显的负面影响。这是重要的优点，因为它减少由不同处理程序引起的胞外核酸群变异性。与分离自未固定样本的胞外核酸相比，分离自相应固定样本的胞外核酸包括明显更少的胞内核酸，特别是片段基因组DNA污染。描述的固定技术提高了诊断或预后细胞外核酸分析的标准，因为样本的处理/存储的变化对包含在含细胞生物样本内的胞外核酸群的质量、相应地组成和由此的图谱具有较少的影响，从而使基于细胞外核酸的诊断或预后应用更可靠且更独立于使用的存储/处理条件。获得的实质性保存是重要的优势，因为它提高旨在分析胞外核酸的任何后续测试的精确性。由此，各自分离的胞外核酸的诊断和预后适用性被改进。本文描述的具体实施方式具有优势：包含在胞外核酸群内的某些胞外核酸分子的比例可以保持恒定，且由此与收集生物样本时存在的比例更相当。因此，有利地，可以保存胞外核酸群的图谱。因此，相应的含细胞生物样本，特别是获自相应固定的样本的胞外核酸的分析变得更有可比性。
此外，本发明的教导排除为避免相应地减少胞外核酸被存储/运输期间死亡或蜕变细胞另外释放的胞内核酸，特别是片段基因组DNA污染，而在样本收集后从样本的无细胞部分直接分离包含在生物样本内的细胞的必要。该优点明显简化含细胞的生物样本，如全血样本的处理。但是，当处理细胞消除生物样本，或通常称为“无细胞”的样本，如血浆或血清时，本发明的教导也是有利的。相应的细胞消除或“无细胞”生物样本可能还包括(还取决于使用的分离方法)残留的细胞，特别是白细胞，其包含基因组DNA。所述残留的细胞造成风险，如果在运输或存储过程中(可能地)残留的细胞破碎或死亡，胞外核酸群变得越来越受胞内核酸，特别是片段化基因组DNA的污染。当采用本发明教导的固定方法，该风险大大降低。因此，当固定包含大量细胞的生物样本如血液样本时，本发明具有很多优点，且当固定包含较少或仅小量细胞或可能仅疑似包含细胞的生物样本，如，例如血浆、血清、尿液、唾液、滑膜液、羊水、泪液、淋巴液、酒类、脑脊液等时，本发明也具有重要优势。
此外，描述乙二醇的应用，用于固定含细胞样本中的胞外核酸群，其中，任选地，乙二醇与聚氧乙烯聚合物和/或本文描述的一种或多种其他固定剂联用。
A.固定方法
根据第一方面，提供适用于固定包含在含细胞生物样本中的胞外核酸群的方法，包括将含细胞生物样本与作为固定剂的至少一种聚氧乙烯聚合物或与作为固定剂的乙二醇接触的步骤。上文描述采用聚氧乙烯聚合物作为固定剂的优势。
优选地，第一方面所述的方法包括将含细胞生物样本与作为固定剂的至少一种聚氧乙烯聚合物接触的步骤。术语聚氧乙烯聚合物特别指环氧乙烷的低聚物或聚合物。它包括至少两个环氧乙烷单元。低和高分子量聚氧乙烯聚合物是已知的。它们的分子量通常是它的单体的分子量44的倍数，且能高达100000。分子量以Da表示。聚氧乙烯聚合物可能是直链的或支链的，或具有其他几何构型。直链聚氧乙烯聚合物是优选的。聚氧乙烯聚合物可以是未取代的或取代的，优选是聚乙二醇。如实施例所示范，具有各种不同的分子量和各种不同的浓度聚乙二醇具有细胞固定效果，因此可以单独使用或与其他固定剂联用从而固定含细胞样本中的胞外核酸群，特别地，通过减少胞外核酸群被胞内核酸如特别是基因组DNA稀释。但是，其他聚氧乙烯聚合物也可能使用，获得聚乙二醇示出的固定效果。如所提及的，也可能使用具有固定效果的取代的聚氧乙烯聚合物，如烷基聚氧乙烯聚合物，如烷基聚乙二醇，和聚(氧乙烯)酯、聚(氧乙烯)胺、聚(氧乙烯)硫醇化合物、聚(氧乙烯)甘油酯和其他。用作固定剂的聚氧乙烯聚合物的优选实施方式是聚乙二醇。它优选是无支链的，并且可以是未取代的或取代的。已知取代形式的聚乙二醇包括烷基聚乙二醇，例如，其在一个或两末端被C1-C5烷基取代。优选地，采用式HO-(CH2CH2O)n-H所示的未取代聚乙二醇。即使未明确说明，本申请中描述聚氧乙烯聚合物的所有公开内容通常特别应用并具体指优选实施方式聚乙二醇。可利用各种分子量的聚氧乙烯聚合物。优选地，术语聚乙二醇是指低聚物或聚合物，由本文规定的适合且优选用于聚氧乙烯聚合物的分子量所示，其还特别应用到优选的实施方式聚乙二醇。
已发现聚氧乙烯聚合物的固定效果和它的分子量之间的关系。发现较高分子量聚氧乙烯聚合物与较低分子量聚氧乙烯聚合物相比是更有效的固定剂。为采用较低分子量聚氧乙烯聚合物获得有效固定，通常推荐比较高分子量聚氧乙烯聚合物更高的浓度。但对于一些应用如血液样本，保持低的固定助剂用量是优选的。因此，在实施方式中，较高分子量聚氧乙烯聚合物用作固定剂，因为它们允许使用较低浓度聚氧乙烯聚合物，同时对胞外核酸群产生强的固定效果。
因此，根据一实施方式，分子量至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物用作固定剂并与包含细胞的样本接触。高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量选自以下范围：1500-50000、1500-40000、2000-40000、3000-40000、2000-30000、2500-30000、2500-25000、3000-20000、4000-20000、3500-15000、3000-10000、4000-10000、4500-10000、4500-9000、4500-8000、5000-8000、5000-7000和5500-7000。如实施例所示，许多不同的高分子量聚氧乙烯聚合物能够与本发明结合使用。结合本发明的不同方面和实施方式，还描述了合适的高分子量聚氧乙烯聚合物。对于聚乙二醇，特别是未取代聚乙二醇的使用，这些分子量是特别优选的。未取代聚乙二醇也用于实施例中。具有特定分子量的聚氧乙烯聚合物的分子量可以在一定制造条件范围内变化，这是本领域技术人员已知的。
高分子量聚氧乙烯聚合物的使用浓度产生或支持包含在含细胞样本中的胞外核酸群的固定。用于不同样本类型的合适浓度可由本领域技术人员确定，例如，通过在实施例中描述的测试实验中测试特定高分子量聚氧乙烯聚合物的浓度。如实施例所示出的，高分子量聚氧乙烯聚合物在各种不同的浓度是有效的。获得的固定效果和优选的浓度也取决于是使用一种还是多种其他固定剂。优选的组合在本文描述。根据一实施方式，含细胞生物样本与高分子量聚氧乙烯聚合物及任选的其他助剂接触后获得的混合物包括浓度范围选自下组的高分子量聚氧乙烯聚合物：0.05％-4％(w/v)、0.1％-3％(w/v)、0.2％-2.5％(w/v)、0.25％-2％(w/v)、0.3％-1.75％(w/v)和0.35％-1.5％(w/v)。根据一实施方式，高分子量聚氧乙烯聚合物以较低浓度范围使用，如0.25％-1.5％(w/v)、0.3％-1.25％(w/v)、0.35％-1％(w/v)和0.4％-0.75％(w/v)。上述浓度范围特别适用于固定血液。以1.5％(w/v)或更低、1.25％(w/v)或更低、1％(w/v)或更低，且特别以0.75％(w/v)或更低的浓度使用高分子量聚氧乙烯聚合物在某些实施方式中是有利的。在高分子量聚氧乙烯聚合物以较高浓度用于所得的包括固定剂和包含细胞的样本，如血液样本的混合物的实施方式中发现，当使用涉及如使用硅胶柱的某些标准核酸分离程序时，后续的胞外核酸分离可能会受损。但是，这对于使用与大多数核酸分离方法匹配的固定技术是有利的，且采用硅胶柱分离胞外核酸被广泛使用和建立。高分子量聚氧乙烯聚合物以1.5％(w/v)或更低、1.25％(w/v)或更低、1％(w/v)或更低、或0.75％或更低的浓度用于固定包含样本的混合物支持采用这种标准方法能够以好的收率从固定样本有效分离胞外核酸，即使采用较高体积的固定组合物。这是有利的，因为胞外核酸，特别是包含在胞外核酸群内的特定目标核酸经常仅以很少的拷贝存在。本文描述的固定技术也适用于其他核酸分离方法，包括基于离子交换的那些。如实施例中所示，观察到的损害也取决于包含高分子量(聚氧乙烯)聚合物的固定组合物的使用体积。采用较小体积固定组合物用于固定能够补偿损害，即使以较高浓度使用高分子量聚氧乙烯聚合物，以致随后的核酸分离不受损。因此，为降低或甚至避免损害，降低包含样本的混合物中高分子量聚氧乙烯聚合物的总浓度和/或降低包含高分子量聚氧乙烯聚合物的固定组合物的体积是可选方案。实施例中示出的该体积依赖作用是显著且非常令人惊讶，因为包含样本的混合中总浓度是相同的。
根据一实施方式，用于固定的聚氧乙烯聚合物分子量低于1500，可能是分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物。它以能够对含细胞生物样本的胞外核酸群产生或支持固定效果的浓度被使用。用于不同样本类型的合适浓度由本领域技术人员确定，如，通过在实施例描述的测试实验中测试不同的浓度。相应的聚氧乙烯聚合物，如分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物能够以选自下组的浓度范围存在于含细胞生物样本与所述聚氧乙烯聚合物以及任选的其他助剂接触后获得混合物中：0.5％-10％,1.5％-9％,2％-8％,2-7％,2.5％-7％和3％-6％。聚氧乙烯聚合物是固体时，百分比值是指(w/v)，聚氧乙烯聚合物是液体时，百分比值是指(v/v)。示出的浓度特别适用于采用血液样本的情况。为获得(或支持)胞外核酸群的固定，对于低分子量聚氧乙烯聚合物至少1％，优选至少1.5％较高的浓度是有利的。如实施例中所示的，分子量为1500或更低，如1000或更低的聚氧乙烯聚合物如聚乙二醇也展示出对胞外核酸群的固定效果，特别是通过减少被基因组DNA的稀释。实施例示出分子量为1500或更低，如1000或更低的聚氧乙烯聚合物如聚乙二醇是有效的固定剂，特别是与本文描述的一种或多种其他固定剂如半胱天冬酶抑制剂和至少一种伯、仲、叔酰胺联合使用时。低分子量聚氧乙烯聚合物的分子量范围选自：100-1000、150-800、150-700、优选200–600且更优选200–500，如200–400。
发现分子量为1000或更低，优选800或700或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物能够以实质上较高浓度使用，因为它基本上不阻碍后续从固定样本分离胞外核酸，即使采用较高体积的固定组合物。但是，如果需要获得固定效果的量太大，这对于样本的加工和处理是不便的。通常优选采用相当低量或体积的固定剂固定样本。这特别地，对于某些样本如血液样本的情况下，可以加入到样本的固定剂的量受限于使用的标准收集管。例如，对于用于收集100毫升血液的标准收集装置，能够加入最大量约2毫升固定剂。
根据一实施方式，至少两种聚氧乙烯聚合物用于固定，它们分子量不同。它们可能是相同类型，优选都是聚乙二醇，如未取代聚乙二醇。根据一实施方式，分子量之差是至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1000。根据一实施方式，分子量之差是至少2500、至少3500、至少5000或至少7500。如随后该实施方式的具体实施方式中所描述的，使用不同分子量的两种聚氧乙烯聚合物是有利的。如本文所述，聚氧乙烯聚合物的固定效果看来取决于它们的分子量。在测试实施例中，发现分子量越高，固定效果越好。但是，根据它们的分子量，聚氧乙烯聚合物可能对后续核酸分离方法具有不同效果。如上述，发现在某些涉及使用较高分子量聚氧乙烯聚合物作为固定剂的实施方式中，特别是在包含样本的固定混合中较高体积的固定组合物和较高浓度的聚合物被使用时，采用某些核酸分离方法分离核酸效率较低。如实施例所示，当使用不同分子量的聚氧乙烯聚合物的混合物时，发生在某些情况中的这些问题能够被克服。因此，使用至少两种分子量不同的聚氧乙烯聚合物的实施方式是有利的，因为它能提供具有与待获得的固定效果和如为某些下游使用所需特征相关的所需特征的聚氧乙烯聚合物的均衡组合物。
根据一实施方式，如上所限定的分子量至少为1500的高分子量聚氧乙烯聚合物与分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物联合使用，包含细胞的样本与两种类型的聚氧乙烯聚合物接触。本文描述合适的实施方式。采用高分子量聚氧乙烯聚合物与低分子量聚氧乙烯聚合物联用是有利的，因为低分子量聚氧乙烯聚合物能降低为获得样本有效固定所需的高分子量聚氧乙烯聚合物的浓度。因此，高分子量聚氧乙烯聚合物能够以不损害采用某些标准方法如涉及硅胶柱的那些方法进行的后续核酸分离的浓度与样本用于混合物中。这种实施方式是有利的，因为它为使用的固定组合物的体积或量提供更多自由。低分子量聚氧乙烯聚合物助于固定，但与高分子量聚氧乙烯聚合物相比，没有在测试样本中发现对后续核酸分离显著的损害，当使用方法，如涉及硅胶柱的那些，实施例中较高分子量聚氧乙烯聚合物在某些浓度和/或体积示出损害效果。采用高和低子量聚氧乙烯聚合物组合固定含细胞样本中的胞外核酸群是特别优选的实施方式，具有重要的优点。低分子量聚氧乙烯聚合物可以是与上述高分子量聚氧乙烯聚合物同类型。且对于低分子量聚氧乙烯聚合物，优选使用聚乙二醇，如未取代聚乙二醇。高分子量聚氧乙烯聚合物的合适分子量如上述。它的分子量范围选自下组：1500-50000、2000-40000、2500-30000、2500-25000和3000-20000。低分子量聚氧乙烯聚合物的分子量范围选自下组：100-1000、150-800、150-700、优选200–600且特优选200–500，如200–400。高和低分子量聚氧乙烯聚合物的合适且优选浓度和浓度范围如上所述，也可以用于两种类型聚合物联用的实施方式中。
根据一实施方式，含细胞生物样本优选是血液与高和低分子量聚氧乙烯聚合物以及任选的用于固定的其他助剂接触后获得的混合物包括分子量范围为3000–40000，优选4000–20000，浓度范围为0.2％-1.5％(w/v)，优选0.3％-1.25％(w/v)，在实施方式中范围为0.4(w/v)-0.75％(w/v)的高分子量聚氧乙烯聚合物；以及分子量范围为200–800，优选200-600，浓度范围为1.5％-8％、优选为2％-7％、更优选为2.5％-6％的低分子量聚氧乙烯聚合物。高和低聚氧乙烯聚合物优选是聚乙二醇，如未取代聚乙二醇。以上还描述了高和低分子量聚氧乙烯聚合物的合适实施方式并与不同的方面和实施方式结合。在这实施方式中含细胞生物样本可能是血液，且血样还与抗凝剂接触。以下描述。抗凝剂的合适实施例。
如提供的实施例所示，在实施方式中单独使用聚氧乙烯聚合物，如高分子量聚氧乙烯聚合物在固定含细胞样本和保护胞外核酸群以免其组成变化，特别是在存储期间由受损或死亡细胞释放的片段基因组DNA污染引起的变化中已经是有效的。但如果聚氧乙烯聚合物，优选是聚乙二醇与其他固定剂和/或助剂联用，固定效果可以被显著改善。发现联用聚氧乙烯聚合物与其他固定剂显著改善获得的固定效果。如实施例中所示的，当与其他固定剂如酰胺和半胱天冬酶抑制剂组合时，显著支持和提高固定效果。这种平衡组合物显著改进获得的固定效果，其也优于现存的现有技术。随后描述其他固定剂和创新的组合物的合适和优选实施例。
根据一实施方式，包含细胞的样本还与作为其他固定剂的一种或多种伯、仲或叔酰胺接触。伯、仲或叔酰胺具有有利的含细胞样本固定效果，因此，在一实施方式内用于支持胞外核酸群的固定。也可以使用两种或多种伯、仲或叔酰胺或组合物。酰胺优选是羧酸酰胺。
不同伯、仲或叔酰胺的合适浓度和/或不同样本类型可以由本领域技术人员确定，如通过在实施例中描述的测试实验中测试不同的浓度。通常，含细胞生物样本与至少一种聚氧乙烯聚合物及一种或多种伯、仲或叔酰胺和任选其他助剂接触时获得的混合物可能包括所述酰胺(或酰胺的组合)，浓度为至少0.05％、至少0.1％、至少0.25％、至少0.5％或至少0.75％。合适的浓度范围包括但不限于0.1％-10％、0.25％-7.5％、0.3％-5％、0.4％-3％、0.5％-2％、0.6％-1.8％和0.75％-1.5％。如本文使用以百分比指示的浓度或浓度范围，具体地，对于固体酰胺，为重量/体积(w/v)百分比，对于液体酰胺，为体积/体积(v/v)百分比。
根据一实施方式，伯、仲或叔酰胺是式1的化合物：
其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，更优选C1-C2烷基,R2和R3相同或不同，选自氢和烃基，优选烷基，具有1-20个原子的碳链长度，以直链或支链形式，和R4是氧、硫或硒，优选R4是氧。
除了聚氧乙烯聚合物用于固定外，也能够使用式1所示一或多个化合物的组合。
在实施方式中，其中R1为烷基，对于R1，1或2的链长是优选的。
式1所示化合物的R2和/或R3相同或不同，选自氢和烃基，优选烷基。根据一实施方式，R2和R3都是氢。根据一实施方式，R2和R3之一是氢，另一个是烃基。根据一实施方式，R2和R3是相同或不同的烃基。烃基R2和/或R3可以互相独立地选自下组：包括短链烷基和长链烷基的烷基、烯基、烷氧基、长链烷氧基、环烷基、芳基、卤代烷基、烷基甲硅烷基、烷基甲硅烷氧基、亚烷基、亚烯基(alkenediyl)、亚芳基，羧酸酯基和羰基。特别地，R2和/或R3的链长n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。根据一实施方式，R2和R3的碳链长度为1-10，优选1-5，更优选1-2。根据一实施方式，R2和/或R3为烷基，优选C1-C5烷基。
优选地，式1所示化合物为羧酸酰胺，以使R4是氧。它可以是伯、仲或叔羧酸酰胺。
根据一实施方式，式1所示化合物是N,N-二烷基-羧酸酰胺。以上描述优选的R1、R2、R3和R4基团。使用式1所示的相应化合物具有优势，额外地，胞内核酸，如特别是RNA，如mRNA和/或miRNA转录物能够固定在包含细胞的样本内。胞内核酸，特别是基因转录水平的额外固定是有利的，因为它允许后续分析包含细胞内目标转录物或转录图谱。根据一实施方式，式1所示化合物选自下组：N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二乙基甲酰胺。同样适合的是单独的硫代类似物，其包括硫，替代R4的氧。如，N,N-二甲基乙酰胺(DMAA)获得好的固定结果，但是其是有毒试剂。优选地，式1所示的至少一种化合物与聚氧乙烯聚合物联合用于固定含细胞生物样本，根据GHS分类它不是有毒试剂。
根据一实施方式，含细胞生物样本与聚氧乙烯聚合物和式1所示的化合物，为N,N-二烷基丙酰胺，如N,N-二丙基丙酰胺接触用于固定。如实施例中所示的，相应的组合特别适用于固定含细胞样本，如血液样本中的胞外核酸群。
根据一实施方式，包含细胞的样本与聚氧乙烯聚合物和至少一种式1所示的化合物，其为伯或仲羧酸酰胺接触。从通过引用并入本文的未公开的US 61/803,107和EP13160896.0(参见公开的WO 2014/146781)的实施例可知，伯和仲羧酸酰胺能够在宽的浓度范围内固定胞外核酸群。根据一实施方式，伯羧酸酰胺选自下组：甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺和丁酰胺。优选地，伯羧酸是丁酰胺，因为丁酰胺对固定胞外核酸群特别有效，如本文实施例中所示的，此外，它是无毒的。丁酰胺对含细胞样本的胞外核酸群的固定效果也详细描述在未公开的申请EP 13159834.4和EP 13180086.4(参见公开的WO 2014/146780和WO 2014/146782)，通过引用并入本文。
根据优选的实施方式，包含细胞的样本与聚氧乙烯聚合物，其优选是聚乙二醇，以及丁酰胺和/或N,N-二烷基丙酰胺接触用于固定，其中N,N-二烷基丙酰胺优选是N,N-二甲基丙酰胺。通常用于伯、仲和叔酰胺的上述合适和优选的浓度和浓度范围通常也特别用于该实施方式。如通过实施例示出的，采用这些范围内的浓度的丁酰胺和/或N,N-二烷基丙酰胺为含细胞样本如血液样本提供有益的固定效果。
根据一实施方式，含细胞生物样本与以上描述的聚氧乙烯聚合物和至少一种半胱天冬酶抑制剂接触。使用不同半胱天冬酶抑制剂的组合也在本发明的范围内。如通过实施例示出的，使用聚氧乙烯聚合物优选高分子量聚乙二醇与半胱天冬酶抑制剂联合显著提高获得的固定效果。此外，发现特别是与包含大量细胞的生物样本接触，且此外，它们的组成不同，如血液样本，获得的固定效果更强，更均匀。如来自不同宿主的血液样本在离体处理期间发生的胞外核酸群的变化可能不同。一些样本胞外核酸群图谱出现强烈变化(特别是基因组DNA强增长)，而在其他样本中，效果不太突出。这种样本对固定的反应不同。当使用聚氧乙烯聚合物与半胱天冬酶抑制剂及还优选以上描述的一种或多种伯、仲或叔酰胺组合用于固定或者不同宿主的血液样本时，能获得更均衡的固定效果。存在于获得的混合物中的半胱天冬酶抑制剂显著支持胞外核酸群的固定。此外，存在于样本中的核酸，特别是基因组DNA的降解被固定剂的所述组合减少。因此，使用聚氧乙烯聚合物如聚乙二醇与至少一种半胱天冬酶抑制剂组合显著改进固定效果，从而支持样本中包含的胞外核酸群基本上保持在获得、相应的收集、甚至在长时间存储生物样本时它所展示的状态。
优选地，半胱天冬酶抑制剂是细胞可渗透的。半胱天冬酶基因家族成员在细胞凋亡中起着显著作用。各半胱天冬酶的底物选择或特异性已经被用于开发成功竞争半胱天冬酶结合的多肽。可能通过将半胱天冬酶特异性多肽连接到如醛、腈或酮等化合物生成可逆或不可逆半胱天冬酶活化抑制剂。例如，氟甲基酮(FMK)衍生多肽，如Z-VAD-FMK作为无新增毒性效果的有效不可逆抑制剂。在N-末端和O-甲基侧链与苄氧羰基(BOC)反应合成的抑制剂表现出增强的细胞渗透性。在C-末端与苯氧基反应合成其他合适的半胱天冬酶抑制剂。实施例是Q-VD-OPh，它是细胞可渗透的、不可逆广谱半胱天冬酶抑制剂，甚至比半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK在防止细胞凋亡以及由此的支持固定上更有效。
根据一实施方式，半胱天冬酶抑制剂是泛半胱天冬酶抑制剂，因此是广谱半胱天冬酶抑制剂。根据一实施方式，半胱天冬酶抑制剂包括改性的半胱天冬酶特异性多肽。优选地，所述半胱天冬酶特异性多肽是经醛、腈或酮化合物改性。根据一实施方式，半胱天冬酶特异性多肽是改性的，优选在羧基端，与O-苯氧基或氟甲基酮(FMK)基反应。根据一实施方式，半胱天冬酶抑制剂选自Q-VD-OPh和Z-VAD(OMe)-FMK构成的组。在优选的实施方式中，作为半胱天冬酶广谱抑制剂的Q-VD-OPh用于固定。Q-VD-OPh是细胞可渗透的，抑制凋亡引起的细胞死亡。Q-VD-OPh是对细胞无毒的，甚至在相当高浓度下，包括偶联到氨基酸缬氨酸和天冬氨酸的羧基端苯氧基。其抑制通过三条主要的凋亡路径，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10，以及半胱天冬酶-12介导的凋亡上是等效的(Caserta等,2003)。半胱天冬酶抑制剂的实施例也列于WO 2013/045457的表1中，通过引用并入本文。
生物样本与至少一种聚氧乙烯聚合物和至少一种半胱天冬酶抑制剂以及任选的其他助剂接触后获得的混合物可能包括半胱天冬酶抑制剂(或半胱天冬酶抑制剂的组合)，浓度为至少0.05μM、至少0.1μM、至少0.5μM、至少0.75μM、至少1μM、至少1.25μM、至少1.5μM、至少1.75μM、至少2μM、至少2.25μM、至少2.5μM、至少2.75μM、至少3μM、至少3.25μM或至少3.5μM。当与含细胞生物样本和其他助剂混合时一种或多种半胱天冬酶抑制剂的合适浓度范围包括但不限于0.1μM-25μM、0.75μM-20μM、1μM-15μM、1.5μM-12.5μM和2μM-10μM及3μM-7.5μM。以上提及的浓度应用至单一半胱天冬酶抑制剂的使用以及半胱天冬酶抑制剂组合的使用。当使用泛半胱天冬酶抑制剂，特别是改性的半胱天冬酶特异性多肽如Q-VD-OPh和/或Z-VAD(OMe)-FMK时，上述浓度是特别合适的。上述浓度，如特别适用于固定全血。各半胱天冬酶抑制剂和/或其他含细胞的生物样本的合适浓度范围可以由本领域技术人员确定，如通过在实施例描述的测试试验中检测不同浓度的各半胱天冬酶抑制剂。
采用固定剂组合观察到的固定效果强于当单独使用时任何单独固定剂观察到的效果，和/或能使用较低浓度的单个固定剂，从而使固定剂的组合使用成为有吸引力的选择。与单个固定剂相比，包括本文描述的聚氧乙烯聚合物如聚乙二醇的固定剂的组合具有更好的固定效果，且因此是有利的实施方式。此外，其他的助剂能够用于固定，如抗凝剂和螯合剂，当固定血液样本时，它们是特别有用的。
如发明背景讨论的，胞外核酸通常不是裸存于包含细胞的样本的胞外部分，而是例如在一定程度上通过被释放保护在复合物内或通过被包含在囊泡或类似物内而固定。这具有效果，胞外核酸天然已经在一定程度上固定，因此通常不会被含细胞样本如全血、血浆或血清中的核酸酶快速降解。因此，当旨在固定包含在含细胞生物样本中的胞外核酸时，获得或收集含细胞生物样本后的主要问题之一是包含在收集的含细胞生物样本中的胞外核酸群被源自包含在含细胞生物样本中的破损或死亡细胞的胞内核酸，特别是片段基因组DNA污染或稀释。根据本发明的固定技术在这方面是特别有利的，因为它不仅基本上保留了存在于样本中的胞外核酸，并如抑制包含的胞外核酸降解(在血液情况下，与未固定样本或如EDTA固定样本相比，在固定期间优选抑制至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或更优选至少95％)，而且此外，有效减少基因组DNA从包含在获得的含细胞生物样本中的细胞释放和/或减少各基因组DNA的片段化。根据一实施方式，采用聚氧乙烯聚合物固定含细胞样本中的胞外核酸群，任选但优选地与上述一种或多种其他固定剂组合，具有如下效果：与非固定样本相比，减少固定期间从包含在样本中的细胞释放的基因组DNA导致的DNA增多。根据一实施方式，与未固定样本或EDTA固定的相应样本(特别是血液样本或源自血液的样本如血浆或血清的情况下)相比，在固定期间，所述基因组DNA的释放被减少至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少17倍或至少20倍。根据一实施方式，与未固定样本或EDTA固定的相应样本(特别是血液样本或源自血液的样本如血浆或血清的情况下)相比，在固定期间，所述基因组DNA的释放被减少至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。可以通过如本文实施例部分描述的定量核糖体18S DNA确定释放的DNA。如实施例所示，采用本发明的教导获得的固定显著降低固定期间DNA的这种释放。因此，根据一实施方式，采用聚氧乙烯聚合物，如聚乙二醇，任选与上述一种或多种其他固定剂，如优选一种或多种伯、仲或叔酰胺和半胱天冬酶抑制剂组合获得的固定效果导致从包含在固定样本中的细胞释放的DNA在固定期间减少至少降到最多8倍、至少降到最多7倍、至少降到最多5倍，更优选减少至少降到最多4倍，更优选减少至少降到最多3倍或优选降到最多2倍或更少，如实施例描述的18SDNA试验中测定的。如通过实施例示出的，采用本发明方法获得至少三天胞外核酸群有效固定，当采用本文描述的固定剂组合时甚至至多6天或更长。在固定样本较短和较长存储期间，实施例中DNA释放可以减少至少最多2倍或更低，如实施例描述的18S DNA试验中测定的。因此，根据本文描述的固定技术的实施方式，当使用本发明的固定方法时，至多3天或甚至至多6天的储存和更长时间内，DNA释放可以减少降至3倍或更低，或甚至2倍或更低。如实施例所示，在实施方式中，获得1-1.5的值。与现有技术方法相比，这是胞外核酸群固定的显著改进。但是，当然，样本也可以早前被进一步处理，如果需要。不需要利用完全的可实现固定期。此外，可以使用不同的标准方法从分别固定样本有效分离核酸，因为由于固定没有交联样本产生。这大大简化和改进依赖胞外核酸分析的分子分析的标准化。
也可能对固定效果有利的合适助剂的选择也可能取决于待固定的含细胞样本的类型。例如，当处理含细胞生物样本血液时，抗凝剂额外用于防止凝血。抗凝剂以能够待固定量的血液凝聚的浓度被使用。抗凝剂可能，如选自下组：肝素，螯合剂如乙二胺四乙酸，羧酸如柠檬酸或草酸的盐或它们的任意组合。在优选的实施方式中，抗凝剂是螯合剂。螯合剂是有机化合物，能够通过有机化合物的两个或多个原子与金属形成配位键。根据本发明的螯合剂包括，但不限于，二乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和N,N-二(羧甲基)甘氨酸(NTA)，以及此外柠檬酸盐或草酸盐。根据优选的实施方式，EDTA用作抗凝剂。如本文所用，术语“EDTA”特别指EDTA化合物如，K2EDTA、K3EDTA或Na2EDTA的EDTA部分。采用如EDTA的螯合剂也具有有利效果，如DNA酶和RNA酶的核酸酶被抑制，从而例如防止胞外核酸被核酸酶降解。因此，当使用非血液的含细胞样本时，使用如EDTA的螯合剂也是有利的。此外，发现以较高浓度使用/添加的EDTA支持固定效果。但是，单独EDTA不能获得足够的固定效果用于本发明描述的目的。但是，与本发明的教导结合使用，特别是与聚氧乙烯聚合物(和本文描述的一种或多种其他固定剂，如优选伯、仲或叔酰胺和/或半胱天冬酶抑制剂)组合，因为以上讨论的原因能进一步改善固定效果。
根据一实施方式，当含细胞生物样本与聚氧乙烯聚合物以及任选的一种或多种其他助剂接触时获得的混合物中螯合剂，优选EDTA的浓度范围选自下组：0.5-40mg/ml、1-30mg/ml、1.6-25mg/ml、5-20mg/ml和7.5-17.5mg/ml。当固定血液、血浆和/或血清样本时，各浓度是特别有效的。合适的浓度也可以由本领域技术人员确定。
为了进一步支持包含细胞的样本的固定，相应地支持胞外核酸群的保存，还可以使用其他的助剂。各助剂的实例包括但不限于，核酸酶抑制剂，特别是RNA酶和DNA酶抑制化合物。当选择相应的其他助剂用于支持固定时，应仔细不能损害和/或消解固定效果。因此，不能以导致或支持包含在被固定的含细胞生物样本内的有核细胞裂解和/或降解和/或支持包含在所述生物样本的无细胞部分内的核酸的降解的浓度使用助剂，如离液序列高的试剂。因此，优选地，本文描述的固定方法不包括使用(i)诱导或促进有核细胞的裂解、(ii)诱导或促进一般的细胞裂解和/或(iii)导致包含在含细胞生物样本的无细胞部分内的核酸的降解的助剂。因本文描述的固定方法不基于细胞裂解而是保存细胞，在固定期后细胞可以从包含细胞的样本分离，从而能获得包括胞外核酸群的无细胞或细胞消除部分。由于本文描述的基于聚氧乙烯聚合物的固定作用，所述胞外核酸群实质上对应或至少近似于在样本收集和固定时存在的胞外核酸群。此外，核酸可以从分离的细胞中分离并用于分析。如上所述，包括式1所示的化合物的组合物也具有转录组固定性能。通过固定转录组和胞外核酸群，分别固定的样本也适用于基因表达图谱。此外，如果需要，分别固定的样本允许从同一固定样本分离分析胞外和胞内核酸群。
在优选的实施方式中，含细胞生物样本，优选血液样本或源自血液的样本如血浆或血清，与下组接触：
a)至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量至少1500，优选为1500-50000、2000-40000、2500-30000、2500-25000、更优选3000-20000或4500-10000；
b)一种或多种式1所示的化合物，优选的浓度使得与含细胞生物样本的混合物中的浓度范围为0.25％-5％、0.3％-4％、0.4％-3％、0.5％-2％或0.75％-1.5％；
c)至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选泛半胱天冬酶抑制剂，更优选Q-VD-Oph，优选的浓度使得与含细胞生物样本的混合物中的半胱天冬酶抑制剂的浓度范围为0.1μM-20μM，更优选0.5μM-10μM，更优选1μM-10μM，更优选3μM-7.5μM或3μM-5μM；
d)任选的至少一种其他聚氧乙烯聚合物，其分子量低于使用的高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量至少100、优选至少200、至少300或至少400，其中所述其他聚氧乙烯聚合物优选是低分子量聚氧乙烯，其分子量为1000或更低，优选分子量为200-800或200-600；
e)任选的螯合剂，更优选EDTA。
在优选的实施方式中，含细胞生物样本，优选血液样本或源自血液的样本如血浆或血清，与下组接触：
a)至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，优选聚乙二醇，分子量为2000–40000、2500–30000、3000–25000、3500–20000或4000-15000；
b)一种或多种式1所示的化合物，优选丁酰胺和/或N,N-二烷基丙酰胺；
c)至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选泛半胱天冬酶抑制剂，更优选Q-VD-Oph；
d)至少一种低分子量聚氧乙烯，优选聚乙二醇，分子量为100-1000、150-800或200-600；
e)任选的螯合剂，更优选EDTA，
其中，含细胞生物样本与所述助剂以及任选的用于固定的其他助剂接触后，获得的混合物包括：
-高分子量聚氧乙烯聚合物，浓度为0.25％-1.25％(w/v)、0.3％-1％(w/v)或0.4％-0.75％(w/v)；
-一种或多种式1所示的化合物，浓度为0.3％-4％、0.4-3％或0.5-2％；
-半胱天冬酶抑制剂，浓度为1μM-10μM、优选3μM-7.5μM；和
-低分子量聚氧乙烯聚合物，浓度为1.5％-10％、2％-8％、2.5-7％和3％-6％。
根据一实施方式，本发明的方法用于固定包含在血液样本中的胞外核酸群，包括将血液样本与至少一种聚氧乙烯聚合物，优选高分子量聚氧乙烯聚合物，优选聚乙二醇和抗凝剂接触，其中在固定期间，从包含在血液样本中的细胞释放基因组DNA进入血液样本的无细胞部分被减少。特别地，本发明提供固定包含在血液样本中的胞外核酸群的方法，包括将血液样本与至少一种聚氧乙烯聚合物、一种或多种伯、仲或叔酰胺(合适和优选实施例和浓度如上所述)、至少一种半胱天冬酶抑制剂和抗凝剂接触，其中从包含在血液样本中的有核细胞释放基因组DNA进入血液样本的无细胞部分被减少。特别地，在固定期间避免/减少白血细胞裂解。此外，由于固定，存在于样本中的核酸的降解被减少。
在一实施方式中，含细胞生物样本是血液样本，与下组接触：
a)至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量为2000-40000、2500-30000、2500-25000、3000-20000、3500–15000或3000–10000；
b)一种或多种式1所示的化合物；
c)至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选泛半胱天冬酶抑制剂，更优选Q-VD-OPh；
d)至少一种分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物、优选为100-800、200–600或200–500；
e)抗凝剂，优选是螯合剂，更优选EDTA，
其中血液样本与所述助剂以及任选的用于固定的其他助剂接触后，获得的混合物包括：
-高分子量聚氧乙烯聚合物，浓度为0.2％-1.5％(w/v)、0.25％-1.25％(w/v)、0.3％-1％(w/v)或0.4％-0.75％(w/v)；
-一种或多种式1所示的化合物，浓度为0.3％-4％，优选0.5-3％，更优选0.5％-2％或0.75％-1.5％；
-半胱天冬酶抑制剂，浓度为1μM-10μM，优选3μM-7.5μM；和
-低分子量聚氧乙烯聚合物，浓度为1.5％-10％，优选2％-6％。
根据一实施方式，方法是用于固定包含在血液样本中的胞外核酸群，包括将血液样本与至少一种聚氧乙烯聚合物、丁酰胺和/或N,N-二烷基丙酰胺如N,N-二甲基丙酰胺、至少一种半胱天冬酶抑制剂和抗凝剂接触，其中，从包含在血液样本中的细胞释放基因组DNA进入血液样本的无细胞部分被减少。优选地，获得所述固定效果至少三天，更优选至多六天或更长。如上所述，在整个固定期间从包含的细胞内释放DNA优选不超过最多2倍，优选甚至约1.5倍或更低。
在实施方式中，当采用本发明的方法固定血液样本时的其他优点是在固定期间显著减少溶血。在一实施方式中，用于固定的一种或多种其他试剂和聚氧乙烯聚合物包含在含水的固定组合物内。实施例示出与未固定或标准EDT血液样本相比，甚至是与其他固定样本相比，这种实施方式显著减少红血细胞溶血。溶血是红细胞破裂和它们的细胞质释放到周围的细胞外液，例如血浆。溶血的程度可以被分析，例如通过视觉检查，因为释放的血红蛋白会引起血清或血浆出现红色。体外溶血的原因大多与标本采集有关。但是，如果不使用正确的固定方法，离体储存期间血液样本中通常也发生体外溶血。取决于关注的胞外核酸，溶血可以是相当大的问题。如果关注的胞外核酸是DNA，溶血是小问题，因为红血细胞不包含核，因此不含有基因组DNA。因此，溶血过程中没有细胞内DNA从红血细胞释放。当关注的胞外核酸是DNA，特别地，白血细胞的裂解或死亡是问题，因为在这种情况下，除了细胞内RNA，基因组DNA也被释放。因此，当关注的胞外核酸是胞外DNA，特别地，必须避免白血细胞的裂解。白血细胞可以在其稳定特性上彼此不同。因此，某些类型的白血细胞比其他类型更稳定。然而，通常，白血细胞比红血球明显更稳定。因此，红血球裂解不一定表示白血细胞裂解。现有技术中也利用白血细胞和红血球对裂解的不同敏感性以特别裂解红血球而保留白细胞，从而能够，如收集白血细胞。但是，如果关注的胞外核酸是RNA，红血球的溶血及因此的裂解不构成问题。成熟红血球也不含有RNA，但是，它们的前体(网状细胞)含有。网状细胞占红血球的约0.5％-1％，并含有大量球蛋白RNA。因此，特别地，当所关注的胞外核酸是RNA，为减少胞外核酸群尤其是胞外RNA群被球蛋白mRNA稀释，减少或防止存储期间红血球及由此的网状细胞裂解是有利的。此外，如上所述，保持胞外核酸群的组成和图谱是有利的。如通过实施例示出的，在实施方式中，当使用本发明的固定方法时，溶血被有效地减少。特别当使用含有水的固定组合物的情况。由此，基本上保留胞外核酸群，此外，固定的血液样本，特别是从固定血液样本获得的血浆或血清，由于预防溶血和细胞裂解，通常也适用于其它标准实验室分析。
聚氧乙烯聚合物可能包含在固定组合物内。如果额外使用一种或多种其他固定剂和助剂，它们可能、优选也包含在固定组合物内。优选地，根据本发明第三方面的固定组合物用于固定含细胞生物样本。
此外，根据第一方面的一替代方式所描述的，待固定的含细胞生物样本与作为固定剂的乙二醇(1,2-乙二醇)接触。乙二醇可能采用以上为低分子量聚氧乙烯聚合物描述的浓度。被提及的相应公开内容也适用于此。具体地，待固定的含细胞生物样本可能与乙二醇和本文描述的任何一种或多种其他固定剂，优选与至少一种半胱天冬酶抑制剂和/或至少一种伯、仲、叔酰胺(优选是上述式1所示的化合物)接触。乙二醇可能与至少一种聚氧乙烯聚合物联用。以上描述了各固定剂合适的实施方式和浓度范围，也适用于为固定或支持含细胞样本和包含其中的胞外核酸群的固定采用乙二醇的实施方式中。
固定组合物的组分可以被包含在，分别被溶解在溶剂中，如水、缓冲液，如生物缓冲液，如MOPS、TRIS、PBS和类似物。此外，组分溶解在或固定组合物可能包含极性非质子溶剂，如二甲基亚砜(DMSO)。如实施例所示，当固定血液样本时，使用包含水的固定组合物是特别优选的，因为该实施方式显著降低溶血。
为收集含细胞生物样本，聚氧乙烯聚合物和任选使用的其他固定剂和/或助剂可以存在于装置，优选容器内。聚氧乙烯聚合物和任选额外用于固定的一种或多种化合物可以存在于相应装置内的固定组合物中，或以独立实体存在。此外，在收集含细胞生物样本前可以将它们添加至相应的收集装置，或在收集含细胞生物样本后将它们添加至收集装置。将固定剂和任选分别使用的其他助剂添加到含细胞生物样本也在本发明的范围内。但是为易于处理，优选在相应收集装置，如以单一组合物形式提供聚氧乙烯聚合物和使用的任何其他固定剂和/或助剂。但是，他们可能作为单独组分或组合物存在于收集装置内。在优选的实施方式中，在加入含细胞生物样本之前，至少一种聚氧乙烯聚合物、一种或多种伯、仲或叔酰胺、至少一种半胱天冬酶抑制剂和任选其他一种或多种助剂，如抗凝剂，如EDTA存在于收集装置内。这确保根据本发明的教导含细胞生物样本一旦与使用的固定剂接触快速被固定。固定剂存在于容器内，其存在量可有效固定待收集、分别被包含在所述收集装置内的含细胞生物样本。随后结合第五方面还描述各收集装置合适且优选的实施方式，参考所述披露。当采用乙二醇作为固定剂时，同样适用。
优选地，含细胞生物样本在收集后直接和/或在收集期间与聚氧乙烯聚合物和任选的其他助剂接触。因此，如上述，优选地，以组合物形式提供用于固定的试剂。优选地，以液体形式提供所述固定组合物。例如，它可以预填充在样本收集装置内以使在收集期间快速固定含细胞生物样本。根据一实施方式，固定组合物与包含细胞的样本以选自下组的体积比接触：10:1-1:20、5:1-1:15、1:1-1:10、1:10-1:5和1:7-1:5，特别约1:6。这些比例对于固定血液样本特别有用。为固定血液样本，固定组合物优选含水。以上描述了获得的包含含细胞的样本，特别是血液样本的混合物中助剂合适和优选浓度，参考相应的披露。本发明教导的特别优势是可以采用小体积的本发明固定组合物获得大样本体积的固定。这特别地，如果上述高分子量聚氧乙烯聚合物被使用，与低分子量聚氧乙烯聚合物相比允许使用较低浓度。因此，优选地，固定组合物与样本的比例为1:10-1:5，特别为1:7-1:5，如约1.6。
如本文所用术语“含细胞生物样本”、“包含细胞的样本”和类似的术语，特别指包含至少50、250、至少500、至少1000、至少1500、至少2000或至少5000个细胞的样本。根据一实施方式，细胞部分占含细胞生物样本的至少1％、至少2％、至少2.5％、至少5％，优选至少10％、至少15％、至少20％，更优选至少25％、至少30％、至少35％或至少40％。包括相当多细胞的含细胞样本，其中细胞部分占40％以上，也能使用本文描述的教导被固定。但是术语“含细胞生物样本”也指并因此包含细胞消除的样本，包括通常称为“无细胞”的细胞消除的样本，如血浆，因相应的样本经常包括残留细胞。至少，它往往不能完全排除，即使所谓的“无细胞”样本如血浆包含残留量的细胞，相应地构成风险，即胞外核酸群被从所述残留细胞释放的胞内核酸污染。因此，根据一实施方式，各细胞消除的和“无细胞”的样本也被术语“含细胞生物样本”所涵盖。因此，“包含细胞的样本”可能包括大量细胞，例如用全血的情况，还可能仅包括少量的细胞。因此，术语“含有细胞的生物样本”还包括仅被怀疑含有细胞或有风险含有细胞的样本。如上所讨论的，对于只包括小量、相应残留量的细胞的生物样本，如血浆(血浆包含-根据制备方法-通常小残余量细胞，即使它通常被称为是无细胞)，根据本发明的方法具有相当大的优势，因为这些残留细胞也可能导致包含的胞外核酸的不希望的污染。使用根据本发明的固定方法具有优势，即基本上不管含细胞生物样本的组成和包含于其中的细胞的数量，包含在所述样本中的胞外核酸群可以基本上被保存，相应固定，由此允许标准化后续的含有的胞外核酸的分离和/或分析。
根据一实施方式，含细胞生物样本选自下组：体液和源自体液的含细胞样本，特别是全血，源自血液的样本如血浆或血清，血沉棕黄层，尿，痰，泪液，淋巴液，汗液，酒，脑脊髓液，腹水，牛奶，粪便，支气管灌洗液，唾液，羊水，鼻分泌物，阴道分泌物，精子/精液，伤口分泌物，细胞培养物和拭子样本。根据一实施方式，含细胞生物样本是体液，身体分泌物或身体排泄物，优选体液，更优选尿，淋巴液，血液，血沉棕黄层，血浆或血清。特别是，含细胞生物样本可以是循环体液如血液或淋巴液。优选地，使用本文所述的教导固定的含细胞生物样本是血液样本，有时也被称为全血。在固定之前血液样本优选没有被稀释或分级。根据一实施方式，血液样本是外周血。根据一实施方式，从人获得含细胞生物样本。含细胞生物样本包括在胞外部分的胞外核酸。
术语“胞外核酸”或“细胞外核酸”用于本文，特别指不包含在细胞内的核酸。各胞外核酸也经常指无细胞核酸。这些术语作为同义词用于本文。因此，胞外核酸通常存在于样本中某细胞外或多个细胞外。术语“胞外核酸”指，如胞外RNA和胞外DNA。在生物样本如体液的无细胞部分(相应部分)发现的典型胞外核酸的实施例包括，但不限于哺乳动物胞外核酸，如胞外肿瘤相关或肿瘤衍生DNA和/或RNA，其他胞外疾病相关DNA和/或RNA，表观遗传修饰DNA，胎儿DNA和/或RNA，小干扰RNA，如miRNA和siRNA，以及非哺乳动物胞外核酸，如病毒核酸，病原体核酸，如从原核生物(如细菌)、病毒、真核寄生虫或真菌释放进入胞外核酸群。胞外核酸群通常包括从破损或死亡细胞释放的一定量胞内核酸。例如，存在于血液中的胞外核酸群通常包括从破损或死亡细胞释放的胞内球蛋白mRNA。这是体内发生的自然过程。存在于胞外核酸群内的这种胞内核酸甚至能在后续核酸检测方法中用作对照。本文描述的固定方法尤其能减少收集包含细胞的样本后由于离体处理样本显著增加包含在胞外核酸群内的胞内核酸，如基因组DNA的量的风险。因此，离体处理所致的胞外核酸群的改变被减少，甚至能被阻止。根据一实施方式，含细胞生物样本是或源自体液，如血液、血浆、血清、唾液、尿、酒、脑脊液、痰、泪腺液、汗、羊水或淋巴液。因此，我们谈到获自循环体液如血液，或淋巴液的胞外核酸为循环胞外核酸或循环无细胞核酸。根据一实施方式，术语胞外核酸特别指哺乳动物胞外核酸。实例包括但不限于，疾病相关或疾病衍生的胞外核酸，如肿瘤相关或肿瘤衍生的胞外核酸，由于炎症或受伤特别是外伤释放的胞外核酸，与其他疾病相关和/或由于其他疾病释放的胞外核酸，或源自胎儿的胞外核酸。术语“胞外核酸”或“细胞外核酸”如本文所述还指获自其他含细胞的生物样本，特别是非体液生物样本的胞外核酸。通常，样本包含多于一种或一类胞外核酸。
如本文使用的术语“胞外核酸群”特别指包含在含细胞样本中的不同胞外核酸的集合。含细胞样本通常包括特有的且因此唯一的胞外核酸群。因此，包含在胞外核酸群特定样本中的一种或多种胞外核酸的类型，种类，比例和/或量可能是重要的样本特性。如上所讨论的，因此它对于固定和由此的将所述胞外细胞群保持在样本收集时的状态是重要的，因它的组成和/或包含在胞外核酸群样本中的一种或多种胞外核酸的量能够提供有价值的医疗，预后或诊断信息。因此，如果细胞外核酸群的图谱在预期的稳定期被有效固定是有利的。本文描述的固定技术减少样本收集和固定后胞外核酸群被胞内核酸，特别是基因组DNA污染和因此的稀释。因此，实现基本保留胞外核酸群。如通过实施例示出的，与血液样本或源自血液的样本的情况下，如EDTA固定的相应样本或未固定样本相比，胞外核酸群量、质量和/或包含的胞外核酸的组成的变化，特别是由释放的基因组DNA增多引起的变化在固定期间明显减少。根据一实施方式，与血液样本(如1.5mg EDTA/ml固定的血液样本)或源自血液的样本的情况下如EDTA固定的相应样本或未固定样本相比，基因组DNA从T0(固定点)到固定期结束(优选T0后48h、72h或96h)基因组DNA增多被降低至至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。如由实施例表明，特别在联合使用半胱天冬酶抑制剂和至少一种伯、仲、叔酰胺的实施方式中，获得超过80％或更高的值。
如上所述且如实施例证明，使用本发明的方法中允许固定包含细胞的样本，无需冷藏或冷冻较长的时间。因此，样本可以保持在室温下，甚至在升高的温度例如高达30℃或甚至高达40℃。根据一实施方式，至少三天获得固定效果，优选至少四天，更优选至少6天。优选地，在所述固定期间，本发明的固定方法具有效果，即包含在样本内的细胞被固定，从包含在样本内的细胞释放基因组DNA进入样本的无细胞部分被减少和/或由于固定存在于样本中的核酸的降解被减少。特别是，在所描述的固定期间，固定降低固定期间包含在生物样本中的胞外DNA群被源自包含在固定样本中的细胞的基因组DNA稀释。根据本发明的方法达到的固定效果在上面详细描述，参考上述公开内容，优选地，在所述固定期间，固定减少固定期间包含在生物样本中的胞外细胞群被源自包含在固定样本中的细胞的胞内核酸、特别是基因组DNA污染。如实施例所示，血液样本可以在室温固定至多3天或更长时间。即使在室温长达6天，甚至更长的存储期间，当使用聚氧乙烯聚合物，优选与半胱天冬酶抑制剂和一种或多种伯、仲或叔酰胺组合时，胞外核酸群基本被固定(特别与非固定样本或如与采用标准方法，如EDTA处理固定的样本相比)。如实施例示出，即使经历10天很长的固定时间，固定效果被保持。通常虽然可能发生固定效果随时间降低，这也取决于来源，例如得到含细胞生物样本的宿主，它通常是仍足以保持胞外核酸群的组成，从而能够分析和/或进一步处理胞外核酸。因此，根据本发明方法固定的含细胞的生物样本，特别是采用聚氧乙烯聚合物、一种或多种伯、仲或叔酰胺和半胱天冬酶抑制剂固定的样本仍然适合分离并分析包含其内的胞外核酸，即使在室温下长期贮存后。因此，甚至更长期的保存/运输时间是可能的。然而，通常情况下，较长周期是不必要的，因为常规的储存和例如运送到实施核酸分离和任选分析的实验室的时间通常不超过6或7天，但通常两三天后就能完成。如实施例所示，固定效率在这段时间内特别好。但是采用本发明方法获得的固定效率和长固定时间提供重要的安全因素。
根据本发明的方法和随后描述的固定组合物能够采用小体积/量添加的固定剂固定大体积的含细胞的生物样本，因为至少一种聚氧乙烯聚合物，优选是聚乙二醇和所述根据本发明的教导使用的固定剂的组合用于固定是高活性的，特别是组合。这是重要的优点，因为样本的大小/体积对后续核酸分离程序带来相当大的限制，特别是当意在使用自动程序分离包含在样本中的胞外核酸时。此外，人们必须考虑胞外核酸通常仅以小量包含在含细胞生物样本内。因此，处理较大体积含细胞生物样本例如血液样本具有优势，即能够从样本分离更多胞外核酸，因此可用于随后的分析。根据一实施方式，采用第一方面的方法固定的样本体积选自下组：1至50ml，2至35毫升，3至25ml，4至20ml和5至15毫升。
本文描述的固定方法提供显著的优势，超过用于固定含细胞样本中的胞外核酸群的最先进的固定方法，其是基于使用交联剂，如甲醛、福尔马林、甲醛释放剂等类似物。交联剂导致核酸分子之间或核酸和蛋白质之间形成分子间或分子内共价键。此交联作用可以显著削弱从这些固定样本中核酸的后续分离，且通常需要特别调整的核酸分离程序允许从这些样本进行分离。由于，例如，全血样本中循环核酸的浓度已经是相对低的，应该避免进一步降低这种核酸产率的任何检测。当检测或分析源自如恶性肿瘤或怀孕头三个月发育中胎儿的非常稀有的核酸分子时，这可能是特别重要的。如通过实施例示出的，本发明的方法不需要用于固定的交联剂。因此，根据一实施方式，根据本发明的固定方法不涉及使用诱导蛋白质-核酸和/或蛋白质-蛋白质交联的交联剂。尤其是，固定不涉及使用甲醛，福尔马林，多聚甲醛或甲醛释放剂。此外，如上述，根据一实施方式，根据本发明的固定方法不涉及使用归类为有毒试剂的助剂。
固定期后，本方法可能包括一或多个以下步骤：
a)固定样本经历核酸分析和/或检测方法；
b)从固定样本分离胞外核酸；
c)从固定样本分离胞外核酸且分析和/或检测分离的核酸；
d)去除包含在固定样本中的细胞；
e)在实施核酸分离、分析和/或检测步骤之前去除包含在固定样本中的细胞；
f)从固定样本去除细胞，并从固定样本的无细胞或细胞消除部分分离胞外核酸；
g)储存(i)固定样本、(ii)已经去除细胞的固定样本和/或(iii)从样本去除的细胞；
h)从固定样本去除细胞并弃去；和/或
i)从固定样本去除细胞，并从自固定样本去除的细胞分离核酸；
j)从固定样本去除细胞，并采用大小选择核酸分离方法从固定样本的无细胞或细胞消除部分分离胞外核酸。
因此，采用本发明的方法固定的含细胞生物样本能够在核酸分析和/或检测方法中被分析；和/或可能被进一步处理。生物样本固定后可能直接进行分析核酸，或核酸首先从固定样本分离。以下结合本发明的第二方面还描述关于核酸分离和分析的细节，参考所述披露。
B.核酸分离方法
根据第二方面，提供从含细胞生物样本分离胞外核酸的方法，包括步骤：
a)根据本发明第一方面限定的方法固定含细胞生物样本；和
b)从固定的样本分离胞外核酸。
在步骤a)，根据本发明第一方面描述的方法固定包含在包含细胞的样本中的胞外核酸群。如以上所讨论的，根据本发明的固定具有效果，即包含在样本中的胞外核酸群在固定期间能基本保持在获得分别地收集生物样本时的状态。特别地，在储存/处理期间，胞内核酸，特别是基因组DNA，更特别是片段化基因组DNA导致的通常可观察到的核酸高增长被减少或甚至被避免，如实施例所示。不受理论束缚，相信本文描述的基于聚氧乙烯聚合物的固定在固定期间固定细胞和/或减少细胞破坏，从而减少胞内核酸的释放。方法允许在所需固定期后从固定样本分离细胞部分。因此，与非固定样本相比，由相应固定的样本获得的胞外核酸包含非常少的源自退化或死亡细胞的胞内核酸的污染，且特别地，包含少量片段化基因组DNA。此外，根据本发明的固定不需要并优选不涉及交联剂的使用。这是超越涉及使用交联剂如甲醛，福尔马林或甲醛释放剂的现有技术的重要优点，因为当使用标准核酸分离技术，这些试剂通常因交联作用而减少胞外核酸的可回收量。此外，如上所述，本文所述的固定允许在分离包含在样本中的细胞之前和/或在步骤b)中分离包含其内的核酸之前，样本能被存储和/或处理，例如运输很久的时间，即使在室温下。有关步骤a)进行的固定的细节，参考在这里也适用的上述披露。下文再简述非限制实施方式。
根据一实施方式，步骤a)中含细胞的生物样本如全血样本被固定，采用：
-如上所述分子量至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物，任选与分子量低于高分子量聚合物至少100的其他聚氧乙烯聚合物，如分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物组合；
-至少一种半胱天冬酶抑制剂；
-一种或多种伯、仲和叔酰胺，和
-任选地，其他固定剂和/或助剂。
步骤a)进行的本发明固定方法的合适和优选的实施方式和用于固定的化合物在上文描述，参考在这里也适用的上述披露。特别优选是额外使用低分子量聚氧乙烯聚合物，至少一种半胱天冬酶抑制剂和丁酰胺和/或N,N-二烷基丙酰胺，如优选N,N-二甲基丙酰胺用于固定。当固定全血样本时，与抗凝剂，优选螯合剂，如EDTA的组合是优选的。此外，如上所述，根据第一方面的一替代方式，待固定的含细胞生物样本与作为固定剂的乙二醇(1,2-乙二醇)接触。参考上文披露。
如果含细胞生物样本包括大量细胞，例如全血的情况下，从剩余样本分离细胞，以获得固定样本的无细胞、相应地细胞减少的或细胞消除的部分，然后在步骤b)从中分离胞外核酸。因此，根据一实施方式，在步骤a)和步骤b)之间从含细胞的样本除去细胞。如果样本被处理仅包括少量残留细胞，如血浆或血清，和/或其中关注的胞外核酸是DNA，中间步骤可以省略。由于本发明的固定，在固定期从包含的细胞释放的基因组DNA减少或甚至被阻止，此外，特别当另外使用半胱天冬酶抑制剂时，基因组DNA的片段化被降低。如本文所述，由于其相当大的尺寸，未成碎片的基因组DNA可以与更小的胞外DNA进行区分。这允许通过使用尺寸选择分离方案选择性地分离胞外DNA，即使在未成碎片的基因组DNA存在下。但是，为了提高效果，优选的是在步骤b)分离胞外核酸之前，从固定样本去除细胞(或潜在的残留细胞)，从而减少在核酸分离期间从细胞释放的胞内核酸对胞外核酸群的污染。如果关注的胞外核酸是RNA，除去所含的细胞也是有利的，因为很难区分胞外RNA和胞内RNA，此外，能够防止胞外RNA的稀释。此外如果关注的胞外核酸是DNA，在步骤b)之前除去细胞通常是有利的，并且因此优选的，因为这允许在步骤b)使用标准核酸分离程序。
取决于含细胞生物样本的类型，细胞，包括残留细胞，能够被分离和去除，通过离心，优选高速离心，或如果要避免离心步骤，通过使用非离心手段，如过滤，沉淀或结合到表面，如(任选磁性)颗粒上。现有技术中已知各细胞分离方法，因而，不需要进行详细的说明。各细胞去除步骤也可以很容易地包含到自动化样本制备方案。如果需要，也可能进一步处理各去除的细胞。细胞可以例如被存储，分析和/或生物分子，例如核酸或蛋白质可以从去除的细胞分离出来，此外，发现特别当额外使用式1所示的化合物如DMPA用于固定包含细胞的样本时，胞内核酸如胞内RNA可以被固定。转录组的额外固定是有利的，因为它允许分析分离的胞内核酸内的转录体的图谱，其对于体外诊断也是重要生物标记物。
此外，包括进一步的中间步骤以处理固定样本也在本发明的范围内。
在步骤b)分离胞外核酸，优选从固定样本的无细胞，相应的细胞消除部分，例如从上清液，或从血浆和/或血清，在固定的包含细胞的样本是血液样本的情况下。为分离胞外核酸，能够使用适用于从固定样本，相应地从获得的细胞消除样本分离核酸的任何已知的核酸分离方法。各纯化方法的实例包括但不限于萃取，固相萃取，基于二氧化硅的纯化方法，基于磁性颗粒的纯化，酚-氯仿提取，色谱法，阴离子交换色谱(使用阴离子交换表面)，电泳，过滤，沉淀和其组合。例如通过使用能序列特异性结合的连接到固体支持物的合适的探针特别分离特定胞外核酸也在本发明的范围内
根据一实施方式，在步骤b)使用离液序列高的试剂和/或乙醇分离核酸。优选地，通过将它们结合到固相，优选包含二氧化硅或载有阴离子交换官能基的固相分离核酸。各方法在现有技术中是已知的，因此，不需详细描述。用于分离胞外核酸的方法和试剂盒可以商购，如循环核酸试剂盒(Circulating Nucleic Acid Kit)(凯杰-QIAGEN)、楷模斯达循环NA试剂盒(Chemagic Circulating NA Kit)(凯根公司-Chemagen)、NucleoSpin血浆XS试剂盒(NucleoSpin Plasma XS Kit)(MN公司-Macherey-Nagel)、血浆/血清循环DNA纯化试剂盒(Plasma/Serum Circulating DNA Purification Kit)(NB公司-NorgenBiotek)、血浆/血清循环RNA纯化试剂盒(Plasma/Serum Circulating RNA PurificationKit)(NB公司)、高纯度病毒核酸大容量试剂盒(罗氏-Roche)和用于提取和纯化胞外核酸的其他市售试剂盒。如上所示，特别地，使用高分子量聚氧乙烯聚合物与低分子量聚氧乙烯聚合物联用的实施方式是有利的，因为它允许使用广泛核酸分离程序以高产率分离胞外核酸。如上述，例如与涉及使用硅胶柱的后续核酸分离方法联用，优选使用分子量至少2000、优选至少3000、更优选为4500-10000的高分子量聚氧乙烯聚合物与分子量为1000或更低，优选150-700，更优选为200-600的低分子量聚氧乙烯聚合物联用。如上所述，聚合物的这种组合能够将包括待固定的包含细胞的样本的固定混合物中有效固定所需的高分子量聚氧乙烯聚合物的量减少至如1.5％(w/v)或更低、1.25％(w/v)或更低、1％(w/v)或更低或0.75％(w/v)或更低。在测试实施例中，这些较低浓度的高分子量聚合物与低分子量聚合物组合对随后的核酸分离基本上没有损害，即使当使用硅胶柱，同时实现较强的固定效果。此外，因使用聚合物的组合，低分子量聚合物的量也可以降低，使得固定组合物的所需体积保持在可接受的范围内。然而，如实施例中所示的，1.5％(w/v)或更低、1.25％(w/v)或更低、1％(w/v)或更低或0.75％(w/v)或更低的各自较低浓度的高分子量聚氧乙烯聚合物也可能在不存在低分子量聚氧乙烯聚合物时使用，如果使用其他的固定剂，本文描述这种固定剂的优选实施方式。
根据一实施方式，在步骤b)通过将核酸结合至包括阴离子交换基团的固相来分离核酸。例如合适的阴离子交换基团为氨基。优选在pH低于7发生结合。这种基于阴离子交换的核酸分离方法是本领域技术人员已知的。根据一实施方式，核酸是胞外核酸。合适的基于阴离子交换的方法，如通过引用并入本文的WO2013045432中描述的方法特别适用于从获自使用本文描述的固定方法固定的血液样本的血浆分离胞外核酸，如胞外DNA。
根据一实施方式，从步骤a)后获得的固定的包含细胞的样本或任选的，在中间步骤从固定的包含细胞的样本去除细胞后获得的样本分离总核酸。优选地，从固定样本，或固定样本的无细胞、相应地细胞消除部分分离核酸。如，能从血浆或血清分离总核酸，胞外核酸将作为一部分包含在这些提取的核酸中。如果在核酸分离前有效去除固定样本中包含的细胞，分离的总核酸将主要包括或甚至由胞外核酸构成。
分离至少主要的特定的目标核酸也在本发明的范围之内。目标核酸可以是，例如某种类型的胞外核酸，例如DNA或RNA，包括mRNA和微小RNA，其它非编码核酸，表观遗传学修饰的核酸，以及其它的核酸。例如，目标胞外核酸可以是DNA，非目标胞外核酸可以是RNA或反之亦然。特别地，旨在分离DNA或RNA的目标特异性核酸分离方法是现有技术中已知的，因此，不需要在此详述。根据一实施方式，通过加入特异性破坏非目标核酸的合适的酶破坏非目标核酸，如，如果目标核酸是DNA，加入RNA酶，如果目标核酸是RNA，加入DNA酶。所述的酶可以加入到裂解或结合混合物，或在胞外核酸结合到固相后加入。实施各非目标核酸分解步骤的合适实施方式是现有技术已知的，因此，不需在此任何详细描述。根据可行的一实施方式，如果DNA和RNA结合到固相支持物，目标核酸的选择性洗脱条件可应用于从固相主要且由此选择性地回收目标核酸。根据一实施方式，使用分离方法，其中在非目标核酸，如RNA不结合的条件下将目标核酸，如DNA选择性结合到固相。合适的结合条件是现有技术已知的，如WO 95/21849中描述。根据一实施方式，通过在合适的条件下将非目标核酸的至少部分结合到固相，然后分离包括目标胞外核酸的剩余样本与结合到固相的非目标核酸以去除非目标核酸。这可以例如在以下条件下通过加入合适的固相实现：其中主要非目标核酸，如DNA结合到固相而非目标核酸，如RNA保留在样本中并在分离步骤从中回收。从目标核酸选择性去除非目标核酸的合适的方法，如在EP 0 880 537和WO 95/21849中描述，通过引用并入本文。如果需要，所述非目标核酸也可能被进一步使用，如进一步被处理，如从固相洗脱。但是，它也可能被丢弃。如分离目标核酸后采用核酸酶消化非目标核酸或其剩余物也在本发明的范围内。
术语目标核酸也可指特定种类的核酸，如特定胞外核酸，已知是某种疾病标志物。如以上所讨论的，胞外核酸的分离也可能包括如通过使用支持选择性分离目标核酸的合适的捕获探针特异性分离各目标核酸。
术语目标核酸也可能指具有一定长度的核酸，如长度为5000nt或更短、2000nt或更短、1000nt或更短、900nt或更短、800nt或更短、700nt或更短、600nt或更短、500nt或更短、400nt或更短或350nt或更短的核酸。分离某一最大尺寸的目标核酸在本发明的的上下文中是有利的。已知胞外核酸通常具有的尺寸为1000nt或更短，且通常甚至500nt或更短。本文所指的尺寸、分别地尺寸范围是指链长。即在双链核酸如双链DNA情况下，它是指碱基对。在步骤b)，选择性分离较小核酸可以提升分离的核酸内获得的胞外核酸部分。根据本发明的固定方法，特别由于抑制基因组DNA释放和/或抑制释放的基因组DNA片段化，能够更有效分离这样的高分子量基因组DNA与较小的胞外核酸群。由于使用本发明的固定技术，基因组DNA和胞外核酸之间的显著尺寸差异基本上保存下来，采用尺寸选择性核酸分离方案能够更有效去除基因组DNA。由于有效固定，如本文所述固定的样本中基因组DNA(通常大于10000bp)和胞外核酸(通常小于1000nt/bp)之间的尺寸差异通常相对较大，因此能够使用选择性分离某一目标长度核酸的已知方法。因此，根据一实施方式，步骤b)包括选择性分离长度为2000nt或更短、1500nt或更短、1000nt或更短、900nt或更短、800nt或更短、700nt或更短、600nt或更低、或500nt或更低的目标核酸。例如通过消除高分子量基因组DNA实现核酸各尺寸选择性分离的合适的方法是现有技术已知的，因此本文不需详述。用于分离目标尺寸的DNA的经典方法涉及在凝胶中分离DNA，切出所需一条或多条凝胶带，然后从凝胶片段分离目标尺寸的DNA。另一广泛使用的技术是采用基于聚乙二醇的缓冲液的尺寸选择性沉淀(Lis和Schleif,核酸研究(Nucleic Acids Res.)1975 03；2(3):383-9)或在羧基官能化珠上的结合/沉淀(DeAngelis等,核酸研究(Nuc.Acid.Res.)1995,卷23(22),4742-3；US5,898,071和US 5,705,628,由贝克曼-库尔特(Beckman-Coulter)商业化(AmPure XP；SPRIselect)和US 6,534,262)。此外，基于使用包括阴离子交换基团和变化pH值的固体支持物的尺寸选择性分离方法是已知的。尺寸选择性分离提供更多的机会，以减少在分离的胞外核酸内的胞内核酸的量。例如，当关注的目标胞外核酸是DNA，在核酸分离步骤b)期间，基因组DNA的去除也能补充或者甚至取代在开始核酸提取之前血浆样本的单独高G力离心，以便去除残留细胞。因本发明的固定，从所述残留细胞释放的基因组DNA被阻止不会大规模降解，特别是如果额外使用半胱天冬酶抑制剂，因此，所述未片段化或较少片段化的基因组DNA能通过在步骤b)使用尺寸选择性核酸分离方案被除去。这点是特别有利的，因为许多临床试验室不具有能实施这种高G力离心的离心机或用于去除特别是痕量残留细胞的其他装置。
然后在步骤c)使用合适的试验和/或分析方法分析和/或进一步处理分离的胞外核酸。例如，它们能被识别，修饰，与至少一种酶接触，扩增，反转录，克隆，测序，与探针接触，被检测(它们存在与否)和/或能被定量。各方法是现有技术已知的，通常用于医学、诊断和/或预后领域以分析胞外核酸(还参见本发明背景中的详细描述)。因此，在步骤b)分离胞外核酸后，任选地作为总核酸、总RNA和/或纵DNA的部分(见前)，它们能被分析，例如从而识别疾病状态包括但不限于众多肿瘤疾病，特别是初癌和恶性肿瘤如不同形式的肿瘤或癌症的存在与否或严重性。例如，分离的胞外核酸能被分析，以检测很多应用领域的诊断和/或预后标记物(如胎儿-或肿瘤衍生的胞外核酸)，包括但不限于非侵入性产前遗传检测，分别地筛选，疾病筛查，病原体筛查，肿瘤学，癌症筛查，早期癌症筛查，肿瘤治疗监测，遗传检测(分型)，感染性疾病检测，损伤诊断，创伤诊断，移植医学或许多其他疾病，因此，是诊断和/或预后相关的。根据一实施方式，分析分离的胞外核酸以识别和/或表征疾病或胎儿特性。因此，如以上所讨论的，本文所描述的分离方法可以进一步包括核酸分析和/或处理的步骤c)。
因此，根据一实施方式，在步骤c)分析分离的胞外核酸以识别、检测、筛查、监控或排除疾病和/或至少一种胎儿特性。可以采用任何核酸分析/处理方法进行分离的胞外核酸的分析/进一步处理，包括但不限于扩增技术，聚合酶链反应(PCR)，等温扩增，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，定量实时聚合酶链反应(Q-PCR)，数字PCR，凝胶电泳，毛细管电泳，质谱，荧光检测，紫外光谱，杂交测定法，DNA或RNA测序，下一代测序，限制性分析，反转录，基于核酸序列的扩增(NASBA)，等位基因特异性聚合酶链反应，聚合酶循环组装(PCA)，不对称聚合酶链反应，线性指数聚合酶链反应(LATE-PCR)，解旋酶依赖性扩增(HDA)，热启动聚合酶链反应，序列间特异性聚合酶链反应(ISSR)，逆聚合酶链反应，连接介导的聚合酶链反应，甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)，多重聚合酶链反应，巢式聚合酶链式反应，固相聚合酶链反应或它们的任意组合。各技术是本领域技术人员是已知的，因此本文不需要进一步描述。
根据一实施方式，在根据本发明的教导收集、相应固定含细胞生物样本后，步骤b)分离和步骤c)分析中任一或两者在至少一天直到三天或两天直到十天中发生。使用本发明的方法固定含细胞生物样本，特别是血液样本，分别地包含于内的胞外核酸群的合适的时间周期联合固定方法也在上文描述，各披露也应用于此。根据一实施方式，在根据本发明的方法收集和固定包含细胞的样本后，实施核酸分离步骤b)至少一天、至少两天或至少三天。
C.固定组合物
根据第三方面，提供适用于固定含细胞生物样本的组合物，包括：
i)作为固定剂的聚氧乙烯聚合物，或
ii)作为固定剂的乙二醇，
和选自下组的一种或多种，优选两种或多种其他助剂：
-一种或多种伯、仲或叔酰胺；
-半胱天冬酶抑制剂；
-抗凝剂和/或螯合剂。
优选地，根据第三方面的组合物包括作为固定剂的聚氧乙烯聚合物，其优选是分子量至少为1500的高分子量聚氧乙烯聚合物，此外包括选自下组的一种或多种，优选两种或多种其他助剂：
-至少一种其他聚氧乙烯聚合物，其分子量比优选是高分子量聚氧乙烯聚合物的第一聚氧乙烯聚合物的分子量低至少100、优选至少200、至少300或至少400，其中所述其他聚氧乙烯聚合物优选是分子量为1000或更小的低分子量聚氧乙烯聚合物；
-一种或多种伯、仲或叔酰胺；
-半胱天冬酶抑制剂；
-抗凝剂和/或螯合剂。
优势以及合适和优选的实施方式联合第一方面的固定方法在上文讨论，参考也应用于此的以上披露。如以上所讨论的，通过本发明提供固定组合物，特别地包括优选是高分子量聚氧乙烯聚合物的聚氧乙烯聚合物，和至少一种半胱天冬酶抑制剂，任选但优选与一种或多种伯、仲或叔酰胺组合的那些在固定含细胞生物样本，特别是血液、血浆和/或血清中是特别有效的，通过固定包括的细胞和包括的胞外核酸从而在固定时基本保留，相应固定胞外核酸群。各固定组合物能使含细胞生物样本，优选是血液在室温存储和/或处理，如运输至少两天、优选至少三天或甚至更长时间，基本上不影响血液样本，相应包含于其内的胞外核酸群的质量。特别地，在固定期间，胞外核酸组合物被胞内核酸，特别是片段化基因组DNA的稀释，相应的污染被降低或甚至避免。优选地，在收集含细胞生物样本期间或之后固定组合物立即与包含细胞的样本接触。此外，如上述，可以使用乙二醇作为固定剂或和聚氧乙烯聚合物一起作为固定剂。含其他固定剂的优选使用的组合基本相同。
根据一实施方式，固定组合物包括高分子量聚氧乙烯聚合物。细节连同第一方面的固定方法在上文描述，参考各披露。高分子量聚氧乙烯聚合物，优选聚乙二醇，如未取代聚乙二醇。在实施方式中，分子量可以选自下组：1500-40000、2000-30000、2500-25000、3000-20000、3500-15000、4000-10000、4500-9000和5000-8000。如上述，能够使用超过40000的较高分子量。
根据一实施方式，固定组合物包括分子量为1500或更低的聚氧乙烯聚合物，在实施方式中，为分子量为1000或更低的低分子聚氧乙烯聚合物。低分子量聚氧乙烯聚合物的分子量选自下组：100–1000、150–800、150–700，优选200–600，更优选200–500，如200-400。如实施例所示，当与一种或多种其他固定剂，如优选本文描述的半胱天冬酶抑制剂和一种或多种伯、仲或叔酰胺联用时，包括优选是聚乙二醇的该聚氧乙烯聚合物的固定组合物是有效的固定剂。如果固定组合物包括分子量为1500或更低的各聚氧乙烯聚合物，如分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物，这些固定剂的固定效果被改善。
根据一实施方式，固定组合物包括高分子量聚氧乙烯聚合物，此外包括分子量比高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量低至少100、优选至少200、至少300或至少400的至少一种其他聚氧乙烯聚合物。根据一实施方式，分子量的差异是至少2500、至少3500、至少5000或至少7500。如上文联合第一方面的固定方法所描述的，使用分子量不同的聚氧乙烯聚合物的组合物是有利的。优选地，两聚氧乙烯聚合物为聚乙二醇，如未取代聚乙二醇。根据有利的实施方式，包括分子量至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物的固定组合物还包括分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物。细节连同第一方面的固定方法在上文描述，参考也应用于此的各披露。低分子量聚氧乙烯聚合物，优选是聚乙二醇，如未取代的聚乙二醇。低分子量聚氧乙烯聚合物的分子量可能选自下组：100–1000、150-800，优选200-600。
根据一实施方式，包括优选为分子量至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物的聚氧乙烯聚合物的固定组合物还包括一种或多种伯、仲或叔酰胺。另外采用一种或多种该酰胺与聚氧乙烯聚合物组合的优点以及合适并优选的实施方式连同第一方面的固定方法在上文详细描述，参考还应用于此的上述披露。根据一实施方式，包含在固定组合物中的至少一种伯、仲、叔酰胺是式1所示的化合物：
其中，R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，更优选C1-C2烷基，R2和R3相同或不同，选自氢和烃基，优选烷基，具有1-20个原子的碳链长度，以直链或支链形式，和R4是氧、硫或硒。优选地，酰胺是羧酸酰胺，以致R4为氧。优选的实施方式连同固定方法在上文描述，参考还应用于此的上述披露。优选地，使用不归为有毒试剂的式1所示的化合物。优选地，包括优选是高分子量聚氧乙烯聚合物的聚氧乙烯聚合物和包括式1所示的化合物的所述固定组合物还包括半胱天冬酶抑制剂。
式1所示化合物可能是羧酸酰胺，选自伯羧酸酰胺和仲羧酸酰胺。根据一实施方式，组合物包括伯羧酸酰胺，选自甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺和丁酰胺。优选地，羧酸酰胺选自丁酰胺和甲酰胺。更优选，它是丁酰胺，因为该试剂对固定胞外核酸群特别有效。
根据一实施方式，根据式1的至少一化合物是N,N-二烷基-羧酸酰胺。根据一实施方式，式1所示化合物是N,N-二烷基丙酰胺，优选N,N-二甲基丙酰胺。N,N-二甲基丙酰胺不归为有毒试剂。此外，N,N-二甲基丙酰胺具有有益效果，即它还能固定胞内核酸，特别是如果以合适浓度使用可能固定转录图谱。
根据一实施方式，固定组合物包括丁酰胺和/或N,N-二烷基丙酰胺，其中，所述N,N-二烷基丙酰胺优选为N,N-二甲基丙酰胺。如实施例所示，两酰胺单用和组合显著改善观察到的固定效果。
根据一实施方式，包括聚氧乙烯聚合物的固定组合物还包括半胱天冬酶抑制剂。使用半胱天冬酶抑制剂及半胱天冬酶抑制剂合适和优选的实施方式组合的好处连同第一方面的固定方法在上文详细描述，参考还用于此的上述披露。优选地，半胱天冬酶抑制剂为泛半胱天冬酶抑制剂。优选地，半胱天冬酶抑制剂为改性的半胱天冬酶特异性多肽，优选在C末端被O-苯氧基改性，如Q-VD-OPh。根据一优选实施方式，分子量至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物用作聚氧乙烯聚合物。优选地，采用聚乙二醇。优选地，采用未取代的聚乙二醇。
根据一实施方式，固定组合物包括优选是高分子量聚氧乙烯聚合物的聚氧乙烯聚合物和至少一抗凝剂。该实施方式特别适用于固定血液样本或源自血液的含细胞样本。根据一实施方式，固定组合物包括优选是高分子量聚氧乙烯聚合物的聚氧乙烯聚合物和螯合剂。合适的螯合剂，也作为抗凝剂和用于固定合适的浓度连同本发明的方法在上文描述，参考还用于此的上述披露。优选地，EDTA用作螯合剂。
固定组合物也可能包括其他助剂，连同固定方法在上文描述。
对于固定血液，固定组合物优选包括优选是高分子量聚氧乙烯聚合物的聚氧乙烯聚合物，至少一种半胱天冬酶抑制剂和抗凝剂，以及任选上文描述的至少一种伯、仲、叔酰胺。聚氧乙烯聚合物优选是聚乙二醇。如所述，所述酰胺优选是式1所示的化合物。采用丁酰胺和/或N,N-二烷基丙酰胺，优选N,N-二甲基丙酰胺是优选的。根据一实施方式，所述组合物包括优选是聚乙二醇的高分子量聚氧乙烯聚合物，还包括优选是聚乙二醇的低分子量聚氧乙烯聚合物。优选的分子量在上文描述，参考各披露。
根据一实施方式，固定组合物包括：
a)至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量至少1500，优选为1500-50000、2000-40000、2500-30000、2500–25000，更优选3000-20000、3500-15000或4500-10000；
b)一种或多种式1所示的化合物；
c)至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选泛半胱天冬酶抑制剂，更优选Q-VD-OPh；
d)至少一种其他聚氧乙烯聚合物，分子量比使用的高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量低至少100，优选至少200，至少300或至少400，其中所述其他聚氧乙烯聚合物优选是低分子量聚氧乙烯，其分子量为1000或更低，优选为200-800或200-600；
e)任选抗凝剂和/或螯合剂，更优选EDTA。
根据一实施方式，固定组合物包括：
a)至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量为2000-40000、2500-30000、2500-25000、3000–20000或3500-15000；
b)一种或多种式1所示的化合物，优选丁酰胺和/或N,N-二甲基丙酰胺；
c)至少一种半胱天冬酶抑制剂；
d)至少一低分子量聚氧乙烯聚合物，分子量为100-1000、150-800或200-600；
e)抗凝剂和/或螯合剂，优选EDTA。
根据一实施方式，固定组合物包括：
a)至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量为4500–10000；
b)一种或多种式1所示的化合物，优选丁酰胺和/或N,N-二甲基丙酰胺；
c)至少一种半胱天冬酶抑制剂；
d)至少一低分子量聚氧乙烯聚合物，分子量为100–800，优选200-600；
e)抗凝剂和/或螯合剂，优选EDTA。
高和低分子量聚氧乙烯聚合物，半胱天冬酶抑制剂，式1所示化合物和抗凝剂以及螯合剂合适和优选的实施方式连同固定方法在上文详细描述，参考还用于此的以上披露。优选地，抗凝剂是螯合剂，更优选为EDTA。
在包括固定组合物和含细胞生物样本的固定混合物中能用于固定的各试剂的合适和优选的浓度在上文描述也用于此。当预期量的固定组合物与待固定的预期量的包含细胞的样本混合时，本领域技术人员能选择所述试剂在固定组合物中合适的浓度从而获得包括含细胞样本的混合物中的所述浓度。参考还用于此的关于固定组合物的上文披露。
根据一实施方式，固定组合物是液体。其后，如果存在于固定组合物中，指示的各试剂的浓度，对血液样本的固定是特别优选的。例如，能使用0.5ml-2.5ml、0.5ml-2ml，优选1ml-2ml或1ml-1.5ml液体固定组合物。包括以下指示浓度的固定剂的该固定组合物能用于固定，如10ml血液。
根据一实施方式，所述液体固定组合物包括高分子量聚氧乙烯聚合物，优选是聚乙二醇，浓度选自下组：0.4％-35％(w/v)、0.8％-25％(w/v)、1.5％-20％(w/v)、2.5％-17.5％(w/v)、3％-15％(w/v)、4％-10％(w/v)和3％-5％(w/v)。合适的浓度可由本领域技术人员确定，并且可特别取决于高分子量聚氧乙烯醇是单独使用还是与另外的聚氧乙烯聚合物如低聚氧乙烯聚合物联用，以及用于固定一定量包含细胞的样本的固定组合物的量，例如体积。当单独使用高分子量聚氧乙烯聚合物时，合适的浓度范围的实例包括但不限于选自下组的浓度：2.2％-33.0％(w/v)、4.4％-22.0(w/v)％、6.6％-16.5％(w/v)和8.8％-13.2％(w/v)。当高分子量聚氧乙烯聚合物与低分子量聚氧乙烯聚合物联用时合适的浓度范围的实例包括但不限于选自下组的浓度：0.4％-30.7％、0.8％-15.3％、1％-10％、1.5％-7.7％、2.5％-6％、3.1％-5.4％和3％-4％。
在特定的实施方式中，液体固定组合物包括5mg-500mg，特别是10mg-250mg、25mg-150mg或40mg-100mg高分子量聚氧乙烯聚合物，优选是聚乙二醇。特别地，液体固定组合物可能包括0.5μmol-50μmol，特别是1μmol-25μmol、2μmol-20μmol或3μmol-10μmol高分子量聚氧乙烯聚合物。该液体固定组合物可以填充如在收集装置内且如适用于固定样本单元。
根据一实施方式，所述液体固定组合物包括低分子量聚氧乙烯聚合物，优选为聚乙二醇，浓度选自下组：0.8％-92.0％、3.8％-76.7％、11.5％-53.7％、19.2％-38.3％、20％-30％和20％-27.5％。根据低分子量聚氧乙烯聚合物是液体与否，前述浓度是指(w/v)或(v/v)。如实施例中所示的，低分子量聚氧乙烯聚合物可以有效支持含细胞样本的固定，特别是当与本文描述的一种或多种其他固定剂联用时。
在特定的实施方式中，液体固定组合物包括40μl-4000μl，特别是100μl-2000μl、150μl-1500μl、200μl-1000μl或250μl-750μl的低分子量聚氧乙烯聚合物。特别地，液体固定组合物可能包括0.2mmol-15mmol，特别0.5mmol-10mmol、0.75mmol-5mmol、1mmol-3mmol或1.2mmol-2mmol的低分子量聚氧乙烯聚合物。该液体固定组合物可以填充如在收集装置内且如适用于固定样本单元。
根据一实施方式，所述液体固定组合物包括一种或多种伯、仲或叔酰胺，浓度选自下组：0.4％-38.3％、0.8％-23.0％、2.3％-11.5％、3.8％-9.2％、5％-15％和7.5％-12.5％。根据伯、仲或叔酰胺是液体与否，前述浓度是指(w/v)或(v/v)。如前所述，优选固定组合物还包括一种或多种伯、仲或叔酰胺，合适和优选的实施例如上文所述。
在特定的实施方式中，液体固定组合物包括10μl-2000μl，特别是50μl-1000μl、100μl-750μl或125μl–500或150-250μl的伯、仲或叔酰胺。特别地，液体固定组合物可能包括0.2mmol-15mmol，特别0.5mmol-10mmol、0.75mmol-5mmol、1mmol-3mmol或1.2mmol-2mmol的伯、仲或叔酰胺。该液体固定组合物可以填充如在收集装置内且如适用于固定样本单元。
根据一实施方式，所述液体固定组合物包括半胱天冬酶抑制剂，浓度选自下组：0.1μM-220μM、0.8μM-115.0μM、7.7μM-76.7μM和23.0μM-50μM。在特定的实施方式中，液体固定组合物包括1nmol-1000nmol，特别5nmol-500nmol、10nmol-200nmol或25nmol-100nmol的半胱天冬酶抑制剂。该液体固定组合物可以填充如在收集装置内且如适用于固定样本单元。
根据一实施方式，所述液体固定组合物包括螯合剂，优选EDTA，如K2EDTA，浓度选自下组：9.5mM-1100mM、20mM-750mM、50mM-600mM、75mM-550mM、100mM-500mM、125mM-450mM、130mM-300mM和140mM-250mM。在特定的实施方式中，液体固定组合物包括10nmol-3000nmol，特别50nmol-1500nmol、100nmol-1000nmol或150nmol-500nmol的螯合剂。该液体固定组合物可以填充如在收集装置内且如适用于固定样本单元。
如上所述，所述液体固定组合物包括优选是高分子量聚氧乙烯聚合物的聚氧乙烯聚合物，以及优选一种或多种伯、仲或叔酰胺，半胱天冬酶抑制剂和螯合剂。根据一实施方式，所述液体组合物包括高分子量聚氧乙烯聚合物，且还包括低分子量聚氧乙烯醇。
根据一替代方案，组合物包括作为固定剂的乙二醇(1,2-乙二醇)。乙二醇可以以上文为低分子量聚氧乙烯聚合物描述的浓度被使用。参考还用于此的各披露。特别是，组合物可能包括乙二醇和上述任何一种或多种其他固定剂连同组合物。根据一实施方式，组合物还包括至少一种半胱天冬酶抑制剂和/或至少一种伯、仲、叔酰胺，特别是如上述的式1所示的化合物。优选地，组合物包括两者。包括乙二醇的组合物也可能包括抗凝剂，优选螯合剂，和/或聚氧乙烯聚合物，如高和/或低分子量聚氧乙烯聚合物，如上所述。各固定剂合适的实施方式和浓度范围如上述且也用于该实施方式，其中组合物包括作为固定剂的乙二醇。
本发明提供的固定组合物固定含细胞生物样本，且因此不诱导包含在样本中的有核细胞且也优选无核细胞的裂解和/或破坏。因此，固定组合物不包括这样浓度的助剂：其中所述助剂会诱导或促进各自细胞且通常优选细胞的细胞裂解。固定组合物诱导包含在样本中的细胞的损害，如由实施例部分描述的测试方法测定。特别地，本文描述的固定组合物能减少基因组DNA从包含在含细胞生物样本内的细胞释放进入样本的无细胞部分。此外，特别当还包括优选的半胱天冬酶抑制剂时，固定组合物可能能够减少存在于固定样本中的核酸，特别是基因组DNA的降解。如所描述的，固定组合物能减少或阻止生物样本内包含的胞外核酸群被源自包含在固定样本中的细胞的胞内核酸，特别是DNA和RNA污染。优选地，固定组合物不包括诱导蛋白-DNA和/或蛋白-蛋白交联的交联剂。特别地，固定组合物不包括甲醛，福尔马林，多聚甲醛或甲醛释放剂或类似的交联剂。优选地，固定组合物不包括根据GHS归类为有毒试剂的试剂。优选地，本发明的固定组合物能优选在室温不需离心固定包含在含细胞生物样本内的胞外核酸群选自下组的时间：至少两天、至少三天、至少四天、至少五天和/或至少六天。特别地，在限定的固定时间，获得一种或多种，优选全部上述固定效果。
根据一实施方式，固定组合物为固定血液，基本上包括一种或多种聚氧乙烯聚合物，一种或多种伯、仲或叔酰胺，至少一种半胱天冬酶抑制剂和抗凝剂，优选是螯合剂，如EDTA，以及任选地，溶剂和/或缓冲剂。如所述的，优选水用作溶剂，因为它在存储期间减少溶血。同样适用于其中乙二醇作为固定剂的实施方式的改进形式。
固定组合物可以固体形式、半液体形式或以液体提供。如果待固定的含细胞生物样本包含液体以溶解固体(如例如含细胞体液，培养基中的细胞，尿)或如果液体，如水加入其中以溶解固体组合物，固体组合物是，如合适的选择。如实施例所示，固体组合物可以固体形式使用。但是，也可能使用液体组合物。液体组合物具有优势，即能够快速获得含待固定样本的混合物，因此样本一与液体固定组合物接触就能提供立即的固定效果。优选地，存在于液体固定组合物中的一种或多种固定剂在溶液中保持稳定，不需要使用者预处理，如例如溶解溶解度有限的沉淀物，因为这种预处理对固定效率造成变化风险。如实施例所示，当固定血液样本时，包含水的固定组合物是特别有利的，因为在存储期间溶血被减少。
本发明还提供包括与含细胞生物样本混合的本发明第三方面的固定组合物的混合物。含细胞的生物样本的合适和优选的实施例以及当与含细胞生物样本混合时一种或多种固定剂的合适浓度在上文描述，特别是结合本发明的固定方法。参考还用于此的以上披露。如所述，优选包含细胞的样本是血液样本。
根据一实施方式，本发明的固定组合物预装在样本收集装置内以使一旦收集或收集期间立即固定样本。根据一实施方式，固定组合物以选自下组的体积比与含细胞生物样本接触：10:1-1:20、5:1-1:15、1:1-1:10、1:10-1:5和1:7-1:5，特别约1:6。本发明固定组合物的特别优点是采用小体积固定组合物能实现大样本体积的固定。因此，优选地，固定组合物与样本的比例范围为1:10-1:5，特别1:7-1:5，如约1:6。
本发明第三方面的固定组合物可以用于固定包含在含细胞样本，如优选血液样本中的胞外核酸群。此外，如上述，固定组合物固定包含的细胞，因此特别减少基因组DNA和其他胞内核酸从包括在含细胞生物样本内的细胞释放。因此，胞外核酸群被基因组DNA和其他胞内核酸污染被减少。
本发明的固定组合物还可能并入样本收集装置，特别血液收集装置，如血液收集容器，从而提供新且有用版本的该装置。容器优选是血液收集管。容器类型也取决于待收集的样本，其他合适的形式在下文描述。
D.应用
根据第四方面，本发明涉及优选是聚乙二醇的聚氧乙烯聚合物的应用，和/或乙二醇的应用，用于固定含细胞生物样本，特别是包含在含细胞生物样本中的胞外核酸群。特别地，第三方面的固定组合物能用于所述目的，例如在本发明第四方面的方法中。所述方法的细节在上文描述，参考还用于此的上文披露。优选地，如上述，如果含细胞生物样本是优选的实施方式，血液，则组合物包括抗凝剂。
E.收集装置
根据第五方面，本发明提供一种用于收集含细胞生物样本的收集装置，其中所述收集装置包括：
i)作为固定剂的聚氧乙烯聚合物，或
ii)作为固定剂的乙二醇，
和选自下组的一种或多种，优选两种或多种其他助剂：
-一种或多种伯、仲或叔酰胺；
-半胱天冬酶抑制剂；
-抗凝剂和/或螯合剂。
优选地，第五方面的收集装置包括作为固定剂的优选是分子量至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物的聚氧乙烯聚合物，此外还包括选自下组的一种或多种，优选两种或多种的其他助剂：
-至少一种其他聚氧乙烯聚合物，其分子量比优选是高分子量聚氧乙烯聚合物的第一聚氧乙烯聚合物的分子量低至少100、优选至少200、至少300或至少400，其中所述其他聚氧乙烯聚合物优选是分子量为1000或更小的低分子量聚氧乙烯聚合物；
-一种或多种伯、仲或叔酰胺；
-半胱天冬酶抑制剂；
-抗凝剂和/或螯合剂。
提供相应的收集装置，如样本收集管具有优势，即当样本被收集在所述收集装置内时立刻被固定。用于收集含细胞生物样本，优选血液样本的收集装置可能包括本发明第三方面的固定组合物。关于应用聚氧乙烯聚合物和任选一种或多种其他助剂用于固定和固定组合物的细节连同其它方面在上文描述，参考还用于此的上文披露。同样的用于乙二醇用作固定剂的替代方式，实施方式的细节已在上文描述。乙二醇也能与至少一种聚氧乙烯聚合物组合使用。随后，收集装置也称为容器。
根据一实施方式，收集装置包括聚氧乙烯聚合物，优选是聚乙二醇，一种或多种伯、仲或叔酰胺，优选一种或多种式1所示的化合物和半胱天冬酶抑制剂。此外，如果收集容器用于收集血液，优选它还包括抗凝剂，优选是螯合剂。
根据一实施方式，提供用于接收和收集含细胞生物样本的收集装置，包括：
a)至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量至少1500、至少2000、优选至少3000，其中分子量优选选自下组：2000-40000、2500-30000、2500-25000、3000-20000、3500-15000、4000-10000、4500–8000和5000–7000；
b)一种或多种伯、仲或叔酰胺；
c)至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选泛半胱天冬酶抑制剂，更优选Q-VD-OPh；
d)任选至少一种低分子量聚氧乙烯聚合物，分子量为1000或更低，其中分子量优选选自下组：100-800、150-700、150-600、200–500和200–400；
e)任选抗凝剂和/或螯合剂，更优选EDTA。
在该实施方式中，优选是聚乙二醇的高分子量聚氧乙烯聚合物(组分a))可能包含在收集装置内，其浓度使得当含细胞生物样本被收集入所述装置，得到的混合物中高分子量聚氧乙烯聚合物的浓度范围选自下组：0.05％-4％(w/v)、0.1％-3％(w/v)、0.2％-2.5％(w/v)、0.25％-2％(w/v)、0.3％-1.75％(w/v)和0.35％-1.5％(w/v)。根据一实施方式，高分子量聚氧乙烯聚合物包含在收集装置内，其浓度使得当含细胞生物样本被收集入所述装置，得到的混合物中高分子量聚氧乙烯聚合物的浓度范围选自下组：0.25％-1.5％(w/v),0.3％-1.25％(w/v),0.35％-1％(w/v)和0.4％-0.75％(w/v)。这些浓度范围特别适用于固定血液，优点连同固定方法在上文讨论。
在该实施方式中，一种或多种伯、仲或叔酰胺(组分b))包含在收集装置内，其浓度使得当含细胞生物样本被收集入所述装置，得到的混合物中酰胺(或酰胺的组合)的浓度范围选自下组：0.25％-5％、0.3％-4％、0.4％-3％、0.5％-2％或0.75％-1.5％。至少一种酰胺优选是式1所示的化合物：
其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，更优选C1-C2烷基,R2和R3相同或不同，选自氢和烃基，优选烷基，具有1-20个原子的碳链长度，以直链或支链形式，和R4是氧、硫或硒。优选地，酰胺为羧酸酰胺以使R4是氧。式1所示化合物的优选实施方式连同固定方法在上文描述，参考还用于此的上文披露。优选地，收集装置包括丁酰胺和/或N,N-二烷基丙酰胺，优选是N,N-二甲基丙酰胺，作为式1所示的化合物。
在该实施方式中，至少一种半胱天冬酶抑制剂(组分c))有利地包含在所述收集装置内，其浓度使得当含细胞生物样本被收集入所述装置，得到的混合物中半胱天冬酶抑制剂的浓度范围为0.1μM-20μM，更优选0.5μM-10μM，更优选1μM-10μM，更优选3μM-7.5μM或3μM-5μM。如通过实施例示出的，包括聚氧乙烯聚合物和半胱天冬酶抑制剂的固定组合物在固定含细胞生物样本，特别是全血样本中是特别有效的。优选地，另外使用如上所述的一种或多种伯、仲或叔酰胺。
如果在该实施方式中，收集装置另外包括分子量为1000或更小的低分子量聚氧乙烯聚合物作为组分b)，当含细胞生物样本被收集入所述装置，它优选以得到的混合物中低分子量聚氧乙烯聚合物的浓度为0.5％-10％、1.5％-9％、2％-8％和2.5％-7％以及3％-6％的浓度包含在收集装置内。在聚氧乙烯聚合物为固体时，百分比是指(w/v)，聚氧乙烯聚合物为液体时，百分比是指(v/v)。优选地，聚氧乙烯聚合物为聚乙二醇。高分子量聚氧乙烯聚合物与低分子量聚氧乙烯聚合物联用的实施方式的优点在上文详述。在优选的实施方式中，收集容器包括高分子量聚氧乙烯聚合物(组分a))和低分子量聚氧乙烯聚合物(组分d))，其浓度使得当含细胞生物样本被收集入所述装置，得到的混合物中高分子量聚氧乙烯聚合物的浓度对于高分子量聚氧乙烯醇位于选自下组的范围：0.2％-1.5％(w/v)、0.3％-1.25％(w/v)和0.4％-0.75％(w/v)，和对于低分子量聚氧乙烯醇在选自下组的范围：1.5％-8％、2％-7％和2.5％-6％。优选地，高和低分子量聚氧乙烯聚合物是聚乙二醇，如上述。
根据一实施方式，收集装置还包括抗凝剂和/或螯合剂。如果容器用于收集血液或源自血液的样本如血浆或血清，该实施方式特别合适。抗凝剂以能阻止血液凝聚的浓度被包含。合适的抗凝剂连同第一方面的方法在上文描述，参考还用于此的上文披露。如所述，抗凝剂优选是螯合剂，合适的实施方式在上文描述，参考各披露。根据一实施方式，容器包括螯合剂，优选EDTA，其浓度使得当含细胞生物样本被收集入容器，得到的混合物中螯合剂的浓度在选自下组的范围内：0.5-40mg/ml、1-30mg/ml、1.6-25mg/ml、5-20mg/ml和7.5-17.5mg/ml。
根据一实施方式，收集装置包括乙二醇作为固定剂。乙二醇可以上文为低分子量聚氧乙烯聚合物描述的浓度被使用。参考还用于此的各披露。特别地，收集装置可能包括乙二醇和本文描述的一种或多种其他固定剂，优选至少一种半胱天冬酶抑制剂和/或至少一种伯、仲、叔酰胺，其优选是上文定义的式1所示的化合物。收集装置还可能包括乙二醇和至少一种聚氧乙烯聚合物。对于各固定剂合适的实施方式和浓度范围在上文描述，也用于乙二醇被包含在收集容器内从而固定或支持含细胞样本和包含于内的胞外核酸群的固定的实施方式。
包含在收集容器内的用于固定的固定组合物和/或各化合物可以液体、半液体或以干燥形式提供。如以上所讨论的，聚氧乙烯聚合物和用于固定的其他助剂可以固定组合物形式提供。用于固定的化合物也可能作为单独部分被提供于容器内，且也可能以不同形式被提供于容器内。例如，一种组分可能以干燥形式提供，而另一种化合物以液体提供。其他的组合也是可能的。合适的制剂和制造选择对本领域技术人员是已知的。
为固定全血，优选在容器中包括抗凝剂，如EDTA，例如在固定组合物中。干燥形式是，例如合适的选择，如果待固定的生物样本包含液体以溶解固体(如，例如含细胞体液，培养基内细胞，尿)，或如果液体，如水或其他溶剂加入其中以溶解固体。使用固体固定组合物的优点在于固体通常比液体化学更稳定。根据一实施方式，采用本发明的固定组合物或其单独的组分，如抗凝剂处理/覆盖容器的内壁。使用，如喷雾干燥方法可以将所述组合物或组分应用到内壁。可以在固定组合物上实施液体去除技术以获得基本上是固体状态的保护组合物。液体去除条件可以是得到分散液体组合物原始量的至少约50重量％、至少约75重量％或至少约80重量％去除的条件。液体去除条件可以是获得充足液体去除以使得到的组合物是膜、凝胶或其他基本上为固体或高粘度层形式的条件。例如，它可能获得实质上固定的涂层(优选一旦与包含细胞的样本，优选是血液产品样本接触，能被再溶解或要不分散的涂层)。冻干或其他技术可能用于实现保护剂的基本固体形式(如一或多个小球的形式)。因此，液体去除条件可能是这样的条件，获得的材料在关注的条件下一旦与样本(如全血样本)接触，保护剂将分散在样本中，并充分保护样本中的成分(如胞外核酸)。液体去除条件可能是这样的条件，获得实质上非晶的残留组合物具有足够高的粘度，使得残留组合物在环境温度下基本固定；或两者。
根据一实施方式，使用液体组合物。对于特定样本如血液样本具有好处。液体组合物具有优势，能够快速获得与待固定的含细胞生物样本的混合物，因此样本一与液体固定组合物接触，基本提供立即的固定效果。此外，如果使用较大量的固定组合物，因此不能或难于喷雾干燥或如果组合物妨碍提供干燥的组合物，液体组合物是有利的。优选地，存在于液体固定组合物中的固定剂在溶液中保持稳定，不需使用者预处理，如，例如溶解有限溶解度的沉淀，因为这种预处理对固定效率造成变化风险。为固定血液，根据一实施方式，全部化合物存在于固定组合物中。如以上所讨论的，在血液情况下，使用包含足量水的固定组合物以减少固定样本存储期间溶血是有利的。
固定组合物包含在容器内，其含量能为待收集入所述容器内的样本有效提供固定作用。根据一实施方式，液体固定组合物与生物样本接触，体积比选自10:1-1:20、5:1-1:15、1:1-1:10、1:10-1:5和1:7-1:5，特别约1:6。本发明的固定组合物的特别优点是能用小体积的固定组合物实现大样本体积的固定。因此，优选地，固定组合物与样本的比例为1:10-1:5，特别为1:7-1:5，如约1:6。
根据一实施方式，收集装置抽真空。优选地，抽真空对于将特定体积的液体含细胞生物样本置入内部是有效的。因此，它确保正确量的样本与包含在容器内的预填充量的固定组合物接触，因此，固定是有效的。根据一实施方式，容器包括管，其开口端被隔膜密封。例如，容器预填充有限定量的固定组合物，或者固体形式或者液体形式，提供限定的真空并被隔膜密封。构建隔膜以使它与标准取样配件(如套管等)相容。当与如套管接触，由真空预定的样本量被收集在容器内。各实施方式对于收集血液是特别有利的。合适的容器如在US6,776,959中公开。
本发明的容器可以由玻璃、塑料或其他合适的材料制成。塑料材料可以是氧可渗透的材料或可能包含氧可渗透层。或者，容器可以由空气可渗透的塑料材料制成。本发明的容器优选由透明材料制成。合适的透明热塑性材料的实例包括聚碳酸酯，聚乙烯，聚丙烯和聚对苯二甲酸乙酯。所述容器可以具有根据所收集的生物样本的所需体积选择的合适尺寸。如上所述，优选地，该容器被抽空到低于大气压的内压。这种实施方式特别适合用于收集体液，例如全血。优选选择压力以将预定体积的生物样本收入容器。除了这种真空管，非真空管，机械分离器管或凝胶屏障管可以用作样本容器，特别用于收集血液样本。合适的容器和封盖装置的例子在US 5,860,397和US 2004/0043505中公开。如同用于收集含细胞样本的容器，可以使用其他收集装置，例如注射器、尿液收集装置或或其它收集装置。容器的类型也可能取决于待收集的样本类型，适当的容器对本领域技术人员也可用。
根据一实施方式，容器具有开放的顶部、底部和从两者之间延伸的侧壁，限定腔室，其中优选是高分子量聚氧乙烯聚合物的聚氧乙烯聚合物和上文提及的一种或多种其他固定剂或第三方面的固定组合物被包含在腔室内。它可能以液体或固体形式被包含。根据一实施方式，它是液体。根据一实施方式，容器是管，底部是封闭的底部，容器还包括在开放的顶部的罩子，且腔室处于减压。腔室内减压压的好处在上文描述。优选地，罩子能够被针或套管刺穿，选择减压以将特定体积的液体样本吸入腔室。根据一实施方式，选择腔室在减压以将特定体积的液体样本吸入腔室，且固定组合物是液体，置于腔室内以使固定组合物与特定体积的包含细胞的样本的体积比选自：10:1-1:20、5:1-1:15和1:1-1:10，且优选为1:10-1:5，更优选1:7-1:5。相关优点在上文描述。
优选地，容器用于给患者抽血。根据一实施方式，它从患者抽取10毫升血液。根据一实施方式，固定组合物是液体，体积是2毫升或更少，可以处于0.5毫升到2毫升、0.75毫升到1.75毫升和1毫升到1.5毫升。
F.收集含细胞样本的方法
根据第六方面，提供一种方法，包括从患者收集含细胞生物样本直接置入本发明第五方面的容器的腔室的步骤。关于容器和含细胞生物样本的细节在上文描述。参考各披露。根据一实施方式，收集血液样本，优选从患者抽取置入容器。
G.制备方法
根据第七方面，提供制备本发明第三方面的固定组合物的方法，其中固定组合物的组分被混合。优选地，它们被混合以提供液体溶液。如所描述的，包括水的固定组合物对于固定血液样本是特别优选的，因为能有效减少溶血。
本发明不受本文公开的示例方法和材料限制，与本文描述的那些相似或等价的任何方法和材料能够用于本发明实施方式的实践或测试。数值范围包括定义该范围的数字。本文所提供的标题不是对可以通过参考说明书作为整体阅读的本发明的各方面或实施方式的限制。
除非上下文另外指明，固体化合物包含在液体混合物或组合物中时，本文所述百分比值指(w/v)；液体化合物包含在液体混合物或组合物，如从固定剂或包含所述固定剂的固定组合物与包含细胞的样本接触获得的混合物中时，百分比值指(v/v)。
如在本说明书所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数方面，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一种聚氧乙烯聚合物”包括单一类型的聚氧乙烯聚合物，以及两种或多种聚氧乙烯聚合物。同样，参照一种“试剂”，“助剂”，“化合物”等包括单个个体和两个或更多个这样的实体的组合。参照“披露”和“本发明”等包括本文教导的单个或多个方面；等等。本文所教导的方面通过术语“发明”涵盖。
本文使用的术语“溶液”特别指一种液体组合物，优选水性组合物。它可以是只有一相的均匀混合物，但溶液包括固体助剂，如沉淀物，特别是包含的化学物质，如固定剂也在本发明的范围内。
关于核苷酸本文所指的大小(尺寸)，分别地大小(尺寸)范围(nt)是指链长，从而为描述单链以及双链分子的长度被使用。在双链分子中，所述核苷酸是配对的。
根据一实施方式，在方法的情况下，本文描述主题包括某些步骤，或在组合物的情况下，包括某些成分，方案和/或缓冲液指由各个步骤或成分构成的主题。优选选择和结合本文所述的优选实施方式以及由优选的实施方式的各组合产生的特定主题也属于本发明。
本申请要求EP 14 000 990.3和US 61/955,200(申请日：2014年3月18日)的优先权，通过引用将两申请的披露并入本文。
实施例
应理解以下实施例仅为举例目的，不以任何方式构成对本发明的限制。
使用的缩写：
BA：丁酰胺
ccfDNA：循环的，无细胞DNA
DMPA：二甲基丙酰胺
EDTA：乙二胺四乙酸
PEG：聚乙二醇
检测聚乙二醇(PEG)或单独或与不同的固定剂，包括半胱天冬酶抑制剂和/或不同的伯和/或叔酰胺联用时固定含细胞生物样本，此处为血液样本的能力。与对照样本(EDTA血液)相比，发现PEG能有效固定全血样本中的白血球，以阻止基因组DNA释放入胞外核酸群的方式。为不同分子量的PEG和在不同的浓度下使用时证实这种固定效果。据证实，PEG可以作为不含水的粉末或液体，如纯试剂或溶解在水溶液中被添加。PEG单独本身具有强的固定效果，但与其它固定剂，包括半胱天冬酶抑制剂和不同酰胺组合显著改善固定作用，第0天(刚抽血后)到第6天(在室温下贮存6天)从白血球释放入血浆的DNA的增加可重复地减小至2倍或甚至更低的水平。获得的延长的有效的固定是重要的优点，因为它为含细胞样本，如血液样本提供均匀的，可靠的固定方法。此外，实施例表明，使用高分子量PEG和低分子量PEG组合是有利的，因为强固定效果得以实现，且使用如基于硅胶柱的核酸分离方法能从固定的样本有效分离胞外核酸。
I.材料和方法
如果没有另外指出，在实施例中采用以下程序。
1.血液收集和固定
将血液抽入含每毫升全血1.8mg K2EDTA的10毫升喷雾干燥EDTA管(BD)内。抽血后30分钟，或者直接加入固定剂，或者将血液轻轻倒入含固定剂的新管内。通过倒转该管十次混合血液和试剂。在室温在直立位置储存固定的血液样本。
2.制备血浆
在环境温度下以3.000rpm(每分钟转数)离心全血样本。通过移液除去清澈血浆部分并转移到新的离心管中。在第二轮，在4℃以16.000xg离心血浆样本10分钟。上清转移进新管中，或直接用于ccfDNA的纯化或储存在-20℃直至使用。
3.ccfDNA纯化
采用QIAamp循环核酸试剂盒(凯杰公司-QIAGEN GmbH)分离源自血浆的DNA，使用从1ml、2ml或3ml血清或血浆纯化循环核酸的方案。如果没有另外说明，2毫升血浆与蛋白酶K和裂解缓冲液ACL混合，在60℃孵育30分钟，与缓冲液ACB混合，结合在QIAamp微型柱(其包含用于结合核酸的硅胶固相)上，采用QIAvac24加真空歧管，采用60μl洗脱缓冲液AVE洗涤和洗脱，根据制造商的建议。
4.定量实时PCR实验分析分离的胞外DNA
用3μl洗脱液在ABI PRISM HT7900(生命技术公司-Life technologies)上用实时PCR实验分析分离的胞外DNA。使用QuantiTect多重PCR试剂盒(凯杰公司)在20μl实验体积中，用多重PCR扩增人8S rDNA基因的两个片段，66bp和500bp。根据gDNA标准曲线将各个样本的循环阈值(Ct值)译成洗脱液中gDNA的量：通过与由从3000稀释到0.3基因组当量(1基因组当量相当于约6.6pg人基因组DNA)人类基因组DNA生成的标准曲线比较获得总量。存储时间点(采血后一般6天)的gDNA量与来自相同供体的时间零时的gDNA水平比较。
表1：总结定量实时PCR检测的使用的DNA目标序列的信息
66bp片段的量化用于反映血浆中18S rDNA拷贝的总量。500bp的定量用来确定由全血的凋亡或机械裂解白细胞衍生的18S rDNA的拷贝量。无细胞DNA的典型长度为140-170bp。因此，500bp的片段被认为是源自凋亡，裂解或以其他方式被破坏的血细胞。从T0到6天存储期间从500bp拷贝数的增加被用于测量固定效率。因此，释放的500bp的DNA的量越低，固定方法的性能越好。释放500bpDNA的较高量表示发生白血细胞的裂解，胞外核酸群被胞内基因组DNA污染。
从多个不同的个体供体获得的血液样本用于随后的实验。为每个单独的供体样本单个计算室温下不同时间点(天)储存的固定或未固定血液中18S rDNA基因的66bp和500bp片段相对于抽血后时间点0(0天)的拷贝数的平均倍数变化。相应的单个计算平均值(倍数改变)用于检测使用的不同固定组合物的固定效率。因血液样本背后存在取决于供体的在组成和包含的胞外核酸量中自然的个体差异，这可能会导致升高的标准偏差。
5.血红蛋白检测
在SpectraMax光度计上检测414nm的吸光度，发现与血浆的溶血变色呈线性关系。
II.实施例
1.实施例1
在实施例1中，检测无水时，不同分子量的聚乙二醇(PEG)与BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)组合的固定效果，并与组合的BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)方案相比较。此外，平行检测血浆样本中该固定混合物对溶血的效果。EDTA血液样本用作未固定参比对照。
血液收集和固定
来自八个供体的10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用含或不含不同分子量的PEG的丁酰胺(BA)和EDTA的混合物在不添加水时进行固定。通过吸管移液加入溶解在DMSO中的半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)。从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。在血浆产生前残留血液在室温再储存6天。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测18S rDNA基因的拷贝数，一式三份。
各条件和测试时间点，全部固定血液样本都设定一式三份。在时间点0(参照时间点)，混合固定溶液和血液后，立即产生血浆，并提取循环胞外DNA。作为参比对照，EDTA固定血液样本(收集在K2EDTA管，无其他助剂)也储存0或6天，并一式三份被分析。
固定剂混合物的组成(对于各10毫升K2EDTA全血)
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、EDTA、Q-VD-OPh：100mg BA、132mg K2EDTA、10μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μlDMSO)，加水至2ml
-PEG(600,1000或3000)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：250mg PEG(600,1000或3000)、100mgBA、132mg K2EDTA、10μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)(无水)
籍此，与血液接触后在混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、EDTA、Q-VD-OPh：1％(w/v)BA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG(600、1000或3000)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：2.5％(w/v)PEG(600、1000或3000)、1％(w/v)BA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
结果
为八个血液供体的每一个单个计算在室温存储6天的来自8个供体的固定或未固定血液中18S rDNA的66bp和500bp片段相对于抽血后时间点0(0天)的拷贝数的平均变化(x倍变化)。图1示出每种条件下相应的来自8个供体的拷贝数的平均倍数变化。与未固定对照(EDTA血液)相比，全部固定组合物显示出在室温存储6天后明显较低量的基因组DNA释放，因为平均倍数变化增加显著减少。因此，甚至在整个6天这么长的固定期都获得固定效果。图1示出将血液样本额外与聚乙二醇接触明显改进获得的固定效果。因此，不同分子量的PEG在改进固定效果上是高度有效的，因为平均倍数变化增加始终被降低低于2倍，且在实施方式中甚至低于1倍。即在第6天的DNA水平与基础时间点(0天)的DNA水平相当。
总之，当与聚乙二醇联用时，包括半胱天冬酶抑制剂和酰胺，此处为伯羧酸酰胺的固定组合物的固定效果可显著增加。不同分子量的聚乙二醇都是有效的。此外，结果表明，随PEG分子量增加，PEG固定性能增加，表明使用的PEG的分子量和获得的样本固定效果之间存在正相关性。较高的分子量改进获得的固定效果。
2.实施例2
在实施例2中，检测无水时BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)组合的固定效果，并与还包括不同量(0.2g、0.3g或0.4g)的分子量600的PEG(PEG600)的组合物相比较。EDTA血液用作未固定参照。
血液收集和固定
来自六个供体10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用丁酰胺(BA)和EDTA的混合物、丁酰胺(BA)和EDTA以及不同量的分子量600的PEG(PEG600)的混合物在不添加水时进行固定。此外，通过吸管移液加入溶解在DMSO中的半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)。从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。在血浆产生前残留血液在室温再储存6天。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测每种条件和测试时间点的18SrDNA基因的拷贝数，一式三份。作为参比对照，EDTA固定血液样本(收集在K2EDTA管，无其他助剂)也储存6天。
固定剂混合物的组成(对于各10毫升K2EDTA全血)：
-BA、EDTA、Q-VD-OPh：100mg BA、182mg K2EDTA、10μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μlDMSO)、加水至2毫升
-PEG600(0.2-0.4g)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：200、300和400mg PEG600、100mg BA、188mg K2EDTA、10μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)
因此，与血液接触后在混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、EDTA、Q-VD-OPh：1％(w/v)BA、20mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG600(0.2-0.4g)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：2、3和4％(w/v)PEG600、1％(w/v)BA、20mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
结果
示为平均倍数变化的六个单独供体样本的定量实时PCR结果示于图2。示出相对于时间0，采用0.2g、0.3g或0.4g PEG600的DNA(66bp和500bp片段)增加(平均倍数变化)。与参照EDTA血液相比，全部测试的固定组合物显示出在室温存储6天后明显较低量的基因组DNA释放。如果包含细胞的样本还与聚乙二醇接触，固定效果显著改善。在全部三组基于PEG固定方案中，与不含PEG的组合物(BA,EDTA,Q-VD-OPh)相比，两18S rDNA扩增子拷贝数的平均倍数变化明显更小。在全部情况下，X倍数变化低于2倍。该实施例表明额外使用不同量的聚乙二醇用于固定胞外核酸群明显改进采用半胱天冬酶抑制剂和伯羧酸酰胺丁酰胺获得的固定结果。
3.实施例3
在实施例3中，检测无水时直接冻干入血液收集管的包括高分子量PEG(PEG3000)、EDTA、BA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的试剂混合物的固定效果，并与采用包括BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的溶液同时处理的样本相比较。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用含或不含PEG3000的丁酰胺(BA)和EDTA以及半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的混合物的混合物进行固定。为冻干，包括半胱天冬酶抑制剂、EDTA、BA和PEG的全部组分溶于水。1ml体积(总浓度见下)在5ml管内，采用Epsilon 2-25D冻干机(Christ GmbH)冻干。血液从K2EDTA管转入含冻干固定剂的5ml管内，并通过倒转管10次固定。作为参照，试剂新近制备，通过吸管移液添加溶于DMSO中的半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)。
从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。在血浆产生前残留血液在室温再储存6天。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测18S rDNA基因的拷贝数，一式三份。
固定剂混合物的组成(对于各10毫升K2EDTA全血)
-新近制备的BA、EDTA、Q-VD-OPh：100mg BA、132mg K2EDTA、10μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至2ml
-新近制备的PEG3000、BA、EDTA、Q-VD-OPh：250mg PEG3000、100mg BA、132mgK2EDTA、10μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)(无水)
冻干入5ml管内的0.5ml固定剂混合物的组成：
-冻干的：0.5ml固定剂，包含125mg PEG3000、50mg BA、67.5mg K2EDTA、5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)
因此，与血液接触后在混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、EDTA、Q-VD-OPh：1％(w/v)BA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG3000、BA、EDTA、Q-VD-OPh：1％(w/v)PEG 3000、1％(w/v)BA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
结果
结果示于图3。示出基于18S rDNA基因不同扩增子长度的抽血后6天相对于时间0的DNA增加(平均倍数变化)。结果再次表明如果额外使用聚乙二醇用于固定显著改进固定效果，且增强由BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)获得的固定效果。此外，在所测试的延长的固定期(6天)，x倍数变化低于2倍。此外，实施例表明这些固定组合物可以新近制备或以冻干形式被使用。
4.实施例4
在实施例4中，在水性固定溶液中检测PEG6000(高分子量PEG)单独或与半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)组合对EDTA固定样本的固定效果，并与单独EDTA固定血液或BA、EDTA固定血液相比较。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用含丁酰胺或PEG与EDTA以及任选的半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)组合的水性溶液进行固定。从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。在血浆产生前残留血液在室温再储存3天。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测18S rDNA基因的拷贝数，一式三份。
固定剂混合物的组成(对于各10毫升K2EDTA全血)：
-BA、EDTA、Q-VD-OPh：360mg BA、68.4mg K2EDTA、有或无2.4μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至2ml
-PEG6000、EDTA、Q-VD-OPh：137.5mg PEG6000、132mg K2EDTA、有或无2.2μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1ml
因此，与血液接触后在混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、EDTA：3％(w/v)BA、7.2mg/ml K2EDTA
-BA、EDTA、Q-VD-OPh：3％(w/v)BA、7.2mg/ml K2EDTA、1μM Q-VD-OPh
-PEG6000、EDTA：1.25％(w/v)PEG6000、7.2mg/ml K2EDTA
-PEG6000、EDTA、Q-VD-OPh：1.25％(w/v)PEG6000、7.2mg/ml K2EDTA、1μM Q-VD-OPh
结果
八个不同供体的qPCR分析结果示于图4。示出来自八个供体的固定或未固定血液在室温储存三天相对于抽血后时间点0(0天)的不同18S rDNA基因扩增子(66bp或500bp)的DNA拷贝的拷贝数的平均变化(倍数变换)。包含高分子量聚乙二醇的固定组合物与未固定EDTA血液相比，在室温存储三天表现出明显较低量的DNA释放。仅包含高分子量PEG作为固定剂的固定组合物在三天储存期间获得的固定效果优于采用固定剂丁酰胺获得的效果。这表明如果要在较短的固定期获得固定，聚乙二醇单独作为固定剂也是有效的。当使用聚乙二醇与半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)联用时，固定效果被改进。采用高分子量PEG与半胱天冬酶抑制剂的组合获得的固定效果甚至优于采用丁酰胺和半胱天冬酶抑制剂的组合的固定方案。结果表明溶于水性溶液的PEG仅联合抗凝剂(EDTA)固定ccfDNA和白血细胞两者(从而阻止细胞DNA释放入血浆)。此外，发现与丁酰胺相比，该固定效果甚至更显著。
5.实施例5
在实施例5中，检测在还包括BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的水性固定溶液中的而不同分子量(PEG300、PEG600、PEG1000)的PEG的固定效果，并与采用BA、二甲基丙酰胺(DMPA)、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)共处理的样本相比较。未固定的EDTA血液用作参照对比。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用包含或不含不同分子量的PEG的水性溶液中的丁酰胺、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的混合物进行固定。从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。在血浆产生前残留血液在室温再储存6天。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测18S rDNA基因的拷贝数，一式三份。
固定剂混合物的组成(对于各10毫升K2EDTA全血)：
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA、180μl DMPA、68.4mg K2EDTA、12μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至2ml
-PEG(300、600或1000)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：287.5mg PEG(300、600或1000)、115mgBA、154.5mg K2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.5ml
因此，与血液接触后在混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA、1.5％(v/v)DMPA、7.2mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG(300、600或1000)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：2.5％(w/v)PEG、1％(w/v)BA、15mg/mlK2EDTA、5μM Q-VD-OPh
结果
图5示出获得的固定结果。可见，包含不同分子量的PEG的水性固定组合物固定血液样本且进一步提高采用丁酰胺和半胱天冬酶抑制剂获得的固定效果。从污染性基因组DNA的量减少可知，白血细胞的固定显著被改进。结果还表明随着使用的PEG的分子量增加，固定效果增强。当使用分子量1000的聚乙二醇时，500bp片段的增加被降低低于2倍。
6.实施例6
此处，结合丁酰胺、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)，在水性固定溶液中检测渐减PFG浓度的固定效果。未固定的EDTA血液用作参比对照。平行检测包含BA、EDTA和Q-VD-OPh的组合物。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用包含或不含不同浓度PEG6000的水性溶液中的丁酰胺、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的混合物进行固定。从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。在血浆产生前残留血液在室温再储存6天。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测18S rDNA基因的拷贝数，一式三份。
固定剂混合物的组成(对于各10毫升K2EDTA全血)：
-BA、EDTA、Q-VD-OPh：110mg BA、147mg K2EDTA、11μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μlDMSO)，加水至1ml
-PEG6000(2–0.7％)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：220、165、110、77mg PEG6000、110mg BA、147mg K2EDTA、11μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1ml
因此，与血液接触后在混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、EDTA、Q-VD-OPh：1％(w/v)BA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG6000(2–0.7％)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：2、1.5、1、0.7％(w/v)PEG6000、1％(w/v)BA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
结果
在实施例6中，检测渐减浓度的较高分子量PEG6000当与丁酰胺、EDTA和半胱天冬酶抑制剂联用时对白血细胞固定的影响。图6描述通过由定量实时PCR分析18S rDNA的增加检测获得的胞外核酸群的固定结果。与涉及丁酰胺、EDTA和半胱天冬酶抑制剂的固定方案相比，室温存储6天后包括PEG的本发明的全部固定组合物显示出明显较低量的DNA释放。此外，可见，高分子量聚乙二醇可以在水性溶液中的不同浓度使用从而固定白血细胞从而减少基因组DNA污染胞外核酸群。此外，再次表明PEG增强丁酰胺和半胱天冬酶抑制剂的固定效果从而提供非常有效的固定方案。
7.实施例7
在实施例7中，检测不同体积水性固定溶液中PEG以及与EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)和不同的酰胺(BA或DMPA)组合的固定效果。未固定的EDTA血液用作参比对照。平行检测包含BA、DMPA、EDTA和Q-VD-OPh的组合物。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用0.8ml和1.2ml不同体积的水性溶液中的PEG6000、丁酰胺或DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的混合物进行固定。从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。在血浆产生前残留血液在室温再储存6天。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测18S rDNA基因的拷贝数，一式三份。
固定剂混合物的组成(对于各10毫升K2EDTA全血)：
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA、180μl DMPA、68.4mg K2EDTA、12μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至2ml
-PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh：112mg PEG6000、56mg BA、150mg K2EDTA、2.23μlQ-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.2或0.8ml
-PEG6000、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：112mg PEG6000、112μl DMPA、150mg K2EDTA、2.23μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.2或0.8ml
因此，与血液接触后在混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA、1.5％(v/v)DMPA、7.2mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG6000、BA或DMPA、EDTA、Q-VD-OPh至1.2ml：1％(w/v)PEG6000、0.5％(w/v)BA或1％(v/v)DMPA、15mg/ml K2EDTA、1μM Q-VD-OPh
-PEG6000、BA或DMPA、EDTA、Q-VD-OPh至0.8ml：1.04％(w/v)PEG6000、0.52％(w/v)BA或1.04％(v/v)DMPA、15.6mg/ml K2EDTA、1.03μM Q-VD-OPh
结果
图7示出这些固定实验的结果。示出固定或未固定血液在室温储存六天相对于抽血后时间点0(0天)的不同18S rDNA基因扩增子(66bp或500bp)的DNA拷贝的拷贝数的平均变化(倍数变换)。结果表明聚乙二醇能与不同的酰胺组合从而在不同体积的水性溶液中固定白血细胞，从而提供固定的血液样本，其中通过防止被胞内核酸稀释保存胞外核酸群。
8.实施例8
在实施例8中，通过溶血测试检测水性固定溶液中固定剂的效果。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用加水的含或不含PEG的丁酰胺或DMPA和EDTA的混合物进行固定。通过吸管移液加入溶于DMSO的半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)。从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。在血浆产生前残留血液在室温再储存3、6和10天。通过在分光光度计上检测414nm吸光度测定血红蛋白含量。
固定剂混合物的组成(对于各10毫升K2EDTA全血)：
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA、180μl DMPA、68.4mg K2EDTA、12μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至2ml
-PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh：137.5mg PEG6000、55mg BA、165mg K2EDTA、11μlQ-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)、加水至1.0ml
-PEG6000、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：110mg PEG6000、110μl DMPA、147mg K2EDTA、11μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)、加水至1.0ml
因此，与血液接触后在混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA、1.5％(v/v)DMPA、7.2mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh：1.25％(w/v)PEG6000、0.5％(w/v)BA、15mg/mlK2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG6000、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.0％(w/v)PEG6000、1.0％(v/v)DMPA、15mg/mlK2EDTA、5μM Q-VD-OPh
结果
图8示出存储0、3、6和10天后来自8个不同供体的血浆样本溶血效果。图8描述血浆组分中随414nm吸光度的增加来自八个供体的溶血的平均增长。
然而，在EDTA对比试验中，在存储期间溶血升高，与EDTA参照相比，在分析的时间点采用包含PEG结合EDTA以及BA或DMPA的本发明的水性固定溶液减少溶血，如图8所示。值得注意的是，EDTA对照中可见的从存储6天到存储10天溶血的增加在包含本发明的固定剂组合物和水的全部测试溶液中基本上被降低。在含PEG水性溶液中溶血减少程度与组合的BA、DMPA、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)固定样本相当。因此，在水性固定组合物中溶解PEG是有利的，因为它有效减少溶血。
9.实施例9
在实施例9中，测试不同分子量PEG(PEG300、PEG600、PEG1000、PEG3000)与BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)联用对ccfDNA拷贝数的影响，并与未固定的EDTA对照血液相比较。平行测试包含BA、DMPA、EDTA以及半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的组合物。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用含增加的分子量的PEG的水性溶液中的丁酰胺、EDTA以及半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的组合进行固定。从5毫升固定的或未固定的血液样本在血液收集一小时后直接获得血浆。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测18S rDNA基因的拷贝数，一式三份。
固定剂混合物的组成(对于各10毫升K2EDTA全血)：
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA、180μl DMPA、68.4mg K2EDTA、12μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至2ml
-PEG(300、600、1000或3000)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：287.5ml PEG 300或287.5mgPEG(600、1000或3000)、115mg BA、154.5mg K2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μlDMSO)，加水至1.5ml
因此，与血液接触后在混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA、1.5％(v/v)DMPA、7.2mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG(300、600、1000or 3000)、BA、EDTA、Q-VD-OPh：2.5％(v/v或w/v)PEG、1％(w/v)BA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
结果
八个不同供体的完全定量实时PCR分析结果以平均值示于图9。特别示出抽血后第0天供体的固定或未固定血液样本中不同的18S rDNA基因扩增子(66bp或500bp)的绝对拷贝数的平均值。目的是测试当使用基于硅胶柱的核酸分离方法时，使用的固定方法对后续核酸产率的影响。图9示出与EDTA参照样本(未固定的方案)或包含BA、DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的固定血液溶液相比，添加较高分子量PEG导致血浆中可检测的扩增子基因拷贝数减少。结果表明对于使用增加的分子量或链长的PEG用于固定，当以较高浓度使用时，可能导致当使用基于硅胶柱的核酸分离方法从固定的样本分离胞外核酸时，血浆中可检测的ccfDNA基因拷贝数减少。
10.实施例10
在实施例10中，以不同浓度(1.0％、1.25％或1.5％)结合BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)测试PEG6000。EDTA固定血液样本用作参比对照。平行分析含BA、DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的血液混合物。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用酰胺(DMPA和/或BA)、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)、含或不含PEG6000的组合在具有增加的PEG浓度的1.5ml-10ml血液体积内进行固定。在血液收集1小时后，从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测18S rDNA基因的拷贝数，一式三份。
对于各10毫升K2EDTA全血固定剂混合物的组成：
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA、180μl DMPA、68.4mg K2EDTA、12μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至2ml
-PEG6000(1–1.5％)、BA、EDTA、Q-VD-OPh–至1.5ml：115、144和172mg PEG6000、115mg BA、155mg K2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.5ml
因此，与血液接触后在混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA、1.5％(v/v)DMPA、7.2mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh：1、1.25和1.5％(w/v)PEG6000、1％(w/v)BA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
结果
实施例10的结果示于图10。示出基于18S rDNA基因不同扩增子长度的在从8个供体抽血后第0天ccfDNA的绝对拷贝数的平均减少量，采用包括不同浓度的PEG6000(1.0％、1.25％或1.5％)和BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的本发明的固定组合物。图10示出在包含PEG的固定血液-血浆中18S rDNA基因的66bp和500bp片段的绝对拷贝数的减少以PEG浓度依赖形式发生。这表明当使用基于硅胶柱的核酸分离方案时，固定溶液中增加浓度的较高分子量PEG(PEG6000)可导致血浆中可检测的ccfDNA基因拷贝数的减少。
11.实施例11
在实施例11中，分析不同体积的包括高分子量PEG(PEG6000)与BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)组合的水性固定组合物的固定效果。平行分析采用包括两种酰胺(DMPA、BA)、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)组合的固定溶液孵育的血液。EDTA血液用作未固定参照。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用酰胺(DMPA和/或BA)、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)、含或不含PEG6000的组合在不同体积的水性溶液内进行固定。在血液收集1小时后，从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测18S rDNA基因的拷贝数，一式三份。
对于各10毫升K2EDTA全血固定剂混合物的组成：
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA、180μl DMPA、68.4mg K2EDTA、12μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至2ml
-PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh–至1ml：110mg PEG6000、110mg BA、147mg K2EDTA、11μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1ml
-PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh–至1.5ml：115mg PEG6000、115mg BA、155mgK2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.5ml
-PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh–至2ml：120mg PEG6000、120mg BA、162mg K2EDTA、12μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至2ml
因此，与血液接触后在混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA、1.5％(v/v)DMPA、7.2mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh至1、1.5或2ml：1％(w/v)PEG6000、1％(w/v)BA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
结果
在实施例11中，测试不同体积(1ml、1.5ml或2ml)的包括PEG6000与BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)组合的本发明固定溶液。示于图11的结果表明固定样本中18SrDNA基因的两测试片段的绝对拷贝数的减少取决于固定剂体积。因此，增加包含高分子量PEG的固定组合物的体积(因此增加固定组合物与血液的比例)导致血浆中可检测的ccfDNA基因拷贝数的减少。从所示的1ml固定溶液的结果可以看出，当使用较小体积时拷贝数没有明显减少。该结果是令人惊讶的，因为在包含样本的混合物中总浓度是相同的。
12.实施例12
实施例12示出在两不同体积(1.5ml和2.0ml)的水性溶液中，除了DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)，还包含高分子量聚乙二醇(PEG6000)和低分子量聚乙二醇(PEG300)组合的固定组合物的固定效果。EDTA血液用作未固定参比对照。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用PEG300和PEG6000、DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的混合物在不同体积1.5和2.0毫升的水性溶液中进行固定。从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。在血浆产生前残留血液在室温再存储六天。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测18S rDNA基因的拷贝数，一式三份。
固定剂混合物的组成(对于各10毫升K2EDTA全血)：
-0.5％PEG6000、2.5或5％PEG300、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh–2ml：60mg PEG6000、300或600μl PEG300、120μl DMPA、162mg K2EDTA、12μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至2ml
-0.5％PEG6000、2.5或5％PEG300、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh–1.5ml：57.5mg PEG6000、287.5μl或575μl PEG300、115μl DMPA、155mg K2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μlDMSO)，加水至1.5ml
因此，与血液接触后在混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-PEG6000、PEG300、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh–2ml：0.5％(w/v)PEG6000、2.5或5％(v/v)PEG300、1％(v/v)DMPA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
结果
图12将8个不同供体的定量实时PCR分析结果描述为相对于取血后时间点0(第0天)，在室温存储6天的源自8个供体的固定或未固定血液中的两种测试18S rDNA基因扩增子(66bp或500bp)的拷贝数变化(平均倍数变化)。全部固定样本示出18S rDNA基因扩增子的拷贝数倍数变化可比的低增加。在全部情况下获得的固定效果非常高。500bp片段的增加远低于2倍，甚至低于1.5倍，尽管样本存储了6天很久的固定期。
还测试各固定化组合物抽血后0天的18S rDNA扩增子的绝对拷贝数的变化来分析可检测的ccf DNA基因拷贝数是否减少。图13示出结果。可见全部测试固定组合物显示出与未固定样本相当或甚至更好的绝对拷贝数。因此，当使用基于硅胶柱核酸分离方法从固定样本分离核酸时，核酸收率不会降低。当使用较高浓度的高分子量聚乙二醇，观察到核酸收率下降，当使用高分子量聚乙二醇和低分子量聚乙二醇组合时，未见。使用各组合能够降低高分子量聚乙二醇的浓度，不损害低分子量聚乙二醇支持的固定效果。也可以较高浓度使用低分子量聚乙二醇，不损害涉及硅胶柱的后续核酸分离程序。观察到的升高的标准偏差是由于这样的事实，供体供体之间ccfDNA的量存在变化。
这表明高分子量聚乙二醇与低分子量聚乙二醇的组合对于获得的固定效果和能从固定样本分离的核酸的收率是非常有利的。因此，不同聚乙二醇的混合物可以组合使用，以有效地固定血样而不减少绝对ccfDNA拷贝数。
13.实施例13
在实施例13中，分析结合在含BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的水性固定溶液中的高分子量PEG(0.5％PEG6000)和低分子量PEG(2.5％或5％PEG300)的组合的固定效果。共同分析采用包括两种酰胺(DMPA,BA)、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的混合物的固定溶液孵育的血液。EDTA血液用作未固定参比对照。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用PEG300和PEG6000、BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的混合物在体积为1.5毫升的水性溶液中进行固定。从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。在血浆产生前残留血液在室温再存储六天。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测18S rDNA基因的拷贝数，一式三份。
固定剂混合物的组成(对于各10毫升K2EDTA全血)：
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA、180μl DMPA、68.4mg K2EDTA、12μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至2ml
-0.5％PEG6000、2.5或5％PEG300、BA、EDTA、Q-VD-OPh–1.5ml：57.5mg PEG6000、287.5μl或575μl PEG300、115mg BA、155mg K2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μlDMSO)，加水至1.5ml
因此，在全血/固定混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA、1.5％(v/v)DMPA、7.2mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG6000、PEG300、BA、EDTA、Q-VD-OPh–1.5ml：0.5％(w/v)PEG6000、2.5或5％(v/v)PEG300、1％(w/v)BA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
结果
图14将8个供体的qPCR分析结果示为相对于取血后时间点0(第0天)，在室温存储6天的源自供体的固定或未固定血液中的测试的66bp或500bp长18S rDNA基因扩增子的拷贝数平均变化(倍数变化)。然而，未固定的EDTA血液显示拷贝数平均倍数变化的升高，包含PEG的全部固定组合物仅表现为18S rDNA基因扩增子拷贝数平均倍数变化的低增长。结果表明测试的含PEG的固定组合物的相似固定能力。获得的固定效果优于含有BA、DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂的固定组合物，从而再次证明本发明取得的重要优势。
另外，可以确认，所使用的含高和低分子量PEG组合的固定溶液的描述的有利的固定能力不伴随ccfDNA拷贝数的减少。这是通过测试相同溶液在抽血后0天的血浆中18SrDNA扩增子的绝对拷贝数变化进行分析。图15示出获得的结果。获得的绝对拷贝数与包括BA、DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂的固定组合物相似。因此，在该测定中没有检测到绝对ccfDNA拷贝数的明显减少。因此，当使用涉及硅胶膜的标准核酸分离程序时，不同分子量PEG的组合，特别是高和低分子量PEG可以在含BA的不同体积的水性溶液中组合从而有效固定血液样本的胞外核酸群，特别是通过固定白血细胞，而不显著减少绝对ccfDNA拷贝数。
14.实施例14
在实施例14中，通过溶血实验测试水性固定溶液的效果。此处，分析高分子量PEG(0.5％PEG6000)和低分子量PEG(2.5％或5％PEG300)的组合与BA或DMPA以及EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的组合。共同分析采用包括两种酰胺(DMPA,BA)、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的混合物的固定溶液孵育的血液。EDTA血液用作未固定参比对照。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本，收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管内，采用PEG300和PEG6000、BA或DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的混合物在体积为1.5毫升的水性溶液中进行固定。从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。在血浆产生前残留血液在室温再存储六天。在分光光度计上通过检测414nm吸光度确定血红蛋白含量。
固定剂混合物的组成(对于各10毫升K2EDTA全血)：
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：180mg BA、180μl DMPA、68.4mg K2EDTA、12μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至2ml
-0.5％PEG6000、2.5或5％PEG300、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：57.5mg PEG6000、287.5μl或575μl PEG300、115μl DMPA、155mg K2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.5ml
-0.5％PEG6000、2.5或5％PEG300、BA、EDTA、Q-VD-OPh：57.5mg PEG6000、287.5μl或575μl PEG300、115mg BA、155mg K2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.5ml
因此，在全血/固定混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-BA、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：1.5％(w/v)BA、1.5％(v/v)DMPA、7.2mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG6000、PEG300、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh：0.5％(w/v)PEG6000、2.5或5％(v/v)PEG300、1％(v/v)DMPA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-PEG6000、PEG300、BA、EDTA、Q-VD-OPh：0.5％(w/v)PEG6000、2.5或5％(v/v)PEG300、1％(w/v)BA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
结果
图16示出分析的包括不同分子量PEG和或DMPA或BA的水性溶液对来自8个不同供体在抽血后0天和储存6天后血浆样品溶血的影响。图16示出随血液贮存0和6天后血浆部分414nm吸光度的增加，溶血增加。
如在图16中可以看出，EDTA对照实验揭示与存储0天初始时间点相比，血液样品储存6天后溶血的增加(在414nm处吸收的增加)。用包含0.5％的PEG6000(较高分子量的PEG)和5％浓度的PEG300(较低分子量的PEG)的混合物与EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)和BA或DMPA组合的固定组合物，溶血类似于EDTA参照样本。与此相反，使用较低浓度的PEG300(此处：2.5％)与0.5％PEG6000、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)和BA或DMPA组合的本发明的固定组合物，血液贮存6天后溶血减少。这证明溶血可以在包含高和低分子量PEG的平衡组合物的固定组合物中当溶于水性溶液时被阻止。
15.实施例15
预充在真空血液收集管(α管)内的包括PEG6000、BA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的固定组合物与包含基于使用甲醛释放剂作为固定剂的固定组合物的市售Streck无细胞DNA BCT管相比较。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA，预充有包括PEG6000、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)和BA或DMPA的本发明固定组合物量的α管以及Streck无细胞DNA BCT管内。从5毫升固定的或未固定的血液样本直接获得血浆。在血浆产生前残留血液在室温再存储3、6和10天。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测18SrDNA基因的拷贝数，一式三份。
不同管内固定剂混合物的组成(全部抽取体积10毫升血液)：
-EDTA–10ml喷雾干燥EDTA
-α1管(PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh)：137.5mg PEG6000、55mg BA、165mg K2EDTA、11μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.0ml
-α2管(PEG6000、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh)：110mg PEG6000、110μl DMPA、147mgK2EDTA、11μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.0ml
-Streck无细胞DNA BCT管：包含甲醛释放剂作为固定剂
因此，在全血/固定混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-EDTA管：1.8mg/ml K2EDTA
-α1管(PEG6000、BA、EDTA、Q-VD-OPh)：1.25％(w/v)PEG6000、0.5％(w/v)BA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-α2管(PEG6000、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh)：1.0％(w/v)PEG6000、1.0％(v/v)DMPA、15mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
-Streck无细胞DNA BCT管：浓度不适用
结果
结果示于图17和18中。相对于从八位血液供体抽血后时间点0(第0天)，分析在室温存储3、6或10天的8个供体的固定或未固定血液中18S rDNA基因的66bp片段(图17)和500bp片段(图18)的拷贝数变化(平均倍数变化)。线条表示每种条件八个供体的拷贝数平均倍数变化的相应标准偏差。如图17和18所示，两种测试的固定组合物，包括PEG6000、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)和BA或DMPA，对固定血液中的胞外核酸群非常有效。对于所有测试时间点，18S rDNA的66bp片段的拷贝数的平均倍数变化停留在时间点零的基础水平(倍数变化约1.0)。图18示出18S rDNA基因的500bp片段水平相当的结果，即细胞破碎时释放的细胞核酸的试验片段在测试时间段停留在时间点零的状态。这种固定效果与使用Streck无细胞DNA BCT管的结果相当。因此，本发明的固定组合物通过减少从白血细胞释放胞内核酸如特别是基因组DNA，有效固定血液样本中的胞外核酸群，与包括甲醛释放剂的Streck无细胞DNA BCT管相似。然而，如以上所解释的，使用释放甲醛的物质有缺点，因为它们通过诱导核酸分子之间或蛋白质和核酸之间的交联损害胞外核酸分离的效率。因此，必须使用特定的核酸分离方法。基于使用聚氧乙烯聚合物的本发明的固定组合物，不涉及使用这种交联物质，具有比基于交联的固定技术具有重要优势。
16.实施例16
分析结合在含BA或DMPA、EDTA和半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)的水性固定溶液中的不同高分子量PEG(0.5％PEG6000、PEG10000或PEG20000)与低分子量PEG(3.5％PEG300)组合的固定效果。固定助剂预充入真空血液收集管(α管)。EDTA血液用作未固定参比对照。
血液收集和固定
来自八个供体10毫升全血样本收集在10毫升喷雾干燥K2EDTA管和预充有包括或PEG6000、PEG10000或PEG20000，以及PEG300、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)和BA或DMPA的本发明固定组合物量的α管内。从5毫升固定的或未固定的血液样本快速生成血浆。在血浆产生前残留血液在室温再存储六天。从2毫升血浆纯化ccfDNA，通过实时PCR检测18SrDNA基因的拷贝数，一式三份。
不同管内固定剂混合物的组成(全部抽取体积10毫升血液)：
-EDTA(未固定的)–18mg喷雾干燥EDTA
-α3管(0.5％PEG6000、3.5％PEG300、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh)：57.5mg PEG6000、402.5μl PEG300、115μl DMPA、152mg K2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.5ml
-α4管(0.5％PEG6000、3.5％PEG300、BA、EDTA、Q-VD-OPh)：57.5mg PEG6000、402.5μl PEG300、115μg BA、152mg K2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.5ml
-α5管(0.5％PEG10000、3.5％PEG300、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh)：57.5mg PEG10000、402.5μl PEG300、115μl DMPA、152mg K2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.5ml
-α6管(0.5％PEG10000、3.5％PEG300、BA、EDTA、Q-VD-OPh)：57.5mg PEG10000、402.5μl PEG300、115μg BA、152mg K2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.5ml
-α7管(0.5％PEG20000、3.5％PEG300、DMPA、EDTA、Q-VD-OPh)：57.5mg PEG20000、402.5μl PEG300、115μl DMPA、152mg K2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.5ml
-α8管(0.5％PEG20000、3.5％PEG300、BA、EDTA、Q-VD-OPh)：57.5mg PEG20000、402.5μl PEG300、115μg BA、152mg K2EDTA、11.5μl Q-VD-OPh(1mg溶于388μl DMSO)，加水至1.5ml
因此，在全血/固定混合物中获得以下终浓度的不同组分：
-未固定的：1.8mg/ml K2EDTA
-PEG6000、PEG10000或PEG20000、PEG300、DMPA或BA、EDTA、Q-VD-OPh–1.5ml：0.5％(w/v)PEG6000(或PEG10000、或PEG20000)、5.5％(v/v)PEG300、1％(v/v)DMPA或(w/v)BA、13,2mg/ml K2EDTA、5μM Q-VD-OPh
结果
结果示于图19和20。图19示出相对于时间点0(第0天)，在室温存储6天来自8个供体的固定或未固定血液中18S rDNA基因的66bp片段或500bp片段的拷贝数变化(平均倍数变化)。图20示出刚抽血后在第0天血浆中的绝对拷贝数。如图19所示，还包括PEG300、EDTA、半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-OPh)和BA或DMPA的组合物中的分子量至多20.000的PEG对固定血液中的胞外核酸群非常有效。与未固定的EDTA血液相反，对于α管3-8的固定血液，存储6天后，18S rDNA的66bp片段和500bp片段的拷贝数的平均倍数变化留在时间点零的天存储的基础水平(倍数变化约1.0)。此外，与刚抽血后来自未固定的EDTA的血浆相比，高和低分子量PEG的平衡组合物并没有减少ccfDNA的绝对拷贝数(参见图20)，从而表明可以从固定样本有效地分离胞外核酸。与未固定参照样本相比，固定样本中绝对拷贝数较低是因为这样的事实，所获得的血浆被液体固定组合物稀释。由于这种稀释，固定样本中核酸的初始量是较低的。
17.实施例17
本发明的固定技术也与基于阴离子交换的核酸分离方案相容。从获自固定血液样本的血浆分离胞外核酸。采用在水中包括K2EDTA、Q-VD-OPH、DMPA、PEG 10000、PEG300的固定组合物进行固定。采用QIAamp循环核酸试剂盒(凯杰)，根据制造商的说明(2毫升血浆体积，60微升洗脱体积)从固定的血浆样本分离胞外核酸。或者采用包含阴离子交换基(叔胺基)的磁粒作为核酸结合固相从固定的血浆样本(2ml)分离胞外核酸。样本被破碎并在酸性pH(4.5)发生结合，洗涤结合的核酸三次并采用75微升碱性洗脱缓冲液(pH 12.5)洗脱。采用自动系统(QIAsymphony)执行方案。
用基于阴离子交换的核酸方案获得的核酸(18s rDNA(66bp)和18s rDNA(500bp))产率与采用QIAamp循环核酸试剂盒通过PCR分析(相对基因组DNA稀释系列以确定拷贝数)获得的结果(设定为100％)相当。下表示出结果。
基于阴离子交换的核酸分离方案 QIAamp循环核酸试剂盒
18srDNA(66bp) 98.64 100.00
18s rDNA(500bp) 88.04 100.00
可见，采用基于阴离子交换的核酸分离方案可以从固定样本以高产率获得胞外核酸。

Claims (33)

1.一种用于固定包含在含细胞生物样本中的胞外核酸群的方法，包括将所述含细胞生物样本与作为固定剂的至少一种聚氧乙烯聚合物或作为固定剂的乙二醇接触的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯聚合物为聚乙二醇。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯聚合物为分子量至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量在选自下组的范围内：1500-50000、2000-40000、2500-30000、2500-25000、3000–20000和3500–15000。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，在所述含细胞生物样本与所述高分子量聚氧乙烯聚合物以及任选的用于固定的其他助剂接触后，得到的混合物包括浓度范围选自下组的高分子量聚氧乙烯聚合物：0.05％-4％(w/v)、0.1％-3％(w/v)、0.2％-2.5％(w/v)、0.25％-2％(w/v)、0.3％-1.75％(w/v)和0.35％-1.5％(w/v)，或选自下组：0.25％-1.5％(w/v)、0.3％-1.25％(w/v)、0.35％-1％(w/v)和0.4％-0.75％(w/v)。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯聚合物的分子量低于1500，优选为分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯聚合物为分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物，且优选地，分子量在选自下组的范围：100-800、150-700、200–600和200–500。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在所述含细胞生物样本与所述聚氧乙烯聚合物以及任选的用于固定的其他助剂接触后，得到的混合物包括聚氧乙烯聚合物，如分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物，浓度范围选自下组：0.5％-10％、1.5％-9％、2％-8％、2-7％、2.5％-7％和3％-6％。
9.如权利要求3-8中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述含细胞生物样本与分子量至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物和分子量为1000或更低的低分子量聚氧乙烯聚合物接触。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述含细胞生物样本与所述高分子量聚氧乙烯聚合物以及任选的用于固定的其他助剂接触后，得到的混合物包括：
-高分子量聚氧乙烯聚合物，浓度范围选自下组：0.1％-3％(w/v)、0.2％-2.5％(w/v)、0.25％-2％(w/v)、0.3％-1.75％(w/v)和0.35％-1.5％(w/v)；或选自下组：0.25％-1.5％(w/v)、0.3％-1.25％(w/v)、0.35％-1％(w/v)和0.4％-0.75％(w/v)；和
-低分子量聚氧乙烯聚合物，浓度范围选自下组：0.5％-10％、1.5％-9％、1.75％-8％、2％-7％和2.5％-6％。
11.如权利要求1-10中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述含细胞生物样本为血液，且其中所述血液样本还与抗凝剂，优选螯合剂接触。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述血液样本与高分子量聚氧乙烯聚合物、低分子量聚氧乙烯聚合物和抗凝剂接触，其中，所述高分子量聚氧乙烯聚合物分子量处于选自下组的范围：3000-40000、2500–25000和4000–20000；所述低分子量聚氧乙烯聚合物分子量处于选自下组的范围：200-800、200–600和200–500，
其中，在所述血液样本与所述高和低分子量聚氧乙烯聚合物、抗凝剂以及任选的用于固定的其他助剂接触后，得到的混合物包括浓度范围为2％-7％，优选为2.25％-6％的低分子量聚氧乙烯聚合物和浓度范围选自下组的高分子量聚氧乙烯聚合物：0.2％-1.5％(w/v)、0.3％-1.25％(w/v)和0.4(w/v)-0.75％(w/v)。
13.如权利要求1-12中一项或多项所述的方法，其特征在于，为固定，所述包含细胞的样本还与作为固定剂的至少一种半胱天冬酶抑制剂和/或一种或多种伯、仲或叔酰胺接触。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述伯、仲或叔酰胺为式1所示的化合物
其中，R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，更优选C1-C2烷基；R2和R3相同或不同，选自氢和烃基，优选烷基，具有1-20个原子的碳链长度，以直链或支链形式；和R4是氧、硫或硒，优选地R4是氧。
15.如权利要求1-14中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述包含细胞的样本与丁酰胺和/或N,N-二烷基丙酰胺接触，其中所述N,N-二烷基丙酰胺优选为N,N-二甲基丙酰胺。
16.如权利要求1-15中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述含细胞生物样本，其优选是血液样本或源自血液的样本如血浆或血清，与下组接触：
a)至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量至少1500，优选为2000–40000，更优选2000-30000、2500–25000或3000-20000；
b)一种或多种式1所示的化合物，优选地浓度使得与含细胞生物样本的混合物中的浓度范围为0.25％-5％、0.3％-4％、0.4％-3％、0.5％-2％或0.75％-1.5％；
c)至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选泛半胱天冬酶抑制剂，更优选Q-VD-Oph，优选地浓度使得与含细胞生物样本的混合物中的半胱天冬酶抑制剂的浓度范围为0.1μM-20μM，更优选0.5μM-10μM，更优选1μM-10μM，更优选3μM-7.5μM；
d)任选的至少一种其他聚氧乙烯聚合物，其分子量低于使用的所述高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量至少100、优选至少200、至少300或至少400，其中所述其他聚氧乙烯聚合物优选是低分子量聚氧乙烯，其分子量为1000或更低，优选分子量为200-800或200-600；
e)任选的螯合剂，更优选EDTA。
17.如权利要求14-16中一项或多项所述的方法，其特征在于，为固定，所述包含细胞的样本，其优选为血液样本，与下组接触：
a)至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量至少3000；
b)一种或多种式1所示的化合物；
c)至少一种半胱天冬酶抑制剂；
d)任选至少一种低分子量聚氧乙烯聚合物，分子量为1000或更低；
e)任选地螯合剂，优选EDTA，
其中，由于固定，减少了从包含在包含细胞的样本内的细胞释放基因组DNA进入样本的无细胞部分。
18.如权利要求1-17中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述包含细胞的样本为血液样本，其与下组接触：
a)至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量为3000-40000、3000–30000或3500–25000；
b)一种或多种式1所示的化合物；
c)至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选泛半胱天冬酶抑制剂，更优选Q-VD-OPh；
d)至少一种低分子量聚氧乙烯聚合物，分子量为1000或更低，优选为100-800、200–600或200–500；
e)抗凝剂，其优选是螯合剂，优选EDTA，
其中，所述血液样本与所述助剂以及任选的用于固定的其他助剂接触后，得到的混合物包括：
-高分子量聚氧乙烯聚合物，浓度为0.2％-1.5％(w/v)、0.25％-1.25％(w/v)、0.3％-1％(w/v)或0.4％-0.75％(w/v)；
-一种或多种式1所示的化合物，浓度为0.3％-4％，优选0.5-3％、0.5-2％或0.75-1.5％；
-半胱天冬酶抑制剂，浓度为1μM-10μM，优选3μM-7.5μM，和
-低分子量聚氧乙烯聚合物，浓度为1.5％-10％，优选2％-6％。
19.如权利要求1、11和13-15中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述方法包括所述含细胞生物样本与作为固定剂的乙二醇接触的步骤，其中任选地，
-所述含细胞生物样本还与至少一种聚氧乙烯聚合物接触，优选地，如权利要求1-10和12中一项或多项所限定；和/或
-其中，所述含细胞生物样本还与一种或多种伯、仲或叔酰胺和/或至少一种半胱天冬酶抑制剂接触，其中优选地，所述酰胺如权利要求14或15限定。
20.如权利要求1-19，特别是11-19中一项或多项所述的方法，其特征在于，用于固定的化合物包含在含水的固定组合物中。
21.如权利要求1-20中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述方法具有一或多个以下特征：
i)固定不涉及使用其浓度将诱导或促进有核细胞裂解的助剂；
ii)固定不涉及使用诱导蛋白-核酸和/或蛋白-蛋白交联的交联剂，如甲醛、福尔马林、多聚甲醛或甲醛释放剂；
iii)所述固定不使用有毒试剂。
22.一种用于从固定的含细胞生物样本分离胞外核酸的方法，包括以下步骤：
a)根据权利要求1-21中一项或多项限定的方法固定所述含细胞生物样本；和
b)分离胞外核酸。
23.一种适用于固定含细胞生物样本的组合物，包括：
i)作为固定剂的聚氧乙烯聚合物，或
ii)作为固定剂的乙二醇，
和选自下组的一种或多种其他助剂
-一种或多种伯、仲或叔酰胺；
-半胱天冬酶抑制剂；
-抗凝剂和/或螯合剂。
24.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含作为固定剂的聚氧乙烯聚合物，其是分子量至少1500的高分子量聚氧乙烯聚合物，且还包括选自下组的一种或多种，优选两种或多种的其他助剂：
-至少一种其他聚氧乙烯聚合物，其分子量比高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量低至少100、优选至少200、至少300或至少400，其中所述其他聚氧乙烯聚合物优选是分子量为1000或更小的低分子量聚氧乙烯聚合物；
-一种或多种伯、仲或叔酰胺；
-半胱天冬酶抑制剂；
-抗凝剂和/或螯合剂。
25.如权利要求23或24所述的组合物，其特征在于，所述聚氧乙烯聚合物为聚乙二醇，优选未取代聚乙二醇。
26.如权利要求23-25中一项或多项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括半胱天冬酶抑制剂和一种或多种伯、仲或叔酰胺，如式1所示：
其中R1是氢或烷基，优选为C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基，更优选C1-C2烷基；R2和R3相同或不同，选自氢和烃基，优选烷基，具有1-20个原子的碳链长度，以直链或支链形式；和R4是氧、硫或硒，优选R4为氧，且其中优选地，所述组合物包括丁酰胺和/或N,N-二烷基丙酰胺，其中所述N,N-二烷基丙酰胺优选为N,N-二甲基丙酰胺。
27.如权利要求24-26中一项或多项所述的组合物，其特征在于，所述高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量选自下组：1500-50000、1500-40000、2000-30000、2500-25000、3000-20000、3500–15000和4000–10000。
28.如权利要求24-27中一项或多项所述的组合物，其特征在于，所述其他聚氧乙烯聚合物为低分子量聚氧乙烯聚合物，分子量为1000或更低，其中，优选地，所述分子量选自下组：100-1000、150-800、150-700、200-600、200–500和200–400。
29.如权利要求23-28中一项或多项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括优选是高分子量聚氧乙烯聚合物的聚氧乙烯聚合物，至少一种半胱天冬酶抑制剂和抗凝剂以及任选地包括至少一种伯、仲、叔酰胺。
30.如权利要求29所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括至少一种伯、仲、叔酰胺，其中优选地，所述酰胺是式1所示的化合物，更优选丁酰胺和/或N,N-二烷基丙酰胺，优选N,N-二甲基丙酰胺。
31.如权利要求24-30中一项或多项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括：
a)至少一种高分子量聚氧乙烯聚合物，分子量至少1500，优选为2000–40000，更优选2500-30000、2500–25000或3000–20000；
b)一种或多种式1所示的化合物；
c)至少一种半胱天冬酶抑制剂，优选泛半胱天冬酶抑制剂，更优选Q-VD-OPh；
d)至少一种其他聚氧乙烯聚合物，其分子量比使用的高分子量聚氧乙烯聚合物的分子量低至少100、优选至少200、至少300或至少400，其中所述其他聚氧乙烯聚合物优选是分子量为1000或更小的低分子量聚氧乙烯聚合物，优选分子量为200-800或200-600；
e)任选地抗凝剂和/或螯合剂，更优选EDTA。
32.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括乙二醇，以及任选地
-还包括至少一种半胱天冬酶抑制剂和至少一种伯、仲、叔酰胺，优选地，如权利要求26中限定；和/或
-包括抗凝剂，优选螯合剂，和/或聚氧乙烯聚合物，如以上权利要求中一项或多项中限定。
33.如权利要求23-32中一项或多项所述的组合物，其特征在于，所述组合物具有一或多个以下特征：
a)它能固定细胞并减少从包含在含细胞生物样本中的细胞释放基因组DNA进入样本的无细胞部分；
b)它能减少存在于固定样本中的核酸，特别是基因组DNA的降解；
c)它能减少或防止包含在生物样本中的胞外DNA群被来自包含在固定样本中的细胞的基因组DNA污染；
d)它能减少或防止包含在生物样本中的胞外核酸群被来自包含在固定样本中的细胞的胞内核酸污染；
e)所述固定组合物不包含其浓度将诱导或促进细胞裂解的助剂；
f)所述固定组合物不包含诱导蛋白-DNA和/或蛋白-蛋白交联的交联剂，如甲醛、福尔马林、多聚甲醛或甲醛释放剂；
g)所述固定组合物不包含有毒试剂；
h)它能固定包含在含细胞生物样本内的胞外核酸群，不需离心，优选在室温选自下组的一段时间：至少三天、至少四天、至少五或至少六天；和/或
i)所述组合物还包含待固定的包含细胞的样本，优选是血液。
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