JP2010536372A - invivo細胞死を検出するためにmiRNAを使用する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2007年8月22日に出願された、米国仮出願第60/965,871号(この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
本発明は、体液中の無細胞低分子RNA、特にマイクロRNA(miRNA)配列の単離および検出用の非侵襲的方法を提供する。より具体的には、本発明は、臨床診断および治療モニタリング用に、miRNAレベルに関して尿および他の体液を分析することによる、in vivo細胞死を検出する方法を含む。
用語「プライマー」は、プライマー延長が開始される条件下に置かれたとき、合成の開始地点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチド「プライマー」は精製制限断片の消化などと同様に自然に存在する可能性があり、または合成によって生成することができる。
尿からのmiRNAの抽出:
採尿:これらの実験用に、患者またはボランティア由来の尿検体を滅菌110ml採尿カップ中に回収し、最終濃度10mMと150mMの間、好ましくは50mMまでEDTAをすぐに補充した。検体は−80℃で10〜50mlのアリコート中に保存した。検体回収直後、EDTAを加える前に、尿の任意選択の濾過をStericup(商標)(Millipore、Vacuum Driven Filtration System、0.45μDurapore(商標)フィルター)で実施した。
これらの実験用に、1.2mlのTRIzolLSを0.4mlの血清に加え、混合物は10分間14,000rpmで遠心分離にかけた。上清は2mlのエッペンドルフチューブに移し、0.3mlのクロロホルムを加え、混合物は15秒間振とう処理した。15分間14,000rpmでの遠心分離後に、上清は5mlのチューブに移し、エタノールを70%の最終濃度まで加えた。混合物は真空マニホールド上のQuiagen Quickカラムに充填し、カラムは0.5mlの2MLiCl−80%EtOHで2回、0.5mlの80%エタノール−80mM酢酸ナトリウム(pH5.0)で1回、および最後に0.5mlの95%エタノールで洗浄した。カラムは1.5mlのエッペンドルフチューブにおいて3分間14,000rpmで遠心分離にかけ、かつRNAは40μlのH2Oで溶出した。
この実施例は、死細胞由来のmiRNAが腎臓壁を通過し、かつ患者の尿中で検出することができることを実証する。
この実施例中で分析したマイクロRNA種は、3つの異なる型、すなわち全てまたは多数の組織中で発現される遍在的miRNA、組織特異的miRNA、および発現が特定組織または細胞型において有意に変わるmiRNAに分類することができる。表1によって示すように、20の異なるmiRNAを16の健常ボランティアおよび登録ドナーの尿から得て、市販のmiRNA発現分析キット(ABI)を使用しリアルタイムRT−PCRによって後に検出した。対応する合成miRNAオリゴヌクレオチドは標準として使用した。反応は供給者によって勧告されたように厳密に実施した。
この実施例は、ヒト上咽頭癌(NPC)細胞由来のmiRNAが患者の腎臓壁を通過することができ、かつリアルタイムRT−PCRによって患者の尿中で検出することができることを実証する。
幾つかのウイルスもmiRNAをコードし生成することは知られている。エプスタインバーウイルス(EBV)は上咽頭癌(NPC)の発生に関与するので、本発明の系を使用して、NPC細胞由来のウイルスmiRNAが患者の尿に到達し、そこで検出することができるかどうか調べた。NPC患者由来の尿試料を回収し、本出願の実施例1中に記載した手順に従い保存した。EBV感染は尿中のウイルス特異的DNA配列の検出によって確認した。健常ドナーから回収した尿はEBV特異的DNA配列に陰性であった。2つのEBV特異的miRNA、BART3−3pおよびBART1−3pをこの試験中で分析した:
この実施例は、患者の尿中のニューロン特異的miRNAの濃度の測定によって、in vivoで脳卒中によって引き起こされる神経細胞死を記録することができることを実証する。
これらの実験用に、脳卒中を有する患者を、脳特異的miRNAまたは脳卒中後に脳内で過剰発現されるmiRNAの、濃度の変化の分析用に調べた。どの脳細胞型およびどの脳領域において、これらのmiRNAが発現されるかは現在知られていないので、9個の異なる脳特異的miRNAを試験した。
A.hsa−mir−128a
B.hsa−mir−9
C.hsa−mir−127
D.hsa−mir−137
E.hsa−mir−129
F.hsa−mir−219
G.hsa−mir−218 。
この実施例は、脳卒中後の患者の尿中のmiRNA濃度の動態は、疾患の結果に関する情報を与えることを実証する。
この実験用に、脳卒中を有する患者を、脳特異的miRNAの濃度の変化と疾患の発生の間の相関関係の分析用に調べた。
アルツハイマー病の診断
アルツハイマー病は、特に皮質および海馬中の、ニューロンの死によって引き起こされる進行性神経疾患である。その診断は神経学的検査および認知症の他の原因の排除に基づき、一方で確定診断は検視解剖でのみ実施することができる。本発明は、アルツハイマー病を特徴付ける過剰な神経死が、患者の尿から単離した特異的脳miRNAのレベルを測定することによって、モニターすることができることを実証する。
パーキンソン病
パーキンソン病は、患者の運動能力および話力を悪化させることが多い中枢神経系の変性疾患である。本発明は、パーキンソン病を特徴付けるドーパミン作動性ニューロンの過剰な神経死が、患者の尿から単離した特異的脳miRNAのレベルを測定することによって、モニターすることができることを実証する。
妊娠関連または胎児疾患の出生前検診
miRNA分子に関する腎臓壁の透過性の主たる発見は、先天性疾患の完全に非侵襲的な出生前診断を実施するための母体尿の使用に関する突破口を開く。このような非侵襲的スクリーニングは以下のように実施することができる。
ダウン症候群
これらの実験用に、正常胎児を妊娠した女性とダウン症候群胎児を妊娠した女性の間の母体尿中の脳特異的miRNAの濃度の差を調べた。
Claims (21)
- 様々な組織および器官中のin vivo細胞死を評価するために、体液中の細胞、組織および/または器官特異的無細胞miRNAを検出および定量する方法であって、in vivo細胞死が特定組織および/または器官の障害と関係があり、該方法は:
(a)対象から体液試料を得ること、および
(b)該体液試料をmiRNAの1つまたは複数の特異的配列に関して分析することを含み、該分析が該特異的miRNA配列の一部分と実質的に相補的であるプライマーおよび/またはプローブを用いて該miRNAを検出するステップを含む、方法。 - 過剰または不十分なin vivo細胞死が特定組織の障害と関係がある、請求項1に記載の方法。
- 前記体液が尿である、請求項1に記載の方法。
- 前記尿試料の分析ステップが、ハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、単鎖の立体配座多型を分析するためのPCR、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される技法を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記尿試料中の核酸の分解を低減させる、請求項3に記載の方法。
- 核酸の分解の低減が、(1つまたは複数の)RNAse阻害剤の添加、熱不活性化によって、またはグアニジン−HCl、グアニジンイソチオシアネート、N−ラウロイルサルコシン、およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される化合物で前記尿試料を処理することによってヌクレアーゼ活性を阻害することを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記尿試料が膀胱中に12時間未満保持されている、請求項3に記載の方法。
- 前記体液が血清である、請求項1に記載の方法。
- 前記血清試料の分析ステップが、ハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、単鎖の立体配座多型を分析するためのPCR、およびリガーゼ連鎖反応からなる群から選択される技法を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記障害が病原体感染である、請求項1に記載の方法。
- 前記病原体がウイルスである、請求項10に記載の方法。
- 前記ウイルスがエプスタインバーウイルスである、請求項11に記載の方法。
- 前記障害が脳卒中である、請求項1に記載の方法。
- 前記障害がアルツハイマー病である、請求項1に記載の方法。
- 前記障害がパーキンソン病である、請求項1に記載の方法。
- 前記障害が妊娠および/または胎児の病状と関係がある、請求項1に記載の方法。
- 前記胎児性障害がダウン症候群である、請求項16に記載の方法。
- 組織または器官中の過剰な細胞死と関係がある障害の結果として、対象の泌尿器系以外の領域由来の無細胞miRNAを尿中において検出する方法であって、該方法は:
(a)対象から尿試料を得ること、および
(b)該尿試料をmiRNAの1つまたは複数の特異的配列に関して分析することを含み、該分析が該特異的miRNA配列の一部分と実質的に相補的であるプライマーおよび/またはプローブを用いて該miRNAを検出するステップを含む、方法。 - 体液中の特異的無細胞miRNAの定量分析による対象の疾患および/または治療モニタリングの方法であって、該方法は:
(a)対象から体液試料を定期的に得ること、および
(b)該試料を、対象とする細胞、組織または器官中で特異的である/過剰発現されるmiRNAの1つまたは複数の特異的配列に関して分析することを含み、該分析が該特異的miRNA配列の一部分と実質的に相補的であるプライマーおよび/またはプローブを用いて該miRNAを検出するステップを含む、方法。 - 前記体液が尿である、請求項19に記載の方法。
- 前記体液が血清である、請求項19に記載の方法。
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