CN102188719B - EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸在制备治疗鼻咽癌的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸的药物用途,具体涉及EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸在制备治疗鼻咽癌的药物中的应用,其中所述的反义寡聚核苷酸的序列是ACACCUGGUGACUAGUGGUGCG(SEQ ID NO:1)。本发明所述的反义寡聚核苷酸可以有效地与EB病毒成熟miRNA结合,阻断miRNA的表达及其相应的调控作用,从而抑制鼻咽癌细胞的侵袭和转移,且miRNA无免疫原性,有利于进一步应用于防治鼻咽癌的复发和转移。体现本发明所述用途的药物,可保护反义寡核苷酸免受核酸酶降解,延长作用时间,比商品用脂质体有更高的转染效率,有利于进一步的临床实际开发和应用。
Description
技术领域
本发明属于含有两个或多个单核苷酸单元的化合物领域,特别是涉及具有以核苷基的糖化物基团连接的单独的磷酸酯基或多磷酸酯基的化合物。
背景技术
鼻咽癌(NPC)是我国南方地区常见的头颈部恶性肿瘤,是头颈部肿瘤中复发率和转移率最高的疾病,颈部淋巴结转移率高达80%,治愈后5年内仍有20~30%患者出现鼻咽癌的复发和转移,是临床上导致死亡的主要因素之一,传统治疗手段如手术、放疗或化疗等对防治鼻咽癌的复发、转移效果不理想,相比较而言,应用生物治疗方法更适合第二阶段的治疗,其中基因疗法对防治鼻咽癌的复发、转移具有更重要的临床意义。
EB病毒(Epstein Barr virus,EBV)是一种γ疱疹病毒,几乎所有的未分化和低分化鼻咽癌都与EB病毒潜伏性感染有关。近来研究发现EB病毒编码的miRNA可参与调控EB病毒编码的基因和人宿主基因的表达EBV-miR-BART2能与编码病毒DNA聚合酶的基因BALF5的3`UTR完全互补。在裂解感染期大量病毒复制时,miR-BART2表达水平降低,对BALF5基因的分解作用减弱,有利于病毒复制循环。随着miR-BART2选择压力变化,BALF5表达降低,EBV感染细胞释放的病毒颗粒不断减少,感染进入潜伏状态(Nucleic Acids Res 37:1035-48,2009);EBV-miR-BHRFI-3与细胞IFN诱导的T细胞趋化因子CXCL-11/I-TAC的表达水平相关,推测CXCL-11/I-TAC是miR-BHRFl-3作用靶点,EB病毒可以此作为调节方式来干扰宿主的免疫监视和免疫清除作用(Cancer Res 68:1436-42,2008);EBV-miR-BART5能通过抑制宿主的凋亡前蛋白PUMAHl,上调P53的表达。如果从EBV感染的细胞中去除miR-BART5,将促进PUMA介导的凋亡作用,提示EBV能够抑制凋亡的发生,从而保护其感染的上皮细胞(J Exp Med 205:2551-60,2008,J Biol Chem 285:33358-70,2010);miR-BART6-5p能抑制EBNA2病毒癌基因的表达,而这种癌基因的表达在I型和II型潜伏状态(免疫低反应)向III型潜伏状态(免疫高反应)转化的过程中是不可缺少的,表明miR-BART6在EBV的感染和潜伏中发挥重要的调节作用(J Biol Chem 285:33358-70,2010)。由此可见,EB病毒miRNA一方面可作用于病毒本身的靶基因,促进病毒的感染和潜伏,另一方面也可以作用于宿主的靶基因,促进病毒逃避宿主细胞的免疫反应,并抑制宿主细胞的凋亡。
然而,有关EB病毒miR-BART3的作用及机制的研究却很少,Lo等(PNAS 104:16164-9,2007)报道3种EB病毒编码的miRNA(miR-BART1-5p,miR-BART16和miR-BART17-5p)可下调EB病毒的LMP1基因的表达。当LMP1受到病毒miRNA调控时,其下游信号途径会受到抑制,NF-KB表达降低,凋亡受到抑制,使EB病毒感染的细胞易向肿瘤发展(Cell Mol Immunol 4:185-96,2007)。另有报道EBV-miR-BART1可与BBLF4和LMP2A mRNA 3’端结合,从而达到调节病毒自身基因表达的目的(PNAS,1993,90:378-382)。重要的是,迄今为止,有关EB病毒miR-BART3与其他EB病毒miRNA促进鼻咽癌发生发展尤其是促鼻咽癌侵袭转移的作用仍未见任何报道。
纳米颗粒具有小尺寸效应、表面效应等优势,通过增强渗透和保留作用(EPR)可有效地靶向肿瘤区域,近年来研究纳米载药系统应用于肿瘤治疗成为热点(Biomacromolecules.11,3531-3538,2010)。纳米颗粒可包裹、浓缩、保护核苷酸,使其免受核酸酶降解;通过表面功能化,可连接特异靶向分子;体内循环时间明显长于普通大小颗粒,100nm以下的纳米颗粒能够逃避网状内皮系统的吞噬,从而延长给药时间,提高给药效果;合适的纳米基因药物既能够发挥阳离子聚合物的体外高效转染的优点,也可以有效避免体内实验过程中网状内皮系统的清除,提高治疗效果,因此将纳米技术应用于基因治疗具有很好的临床应用前景。粒径为1nm~150nm的金颗粒(AuNP)为惰性物质,无毒,制备方法简单,成本较低,具有特殊的光学性质以及良好的生物相容性和表面易于功能化等优点,可与药物分子、生物大分子等结合,广泛地应用于免疫标记、生物芯片、生物传感及药物输送系统等生物医学领域(Adv.Drug Deliv.Rev.60,1307-1315,2008)。近年来以金纳米颗粒为载体,表面进行适当功能化的基团修饰,再进一步负载AMO、siRNA等进行基因治疗获得了许多可喜的成果。美国西北大学研究团队,应用13nm左右金颗粒稳定多股巯基化寡核苷酸,使其进细胞能力大大增强,可绑定到目标信使的核酸(mRNAs)使其表达下调,并具有抗核酸酶性质,转染效率高于未经过修饰的寡核苷酸及商品用转染脂质载体Lipofectamine2000(Science.312,27-30,2006);Klibavov小组将带有低分子量PEI(2KDa)的金纳米颗粒作为载体转染质粒DNA进猴肾细胞COS-7,既增加了PEI的有效分子量又降低了其细胞毒性,转染效率较单一的PEI增加了12倍(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100(16):9138-9143,2003)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸的药物用途,体现该用途的药物可以有效地与EB病毒miR-BART3结合,阻断miR-BART3的表达及其对鼻咽癌侵袭转移的调控促进作用,从而达到抗鼻咽癌侵袭转移和治疗鼻咽癌的目的。
上述EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸的药物用途具体是,EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸在制备抗鼻咽癌侵袭转移的药物中的应用,其中所述的反义寡聚核苷酸的序列是ACACCUGGUGACUAGUGGUGCG(SEQ ID NO:1)。
本发明所述的反义寡聚核苷酸采用本领域常规方法合成,如,先采用核酸合成仪合成,再经简单的单链化学修饰(如,2’-甲氧修饰,变成增强型寡核苷酸)和HPLC纯化制得。本发明人推荐的方法由以下步骤组成:
1.反义寡核苷酸探针的设计
(1.1)根据国际公用的sanger mirbase数据库中的EB病毒miR-BART3序列,进行反义设计,获得反义寡核苷酸序列;其中探针设计的基本原则是,1)探针内部的发夹结构不超过2个;2)经BLAST比较与其它序列的相似性小于20%;3)经BLAST比较与其它基因序列的重复连续不超过3个碱基;
(1.2)采用21-23 nt 2`-甲氧修饰,得到SEQ ID NO:1所示序列;
2.反义寡核苷酸探针的合成及纯化
(2.1)将SEQ ID NO:1所示的序列输入3900合成仪自动合成,得到含SEQ ID NO:1所示序列的反义寡核苷酸的合成柱;
(2.2)对合成柱进行洗脱并收集洗脱液,然后,冰冻、干燥、去氨水,溶于9∶1的甲酞胺和TBE混合溶液中;
(2.3)上样于HPLC进行纯化;
(2.4)酒精沉淀、洗涤、真空抽干后得到序列为SEQ ID NO:1的反义寡核苷酸,-20℃保存备用。
本发明利用转移和侵袭试验(Transwell实验和Boyden小室实验)分析发现在鼻咽癌细胞中呈高度表达的EB病毒miR-BART3能明显促进鼻咽癌细胞的侵袭和转移。将EB病毒编码的miR-BART3转染进鼻咽癌细胞株CNE1后,与没有转染EB病毒miR-BART3的CNE1细胞株相比较,细胞穿透滤膜和基质膜的数量显著增多,表明该miRNA调控促进了鼻咽癌细胞的迁移和侵袭。
本发明人将EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸作用鼻咽癌细胞后,EB病毒miR-BART3表达水平发生显著性差异变化(Welch/F=104.400,P=0.000,24h和48h干扰抑制效率均可达到80%以上(表明其反义抑制作用至少能维持两天),表明经EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸作用的鼻咽癌细胞的转移侵袭能力出现明显降低,穿过透滤膜和基质膜的数量明显减少。
本发明所述的治疗鼻咽癌的药物由EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸和药学上可以接受的赋形剂组成。
为了提高药效,最好是先将EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸吸附在纳米球上,然后再加入适当的赋形剂制成所需要的剂型。
本发明所述的纳米球的粒径为30nm~50nm,该纳米球由含巯基的纳米金、分子量为2Kda的聚乙烯亚胺、反义寡核苷酸与聚乙二醇单甲醚和支链型聚乙烯亚胺的共聚物组成;所述的纳米球可以由以下方法制备得到:
(a)将含巯基的纳米金和质量为含巯基的纳米金10倍的分子量为2Kda的聚乙烯亚胺加入1mM NaCl溶液中,常温下反应30分钟,离心纯化分离得到聚乙烯亚胺包裹纳米金;
(b)将步骤(a)制备的聚乙烯亚胺包裹纳米金和质量为含巯基的纳米金80倍的序列为SEQ ID NO:1的反义寡聚核苷酸加入1mM NaCl溶液中,常温下反应30分钟,离心纯化分离得到负载反义寡核苷酸纳米金;
(c)将步骤(b)制备的负载反义寡核苷酸纳米金、质量为含巯基的纳米金6倍的聚乙二醇单甲醚和支链型聚乙烯亚胺的共聚物加入1mM NaCl溶液中,常温下反应30分钟,离心纯化分离得到纳米球其中,聚乙二醇单甲醚的分子量为2Kda,支链型聚乙烯亚胺的分子量为25Kda,且聚乙二醇单甲醚与支链型聚乙烯亚胺的物质的量之比为1∶1.5。
上述纳米球的制备方法中,所述的共聚物的制备方法可参照文献的报导(如:Macromolecules,35,6867-6874,2002)。
上述纳米球的制备方法中,所述的含巯基的纳米金的粒径为15~20nm。其中,所述的含巯基的纳米金可以依据本领域常用的方法制备,具体步骤可以参照文献的报导(如:ACS Nano,4(9):5505-5511,2010)。
本发明所述的反义寡核苷酸可阻断EB病毒编码的miRNA的复制、生存和表达,其碱基序列与反向互补的序列结合,具有比抗体更高的专一性,使鼻咽癌侵袭转移受到有效抑制,且miRNA无免疫原性,有利于更好地防治鼻咽癌的复发和转移。更进一步地,本发明将所述的反义寡核苷酸制备成纳米基因药物,以保护反义寡核苷酸免受核酸酶降解,延长作用时间,比商品用脂质体有更高的转染效率,有利于进一步的临床实际开发和应用。
附图说明
图1是本发明所述的EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸Transwell转移实验的直方图,图中Control为未加反义寡核苷酸的鼻咽癌细胞株Transwell转移实验结果,BART3-AMO是反义寡核苷酸作用后的鼻咽癌细胞株Transwell转移实验结果。
图2是本发明所述的EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸Boyden小室侵袭实验直方图,图中Control为未加反义寡核苷酸的鼻咽癌细胞株Boyden小室侵袭实验结果,BART3-AMO是反义寡核苷酸作用后的鼻咽癌细胞株Boyden小室侵袭实验结果。
具体实施方式
实施例1
1、含有EB病毒miR-BART3的鼻咽癌细胞株CNE1的制备;
细胞:
CNE1细胞株:购自湖南中南大学湘雅医学院中心实验室。
过表达miR-BART3的CNE1细胞制备:化学合成EB病毒miR-BART3前体分子序列(282bp),连接到含GFP表达的慢病毒载体pMAGic 4.0中,经pNL-EGFP/CMV/WPREDU3载体质粒、pCD/NL-BH*DDD包装质粒和pLTR-G质粒,在293T细胞中的包装,产生能表达EB病毒miR-BART7的慢病毒载体pMAGic-EB病毒miR-BART3。用此慢病毒载体转染鼻咽癌细胞株CNE1,经流式分筛,定量PCR证实,获得EB病毒miR-BART3稳定高表达的CNE1(含GFP表达)。具体步骤可以参照文献(南方医科大学学报2011;31(3):419)。
寡核苷酸:EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸的序列为SEQ ID NO:1,委托上海吉玛制药技术有限公司合成。
另外,对于EB病毒编码的miR-BART3及其反义寡核苷酸的生物活性实验,均用商品化脂质体Lipofectamine2000为载体进行转染。
EB病毒miR-BART3反义寡核苷酸抑制EB病毒miR-BART3活性的测定方法:
(1)细胞转染:取单层过表达miR-BART3的鼻咽癌细胞株,以不含抗生素的10%小牛血清完全培养基(PBR1640或DMEM)培养接种于6孔板,37℃,5%的CO2孵育过夜,次日,每孔用无血清培基稀释lipofectamine 2000,室温孵育5min,同时用无血清培基稀释EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸,混合稀释的lipofectamine 2000和稀释的EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸,室温下放置20min,6孔板细胞移去培基后,冲洗2次,加入2mL无血清培基后,将混合液加入每孔中轻轻混匀,37℃,5%的CO2培养箱孵育6h后,更换含有10%小牛血清全培养基,应用荧光定量PCR检测不同时间的转染水平。
(2)荧光定量PCR检测转染水平:所有用于RNA制备的器皿均经去RNase处理,所需液体均用灭活的DEPC水配制。细胞总RNA的抽提按照TRIzol试剂说明书进行。取对数生长期的鼻咽癌细胞株培养至细胞待测密度,用预冷的PBS洗2遍,加入1mL TRIzol,冰上静置5min后裂解液转移至1.5mL EP管,加入氯仿0.2mL,剧烈振摇15sec,室温放置5分钟后12000rpm 4oC离心15min,吸出上层水相,下层转移至另一1.5ml EP管,按等比例加入异丙醇,混匀后室温静置5min,离心30min,75%乙醇洗涤沉淀,离心10分钟,下层在超净台中自然干燥5-10min,待酒精挥发后用适量DEPC水溶解,-80℃保存备用。RNA标本稀释后测定A260和A280,计算RNA浓度和纯度,在1%的琼脂糖凝胶中电泳检测RNA有无降解。检测完好的RNA用于进行逆转录反应,按照TIANScript cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA的合成。应用荧光定量PCR检测不同时间的转染水平。
2、EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸抗鼻咽癌细胞侵袭的实验;
用matrigel在Transwell上室制备人工基底膜,转染前后各组细胞用无血清培基稀释成密度为1×106/ml的细胞悬液,100μL细胞悬液加入Transwell上室,下室加600μL条件培养液,37℃5%,CO2培养箱孵育36h后,取出Transwell小室,吸弃液体,用棉签擦净基底膜胶,PBS漂洗后甲醛固定30min,苏木精染色。镜下计数(平均计数4个视野),以上实验独立重复3次。结果如图1所示。图1表明,与带有EB病毒-miR-BART1-5p的鼻咽癌细胞株相比较,经EB病毒miR-BART3的反义寡核苷酸作用后的细胞,细胞穿透滤膜数量减少,具有显著差异(P<0.0000),说明EB病毒miR-BART3的反义寡核苷酸抑制了鼻咽癌细胞的迁移。
3、EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸抑制鼻咽癌细胞转移的实验。
与Transwell侵袭实验相同,只是Transwell上室不需用人工基底膜覆盖,实验独立反复3次。结果如图2所示。图2表明,与带有EB病毒miR-BART3的鼻咽癌细胞株比较,经EB病毒miR-BART3的反义寡核苷酸作用后的细胞,细胞穿透基质膜数量减少,具有显著差异(P<0.0000),说明EB病毒miR-BART3的反义寡核苷酸抑制了鼻咽癌细胞的侵袭。
从图1和图2可以知道EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸抑制了鼻咽癌细胞的迁移和侵袭,具有治疗鼻咽癌效果。
实施例2
1.纳米球的制备
1.1制备聚乙烯亚胺包裹纳米金
将含巯基的纳米金加入浓度为1mM的NaCl溶液,调整纳米金浓度为0.1mg/mL;向反应液中加入聚乙烯亚胺(PEI,Mw=2k)至聚乙烯亚胺浓度为1.0mg/mL,常温反应30分钟,用157500xg离心10分钟,重复2次,制备得到聚乙烯亚胺包裹金纳米;将聚乙烯亚胺包裹纳米金重悬于浓度为10mM的NaCl溶液,得到0.1mg/mL聚乙烯亚胺包裹纳米金NaCl溶液,待用;
其中含巯基的纳米金可以依据以下方法制备得到:
取100mL氯金酸水溶液(0.01%),加热至沸,搅拌下准确加入1%柠檬酸三钠水溶液2mL,金黄色的氯金酸水溶液在5分钟内变为橙红色,继续煮沸15分钟,冷却后,用220nm的滤膜除去大粒子,用蒸馏水恢复到原体积;取新制备的金溶胶溶液用1N的NaOH溶液调整pH值为11,加入11-巯基十一烷酸至终浓度为0.1mg/mL,常温搅拌过夜,用离心转速157500xg离心10分钟,重复2次,得到含巯基纳米金。经TEM检测含巯基的纳米金粒径为15~20nm。
1.2.制备负载反义寡核苷酸的纳米金
取0.1mg/mL聚乙烯亚胺包裹纳米金NaCl溶液5.5mL,加入序列为SEQ ID NO:1的EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸4.0mg,常温下搅拌30分钟,用157500xg离心10分钟,重复2次,得到负载反义寡核苷酸金纳米。将负载反义寡核苷酸纳米金重悬于浓度为10mM的NaCl溶液,得到0.1mg/mL负载反义寡核苷酸纳米金NaCl溶液,待用;
1.3.制备纳米球
取0.1mg/mL负载反义寡核苷酸纳米金NaCl溶液10mL,加入分子量为2Kda的聚乙二醇单甲醚3.3mg和分子量为25Kda的支链型聚乙烯亚胺62.6mg,常温反应30分钟,用157500xg离心10分钟,重复2次,得到纳米球。将纳米球加入浓度为10mM的NaCl溶液,密封保存。
2.纳米球性能检测
应用紫外光分光光度计测定纳米球在519nm和260nm处的显示吸收峰。其中,519nm处吸收峰是纳米金的特征吸收峰;260nm处吸收峰是核酸特征吸收峰。
利用透射电镜(TEM)观察负载药物纳米球,粒径为30~50nm。
3.抑制鼻咽癌细胞中EB病毒-miR-BART3效果
序列SEQ ID NO:1的反义寡核苷酸及负载该反义寡核苷酸纳米球抑制鼻咽癌细胞CNE1中EB病毒-miR-BART3的表达及有效作用时间
3.1纳米球抑制鼻咽癌细胞中EB病毒miR-BART3实验:
取单层过表达miR-BART3的鼻咽癌CNE1细胞株,以不含抗生素的10%小牛血清PBR1640培养基培养接种于6孔板,37℃,5%的CO2孵育过夜,次日,6孔板细胞移去培基后,冲洗2次,每孔加入2mL用无血清培基稀释载有反义寡核苷酸纳米球(含有反义寡核苷酸5nmol),轻轻混匀,37℃,5%的CO2培养箱孵育6h后,更换含有10%小牛血清全培养基。同时,将Lipofectamine2000转染EB病毒miR-BART3反义寡核苷酸作为对照样,未转染EB病毒miR-BART3反义寡核苷酸的细胞作为空白样,进行对比实验。在整个实验过程中,分别收集转染前、转染后24h和48h时的细胞。
3.2.应用荧光定量PCR检测对EB病毒miR-BART3的抑制效果和有效作用时间
3.2.1对收集的细胞分别进行总RNA抽提
取对数生长期的鼻咽癌细胞株培养至细胞待测密度,用预冷的PBS洗2遍,加入1mLTRIzol,冰上静置5min后裂解液转移至1.5mL EP管,加入氯仿0.2mL,剧烈振摇15sec,室温放置5分钟后12000rpm 4℃下离心15min,吸出上层水相,下层转移至另一1.5ml EP管,加入等比例异丙醇,混匀后室温静置5min,离心30min,75%乙醇洗涤沉淀,离心10分钟,下层在超净台中自然干燥5~10min,待乙醇挥发后用DEPC水溶解得到总抽提RNA,-80℃保存备用。总抽提RNA标本稀释后测定A260和A280,计算RNA浓度和纯度,在1%的琼脂糖凝胶中电泳检测总抽提RNA有无降解。
3.2.2.荧光定量PCR检测EB病毒miR-BART3的表达
3.2.2.1.依照TaqMan MiRNA Reverse Transcription Kit说明书,对总抽提RNA标本进行逆转录反应,合成cDNA
(a)在DEPC水处理过的EP管中先加入10×RT buffer 1.5μl、dNTP 0.15μl、RNaseInhibitor 0.19μl、RT enzyme 1μl;再加入3μl特异性RT primer、5μl总抽提RNA标本,轻轻混匀。
(b)冰上放置5min后,置于T1 Thermocycler PCR仪上,设置反应条件为:16℃30min,42℃30min,85℃5min,4℃终止,得到逆转录cDNA。
3.2.2.2.荧光定量PCR反应
按照TaqMan MiRNA Assay说明书,进行荧光定量PCR反应:在8联管中加入Nuclease freewater 3.835μl、2×Master mix 5μl、TaqMan MiRNA Assay(20×)0.5μl、逆转录cDNA0.665μl;设置反应条件为:95℃预变性10min;然后为95℃15s、60℃60s,45个循环,在荧光定量Mx3000PCR仪上反应。实验均重复3次。结果以Ct值显示。采用相对定量法比较收集细胞的EB病毒miR-BART1-5表达情况。
测定结果如表1所示。由表1可见,与空白对照相比,经Lipofectamine2000转染后,序列SEQ ID NO:1的反义寡核苷酸能够在24小时、48小时有效抑制miR-BART3表达水平,相应的纳米药物能够达到更好的抑制效果。与商品用脂质体Lipofectamine2000转染效果相比,纳米药物具有更高的抑制效果,延长有效作用时间,作用时间能够在48小时以上。
表1纳米球的抑制效果
实施例3
取40mg实施例1制备的纳米球与500μl的10mM无菌NaCl水溶液混合,加入适量防腐剂和稳定剂,配制为注射剂。
实施例4
取40mg实施例1制备的纳米球和对羟基苯甲酸乙酯0.0135g溶于500μl的10mM无菌NaCl水溶液中,减压过滤得到喷雾剂。
Claims (2)
1.EB病毒miR-BART3反义寡聚核苷酸在制备治疗鼻咽癌的药物中的应用,其中所述的反义寡聚核苷酸的序列是ACACCUGGUGACUAGUGGUGCG(SEQ ID NO:1)。
2.权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的药物是先将所述反义寡聚核苷酸负载到纳米金上制成纳米球,再加入药学上可以接受的辅料制成;其中,所述的纳米球的粒径为30nm~50nm,该纳米球由含巯基的纳米金、分子量为2Kda的聚乙烯亚胺、反义寡核苷酸与聚乙二醇单甲醚和支链型聚乙烯亚胺的共聚物组成;所述的纳米球可以由以下方法制备得到:
(a)将含巯基的纳米金和质量为含巯基的纳米金10倍的分子量为2Kda的聚乙烯亚胺加入1mM NaCl溶液中,常温下反应30分钟,离心纯化分离得到聚乙烯亚胺包裹纳米金;
(b)将步骤(a)制备的聚乙烯亚胺包裹纳米金和质量为含巯基的纳米金80倍的序列为SEQ ID NO:1的反义寡聚核苷酸加入1mM NaCl溶液中,常温下反应30分钟,离心纯化分离得到负载反义寡核苷酸纳米金;
(c)将步骤(b)制备的负载反义寡核苷酸纳米金、质量为含巯基的纳米金6倍的聚乙二醇单甲醚和支链型聚乙烯亚胺的共聚物加入1mM NaCl溶液中,常温下反应30分钟,离心纯化分离得到纳米球;其中,聚乙二醇单甲醚的分子量为2Kda,支链型聚乙烯亚胺的分子量为25Kda,且聚乙二醇单甲醚与支链型聚乙烯亚胺的物质的量之比为1∶1.5。
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