CN105400868B - 使用miRNA检测体内细胞死亡情况的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述通过测量遍在和组织特异miRNA的水平检测体内细胞死亡的非介入性方法。该方法可用于检测细胞死亡伴随或引起的病理以及诊断感染性疾病；由不同理化因子诱导的细胞毒作用和特定的胎儿异常的存在情况。

Description

使用miRNA检测体内细胞死亡情况的方法
本申请是分案申请，原申请的申请日为2008年8月22日，申请号为200880113585.0(PCT/US2008/009991)，发明名称为“使用miRNA检测体内细胞死亡情况的方法”。
相关申请
该申请要求于2007年8月22日提交的U.S.临时申请第60/965,871号的利益，其全部内容通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明提供了分离和检测体液中脱细胞小RNA特别是微小RNA(miRNA)序列的非介入性的方法。更具体地说，本发明涵盖通过分析尿液和其它体液中miRNA的水平(用于临床诊断和治疗监测)检测体内细胞死亡情况的方法。
发明背景
细胞死亡是多细胞生物体发育和机能的正常部分。作为自然过程，细胞死亡涉及许多由内部因素引起的疾病的病理学。细胞死亡还伴随着由外部的物理、化学、生物试剂引起的疾病的发生。
存在两种主要类型的细胞死亡：坏死和凋亡，它们表现出不同的形态特性和分子特性(Kerr等,Br.J.Cancer.26,239-257(1972)；Umansky,Theor.Biol.97,591-602(1982)；Umansky等,Adv Pharmacol.41,383-407(1997)；Ameisen,Cell Death Differ.11,4-10(2004)；Lockshin等.Int J Biochem Cell Biol.36,2405-19(2004)；G.Kroemer,等,CellDeath and Differentiation 12,1463-1467(2005))。坏死被认为直接由严重的分子和/或结构损害的引起的灾难性代谢失效，并导致炎症和对周围细胞的继发性损害。凋亡是比坏死普遍得多的生物学现象，可由特定信号如激素、细胞因子；由特定信号如生长或粘附因子的缺乏或由不造成灾难性地失去完整性的分子损伤所诱导。凋亡是积极的细胞应答的结果，后者涉及分子事件有序和特定级联的开始。凋亡导致各种现象的出现：染色质浓缩和边缘化、核碎裂、细胞萎缩、胞膜起泡和核DNA的酶促核小体间断裂(enzymaticinternucleosomal fragmentation)(Umansky等，Biochim Biophys Acta.655，9-17(1981)；Arends等，Am J Pathol.136，593-608(1990))。还有文献描述以特定形态学为特点的其它更罕见的细胞死亡模式，例如所谓的自体吞噬细胞死亡(Bredesen等，Stroke.38(2Suppl)：652-660(2007)。
无论细胞死亡的特定机制和类型如何，检测死亡细胞类型的方法对于各种疾病的诊断是重要的，对于疾病和治疗监测是关键的，对于不同的诊断是有帮助的。此外，能够检测体内特定细胞死亡的方法对于开发预防或诱导细胞死亡的药物以及对于新开发药物细胞毒性的分析是有用的。
现存某些对与疾病相关的过度细胞死亡的诊断的临床试验，其基于对组织特异性标记物如血液或其它体液中的抗原、酶和其它蛋白的检测。例如，血液中肝特异性酶活性的测定是一种广泛使用的肝细胞死亡评价方法(Amacher，等，Regul ToxicolPharmacol.Apr；27(2)：119-130(1988)；Salaspuro，等，Enzyme 37：87-107(1987)；Herlong，Hosp.Pract.(Off Ed).29(11)：32-38(1994))。对心肌细胞特异抗原水平的评价已用于诊断心肌梗塞(Mair等，Clin Chem Lab Med.37：1077-1084(1999)；Nunes等，RevPort Cardiol.20：785-788(2001))。然而，这种技术的数量仅限于某些疾病，所述疾病中标记物和检测方法是已知的，可用于提供有意义的、组织特异性结果的分析(Oh S等，CurrGastroenterol Rep.3：12-18(2001)；Rochling等，Clin Cornerstone.3(6)：1-12(2001))。其它方法需要对怀疑有疾病状态的特定组织进行介入性.活检以获取分析样本。然而，某些器官和组织如大脑的活检是高度介入性的，因而往往难以实施。
已知凋亡即程序性细胞死亡(哺乳动物机体中主要的细胞死亡形式)伴随着核DNA的核小体间断裂。很多实验室证明了一部分这种DNA出现在血液中(Lo Y.M.Ann N Y AcadSci.945：1-7(2001)；Lichtenstein等，Ann N Y Acad Sci.945：239-249(2001)；Taback等，Curr Opin MoI Ther.6：273-278(2004)；Bischoff等，Hum Reprod Update.8：493-500，(2002))。已经证明这种断裂的DNA(称之为跨肾DNA(Tr-DNA))跨过肾屏障并可在尿液中检测到(Botezatu等，Clin Chem.46：1078-1084，(2000)；Su等，J Mol Diagn.6：101-107(2004)；Su等，Ann N Y Acad Sci.1022：81-89(2004)。
尽管脱细胞血浆DNA和Tr-DNA都可被用作诊断工具，但是当评估组织特异性事件如细胞死亡时它们提供的方法相当有限。因此，提供更广范围的特定病理学适应症的非介入性分析方法，因其检测特定组织和器官中死亡细胞水平的能力，而可用于诊断和监测患者不同疾病状态或病理学状况。另外，提供用于监测患者对疾病治疗反应的工具的组织特异性分析方法可用于确定治疗效果，并且在药物治疗情况下可用于确定给药所需的最适剂量。
为了解决这些问题，本发明致力于作为监测体液如血清或尿液中体内细胞死亡的诊断工具的微小RNA(miRNA)的应用。与脱细胞血浆DNA和Tr-DNA不同的是，许多miRNA显示细胞、组织和器官特异性表达概况(Liang等，Genomics，8：166(2007)；Lukiw等，Neuroreport.18：297-300(2007)；Lagos-Quintana等，Curr Biol.12：735-739(2002)；Chen等，Nat Genet.38：228-233(2006)；Beuvink等，J.Nucleic Acids Res.35：e52(2007))。此外，已证明了miRNA细胞和组织特异概况与不同病理学和肿瘤类型的相关性(Visone R.，等Oncogene.26：7590-7595(2007)；Nelson等，Neuropathol Exp Neurol.66：461-468(2007)；Negrini等，J Cell Sci.120：1833-1840(2007)；Chang等，Annu Rev Genomics HumGenet.8：215-239(2007)；Jay等，Cell Biol.26：293-300(2007))。
因此，本发明提供了通过检测具有特定病理学特征的组织特异性miRNA来测量体液如血清或尿液中体内细胞死亡的方法。基于检测体液中miRNA的本方法可用于进一步开发诊断或监测试验。
发明概述
本发明涉及以下新方法：通过分析从体液获得的脱细胞核酸的特定miRNA序列的水平来检测和测量体内细胞死亡，所述miRNA来源于整个身体的细胞死亡；以及用所得到的分析结果确定患者疾病状态或异常的医学病症。
本发明方法基于脱细胞核酸在阴离子交换剂上的吸附和洗脱，这使得浓缩和分离大于10个核苷酸的核酸片段成为可能。具体而言，本发明证明了：(i)miRNA在体液中的存在；(ii)在尿液中对来源于位于泌尿系统外部器官的miRNA(例如跨肾miRNA(Tr-miRNA))的检测，这意味着所述miRNA已跨越了肾屏障；(iii)对血清中的miRNA的检测，(iv)与特定细胞、组织和/或器官中细胞死亡相关的病理伴随着所述器官特异性miRNA水平的变化。
本发明提供了以下方法：检测和定量体液中细胞、组织和/或器官特异性脱细胞miRNA，以评价各种组织和器官中的体内细胞死亡情况，其中体内细胞死亡情况与特定组织和/或器官(含有从受试对象获得的体液样品)的疾病相关；对所述体液样品进行针对一种或多种特定miRNA序列的分析，其中所述分析包括以下步骤：用与所述特定miRNA序列的一部分基本上互补的引物和/或探针检测所述miRNA。在本发明某些实施方案中，体内细胞死亡过度或不足与特定组织疾病有关。
在本发明的一个实施方案中，体液是尿液。在另一个实施方案中，所述尿样分析方法包括选自以下的技术：杂交、循环探针反应、聚合酶链式反应、巢式聚合酶链式反应、分析单链构象多态性的PCR和连接酶链式反应。然而在另一个实施方案中，减少所述尿样中的核酸降解。
本发明的方法包括减少核酸降解作用，其包括通过以下方式抑制核酸酶活性：添加一种或多种RNA酶抑制剂；热灭活或者用选自盐酸胍、异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和十二烷基硫酸钠的化合物处理所述尿样。在本发明的一个实施方案中，尿样在膀胱中停留的时间低于12个小时。
在本发明的一个实施方案中，体液是血清。本发明的方法包括对血清样品的分析，其包括选自以下的技术：杂交、循环探针反应、聚合酶链式反应、巢式聚合酶链式反应、分析单链构象多态性的PCR和连接酶链式反应。
然而在另一个实施方案中，本发明的方法包括检测脱细胞miRNA，其作为用于与组织或器官中细胞死亡过度或不足相关的特定疾病的特定标记物。任选地，所述疾病是病原体感染。优选所述病原体是病毒。更优选所述病毒是埃巴病毒。任选地，所述疾病是脑中风、阿尔茨海默病、帕金森病、与怀孕和/或胎儿相关的疾病或唐氏综合症。
本发明提供了检测因与组织或器官中细胞死亡过度或不足相关的疾病而在受试对象的不同器官和组织(包括非泌尿系统区域)中产生的尿液脱细胞miRNA的方法，所述方法包括：从受试对象获得尿样，以及对所述尿样进行针对一种或多种特定miRNA序列的分析，其中所述分析包括以下步骤：用与所述特定miRNA序列的一部分基本上互补的引物和/或探针检测所述miRNA。
本发明方法提供了通过定量分析体液中特定脱细胞miRNA以在受试对象中监测疾病和/或治疗的方法，所述方法包括：定期从受试对象获取体液样品，并对所述样品进行针对一种或多种在目标细胞、组织或器官中特异性/过量表达的特定miRNA序列的分析，其中所述分析包括以下步骤：用与所述特定miRNA序列的一部分基本上互补的引物和/或探针检测所述miRNA。在一个实施方案中，所述体液是尿液。在另一个实施方案中，所述体液是血清。
附图简述
根据附图中所阐述的内容，从本发明实施方案更详细说明可得知本发明上述和其它目标、特征和优点。附图对于范围、重点不是必需的，而是旨在说明本发明的原理。
图1是用Q-SepharoseTM滤过的尿液中所提取核酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳的照片
图2是来源于EBV的BART1miRNA特异性RT-PCR产物的聚丙烯凝胶分析照片
图3A-3G是表示脑中风后12和24小时时间点的经标准化的患者尿样miRNA浓度的点图。
图4是表示miRNA 129和219浓度变化与脑中风结果之间相关性的图表。标记为o和□的患者在中风后一个月其临床状况改善，标记为x的患者在中风后一个月临床状况恶化。
图5是表示阿尔茨海默病患者和同龄对照的未过滤尿样中经标准化的miRNA浓度的点图。
图6是表示阿尔茨海默病患者和同龄对照的过滤尿样中经标准化的miRNA浓度的点图。
图7是表示阿尔茨海默病患者和同龄对照的血清样品中经标准化的miRNA浓度的点图。
图8是表示帕金森病患者和同龄对照的尿样中经标准化的miRNA浓度的点图。
图9是表示怀有唐氏综合症胎儿和正常胎儿的孕妇尿样中经标准化的miRNA-9浓度的点图。
发明详述
本发明技术是基于对存在于体液中的小RNA、尤其是包括跨肾miRNA(Tr-miRNA)在内的特定微小RNA(miRNA)的发现，它们的浓度反映了与器官损伤或其它病理学相关的细胞死亡。因此，这些核酸序列以低于或高于对照组的水平存在，表明从中获取样品的患者中可能存在异常或病理状况。
由于本发明方法所固有的非介入性特点，其提供了优于现有的诊断、检测和监测方法的改进。
为了帮助理解本发明，许多术语定义如下：
术语“引物”是指当处于启动引物延伸的条件下能够用作合成起始点的寡核苷酸。寡核苷酸“引物”可以天然存在于纯化的限制性消化物中，或者合成制备。
选定引物使其与模板的特异性序列链“基本上”互补。引物必须充分地互补以与模板链杂交从而使引物延伸得以发生。引物序列无需反映确切的模板序列。例如，引物的5′末端可连接有非互补的核苷酸片段，而引物序列的剩余部分与上述链基本上互补。还可使非互补的碱基或较长的序列散布在引物中，前提是引物序列与模板序列有足够的互补性来实现杂交，并由此形成用于合成引物延伸产物的模板引物复合体。
“靶”核酸是通过杂交、扩增或任何其它分析核酸序列的方法(包括分析方法的组合)进行评价的miRNA序列。
“杂交”方法包括使互补序列与靶核酸序列(所分析的序列)退火。两种含有互补序列的核酸多聚体互寻并经由碱基配对作用的退火的能力是公认的现象。由Marmur和Lane，Proc.Natl.Acad.Sci.USA46：453(1960)以及Doty等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46：461(1960)提出的“杂交”过程的最初观察结果现已改进成现代生物学的重要工具。杂交包括但不限于狭线杂交、斑点杂交和印迹杂交技术。
对于某些诊断应用来说，重要的是确定杂交是否代表完全或部分互补性。例如，当期需简单地检测病原体miRNA的存在或不存在时，唯一重要的是，存在相应的序列时杂交方法确保杂交得以进行；当部分互补的探针和完全互补的探针会发生杂交时，可选定条件。然而，其它诊断应用可能需要区分部分互补性与完全互补性的杂交方法。检测遗传多态性可能是受关注的。
本文所用术语“探针”是指寡核苷酸(即核苷酸序列)，无论是天然存在于纯化的限制性消化物中或者是合成制备的，其由于探针中至少一段序列与其它核酸中的序列的互补性或其它可重现的吸引作用方式而与另一核酸序列形成双螺旋结构或其它复合体。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离。预期本发明所使用的任何探针将用任何“报告分子”来标记，以便可在任何检测系统中进行检测，所述系统包括但不限于酶(例如ELISA和基于酶的组织化学分析)、荧光、放射性和发光系统。进一步期望目标寡核苷酸(即待检测的目标寡核苷酸)将用报告分子标记。还期望探针和目标寡核苷酸两者都被标记。没有预期本发明受限于任何特定的检测系统或标记物。
本文所用术语“miRNA”是非编码的单链小RNA的子集，其长度大约为18-23个核苷酸，在代谢过程的调节中起重要的作用，特别是由于它们参与调节编码特定蛋白的mRNA的稳定性和翻译。miRNA还参与其它重要的过程，如异染色质形成和基因组重排。
术语体内细胞死亡“过度”或“不足”描述以下情况：特定器官或组织中死亡的细胞数分别高于或低于相应年龄和性别对照中的细胞数。
本文所用术语“纯化的”、“净化的”和“灭菌的”是指去除样品中的一种或多种污染物。
本文所用术语“基本上纯化”和“基本上分离”是指以下核酸序列：所述核酸序列从它们的自然环境中移出、分离或独立出来，并且优选60％、更优选75％、最优选90％脱离与它们天然缔合的其它组分。因此，“分离的多核苷酸”是基本上纯化的多核苷酸。预期为了实施本发明的方法，多核苷酸可以但不必为基本上纯化。在本技术领域中已知有很多以不纯的形式检测核酸序列的方法。
本文中所用术语“PCR产物”和“扩增产物”是指在变性、退火和延伸的PCR步骤的二个或多个循环完成之后所得的化合物的混合物。这些术语包括已扩增一种或多种靶序列的一种或多种片段的情况。
本文所用术语“尿道”是指参与尿液从身体分泌和排除的器官和通道。
本文所用术语“患者”或“受试对象”是指治疗受体。包括哺乳动物和非哺乳动物患者。在一个特定的实施方案中，患者是哺乳动物，如人、犬、鼠、猫、牛、绵羊、猪或山羊。在特定的实施方案中，患者是人。
在本发明的一个实施方案中，被检测的miRNA来源于并特异性表达于体内的特定细胞类型、组织和器官中，其中所述miRNA水平的变化表明所述组织的急性病状，例如与心肌细胞死亡相关的急性心肌梗塞、与神经元和神经胶质细胞死亡相关的脑中风、与由病毒或其它感染或毒素作用引起的肝细胞死亡相关的肝炎或肝硬化、与各种胰腺细胞死亡相关的急性胰腺炎、与所移植器官的细胞过度死亡相关的移植器官排斥作用、各种器官的创伤性伤害、各种急性感染例如与肺部和/或其它感染器官细胞死亡相关的肺结核。
在本发明另一个实施方案中，所检测的miRNA来源于并特异性表达于体内特定的细胞、组织或器官中，其中所述miRNA的水平变化表明所述组织的慢性病状，例如阿尔茨海默病、帕金森病、额颞痴呆(frontotemporal dementia)和神经元死亡所引起或伴随的其它中枢神经系统疾病、与心肌细胞死亡相关的慢性心力衰竭、与肺细胞死亡相关的肺气肿、与胰腺β细胞的死亡相关的1型糖尿病、与肾细胞死亡相关的肾小球性肾炎、与活跃增生的癌前细胞的凋亡死亡相关的癌前病症、与由于供血不足所致的大量细胞坏死相关的癌症和慢性感染器官或组织中的细胞死亡。
在本发明又一个实施方案中，所检测的miRNA来源于并特异性表达于体内特定的细胞类型、组织或器官，并且所述miRNA的水平变化表明理化试剂的细胞毒作用，例如与杀死骨髓细胞的相对低剂量和导致胃肠系统上皮细胞死亡的较高剂量以及杀死脑神经元的更高剂量相关的辐射；以及与由天然或合成的毒性化合物引起的各种器官和组织的细胞死亡相关的化学细胞毒性。
在本发明再一个实施方案中，所检测的miRNA来源于并特异性表达于体内特定的细胞类型、组织或器官并可被用于疾病结果的预后。显示疾病发展/消退、治疗或手术介入的成功的相应miRNA水平变化可用于疾病和治疗的监测。
在本发明另一实施方案中，所检测的miRNA来源于移植的细胞、组织或器官，并且它们的水平指示出排斥发作和相应治疗。
在本发明另一实施方案中，所检测的miRNA来源于病原体，并可用于感染诊断和监测。在本发明特定的实施方案中，病原体是病毒如埃巴病毒。
在本发明又一个实施方案中，所检测的miRNA来源于受感染器官的细胞，并可用于支持诊断、评价受感染组织的损伤以及进一步监测疾病和治疗。
在本发明再一个实施方案中，所检测的miRNA来源于孕妇的胎儿，并以胎儿的状况或病理学为特征，例如先兆子痫，其特征在于胎盘营养细胞的过度死亡。在再一个实施方案中，所检测的miRNA来源于孕妇的胎儿，并以胎儿的状况或病理学为特征，例如伴随着器官发育延迟和细胞死亡过度或受抑制的唐氏综合症和其它三体综合症(trisomies)。
在本发明再一个实施方案中，关于单独的或与其它标记物结合的组织或细胞特异性miRNA的水平的信息用于诊断或监测癌症或癌前病症，例如肝癌、肾癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌和其它已知的癌症。
在一些实施例中，利用血清中遍在的miRNA水平、尿中白蛋白或肌酸酐水平或用于标准化其它组织特异性胎儿miRNA的胎盘特异性miRNA水平来对细胞特异性和/或组织特异性miRNA的水平进行标准化。
在本发明的一方面，分析所述尿样以检测特定miRNA的步骤包括选自以下的技术：杂交、循环探针反应、聚合酶链式反应、巢式聚合酶链式反应、分析单链构象多态性的PCR和连接酶链式反应。
在本发明的某些方面，所述尿样中的核酸降解作用减少。减少核酸降解作用的方法包括利用RNA酶抑制剂抑制核酸酶活性，或者用选自以下的化合物处理所述尿样：盐酸胍、异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和十二烷基硫酸钠。在本发明另一方面，所述尿样在膀胱中储存的时间少于12小时。
在本发明的一个实施方案中，所测量的miRNA序列特别涉及到体内的组织，这些组织可选自但不限于：肺、心、肝、神经系统、大脑、血液、肾、骨、眼或胰腺。
选作分析的组织可以是正常组织或异常组织(例如恶性组织)。恶性组织和肿瘤通常包括：癌症、肉瘤、黑素瘤和白血病，更具体地说选自与以下癌症相关的恶性组织和肿瘤：胆管癌、膀胱细胞癌、骨癌、脑和CNS癌、乳癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、慢性骨髓性白血病、结肠癌、结缔组织癌、皮肤T-细胞白血病、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、滤泡性淋巴瘤、胃癌、毛细胞白血病、何杰金白血病、上皮内瘤、喉癌、淋巴瘤、肝癌、肺癌(例如小细胞和非小细胞肺癌)、黑素瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌和肾癌。该方法可用来区别良性和恶性肿瘤。
可从中收获所述组织样品的受试对象包括那些处于发展癌症的风险中的受试对象。处于发展成癌症的风险中的受试对象是具有高度发展成癌症可能性(即比一般人群中的可能性更高的可能性)的受试对象。例如，这些受试对象包括：具有遗传异常(已证明其存在与发展为癌症的可能性有关，这种可能性高于一般人群的可能性)的受试对象、暴露于致癌因子(即致癌物)如烟草、石棉、或其它化学毒素的受试对象、或者以前接受过癌症治疗并正处于明显的减退的受试对象。
本方法包括从患者体液中分离miRNA。在本发明的一个方面，可在体液如血液、羊水、脑脊液、血浆、乳液、精液、血清、痰、唾液和尿液中检测目标miRNA。在本发明的一个方面，在尿液中检测miRNA。在另一个实施方案中，在血清中检测miRNA。
分离本发明miRNA的本发明方法可利用市售的阴离子交换材料。不论强的还是弱的阴离子交换剂都可使用。通过利用所选的吸附和洗脱溶液，可将miRNA纯化、浓缩并基本上地分离。
可通过利用已知离子强度的溶液使miRNA与阴离子交换柱材料初步结合，将包括其它带负电的分子如蛋白质(微弱结合的污染物)在内的大多数水溶性组分经由交换柱洗去。对于洗脱，通过使用已知浓度的盐如NaCl(其可与缓冲液混合以控制pH)来达到所需的离子强度，理想的是，所述离子强度对应于核酸被完全洗脱的最低离子强度。由此，以比核酸更高的严格性结合到阴离子交换树脂的污染物可留在柱内，即，结合较强的污染物与核酸分离开。
优选的弱交换剂是其中伯、仲或叔胺基团(即可质子化的胺)提供交换位点的那些交换剂。强碱阴离子交换剂具有季胺基团(即不可质子化并且总是带正电荷的)作为交换位点。可根据其各自的吸附和洗脱离子强度和/或用于分离miRNA的pH来选定这两种交换剂。溶液强度高于结合强度。
在本发明的一个方面，提供了从尿液中分离跨肾miRNA的方法，该方法包括提供来自受试对象的尿液；任选通过过滤或离心从尿液中分离细胞和细胞碎片；向尿液中加入EDTA和Tris-HCl；向尿液中加入无硅阴离子交换树脂；温育混合物；从尿液中除去阴离子交换介质；并从树脂中洗脱miRNA。
在一个从尿液中分离miRNA的方法的实施方案中，EDTA和Tris-HCl在加入尿液中之后的浓度在10-100mM范围之间，溶液的pH在约8.0-约8.5之间。
在进一步的实施方案中，在吸附到阴离子交换介质之前，任选地将体液通过膜进行预过滤。
在进一步的实施方案中，阴离子交换介质是用阳离子季铵基团功能化的基于琼脂糖的树脂。用阳离子季铵基团功能化的基于琼脂糖的树脂的实例包括Q-SepharoseTM ANX-4SepharoseTM Fast Flow、DEAE-Sepharose TM和Q-Sepharose-XLTM DEAE Sepharose FastFlow(GE Healthcare)。
在进一步的实施方案中，阴离子交换介质选自基于琼脂糖的季铵阴离子交换介质如Q-过滤剂(Q-filter)或Q-树脂(Q-resin)。
在本发明进一步的实施方案中，将阴离子交换介质固定在单独的载体上，其中该载体是可用于运输或储存介质/核蛋白结合复合体的柱式、筒式或便携式过滤系统。
在本发明另一个实施方案中，例如，定期对存在于同一人的尿液样中的miRNA序列进行分析，可提供关于特定器官或组织中病理过程的早期信息。例如，miRNA122仅在肝脏中合成，并且其数量的增加可为肝炎或其它肝脏病理标志。阿尔茨海默综合症可伴随着神经元中特异性表达的miRNA浓度的增加。
在另一个实施方案中，对患者样品体液中组织特异性miRNA的更详细的监测可用于评价疾病的严重性和治疗的有效性。
在又一个实施方案中，关于组织特异性miRNA的数据联合肿瘤特异突变的分析有助于确定肿瘤位置。
本发明其它方面涉及由一种或多种特定miRNA表达的变化所引起或伴随的疾病。所述技术将有助于诊断这种类型的病状。
在又一个实施方案中，本方法的应用可延伸至监测患者尿液中合成的siRNA的药物代谢动力学，从而加强siRNA药物设计的最优化。
除非另有说明，否者本文所使用的所有科技术语具有如本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同等含义。尽管相似或等同于那些本文所述的方法和材料可用于本发明的实践中，但合适的方法和材料描述如下。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料清楚地通过整体引用结合到本文中。在有冲突的情况下，将以包括定义在内的本说明书为准。另外，本文所描述的材料、方法和实施例仅仅是说明性的，没有限制的意思。
实施例
实施例的提出是为了更充分地说明本发明的各种实施方案。这些实施例决不应理解为限制所附权利要求书中所记载的本发明的范围。
实施例1
从尿液中提取miRNA
尿液的收集：为了进行这些实验，将来自患者或志愿者的尿样收集到无菌110ml尿液收集杯中，并立即用EDTA补充至终浓度到10-150mM之间，优选为50mM。样品于-80℃下以10-50ml等份试样贮存。在收集样品之后、加入EDTA之前立即在StericupTM(Millipore，Vacuum Driven Filtration System，0.45μDuraporeTM过滤器)上进行尿液的选择性过滤。
Q结合：在50ml的试管中，用等体积50mM EDTA(pH 8.0)和50mM Tris-HCl(pH 8.0)稀释20mL的尿液，然后补充1-2ml Q-SepharoseTM(GE Healthcare；17-0510-10)浆液，于室温下剧烈搅拌混合10-30min。使用浮桶式转头(swing bucket rotor)的台式临床离心机在室温下以2000g离心5min收集结合了核酸的树脂。通过抽吸将接近500μl的上清液除去。将树脂沉淀重悬于残存的上清液中并转移至Micro Bio-Spin色谱柱(Bio-Rad)或等效物中，其通过真空离心来操作。用500μl 2xSSC(300mM NaCL/30mM柠檬酸钠(pH 7.0))或具有相近离子强度的缓冲液(例如300mM NaCl或LiCl)洗涤柱中的树脂三次。用高离子强度(例如1MNaCl或LiCl)将核酸从Q-Sepharose中洗脱下来，但下面所描述的方法能更好地保存RNA。
Q-SepharoseTM和TRIzolTM相分离洗脱：用500μl TRIzolTM试剂(Invitrogen)进一步洗脱结合的核酸。按照制造商的指示从TRIzol中萃取核酸。简言之，为了进行相分离，用100μl氯仿补充TRIzol洗脱液，剧烈混合，于室温下孵育3-5min并以12,000xg于4℃离心15min。将300μl上层相转移至新的离心管中，同时避免碰触界面。然后将核酸沉淀或者另外在硅胶柱上进行清洗并脱盐。
核酸沉淀：为了进行核酸沉淀，用1μl 20mg/mL糖原(Roche)和300μl100％异丙醇补充上述制备物。离心收集核酸，用200μl 70％乙醇洗涤沉淀两个，室温下风干5min，然后将核酸溶解在30μl 0.1mM EDTA/1x RNA Secure(Ambion)。将样品于60℃下孵育10min以灭活残存的RNA酶活性。
核酸的硅胶柱清洗：为了与硅胶柱(Qiagen PCR清洗柱或等效物)结合，将3倍体积96％的乙醇加入到来自Trlzol上层相的核酸制备物中，室温下孵育3min之后，将混合物加样到在柱上。用500μl 2M LiCl/80％乙醇洗涤柱子两次，并用500μl 80％乙醇洗涤两次。用50μl的0.1mM EDTA/1x RNA Secure(Ambion)洗脱核酸。于60℃下温育样品10min灭活任何残存的RNA酶。
DNA酶I和RNA酶A消化：为了检验用上述方案从尿液中提取材料的核酸身份，用DNA酶I和/或RNA酶A消化该制备物。在含有2个单位无RNA酶的DNA酶I(NEB)的DNA酶I反应缓冲液(NEB)中进行DNA酶I的消化。在补充了50ng/mL经煮沸RNA酶A的TE缓冲液中进行RNA酶A的消化。于37℃下孵育样品60min，在加入加样染料之后，将样品进行5％聚丙烯酰胺1xTBE凝胶电泳，并用1/10000稀释的
Figure BDA0000817768290000161
Gold(Invitrogen)进行染色。如图1所示，经分离的材料代表低分子量的核酸、主要是RNA及其片段。另外(见图1)，为了进行比较，泳道2和3为用3M NaCl从Q-树脂洗脱的核酸，泳道4和5为用TrizolTM洗脱的核酸。
在图1中，泳道1和5分别代表用高盐和TriZol从Q-Sepharose洗脱来分离的核酸；泳道2和6；3和7；4和8分别代表用DNA酶、RNA酶或DNA酶+RNA酶处理后的核酸。
此外，为了证明RNA的存在和分子大小，用DNA酶I消化纯化的核酸的RNA等份试样，即泳道3和5。
从血清中提取RNA
为了进行这些实验，将1.2ml TRIzol LS加到0.4ml血清中，以14,000rpm离心混合物10min。将上清液转移至2ml Eppendorf管中，加入0.3ml氯仿，将混合物振荡15秒钟。14,000rpm离心15min之后，将上清液转移至5ml管中并加入乙醇至最终浓度为70％。将混合物加样到Quiagen Quick柱真空歧管上，用0.5ml的2M LiCl-80％EtOH洗涤柱子两次，一次用0.5ml 80％乙醇-80mM醋酸钠(pH 5.0)，最后用0.5ml 95％乙醇。以14,000rpm在1.5mlEppendorf管中离心柱子3min，并用40μl H2O洗脱RNA。
实施例2
该实施例证明了来自死亡细胞的miRNA跨越肾屏障，并可在患者的尿液中检测到。
尿液中人类miRNA分子的检测
在本实施例中所分析的微小RNA种类可分成三组不同的类型，即在所有或多种组织中表达的遍在miRNA、组织特异性miRNA和在特定的组织或细胞类型中其表达有显著变化的miRNA。如表1所示，从16名健康的志愿者和所登记供者的尿液中获得20种不同的miRNA，之后用市售的miRNA表达分析试剂盒(ABI)通过实时RT-PCR进行检测。用相应的合成miRNA寡核苷酸作为标准品。按照供应商所推荐的严格地进行反应。
表1检测的miRNA
Figure BDA0000817768290000181
在大多数尿液RNA制备物中检测到所有三种类型的miRNA。最高的拷贝数以遍在miRNA为特征。然而，组织特异性miRNA或在特定组织或细胞类型中过量表达的miRNA也是可检测到的。已经清楚地表明：来自死亡细胞的一部分miRNA不被降解，但出现在血液里，并最终分泌到尿液中。
实施例3
该实施例证明了来自人类鼻咽癌(NPC)细胞的miRNA可跨越患者的肾障碍，并可通过实时RT-PCR在患者的尿液中检测出来。
尿液中来源于病毒的miRNA
已知以一些病毒也编码和合成miRNA。由于埃巴病毒(EBV)涉及鼻咽癌(NPC)的发展，该系统用于探求来自NPC细胞的病毒miRNA是否可以达到患者的尿液中并从中检测出来。按照本申请的实施例1所描述的方法收集并贮存来自NPC患者的尿样。通过检测尿液中病毒特异性DNA序列来证实EBV的感染。从健康供者收集的尿液呈EBV特异性DNA序列阴性。在此项研究中，分析了两种EBV特异性miRNA，即BART3-3p和BART1-3p：
BART3-3P CGC ACC ACU AGU CAC CAG GUG U SEQ ID NO：21
BART1-3P UAG CAC CGC UAU CCA CUA UGU CU SEQ ID NO：22
反转录在15μl体系中完成，取1/10的RT反应物，用来自Sigma的JumpStart DNA聚合酶进行PCR扩增。下列引物的使用浓度为500nM。
Figure BDA0000817768290000191
Figure BDA0000817768290000201
以15％聚丙烯酰胺凝胶(PAAG)分析产物。
如图2中所示，BART3和BART 1miRNA两者都在NPC患者的尿液中检测出来，但在健康供者尿液中没有检测到。这些数据再次说明可在尿液中检测到来自位于泌尿系统外的死亡细胞的miRNA。在图2中，泳道1代表标记物；泳道2和3代表鼻咽癌患者；泳道4和5代表对照患者；泳道6代表阳性对照，其代表相应的合成miRNA。
实施例4
该实施例证明可通过测量患者尿液中神经元特异性miRNA的浓度指示体内由中风引起的神经元死亡。
脑中风诊断
为了进行这些实验，对脑中风患者进行了研究，以分析中风后脑特异性miRNA或脑中过量表达的miRNA浓度的变化情况。由于目前还不清楚什么类型的脑细胞以及在脑部什么区域表达这些miRNA，因此对9种不同的脑特异性miRNA进行了研究。
患者：从在医院急诊室接收的患者中收集尿样。脑中风的诊断基于临床症状。中风后12和24小时收集尿样。对照尿样由没有中风症状的同龄志愿者提供。按照本申请实施例1所述的方法收集并贮存样品。
miRNA种类：按照实施例1所述的方法提取尿液中的miRNA。对与675μl尿液中所分离的RNA等量的RNA进行反转录PCR，取1/10的RT-PCR混合物的进行最终实时PCR，这通过用制造商所提供的方案来实施。通过按照尿液中的肌酸酐浓度重新计算来对所获得的数据进行针对个体肾过滤率(individual kidney filtration rate)的标准化。为了进行这些实验，将从同一年龄组的健康供者中收集的尿样用作基线。不同的miRNA种类如下所示：
A.hsa-mir-128a
B.hsa-mir-9
C.hsa-mir-127
D.hsa-mir-137
E.hsa-mir-129
F.hsa-mir-219
G.hsa-mir-218
图3A-3G总结的结果清楚地表明：在脑中风之后，几种脑特异性miRNA(128a，129，218，219)水平的显著增加，这反映了脑细胞死亡的动力学。
实施例5
该实施例证明：中风后患者尿液中miRNA浓度的动力学提供了有关疾病结果的信息。
脑中风监测
为了进行实验，对脑中风患者进行了研究，以分析脑特异性miRNA浓度变化与疾病发展之间相关性。
患者：从在医院急诊室接收的患者中收集尿样。脑中风的诊断基于临床症状和MRI分析。在中风后12、24、48小时和一周收集尿样。中风后30天对患者临床状态进行评价。由无中风症状的同龄志愿者提供对照尿样。根据本申请实施例1所述的方法收集和贮存样品。
miRNA种类：根据实施例1所述的方法从尿液中提取miRNA，并用TaqMan miRNA测定(Applied Biosystems)对其进行分析。对与400μl尿液中所分离的RNA等量的RNA进行反转录PCR，取1/10的RT-PCR混合物进行最终实时PCR，这通过用制造商所提供的方案来实施。通过按照尿液中的肌酸酐浓度重新计算来对所获得的数据进行针对个体肾过滤率的标准化。
图4A和B总结的结果清楚地表明：在脑中风之后，Tr-miRNA 129和Tr-miRNA 219的变化动力学在不同的患者中有差异，并且与疾病的发展相关。第3名患者中风后一周神经元死亡的增加对应于患者临床状况的恶化。与此同时，研究证明，跨肾神经元特异性miRNA趋于正常化的两名患者有显著改善。
实施例6
阿尔茨海默病诊断
阿尔茨海默病是由神经元(特别是在大脑皮质和海马组织)死亡引起的渐进性神经系统疾病。诊断基于神经检查并排除其它痴呆因素，而仅在尸检时才可作出确定的诊断。本发明证明了以过度神经元死亡为表征的阿尔茨海默病可通过测量从患者尿液中分离到的脑特异性miRNA水平来监测。
为了进行这些实验，对诊断为阿尔茨海默病的患者进行了研究，以分析因神经元死亡引起的脑特异性miRNA或过量表达的miRNA浓度的变化。
患者：从诊断为不同时期阿尔茨海默病的患者收集尿样和血清样品。由没有阿尔茨海默病症状的同龄志愿者提供对照尿样和血清样品。根据本申请实施例1所述的方法收集和贮存样品。在按照实施例1所述进行收集之后，过滤某些尿样以除去细胞和细胞碎片。
miRNA种类：根据实施例1所述的方法从尿液和血清中提取RNA。
在一组实验中，对与750μl尿液中所分离的RNA等量的RNA进行反转录PCR，取1/10的RT-PCR混合物进行最终实时PCR，者通过用制造商(Applied Biosystems)所提供的方案来实施。通过按照尿液中的肌酸酐浓度重新计算来对所获得的数据进行针对个体肾过滤率的标准化。图5清楚地表明：在阿尔茨海默病患者的尿液中几种脑特异性miRNA的浓度增加。
在另一组实验中，分析了从过滤的尿液或血清中分离的RNA。对与0.6ml尿液或50μl血清中所分离的RNA等量的RNA进行反转录PCR，取1/10的RT-PCR混合物进行最终实时PCR，这通过用制造商(Applied Biosystems)所提供的方案来实施。通过按照尿液中的肌酸酐浓度重新计算来对所获得的关于尿液miRNA的数据进行针对个体肾过滤率的标准化。按照遍在miRNA-16对所获的关于血浆miRNA的数据进行标准化。图6和图7显示：在阿尔茨海默病患者的过滤的尿液和血清中某些神经元特异性miRNA的水平都比同龄对照高。
实施例7
帕金森病
帕金森病是一种通常损害患者运动技巧和语言能力的中枢神经系统退行性疾病。本发明证明：特征在于多巴胺能神经元的过度细胞死亡的帕金森病可以通过测量分离自患者尿液中的脑特异性miRNA的水平来监测。
为了进行这些实验，对诊断为帕金森病的患者进行研究，以分析由神经元死亡引起的脑特异性miRNA或过量表达的miRNA的浓度变化。
患者：从诊断为各个时期帕金森病的患者中收集尿样。由没有帕金森病症状的同龄志愿者提供对照尿样。根据本申请实施例1所述的方法收集和贮存样品。
miRNA种类：为了进行这些实验，根据实施例1所述的方法从尿液中提取RNA。对与750μl尿液中所分离的RNA等量的RNA进行反转录PCR，取1/10的RT-PCR混合物进行最终实时PCR，这通过用制造商(Applied Biosystems)所提供的方案来实施。通过按照尿液中的肌酸酐浓度重新计算来对所获得的数据进行针对个体肾过滤率的标准化。图8证明：帕金森病患者的尿液中几种脑特异性miRNA的浓度增加。
实施例8
怀孕相关疾病或胎儿疾病的产前试验
肾屏障对miRNA分子渗透性的重要发现开辟了利用母体尿液进行对先天性疾病的完全非介入性产前诊断的先河。这种非介入性筛查可如下进行：
首先，从怀孕患者中收集尿样。然后根据需要，用上述方法分离、纯化和/或处理尿样中的miRNA以防降解。然后用定量PCR或miRNA阵列进行miRNA概况分析(profiling)，根据关于以上其它病状所述，所得的数据用来确定不同的胎儿病状。
实施例9
唐氏综合症
为了进行实验，研究了怀有正常胎儿和唐氏综合症胎儿的妇女的母体尿液中脑特异性miRNA浓度的差异。
患者：从通过羊膜腔穿刺术诊断为唐氏综合症的孕妇中收集尿样。同龄的正常孕妇提供对照尿样。根据本申请实施例1所述的方法收集和贮存样品。
miRNA种类：根据实施例1所述的方法从尿液中提取miRNA。对与750μl尿液中所分离的RNA等量的RNA进行反转录PCR，取1/10的RT-PCR混合物进行最终实时PCR，这通过用制造商(Applied Biosystems)所提供的方案来实施。按照胎盘特异性miRNA 518对所得数据进行标准化。图9表明，与正常孕妇尿液相比，怀有唐氏综合症胎儿的孕妇尿液中脑特异性miRNA 9的浓度较低，这表明与相应的对照相比细胞死亡不足。

Claims (22)

1.与体液中的细胞、组织和/或器官特异性脱细胞miRNA的miRNA序列的一部分互补的引物和/或探针在制备用于评价受试对象各种组织和器官中的体内细胞死亡的试剂中的用途，其中体内细胞死亡与特定组织和/或器官病症有关，并且其中所述评价包括：
对获自受试对象的选自血液、血清和尿液的体液样品进行针对一种或多种特定miRNA序列进行分析，其中所述分析包括以下步骤：用与所述特定miRNA序列的一部分互补的引物和/或探针检测所述miRNA，
其中所述病症为
(a) 病原体感染；
(b) 脑中风；
(c) 阿尔茨海默病；或
(d) 帕金森病。
2.权利要求1的用途，其中体内细胞死亡过度或不足与特定组织病症相关。
3.权利要求1的用途，其中所述分析步骤包括选自以下的技术：杂交、循环探针反应、聚合酶链式反应、巢式聚合酶链式反应、分析单链构象多态性的PCR和连接酶链式反应。
4.权利要求1的用途，其中尿样中的核酸降解作用减少。
5.权利要求4的用途，其中减少核酸降解作用包括通过以下方式抑制核酸酶活性：加入一种或多种RNA酶抑制剂；热灭活；或者用选自盐酸胍、异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和十二烷基磺酸钠的化合物处理所述尿样。
6.权利要求1的用途，其中获得的尿样停留于膀胱少于12小时。
7.权利要求1的用途，其中所述病原体是病毒。
8.权利要求7的用途，其中所述病毒是埃巴病毒。
9.引物和/或探针在制备用于检测因与组织或器官中细胞死亡过度相关的疾病而在受试对象的非泌尿系统区域中产生的尿液脱细胞miRNA的试剂中的用途，评价包括：
对获自受试对象的尿样进行针对一种或多种特定miRNA序列的分析，其中所述分析包括以下步骤：用与所述特定miRNA序列的一部分互补的引物和/或探针检测所述miRNA，并且
其中所述疾病为
(a) 病原体感染；
(b) 脑中风；
(c) 阿尔茨海默病；或
(d) 帕金森病。
10.权利要求9的用途，其中所述病原体是病毒。
11.权利要求10的用途，其中所述病毒是埃巴病毒。
12.脱细胞核酸在制备用于检测和测量体内细胞死亡的试剂中的用途，包括：
(a) 对获自患者体液样品的脱细胞核酸中特定miRNA序列水平进行分析，其中所述体液样品选自血液、血清和尿液，所述miRNA序列指示体内细胞死亡并且来源于患者整个身体的细胞死亡；和
(b) 确定患者中疾病状态或异常的医学病症，
其中所述疾病状态或异常的医学病症是
(i) 病原体感染；
(ii) 脑中风；
(iii) 阿尔茨海默病；或
(iv) 帕金森病。
13.权利要求12的用途，其中所述病原体是病毒。
14.权利要求13的用途，其中所述病毒是埃巴病毒。
15.权利要求12的用途，其中疾病是与组织或器官中细胞死亡过度或不足相关的病症，任选其中体内细胞死亡过度或不足与特定组织的病症相关。
16.权利要求12的用途，其中所述体内细胞死亡与特定组织和/或器官的病症相关。
17.权利要求12-16中任一项的用途，其中所述分析包括用与所述特定miRNA序列的一部分互补的引物和/或探针检测所述miRNA序列。
18.权利要求12的用途，其中所述分析包括选自以下的技术：杂交、循环探针反应、聚合酶链式反应、巢式聚合酶链式反应、分析单链构象多态性的PCR和连接酶链式反应。
19.权利要求12-16中任一项的用途，还包括在尿样中减少核酸降解作用。
20.权利要求19的用途，其中在所述尿样中减少核酸降解作用包括加入一种或多种RNA酶抑制剂；热灭活；或者用选自盐酸胍、异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和十二烷基磺酸钠的化合物处理所述尿样。
21.权利要求12-16中任一项的用途，其中尿样停留于膀胱中少于12小时。
22.权利要求12-16中任一项的用途，其中被检测miRNA序列中至少一种选自hsa-miR-129、hsa-miR-218、hsa-miR-219、hsa-miR-128a、hsa-miR-138、hsa-miR-134和hsa-miR-124a。
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