CN117915772A - 用于核酸和生物样品的防腐剂组合物及其使用方法 - Google Patents

用于核酸和生物样品的防腐剂组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及核酸和细胞防腐剂组合物。保存血液或其他生物样品中的核酸和/或细胞的方法，以及用于保存血液或其他生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒也有所描述。

Description

用于核酸和生物样品的防腐剂组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年7月15日提交的美国临时申请63/222，394的权益、优先权，并且该临时申请以引用的方式整体并入。
技术领域
本公开涉及用于保存血液或其他生物样品中的核酸和/或细胞的组合物、方法和试剂盒。
背景技术
许多基于核酸的测试被用于分析DNA和RNA的序列、结构或表达的差异，以用于多种诊断目的。实际上，核酸是非侵入性生物医学研究的常见检查目标。然而，在采集生物样品后，该样品内的核酸(例如，RNA和DNA)，无论是细胞的/基因组的还是无细胞的，即开始降解。此外，基因诱导和基因转录物的降解在血液或其他生物样品采集后几分钟内就开始发生，这使得在采集样品时难以准确分析样品的基因表达。此外，一般而言，血液或其他生物样品越新鲜，该样品的核酸的质量就越好。当要分析受试者的血液或生物样品的核酸时，这会出现问题。通常情况是，血液和其他生物样品采集的地点和时间与分析时不同。为此，在采集血液或其他生物样品后，需要储存和运输才能进行分析。由于血液和其他生物样品中的核酸在采集后发生快速降解，因此需要保存样品中存在的核酸的组合物和方法，以确保样品的核酸在分析时具有高质量。
对于血液或其他生物样品中的无细胞的核酸而言，采集和分析的不同位置和时间安排会带来另一个问题：细胞裂解。采集的样品中的细胞裂解可能导致无细胞的核酸谱被细胞的核酸污染，这使得难以准确分析血液或生物样品中的无细胞的核酸。在采集血液或其他生物样品后不久，细胞裂解就开始发生。当样品在分析之前需要储存较长时间时，这会出现问题。因此，还需要保存血液和其他生物样品，以维持其核酸的无细胞特征谱。
类似地，对于基于细胞(例如，生物样品中的循环肿瘤细胞)的检测或分析的诊断应用，以完整形式保存这些细胞是重要的。
发明内容
本公开在各个方面涉及核酸和细胞防腐剂组合物、含有这些组合物的试剂盒以及使用所述组合物和试剂盒的方法。
在第一方面，本公开涉及一种核酸和细胞防腐剂组合物，所述核酸和细胞防腐剂组合物包含：
a.任选的一种或多种渗透剂；
b.一种或多种酶抑制剂；
c.任选的一种或多种代谢抑制剂；
d.任选的一种或多种细胞表面重塑聚合物；
e.任选的一种或多种选自由以下各项组成的组的试剂：羟乙基淀粉、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)的聚合物、Ficoll、蛋白质胶体、非蛋白质合成胶体、乙二醇、丙二醇、水溶性聚合物和羧甲基纤维素或者它们中的任一者的盐；以及
e.任选的聚丙二醇(PPG)；
其中存在至少一种细胞表面重塑聚合物(d)或试剂(e)，并且其中所述任选的一种或多种渗透剂和所述一种或多种酶抑制剂以足以产生高渗溶液的组合量存在。
在第二方面，本公开涉及一种核酸和细胞防腐剂组合物，所述核酸和细胞防腐剂组合物包含：
a.一种或多种酶抑制剂；
b.任选的一种或多种代谢抑制剂；
c.任选的一种或多种细胞表面重塑聚合物；
d.任选的一种或多种选自由以下各项组成的组的试剂：羟乙基淀粉、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)的聚合物、Ficoll、蛋白质胶体、非蛋白质合成胶体、乙二醇、丙二醇、水溶性聚合物和羧甲基纤维素或者它们中的任一者的盐；以及
e.任选的聚丙二醇(PPG)；
其中存在至少一种细胞表面重塑聚合物(c)或试剂(d)，并且其中所述一种或多种酶抑制剂以足以产生高渗溶液的量存在。
在第三方面，本公开涉及一种核酸和细胞防腐剂组合物，所述核酸和细胞防腐剂组合物包含：
a.一种或多种酶抑制剂；
b.任选的一种或多种代谢抑制剂；
c.一种或多种细胞表面重塑聚合物；以及
d.任选的聚丙二醇(PPG)；
其中所述一种或多种酶抑制剂以足以产生高渗溶液的量存在。
在第四方面，本公开涉及一种本公开的防腐剂组合物和生物样品的组合。
在第五方面，本公开涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的方法，所述方法包括将本公开的防腐剂组合物与所述生物样品组合的步骤。
在第六方面，本公开涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.本公开的防腐剂组合物；以及
b.任选的，所述防腐剂组合物的使用说明。
在第七方面，本公开涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.血液或其他生物样品采集管，所述血液或其他生物样品采集管任选地含有抗凝剂；
b.注射器，所述注射器含有本公开的防腐剂组合物；以及
c.任选的，可附接至所述注射器的针。
在第八方面，本公开涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.血液或其他生物样品采集管，所述血液或其他生物样品采集管任选地含有抗凝剂；以及
b.密封的安瓿瓶，所述密封的安瓿瓶含有本公开的防腐剂，其中所述安瓿瓶包括可移除的封闭件，并且其中所述安瓿瓶被构造为在使用者移除所述封闭件时容纳分配装置。
在一些实施方案中，所述生物样品来源于体液。在一些实施方案中，所述体液是血液。
在一些实施方案中，所述核酸是无细胞的(“cf”)DNA。在本公开的其他实施方案中，所述核酸是细胞(即，基因组或“g”)DNA。
在一些实施方案中，所述核酸是无细胞的(“cf”)RNA。在本公开的其他实施方案中，所述核酸是细胞(即，基因组或“g”)RNA。
在一些实施方案中，所述细胞是干细胞、骨细胞、血细胞(例如，红细胞和/或白细胞)、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞或循环肿瘤细胞。在一些实施方案中，细胞是实验室来源的或经修饰的细胞。
具体实施方式
定义
除非本文另外定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。如果发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。
在整个本申请及其各种实施方案和方面，词语“包括”或变体诸如“包含”或“含有”将被理解为允许包括规定的整数或整数组，但是不排除任何其他整数或整数组。
术语“包括”或“包含”用于意指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
术语“如”或“例如”之后的任何实例并不意味着穷举或限制本公开。
除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
本文使用冠词“一”、“一个”和“所述”来指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。
本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如，“1至10”的规定范围应被视为包括在最小值1和最大值10之间(包括端值在内)的任何值和所有子范围；也就是说，所有子范围均以的最小值1或更大(例如，1至6.1)开始，并且以最大值10或更小(例如，5.5至10)结束。当在组分的重量百分比或混合物的v/v的上下文中使用时，术语“约”意指所列举的数的+/-10％。
本公开的每个实施方案可以单独或与本公开的一个或多个其他实施方案组合采用。
本文描述了示例性方法和材料，应当理解，与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可以用于本公开的各个方面和实施方案的实践或测试。材料、方法和实例仅仅是说明性的并且不旨在进行限制。
为了使本公开更容易理解，首先定义某些术语。这些定义应根据本领域的普通技术人员所理解的本公开的其余部分来阅读。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在整个具体实施方式中阐述了另外的定义。
如本文所用，术语“渗透剂”是指产生高渗、等渗或低渗溶液的试剂。此外，如本文所用，酶抑制剂可以还充当渗透剂。渗透剂的实例包括但不限于例如钠盐、钾盐、镁盐和钙盐、林格氏乳酸盐、林格氏乙酸盐、氨基酸、山梨糖醇、甘油、甘露糖醇、糖(诸如蔗糖或葡萄糖)、酒石酸和葡萄糖二酸或它们中的任一者的盐。可以还充当渗透剂的酶抑制剂的实例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、柠檬酸、草酸盐、金精三羧酸(ATA)、酒石酸、葡萄糖二酸或它们中的任一者的盐(包括但不限于钠盐和钾盐)。不希望受理论的束缚，渗透剂用于改变血液或其他生物样品的渗透压，导致例如血液或其他生物样品中存在的水从细胞中释放以抵消失衡。这可以导致例如细胞收缩，从而使它们对细胞裂解具有更强的耐受性，否则细胞裂解会导致生物样品的无细胞的核酸被细胞的核酸污染，或者细胞不太适合进行测定和分析。另外，据信血浆增容剂将增强这种效果。
如本文所用，术语“高渗溶液”是指溶质浓度高于生理浓度的溶液。高渗溶液的实例包括但不限于约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％和25％(按重量计)NaCl溶液。
如本文所用，术语“低渗溶液”是指溶质浓度低于生理浓度的溶液。低渗溶液的实例包括但不限于约0.10％、0.15％、0.20％、0.25％、0.30％、0.35％、0.40％和0.45％(按重量计)NaCl溶液。
如本文所用，术语“等渗溶液”是指溶质浓度大约等于生理浓度的溶液。等渗溶液的实例包括但不限于约0.5％、0.7％和1％(按重量计)NaCl溶液。
如本文所用，术语“酶抑制剂”是指单独或在本公开的防腐剂组合物中与金属离子(诸如钙、镁、锰或锌)一起产生复合物的试剂，该复合物被认为可减少血液凝固、抑制核酸酶和/或减少酶促细胞裂解。本公开的酶抑制剂的实例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、柠檬酸、草酸盐、金精三羧酸(ATA)、酒石酸、葡萄糖二酸或它们中的任一者的盐(包括但不限于钠盐和钾盐)。不希望受理论的束缚，核酸酶的抑制将防止或减少生物样品内的无细胞的核酸的降解。本公开的酶抑制剂抑制的酶的实例包括但不限于溶葡萄球菌素、消解酶、蛋白酶、聚糖酶或者已知诱导细胞裂解从而起到保存血液或其他生物样品的细胞的作用的其他酶。
如本文所用，术语“代谢抑制剂”是指单独或在本公开的防腐剂组合物中抑制细胞过程(诸如细胞呼吸、细胞代谢和代谢功能)的试剂，该抑制被认为可减少无细胞的核酸的降解。不希望受理论的束缚，本公开的代谢抑制剂被认为通过抑制细胞代谢功能和压制细菌生长来减缓细胞的生长，从而减少无细胞的核酸的降解。本公开的代谢抑制剂的实例包括但不限于叠氮化钠、硫柳汞、普洛林(proclin)或氯己定(chlorohexidine)。
如本文所用，术语“血浆增容剂”是指产生高膨胀压或高渗溶液的试剂。血浆增容剂的实例包括但不限于甘油、淀粉、蛋白质胶体(例如，白蛋白、卵清蛋白和明胶)和非蛋白质胶体(例如，羟乙基淀粉)。不希望受理论的束缚，血浆增容剂还用于增加血浆或其他生物样品的渗透压，导致水从细胞中释放以抵消失衡。这导致细胞收缩，从而使它们对细胞裂解具有更强的耐受性，否则细胞裂解会导致生物样品的无细胞的核酸被细胞的核酸污染，或者细胞不太适合进行测定和分析。
如本文所用，术语“细胞表面重塑聚合物”是指通过共价相互作用、疏水相互作用或静电相互作用与血液或其他生物样品中的细胞表面相互作用(例如，通过结合至细胞表面受体，或通过与细胞表面上的特定官能团反应)的聚合物。据信，在一些情况下，此类相互作用会导致血液或其他生物样品中的细胞沉积。不希望受理论的束缚，据信，生物样品中的细胞的沉降和/或细胞表面与聚合物的相互作用防止或减少细胞裂解以及随后的细胞的核酸向样品的释放，否则可能会污染例如样品内的无细胞的核酸或完整细胞。随后可以通过本领域已知的常规方法来分离和分析核酸和/或细胞。在本公开的一些实施方案中，“细胞表面重塑聚合物”是表面活性剂。细胞表面重塑聚合物的实例包括但不限于N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和硼酸的共聚物、精甘天冬氨酸(RGD)三肽聚合物衍生物、绿豆植物血球血凝素、泊洛沙姆和合成糖肽，所述合成糖肽的特征在于甘露糖6磷酸受体的一个或多个配体(例如，携带多个丝氨酸-O-甘露糖-6-膦酸(M6Pn)残基的糖肽)。对于携带甘露糖6磷酸受体的重复配体的糖肽的实例，参见Banik，Steven；Pedram，Kayvon；Wisnovsky，Simon；Ri1ey，Nicholas；Bertozzi，Carolyn(2019)：Lysosome Targeting Chimeras(LYTACs)for theDegradation of Secreted and Membrane Proteins.ChemRxiv.Preprint.https：//doi.org/10.26434/chemrxiv.7927061.v2。
如本文所用，“Ficoll”是指由蔗糖与表氯醇的聚合形成的水溶性高分子量蔗糖聚合物。例如，Ficoll 400和Ficoll 70。
如本文所用，“泊洛沙姆”是指具有由两个聚氧乙烯的亲水链侧接的聚氧丙烯的中心疏水链的水溶性三嵌段共聚物。泊洛沙姆的实例包括但不限于泊洛沙姆p188和泊洛沙姆p407。
如本文所用，“蛋白质胶体”是指其中一种或多种蛋白质分散于溶液中的混合物。蛋白质胶体的实例包括但不限于白蛋白、卵清蛋白或明胶。白蛋白可以以例如人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白的形式提供。明胶的实例包括但不限于脲连接的明胶(例如，)，琥珀酰化的明胶(例如，/>)和氧化聚明胶。
如本文所用，术语“非蛋白质胶体”是指其中一种或多种大分子或超微观颗粒分散于溶液中的混合物。非蛋白质胶体的实例包括但不限于支链淀粉的支链天然聚合物(诸如羟乙基化的淀粉(HES))和多糖(诸如葡聚糖，例如葡聚糖40和/或葡聚糖70)。
如本文所用，“水溶性聚合物”是指可溶于水溶液的聚合物。水溶性聚合物的实例包括但不限于聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚右旋糖、聚甘氨酸、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的聚合物、二乙烯基醚-马来酸酐的聚合物、聚噁唑啉、聚磷酸盐、聚磷腈、黄原胶、果胶、壳聚糖衍生物、葡聚糖、角叉菜胶、瓜尔胶、纤维素醚、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、透明质酸、白蛋白、淀粉或基于淀粉的衍生物。对于本公开的水溶性聚合物的另外的非限制性实例，参见Betageri，G.V，Kadajji，VG.，Polymers，2011，3，第1972-2009页。
如本文所用，术语“核酸”包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两者。RNA和/或DNA可以是直链的或支链的、单链的或双链的或者片段化的。RNA和DNA可以是细胞RNA(即，基因组RNA)、细胞DNA(即，基因组DNA)、无细胞RNA、无细胞DNA或它们的组合。核酸存在于生物样品，尤其是血液样品中。
如本文所用，术语“生物样品”是指从生物来源获得的包含核酸和/或细胞的样品，包括实验室来源的或经实验室修饰的细胞。生物样品可以是细胞、培养物或组织样品。另外，生物样品可以来源于体液，例如，血液、血浆、血清、尿液、唾液、粪便、母乳、泪液、汗液、脑脊液、滑液、精液、阴道液、腹水、羊水或细胞培养基。
如本文所用，术语“防腐剂”是指添加至生物样品中，抑制、防止或减缓该样品中的核酸的降解和/或细胞裂解的组合物。
如本文所用，术语“经处理的生物样品”是指已经与本公开的防腐剂组合物组合的生物样品。
如本文所用，术语“细胞”是指可以存在于血液或其他生物样品中的任何细胞。细胞的类型包括但不限于干细胞、骨细胞、血细胞(例如，红细胞或白细胞)、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞(CTC)以及实验室来源的和/或经修饰的细胞。
本公开的防腐剂组合物
本公开的组合物可用于保存和稳定生物样品中的核酸和/或细胞。当将本公开的防腐剂组合物添加至含有核酸和/或细胞的生物样品中时，与未经处理的生物样品相比，该样品中的核酸的降解和/或细胞裂解得以减少、减缓或防止，从而允许通过本领域已知的常规技术，尤其是高通量技术进行样品中的核酸和/或细胞的后续分离和更准确分析。另外，本公开的防腐剂组合物抑制、减缓或减少细胞裂解，从而允许样品中的无细胞的核酸在长时间内保持量和特性的更高的一致性。根据本公开，经处理的生物样品中的细胞裂解的减少还减少了核酸酶的释放，从而进一步防止或减少样品内的核酸和/或细胞的降解。可以通过本公开的组合物保存的核酸包括RNA、DNA或它们的组合。RNA和DNA可以是细胞的或无细胞的或它们的组合，即细胞RNA、细胞DNA、无细胞RNA、无细胞DNA或它们的组合。优选地，DNA和/或RNA是无细胞DNA和/或RNA。使用本公开的组合物和方法减少裂解的细胞可以是但不限于干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞以及实验室来源的或经修饰的细胞。
在第一方面，本公开涉及一种核酸和细胞防腐剂组合物，所述核酸和细胞防腐剂组合物包含：
a.任选的一种或多种渗透剂
b.一种或多种酶抑制剂；
c.任选的一种或多种代谢抑制剂；
d.任选的一种或多种细胞表面重塑聚合物；
e.任选的一种或多种选自由以下各项组成的组的试剂：羟乙基淀粉、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)的聚合物、Ficoll、蛋白质胶体、非蛋白质合成胶体、乙二醇、丙二醇、水溶性聚合物和羧甲基纤维素或者它们中的任一者的盐；以及；
f.任选的聚丙二醇(PPG)；
其中存在至少一种细胞表面重塑聚合物(d)或试剂(e)，并且其中所述任选的一种或多种渗透剂和所述一种或多种酶抑制剂以足以产生高渗溶液的组合量存在。
在第二方面，本公开涉及一种核酸和细胞防腐剂组合物，所述核酸和细胞防腐剂组合物包含：
a.一种或多种酶抑制剂；
b.任选的一种或多种代谢抑制剂；
c.任选的一种或多种细胞表面重塑聚合物；
d.任选的一种或多种选自由以下各项组成的组的试剂：羟乙基淀粉、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)的聚合物、Ficoll、蛋白质胶体、非蛋白质合成胶体、乙二醇、丙二醇、水溶性聚合物和羧甲基纤维素或者它们中的任一者的盐；以及；
e.任选的聚丙二醇(PPG)；
其中存在至少一种细胞表面重塑聚合物(c)或试剂(d)，并且其中所述一种或多种酶抑制剂以足以产生高渗溶液的量存在。
在第三方面，本公开涉及一种核酸和细胞防腐剂组合物，所述核酸和细胞防腐剂组合物包含：
a.一种或多种酶抑制剂；
b.任选的一种或多种代谢抑制剂；
c.一种或多种细胞表面重塑聚合物；以及
d.任选的聚丙二醇(PPG)；
其中所述一种或多种酶抑制剂以足以产生高渗溶液的量存在。
在本公开的第一方面的一些实施方案中，酶抑制剂中的一种或多种还充当渗透剂。
在本公开的第一和其他方面(不限于本文提及的第二至第八方面)的一些实施方案中，不存在任选的一种或多种渗透剂，但是存在可以充当渗透剂的一种或多种酶抑制剂。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，不存在血浆增容剂。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，一种或多种酶抑制剂以按组合物的重量计约0.5％至约30％的量，在一些方面，以按组合物的重量计约0.5％至约5％的量，并且在其他方面，以按组合物的重量计约1％至约30％的量存在于本公开的防腐剂组合物中。在一些实施方案中，酶抑制剂以按组合物的重量计约1％至约20％的量存在。在其他实施方案中，酶抑制剂以按组合物的重量计约1％至约10％的量存在。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，一种或多种酶抑制剂选自由以下各项组成的组：乙二胺四乙酸(EDTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、柠檬酸、草酸盐、金精三羧酸(ATA)、酒石酸、葡萄糖二酸或它们中的任一者的盐。盐包括但不限于一价、二价、三价或四价钠盐和钾盐或者它们的混合物。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，一种或多种任选的代谢抑制剂以按组合物的重量计约0.01％至约10％的量存在于本公开的防腐剂组合物中。在一些实施方案中，任选的代谢抑制剂以按组合物重量计约0.01％至约5％的量存在。在一些实施方案中，任选的代谢抑制剂以按组合物重量计约0.01％至约2％的量存在。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，一种或多种任选的代谢抑制剂是叠氮化钠、硫柳汞、普洛林或氯己定。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，一种或多种任选的试剂是Ficoll。在一些实施方案中，Ficoll是Ficoll-400。
不希望受理论的束缚，Ficoll充当拥挤剂，迫使细胞离开溶液，从而防止或减少细胞裂解和随后的细胞降解或细胞的核酸释放至样品中，否则可能会污染例如样品内的无细胞的核酸。随后可以通过本领域已知的常规方法来分离和更准确地分析核酸和/或细胞。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，Ficoll以按组合物重量计约10％至约50％的量存在。在一些实施方案中，一种或多种试剂以按组合物的重量计约10％至约40％、或按组合物的重量计约15％至约35％、或按组合物的重量计约20％至约30％的量存在。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，一种或多种细胞表面重塑聚合物选自由以下各项组成的组：N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和硼酸的共聚物、精甘天冬氨酸(RGD)三肽聚合物衍生物、绿豆植物血球血凝素和携带甘露糖6磷酸受体的重复配体的合成糖肽。在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，细胞表面重塑聚合物中的一种或多种是表面活性剂。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，细胞表面重塑聚合物是泊洛沙姆。在一些实施方案中，细胞表面重塑聚合物是泊洛沙姆p188。在一些实施方案中，细胞表面重塑聚合物是泊洛沙姆p407。在一些实施方案中，细胞表面重塑聚合物是泊洛沙姆p188和泊洛沙姆p407的组合。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，一种或多种细胞表面重塑聚合物以按组合物的重量计约10％至约40％的量存在于本公开的组合物中。在一些实施方案中，当细胞表面重塑聚合物是泊洛沙姆时，泊洛沙姆以按组合物的重量计约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约25％、约10％至约20％、约15％至约20％、约15％或约30％的量存在。在一些实施方案中，当细胞表面重塑聚合物是泊洛沙姆p188和泊洛沙姆p407的组合时，组合以按组合物的重量计约10％至约40％或约30％的量存在。在一些实施方案中，当细胞表面重塑聚合物是泊洛沙姆p188和泊洛沙姆p407的组合时，每种泊洛沙姆以按组合物的重量计15％的量存在。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，存在一种或多种细胞表面重塑聚合物，并且不存在任选的试剂。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，存在一种或多种任选的试剂，并且也存在一种或多种细胞表面重塑聚合物。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，任选的聚丙二醇(PPG)以按组合物的重量计约0.1％至10％的量存在。在一些实施方案中，任选的PPG以按组合物的重量计约5％至约10％、或按组合物的重量计约1％至约5％、或按组合物的重量计约0.1％至约1％的量存在。
在本公开的第一和其他方面的一些实施方案中，本公开的防腐剂组合物的一种或多种组分可以起到防腐剂组合物的其他组分中的一种或多种的作用或功能。
在本公开方面的一些实施方案中，防腐剂组合物的一种或多种组分可以起到防腐剂组合物的其他组分中的一种或多种的作用或功能。例如，酒石酸或葡萄糖二酸或EDTA或它们的盐可以作为酶抑制剂、渗透剂或它们两者存在于本公开的组合物中。
在一些实施方案中，本公开涉及一种核酸和细胞防腐剂组合物，所述核酸和细胞防腐剂组合物包含：
a.1.57重量％EDTA或其盐；
b.15.00重量％泊洛沙姆p188；和
c.15.00重量％泊洛沙姆p407；其中所述EDTA或其盐以足以产生高渗溶液的量存在。
在一些实施方案中，本公开涉及一种核酸和细胞防腐剂组合物，所述核酸和细胞防腐剂组合物包含：
a.2.5重量％EDTA或其盐；
b.15.00重量％泊洛沙姆p188；和
c.15.00重量％泊洛沙姆p407；其中所述EDTA或其盐以足以产生高渗溶液的量存在。
根据本公开的各个方面的防腐剂组合物可以是冻干粉末、颗粒、片剂的形式，或者作为溶液(例如，其中防腐剂组合物在合适的媒介物中复原)。冻干粉末、颗粒和/或片剂可以直接添加至生物样品中或者可以在添加至生物样品之前复原。冻干粉末、颗粒和/或片剂可以例如通过将组合物溶解于合适的媒介物中来复原。合适的媒介物包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、植物来源的不挥发性油、脂肪酸的单甘油酯和脂肪酸的二甘油酯、乙醇、甘油和丙二醇。或者，可以将生物样品直接添加至冻干粉末、颗粒、片剂或复原的组合物(即，溶液)中。在一些实施方案中，当生物样品来源于体液时，体液可以作为用于溶解防腐剂组合物的可接受的媒介物。例如，冻干粉末、颗粒和/或片剂形式的防腐剂组合物可以与体液组合，从而被体液溶解。在一些实施方案中，在将生物样品采集到管或容器中之前，采集管或容器含有冻干粉末、颗粒、片剂或溶液形式的防腐剂组合物。
在一些实施方案中，本公开的防腐剂组合物是水溶液的形式。水溶液可以与生物样品组合，或者生物样品可以与水溶液组合。
防腐剂组合物和生物样品的组合以及保存生物样品的核酸和/或细胞的方法
在第四方面，本公开涉及一种本公开的防腐剂组合物和生物样品的组合。
在第五方面，本公开涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的方法，所述方法包括将本公开的防腐剂组合物与所述生物样品组合的步骤。
在第四和第五方面的一些实施方案中，生物样品是细胞或组织样品。
在第四和第五方面的一些实施方案中，生物样品来源于体液。在一些实施方案中，体液是血液、血浆、血清、尿液、唾液、粪便、母乳、泪液、汗液、脑脊液、滑液、精液、阴道液、腹水或羊水。在一个优选的实施方案中，生物流体是血液，例如，全血或其级分。生物样品可以包含细胞或者可以是无细胞的。
在第四和第五方面的一些实施方案中，生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞或循环肿瘤细胞。
在第四和第五方面的一些实施方案中，生物样品包含核酸，所述核酸选自RNA、DNA或它们的组合。在一些实施方案中，核酸是无细胞RNA、无细胞DNA或它们的组合。在一些实施方案中，核酸是细胞RNA、细胞DNA或它们的组合。
生物样品可以以多种方式与本公开的防腐剂组合物组合。例如，可以将生物样品采集到合适的容器中，然后例如通过注射器或移液器将防腐剂组合物添加至该容器中。或者，可以在生物样品的采集之前将防腐剂组合物添加至用于生物样品采集的合适的容器中。在一些实施方案中，将防腐剂组合物添加至生物样品中。在一些实施方案中，将生物样品添加至防腐剂组合物中。
这些各个方面的公开内容还考虑了其中将防腐剂组合物的组分同时或单独添加至生物样品中的方法。因此，在一些实施方案中，本公开涉及保存生物样品中的核酸和/或细胞的方法，所述方法包括使生物样品以任何顺序或同时与本公开的防腐剂组合物的构成组分接触。在一些实施方案中，用于生物样品的采集的合适的容器已经含有防腐剂组合物的组分中的一种或多种，并且将其余的组分按顺序或在采集生物样品的同时添加至生物样品中。例如，已经含有合适的酶抑制剂(例如，酒石酸、或者EDTA或其盐、或者葡萄糖二酸)的采血管可以用于采集生物样品。在采集生物样品之后，可以将其余的组分添加至生物样品中。在另一个实施方案中，在采集生物样品之后，将防腐剂组合物的组分按顺序或同时添加至生物样品中。在一些实施方案中，在使用容器采集样品之前，防腐剂组合物的所有必需组分和任选地任选组分均存在于容器中。
在一些实施方案中，用于样品采集的容器含有冻干粉末形式的防腐剂组合物。在一些实施方案中，用于样品采集的容器含有颗粒形式的防腐剂组合物。在一些实施方案中，用于样品采集的容器含有片剂形式的防腐剂组合物。在一些实施方案中，用于样品采集的容器含有防腐剂组合物和合适的媒介物。在一些实施方案中，用于样品采集的容器含有水溶液形式的防腐剂组合物。在另一个实施方案中，用于血液样品采集的容器还包含抗凝剂。抗凝剂的实例包括但不限于EDTA(它也可以充当酶抑制剂)、柠檬酸钠、柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)、肝素锂、肝素钠、氟化钠、柠s檬酸右旋糖(ACD)和聚茴香脑磺酸钠。在一些实施方案中，合适的容器是抽成真空的血液样品采集管。
可以与生物样品组合的防腐剂组合物的量可以由本领域的技术人员通过常规实验来确定。在一些实施方案中，防腐剂组合物与生物样品的比率可以为约1∶10至约1∶1 v/v。在一些实施方案中，防腐剂组合物与生物样品的比率为约1∶8至约1∶2 v/v。在一些实施方案中，防腐剂组合物与生物样品的比率为约1：6至约1：3 v/v。在一些实施方案中，防腐剂组合物与生物样品的比率为约1∶5至约1∶4 v/v。
在生物样品被采集并且与本公开的防腐剂组合物接触之后，可以使用本领域的技术人员已知的方法从生物样品中分离核酸和/或细胞以用于分析。此类方法可以包括提取、离心和色谱方法。本领域的技术人员将认识到，存在很多可以用于从生物样品中分离核酸和/或细胞的方法。
使用本公开的防腐剂组合物来保存的核酸和/或细胞可以在多种温度条件下长期储存后从经处理的生物样品中分离。在一些实施方案中，已经与本公开的防腐剂组合物接触的生物样品可以在环境条件或低温下储存至少1天、至少1周、至少2周、至少3周或至少4周。在一些实施方案中，本公开的组合物允许在约-20℃至约30℃的范围内的温度下长时间保存生物样品(即，生物样品中的核酸和/或细胞)。在一些实施方案中，防腐剂组合物能够在环境处保存生物样品(即，生物样品中的核酸和/或细胞)至少1周、至少2周、至少3周或至少4周。在一些实施方案中，防腐剂组合物能够在环境温度处保存生物样品至少2周。在一些实施方案中，本公开的防腐剂组合物能够在4℃处保存生物样品(即，生物样品中的核酸和/或细胞)至少1周、至少2周、至少3周或至少4周。在一些实施方案中，本公开的防腐剂组合物能够在-20℃处保存生物样品(即，生物样品中的核酸和/或细胞)至少1周、至少2周、至少3周或至少4周。使用本公开的组合物和方法保存的核酸(RNA和DNA)显示出良好的收率、纯度、完整性以及RNA可扩增性。
用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒
根据本公开的防腐剂组合物可以作为由使用者接收的试剂盒的一部分提供。试剂盒允许本公开的防腐剂组合物容易地与生物样品组合，以使得该生物样品中存在的核酸和/或细胞得以长时间保存，例如保存至少1周、至少2周、至少3周或至少4周。可以提供防腐剂组合物，以使得该防腐剂组合物可在采集生物样品后与生物样品组合。或者，提供防腐剂组合物，以使得该防腐剂组合物在采集生物样品时与生物样品混合。
在一些实施方案中，防腐剂组合物作为分配装置中的水溶液提供。在一些实施方案中，分配装置是注射器。在一些实施方案中，分配装置中的防腐剂的量是预定量，以使得与生物样品组合的防腐剂组合物的比率能够在长时间内保存该样品的核酸和/或细胞。试剂盒可以另外包括可附接至所述注射器的针。在一些实施方案中，试剂盒用于保存血液样品中的核酸和/或细胞，并且还包括任选地含有抗凝剂的采血管。任选的抗凝剂的量可以是预先确定的，以使得在从所采集的血液样品中分离细胞或核酸之前，所述血液样品表现出减少或最少的凝血。技术人员可以使用常规方法容易地确定这些量。
在一些实施方案中，防腐剂组合物以密封的安瓿瓶提供，其中所述安瓿瓶包括可移除的封闭件，并且其中所述安瓿瓶被构造为在使用者移除封闭件时容纳分配装置。在一些实施方案中，分配装置是移液器或注射器。在一些实施方案中，试剂盒用于保存血液样品中的核酸和/或细胞，并且还包括含有抗凝剂的采血管。
在另外的实施方案中，试剂盒涉及保存血液样品中的核酸和/或细胞，并且包括采血管，所述采血管任选地含有预定量的抗凝剂和预定量的本公开的防腐剂组合物。
在第六方面，本公开涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.本文公开的防腐剂组合物；以及
b.任选的，所述防腐剂组合物的使用说明。
在第七方面，本公开涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.血液或其他生物样品采集管，所述血液或其他生物样品采集管任选地含有抗凝剂；
b.注射器，所述注射器含有本公开的防腐剂组合物；以及
c.任选的，可附接至所述注射器的针。
在第八方面，本公开涉及一种用于保存生物样品中的核酸和/或细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.血液或其他生物样品采集管，所述血液或其他生物样品采集管任选地含有抗凝剂；以及
b.密封的安瓿瓶，所述密封的安瓿瓶含有本公开的防腐剂，其中所述安瓿瓶包括可移除的封闭件，并且其中所述安瓿瓶被构造为在使用者移除所述封闭件时容纳分配装置。
在第六至第八方面的一些实施方案中，生物样品是细胞或组织样品。
在第六至第八方面的一些实施方案中，生物样品来源于体液。在一些实施方案中，体液是血液、血浆、血清、尿液、唾液、粪便、母乳、泪液、汗液、脑脊液、滑液、精液、阴道液、腹水或羊水。在一些实施方案中，体液是全血或其级分。生物样品可以包含细胞或者可以是无细胞的。
在第六至第八方面的一些实施方案中，生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞或它们的组合。
在第六至第八方面的一些实施方案中，生物样品包含核酸，所述核酸选自RNA、DNA或它们的组合。在一些实施方案中，核酸是无细胞RNA、无细胞DNA或它们的组合。在一些实施方案中，核酸是细胞RNA、细胞DNA或它们的组合。
等同物
上文的描述和下文的实施例详述了本公开的某些特定实施方案，并且描述了发明人所设想的实践本公开的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容在文本中如何详述，本公开都可以以多种方式实践，并且本公开应根据所附实施方案以及它们的任何等同物来解释。
虽然已经参考各种应用、方法、化合物和组合物描述了本公开，但是应当理解，在不背离本文的公开内容的情况下可以进行各种改变和修改。提供以下实施例以便更好地说明本公开，并且所述实施例不旨在限制本文提供的教导的范围。虽然已经根据这些示例性实施方案描述了本公开，但是技术人员将容易地理解，在不进行过度实验的情况下，对这些示例性实施方案进行的多种变化和修改是可能的。所有此类变化和修改都在当前公开的范围内。
实施例
实施例1-组合物
本公开的防腐剂组合物如表1所示：
表1：防腐剂组合物1-12
化学物质 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
泊洛沙姆p188 23.030％ 30.000％ 26.960％ 23.030％ 26.960％ 30.00％ 30.000％ 15.000％ 15.000％ 30.000％ 15.000％ 15.000％
泊洛沙姆p407 9.545％ - 9.545％ 9.545％ 9.545％ 15.000％ 15.000％ 15.000％ 15.000％ 15.000％ 15.000％ 15.000％
Ficoll 1.545％ - 1.545％ - - - - - - 1.500％ 1.500％ 3.000％
2Na-EDTA 0.706％ 1.125％ 0.710％ 0.706％ 0.710％ 0.706％ 1.125％ 0.706％ 1.125％ 0.706％ 0.706％ 0.706％
4Na-EDTA 0.863％ 1.375％ 0.868％ 0.863％ 0.868％ 0.863％ 1.375％ 0.863％ 1.375％ 0.863％ 0.863％ 0.863％
EDTA(总计) 1.570％ 2.500％ 1.579％ 1.570％ 1.579％ 1.570％ 2.500％ 1.570％ 2.500％ 1.570％ 1.570％ 1.570％
实施例2-血浆体积的分析
将来自各种供体的血液样品采集到血液样品采集管中，以评估用根据本公开的防腐剂组合物处理的样品的血浆体积。通过将血液样品添加至含有2mL防腐剂组合物的管中来测试防腐剂组合物。
然后将组合的防腐剂组合物和血液样品在室温和425g处离心约15分钟，以使得在采集管中形成沉淀。然后，在不干扰分离的组分的情况下，使用移液管将上层血浆层(上清液)转移至单独的采集管中。然后将转移的上清液在4℃和16,000g处再次离心约15分钟，以除去任何意外转移的细胞碎片或沉淀物，并且测量残留血浆的体积。测量的体积在本文中称为“血浆体积”。
不希望受理论的束缚，预期“血浆体积”是促进在高通量应用中使用本公开的方面的重要因素。在这些应用中使用自动化和机器人技术需要一致的血浆体积，理想地在3-6mL之间。
观察到根据上述程序处理并且保存在含有组合物1-5、8-9和11-12的管中的混合物的“血浆体积”在2天后在4.3-4.9mL的范围内，在7天后在4.1-5.2mL的范围内，在14天后在4.2-5.0mL的范围内，在21天后在4.5-5.1mL的范围内。所有均在期望的范围内。
实施例3-分离的cfDNA和RNA的完整性的分析
将来自各种供体的血液样品采集到血液样品采集管中，以评估本公开的防腐剂组合物的实施方案保存cfDNA和RNA的能力。通过将血液样品添加至含有2mL防腐剂组合物的管中来测试防腐剂组合物。
使用本领域已知的提取和分离技术从样品中分离cfDNA和RNA。一种这样的cfDNA提取方法涉及使用MagMAXTM无细胞DNA分离试剂盒。一种这样的RNA提取方法涉及使用基于Beckman Coulter的RNAdvance血液试剂盒的程序。
在第1天和随后几天对分离的cfDNA和RNA进行分析，并且在第0天采集血液。分析核酸的完整性以评估防腐剂组合物的特征。
cfDNA完整性
通过长和短DNA片段的qPCR来分析cfDNA的完整性，并且通过长片段与短片段的比率(222bp/90bp)来表征cfDNA的完整性。所得的比率在本文中称为DNA完整性数(DIN)。DIN是cfDNA质量的客观指标。当DIN＜0.5时，cfDNA被认为是纯的(即，血浆未受到gDNA(细胞的或基因组DNA)的污染)。
制备gDNA的10倍稀释系列(1ng/μL至0.01ng/μL)以用于标准曲线分析。通过将5μL100μM正向引物、5μL 100μM反向引物与90μL无核酸酶的水混合来制备5μM浓度的正向和反向引物混合物。
分别用1μL标准品或cfDNA样品和8μL无核酸酶的水来制备两种单独的混合物，以用于混合物#1中的1次反应，并且用1μL引物混合物和10μL 2X PowerTrack SYBR绿色标准混合物(ThermoFisher Scientific)来制备两种单独的混合物，以用于混合物#2中的1次反应。将9μL混合物#1和11μL混合物#2添加至96孔光学板的孔中以运行实时PCR。热循环条件列于下表中。
RNA完整性
来自样品的RNA的完整性使用琼脂糖凝胶电泳通过BioAnalyzer来分析，并且通过RNA完整性数(RIN)来表征。RIN是总RNA质量的客观指标，范围为10(高度完整的RNA)至1(完全降解的RNA)。
使用表1的组合物保存的血液样品中的cfDNA的性质：
从保存在含有组合物1-5、8-9和11-12的管中的血液样品提取的cfDNA的完整性(即，DIN)通常较高。观察到来自qPCR测定法的长片段与短片段的比率(222bp/90bp)在2天后在＜0.1-0.5的范围内、在7天后在＜0.1-0.2的范围内、在14天后在＜0.1-0.2的范围内，在21天后在＜0.1-0.21的范围内。
使用表1的组合物保存的血液样品中的RNA的性质：
从保存在含有组合物1-5、8-9和11-12的管中的血液样品分离的RNA的RIN通常较高，因为观察到它们的RIN在第2天在9.3-8.8的范围内，在第3天在8.8-8.4的范围内，在第5天在8.2-7.6的范围内，在第7天在8.0-6.9的范围内，在第10天在7.4-5.2的范围内。
本文所述的单独的实施方案中的任一者可以在本发明的一个或多个实施方案中单独或组合使用。

Claims (92)

1.一种防腐剂组合物，所述防腐剂组合物包含：
a.任选的一种或多种渗透剂；
b.一种或多种酶抑制剂；
c.任选的一种或多种代谢抑制剂；
d.任选的一种或多种细胞表面重塑聚合物；
e.任选的一种或多种选自由以下各项组成的组的试剂：羟乙基淀粉、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)的聚合物、Ficoll、蛋白质胶体、非蛋白质合成胶体、乙二醇、丙二醇、水溶性聚合物和羧甲基纤维素或者它们中的任一者的盐；以及
f.任选的聚丙二醇(PPG)；
其中存在至少一种细胞表面重塑聚合物(d)或试剂(e)，并且其中所述任选的一种或多种渗透剂和所述一种或多种酶抑制剂以足以产生高渗溶液的组合量存在。
2.一种防腐剂组合物，所述防腐剂组合物包含：
a.一种或多种酶抑制剂；
b.任选的一种或多种代谢抑制剂；
c.任选的一种或多种细胞表面重塑聚合物；
d.任选的一种或多种选自由以下各项组成的组的试剂：羟乙基淀粉、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)的聚合物、Ficoll、蛋白质胶体、非蛋白质合成胶体、乙二醇、丙二醇、水溶性聚合物和羧甲基纤维素或者它们中的任一者的盐；以及
e.任选的聚丙二醇(PPG)；
其中存在至少一种细胞表面重塑聚合物(c)或试剂(d)，并且其中所述一种或多种酶抑制剂以足以产生高渗溶液的量存在。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的防腐剂组合物，其中不存在血浆增容剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的防腐剂组合物，其中存在所述一种或多种任选的细胞表面重塑聚合物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的防腐剂组合物，其中不存在所述一种或多种任选的试剂。
6.根据权利要求1所述的防腐剂组合物，其中所述酶抑制剂中的一种或多种还充当渗透剂。
7.根据权利要求2所述的防腐剂组合物，其中除了还充当渗透剂的一种或多种酶抑制剂之外，不存在渗透剂。
8.根据权利要求6所述的防腐剂组合物，其中还充当渗透剂的所述一种或多种酶抑制剂和所述渗透剂以足以产生高渗溶液的量存在。
9.根据权利要求2或8所述的防腐剂组合物，其中所述一种或多种酶抑制剂以按所述组合物的重量计约0.5％至约30％、约1％至约10％、约1.5％至约5％或约1.5％至约2.5％的量存在于所述防腐剂组合物中。
10.根据权利要求9所述的防腐剂组合物，其中所述一种或多种酶抑制剂选自由以下各项组成的组：乙二胺四乙酸(EDTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、柠檬酸、草酸盐、金精三羧酸(ATA)、酒石酸、葡萄糖二酸或它们中的任一者的盐。
11.根据权利要求10所述的防腐剂组合物，其中所述酶抑制剂是乙二胺四乙酸(EDTA)或其一价盐、二价盐、三价盐或四价盐。
12.根据权利要求11所述的防腐剂组合物，其中所述EDTA或其盐以按所述组合物的重量计约1.5％至约2.5％的量存在。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的防腐剂组合物，其中所述一种或多种任选的代谢抑制剂是叠氮化钠、硫柳汞、普洛林或氯己定。
14.根据权利要求1至4或6至13中任一项所述的防腐剂组合物，其中所述一种或多种任选的试剂是Ficoll。
15.根据权利要求14所述的防腐剂组合物，其中所述Ficoll是Ficoll400。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的防腐剂组合物，其中所述任选的细胞表面重塑聚合物是表面活性剂。
17.根据权利要求16所述的防腐剂组合物，其中所述表面活性剂是泊洛沙姆。
18.根据权利要求17所述的防腐剂组合物，其中所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆p188和泊洛沙姆p407中的一者或两者。
19.根据权利要求18所述的防腐剂组合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆p188。
20.根据权利要求18所述的防腐剂组合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆p407。
21.根据权利要求18所述的防腐剂组合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆p188和泊洛沙姆p407的组合。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的防腐剂组合物，其中所述泊洛沙姆以按所述组合物的重量计约10％至约50％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约25％、约10％至约20％、约15％至约20％或约15％或30％的量存在。
23.根据权利要求22所述的防腐剂组合物，其中所述泊洛沙姆p188和所述泊洛沙姆p407中的每者以按所述组合物的重量计约15重量％的量存在。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的防腐剂组合物，其中所述任选的聚丙二醇(PPG)以按所述组合物的重量计约0.1％至约10％的量存在。
25.一种防腐剂组合物，所述防腐剂组合物包含：
a.一种或多种酶抑制剂；
b.任选的一种或多种代谢抑制剂；
c.一种或多种细胞表面重塑聚合物；以及
d.任选的聚丙二醇(PPG)；
其中所述一种或多种酶抑制剂以足以产生高渗溶液的量存在。
26.根据权利要求25所述的防腐剂组合物，其中不存在渗透剂。
27.根据权利要求25或26中任一项所述的防腐剂组合物，其中不存在血浆增容剂。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的防腐剂组合物，其中不存在选自由以下各项组成的组的试剂：羟乙基淀粉、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)的聚合物、Ficoll、蛋白质胶体、非蛋白质合成胶体、乙二醇、丙二醇、水溶性聚合物和羧甲基纤维素或者它们中的任一者的盐。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的防腐剂组合物，其中所述一种或多种酶抑制剂以按所述组合物的重量计约0.5％至约30％、约1％至约10％、约1.5％至约5％或约1.5％至约2.5％的量存在于所述防腐剂组合物中。
30.根据权利要求29所述的防腐剂组合物，其中所述一种或多种酶抑制剂选自由以下各项组成的组：乙二胺四乙酸(EDTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、柠檬酸、草酸盐、金精三羧酸(ATA)、酒石酸、葡萄糖二酸或它们中的任一者的盐。
31.根据权利要求30所述的防腐剂组合物，其中酶抑制剂是乙二胺四乙酸(EDTA)或其一价盐、二价盐、三价盐或四价盐。
32.根据权利要求31所述的防腐剂组合物，其中所述EDTA或其盐以按所述组合物的重量计约1.5％至约2.5％的量存在。
33.根据权利要求25至32所述的防腐剂组合物，其中所述一种或多种任选的代谢抑制剂是叠氮化钠、硫柳汞、普洛林或氯己定。
34.根据权利要求25至33所述的防腐剂组合物，其中所述细胞表面重塑聚合物是表面活性剂。
35.根据权利要求34所述的防腐剂组合物，其中所述表面活性剂是泊洛沙姆。
36.根据权利要求35所述的防腐剂组合物，其中所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆p188和泊洛沙姆p407中的一者或两者。
37.根据权利要求36所述的防腐剂组合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆p188。
38.根据权利要求36所述的防腐剂组合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆p407。
39.根据权利要求36所述的防腐剂组合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆p188和泊洛沙姆p407的组合。
40.根据权利要求36至39所述的防腐剂组合物，其中所述泊洛沙姆以按所述组合物的重量计约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约25％、约10％至约约20％、约15％至约20％或约15％或30％的量存在。
41.根据权利要求40所述的防腐剂组合物，其中所述泊洛沙姆p188和所述泊洛沙姆p407中的每者以按所述组合物的重量计约15重量％的量存在。
42.根据权利要求25至41中任一项所述的防腐剂组合物，其中所述任选的聚丙二醇(PPG)以按所述组合物的重量计约0.1％至约10％的量存在。
43.一种防腐剂组合物，所述防腐剂组合物包含：
a.1.57重量％EDTA或其盐；
b.15.00重量％泊洛沙姆p188；和
c.15.00重量％泊洛沙姆p407；
其中所述EDTA或其盐以足以产生高渗溶液的量存在。
44.一种防腐剂组合物，所述防腐剂组合物包含：
a.2.5重量％EDTA或其盐；
b.15.00重量％泊洛沙姆p188；和
c.15.00重量％泊洛沙姆p407；
其中所述EDTA或其盐以足以产生高渗溶液的量存在。
45.根据权利要求43或44中任一项所述的防腐剂组合物，其中不存在渗透剂、血浆增容剂或选自由以下各项组成的组的试剂：羟乙基淀粉、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)的聚合物、Ficoll、蛋白质胶体、非蛋白质合成胶体、乙二醇、丙二醇、水溶性聚合物和羧甲基纤维素或者它们中的任一者的盐。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的防腐剂组合物，所述防腐剂组合物是冻干干粉的形式。
47.根据权利要求1至45中任一项所述的防腐剂组合物，防腐剂组合物是水溶液的形式。
48.一种根据权利要求1至47中任一项所述的防腐剂组合物和生物样品的组合。
49.根据权利要求48所述的组合，其中所述生物样品是细胞或组织样品。
50.根据权利要求48所述的组合，其中所述生物样品来源于体液。
51.根据权利要求50所述的组合，其中所述体液是全血或其多种级分中的一种。
52.根据权利要求48所述的组合，其中所述生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞或循环肿瘤细胞。
53.根据权利要求48所述的组合，其中所述生物样品包含核酸，所述核酸选自RNA、DNA或它们的组合。
54.根据权利要求53所述的组合，其中所述核酸是无细胞RNA、无细胞DNA或它们的组合。
55.根据权利要求53所述的组合，其中所述核酸是细胞RNA、细胞DNA或它们的组合。
56.根据权利要求50至55中任一项所述的组合，其中所述防腐剂组合物与所述生物样品的比率为约1：10至约1：1v/v。
57.根据权利要求58所述的组合，其中所述防腐剂组合物与所述生物样品的比率为约1：5至约1：4v/v。
58.根据权利要求52至57中任一项所述的组合，其中所述组合物能够在环境温度处保存生物样品中的所述核酸和/或细胞至少2周。
59.一种用于保存生物样品中的核酸和细胞中的一者或两者的方法，所述方法包括将根据权利要求1至47中任一项所述的防腐剂组合物与所述生物样品组合的步骤。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述生物样品是细胞或组织样品。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述生物样品来源于体液。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述体液是全血或其一种或多种级分。
63.根据权利要求59所述的方法，其中所述生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞或循环肿瘤细胞。
64.根据权利要求59所述的方法，其中所述生物样品包含核酸，所述核酸选自RNA、DNA或它们的组合。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述核酸是无细胞RNA、无细胞DNA或它们的组合。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述核酸是细胞RNA、细胞DNA或它们的组合。
67.根据权利要求59至66中任一项所述的方法，其中所述防腐剂组合物与所述生物样品的比率为约1：10至约1：1v/v。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述防腐剂组合物与所述生物样品的比率为约1：5至约1：4v/v。
69.一种用于保存生物样品中的核酸和细胞中的一者或两者的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.根据权利要求1至47中任一项所述的防腐剂组合物；以及
b.任选的，所述防腐剂组合物的使用说明。
70.根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述生物样品是细胞或组织样品。
71.根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述生物样品来源于体液。
72.根据权利要求71所述的试剂盒，其中所述体液是全血或其一种或多种级分。
73.根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞或它们的组合。
74.根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述生物样品包含核酸，所述核酸选自RNA、DNA或它们的组合。
75.根据权利要求74所述的试剂盒，其中所述核酸是无细胞RNA、无细胞DNA或它们的组合。
76.根据权利要求74所述的试剂盒，其中所述核酸是细胞RNA、细胞DNA或它们的组合。
77.一种用于保存生物样品中的核酸和细胞中的一者或两者的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.血液或其他生物样品采集管，所述血液或其他生物样品采集管任选地含有预定量的任选的抗凝剂；
b.一种注射器，所述注射器含有预定量的根据权利要求1至47中任一项所述的防腐剂组合物；以及
c.任选的，可附接至所述注射器的针。
78.根据权利要求77所述的试剂盒，其中所述生物样品是细胞或组织样品。
79.根据权利要求77所述的试剂盒，其中所述生物样品来源于体液。
80.根据权利要求79所述的试剂盒，其中所述体液是全血或其一种或多种级分。
81.根据权利要求77所述的试剂盒，其中所述生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞或它们的组合。
82.根据权利要求77所述的试剂盒，其中所述生物样品包含核酸，所述核酸选自RNA、DNA或它们的组合。
83.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述核酸是无细胞RNA、无细胞DNA或它们的组合。
84.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述核酸是细胞RNA、细胞DNA或它们的组合。
85.一种用于保存生物样品中的核酸和细胞两者中的一者的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.血液或其他生物样品采集管，所述血液或其他生物样品采集管任选地含有预定量的抗凝剂；以及
b.一种密封的安瓿瓶，所述密封的安瓿瓶含有预定量的根据权利要求1至47中任一项所述的防腐剂组合物，其中所述安瓿瓶包括可移除的封闭件，并且其中所述安瓿瓶被构造为在使用者移除所述封闭件时容纳分配装置。
86.根据权利要求85所述的试剂盒，其中所述生物样品是细胞或组织样品。
87.根据权利要求85所述的试剂盒，其中所述生物样品来源于体液。
88.根据权利要求87所述的试剂盒，其中所述体液是全血或其一种或多种级分。
89.根据权利要求85所述的试剂盒，其中所述生物样品包含干细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、内皮细胞、生殖细胞、胰腺细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞或它们的组合。
90.根据权利要求85所述的试剂盒，其中所述生物样品包含核酸，所述核酸选自RNA、DNA或它们的组合。
91.根据权利要求90所述的试剂盒，其中所述核酸是无细胞RNA、无细胞DNA或它们的组合。
92.根据权利要求90所述的试剂盒，其中所述核酸是细胞RNA、细胞DNA或它们的组合。
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Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1305040B1 (en) * 2000-07-28 2009-09-09 Christopher J. Murphy Transplant media
US20080039416A1 (en) * 2004-06-02 2008-02-14 Ho Steffan N Methods for Treating Disease by Modulating an Osmotic Stress Pathway
US8747872B2 (en) * 2007-05-02 2014-06-10 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same
JP7344631B2 (ja) * 2015-02-09 2023-09-14 アボゲン， インコーポレイティド サンプル収集関連応用、分析および診断のためのデバイス、溶液および方法
IL299326A (en) * 2015-08-18 2023-02-01 Astellas Inst For Regenerative Medicine Clinical formulations
US10933096B2 (en) * 2017-12-22 2021-03-02 Aesthetics Biomedical, Inc. Biologic preserving composition and methods of use
WO2021030452A1 (en) * 2019-08-14 2021-02-18 Decibel Therapeutics, Inc. Permeation enhancers, compositions containing them, and methods of using the same
JP2023524649A (ja) * 2020-04-20 2023-06-13 エスアイオー２ メディカル プロダクツ，インコーポレイテッド 核酸及び細胞保存剤組成物並びに使用方法

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