JP2023510252A - 核酸及び細胞保存剤組成物並びに使用方法 - Google Patents

核酸及び細胞保存剤組成物並びに使用方法 Download PDF

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Abstract

核酸及び細胞保存剤組成物。血液又は他の生物学的試料中の核酸及び／又は細胞を保存する方法並びに血液又は他の生物学的試料中の核酸及び／又は細胞を保存するためのキットも記載される。保存剤組成物、方法及びキットは、良好な収率、純度、完全性及びＲＮＡに関して増幅能を示す、無数の生物学的試料からのゲノム並びにセルフリーのＤＮＡ及びＲＮＡの単離を提供する。

Description

様々な診断目的のために、ＤＮＡ及びＲＮＡの配列、構造又は発現の変化を分析する多くの核酸ベースの試験が使用されている。実際、核酸は、非侵襲性の生物医学的研究のための一般的な検査対象である。しかしながら、生物学的試料が収集された後、その試料内の核酸、例えばＲＮＡ及びＤＮＡは、細胞／ゲノムの核酸であろうとセルフリー核酸であろうと、分解を始める。さらに、遺伝子誘導及び遺伝子転写物の分解は、血液又は他の生物学的試料収集の数分以内に起こり始め、それは、試料収集時点での試料の遺伝子発現の正確な分析を困難なものにする。さらに、一般に、血液又は他の生物学的試料が新鮮であるほど、その試料の核酸の品質が良好である。これは、対象の血液又は生物学的試料の核酸を分析する際に問題となる。血液及び他の生物学的試料は、分析される場所及び時点と異なる場所及び非常に異なる時点で収集される場合が多い。この理由のため、血液又は他の生物学的試料は、収集後、それらが分析され得る前に貯蔵され、輸送される必要がある。血液及び他の生物学的試料が収集された後に生じる核酸の急速な分解のため、試料の核酸の分析時点での高品質を確実なものにするために、試料中に存在する核酸を保存する方法が必要とされている。
血液又は他の生物学的試料中のセルフリー核酸の場合、収集する場所及び時点と、分析する場所及び時点とが異なることにより、さらなる問題、すなわち細胞溶解の問題が生じる。収集された試料における細胞溶解は、細胞核酸によるセルフリー核酸プロファイルの汚染をもたらすおそれがあり、生物学的試料中のセルフリー核酸を正確に分析することを困難にする。細胞溶解は、血液又は他の生物学的試料が収集された直後に起こり始める。これは、試料を分析する前に長期間保存する必要がある場合に問題となる。したがって、血液及び他の生物学的試料は、その核酸のセルフリープロファイルが維持されるように保存することがさらに必要である。
同様に、細胞（例えば、生物学的試料中の循環腫瘍細胞）の検出又は分析に基づく診断適用のために、それらの細胞をインタクトな形態で保存することが重要である。
一態様では、本開示は、核酸及び細胞保存剤組成物であって、
ａ．１種以上の浸透圧剤、
ｂ．１種以上の酵素阻害剤、
ｃ．任意選択により、１種以上の代謝阻害剤、
ｄ．任意選択により、血漿増量剤、及び
ｅ．ヒドロキシエチルデンプン、Ｎ－ビニルピロリドン（ＮＶＰ）のポリマー、Ｆｉｃｏｌｌ、タンパク質コロイド、非タンパク質合成コロイド、エチレンジオール、プロピレングリコール、水溶性ポリマー及びカルボキシメチルセルロース又はその塩から選択される１種以上の薬剤
を含む核酸及び細胞保存剤組成物を対象とする。
別の態様では、本開示は、生物学的試料中の核酸を保存する方法であって、本開示の保存剤組成物と、生物学的試料とを組み合わせる工程を含む方法を対象とする。
一態様では、本開示は、生物学的試料中の細胞を保存する方法であって、本開示の保存剤組成物と、生物学的試料とを組み合わせる工程を含む方法を対象とする。
さらなる態様では、本開示は、生物学的試料中の核酸及び／又は細胞を保存するためのキットであって、
ａ．本明細書に開示される保存剤組成物、及び
ｂ．任意選択により、前記保存剤組成物の使用説明書
を含むキットを対象とする。
別の態様では、本開示は、生物学的試料中の核酸及び／又は細胞を保存するためのキットであって、
ａ．所定量の任意選択の抗凝固剤を任意選択により含有する、血液又は他の生物学的試料を収集するチューブ、
ｂ．所定量の、本明細書に開示される保存剤組成物を含有するシリンジ、及び
ｃ．任意選択により、前記シリンジに取り付け可能な針
を含むキットを対象とする。
さらなる態様では、本開示は、生物学的試料中の核酸及び／又は細胞を保存するためのキットであって、
ａ．任意選択により所定量の抗凝固剤を含有する、血液又は他の生物学的試料を収集するチューブ、及び
ｂ．所定量の、本明細書に開示される保存剤を含有するアンプル
を含み、前記アンプルは、取り外し可能な密閉部材を含み、前記アンプルは、使用者によって密閉部材が取り外されたときに分配手段を受け入れるように構成される、キットを対象とする。
別の態様では、本開示は、生物学的試料中の核酸及び／又は細胞を保存するためのキットであって、所定量の抗凝固剤及び本明細書に開示される保存剤組成物を任意選択により含有する収集チューブを含むキットを対象とする。
本開示の一態様では、核酸は、セルフリー（「ｃｆ」）ＤＮＡである。本開示の別の態様では、核酸は、細胞（すなわちゲノム又は「ｇ」）ＤＮＡである。
本開示の一態様では、核酸は、セルフリー（「ｃｆ」）ＲＮＡである。本開示の別の態様では、核酸は、細胞（すなわちゲノム又は「ｇ」）ＲＮＡである。
本開示の別の態様では、細胞は、幹細胞、骨細胞、血液細胞（例えば、赤血球及び／又は白血球）、筋細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、神経細胞、内皮細胞、性細胞、膵臓細胞、癌細胞、腫瘍細胞又は循環腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、実験室由来細胞又は改変細胞である。
定義
本明細書で別段の定義がない限り、本出願で使用される科学用語及び技術用語は、当業者が一般に理解している意味を有するものとする。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先される。
本出願及びその様々な実施形態及び態様を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含んでいる」などの変形は、記載された整数又は整数群を含むことを認めるが、他の任意の整数又は整数群を排除することを認めるものではないことが理解されるであろう。
用語「包含している」又は「包含する」は、「含むが、限定されない」を意味するために使用される。「含む」及び「含むが、限定されない」は、互換的に使用される。
「例えば」又は「例として」という用語に続く例は、本開示を網羅又は限定することを意味するものではない。
文脈上別段の要求がない限り、単数の用語は、複数を含み、複数の用語は、単数を含むものとする。
冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、本明細書では、冠詞の文法上の目的語の１つ又は２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を指すために使用される。
本明細書に開示される全ての範囲は、その中に含まれるあらゆる部分範囲を包含すると理解されるべきである。例えば、「１～１０」と記載された範囲は、最小値の１と最大値の１０との間（両端値を含む）の全ての部分範囲、すなわち最小値の１以上、例えば１～６．１で始まり、最大値の１０以下の最大値、例えば５．５～１０で終わるあらゆる部分範囲を含むと考えられるべきである。用語「約」は、成分の重量パーセントに関連して使用される場合、列挙された数の＋／－１０％を意味する。
本開示の各実施形態は、単独で又は本開示の他の実施形態の１つ以上と組み合わせて解釈され得る。
例示的な方法及び材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されるものと類似の又は均等な方法及び材料も様々な態様及び実施形態の実施又は試験において使用できることが理解されるべきである。材料、方法及び実施例は、例示にすぎず、限定を意図するものではない。
本開示をより容易に理解するために、特定の用語をまず定義する。これらの定義は、当業者に理解されているように、本開示の残りの部分に照らして読まれるべきである。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって記載する。
本明細書で使用される場合、用語「浸透圧剤」は、高張液、いくつかの実施形態では等張液を生成する薬剤を指す。浸透圧剤の例には、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、アミノ酸、ソルビトール、グリセロール、マンニトール、スクロース若しくはグルコースなどの糖、酒石酸並びにグルカル酸又はこれらのいずれかの塩を含有する溶液を含むが、これらに限定されない高張又は等張の塩溶液が含まれるが、これらに限定されない。理論に束縛されることを望むものではないが、１種以上の浸透圧剤は、血液又は他の生物学的試料中の浸透圧を高めるのに役立ち、血液又は生物学的試料中に存在する細胞から水を放出させ、不均衡をなくす。これにより、細胞は、収縮し、それによりさもなければ生物学的試料のセルフリー核酸の細胞核酸による汚染を引き起こすか、又は細胞のアッセイ及び分析を困難にする細胞溶解に対する抵抗性が増大する。さらに、任意選択の血漿増量剤がこの効果を高めると考えられる。
本明細書で使用される場合、用語「酵素阻害剤」は、単独で又は本開示の保存剤組成物において、例えばカルシウム、マグネシウム、マンガン又は亜鉛などの金属イオンと錯体を生成して血液凝固を減少させ、ヌクレアーゼを阻害し、且つ／又は酵素による細胞溶解を減少させる薬剤を指す。本開示の酵素阻害剤の例には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）、酒石酸、グルカル酸又はナトリウム塩及びカリウム塩を含むが、これらに限定されない、これらのいずれかの塩が含まれるが、これらに限定されない。理論に束縛されることを望むものではないが、ヌクレアーゼの阻害は、生物学的試料内のセルフリー核酸の分解を抑制又は減少させる。本開示の酵素阻害剤が阻害する酵素の例には、リソスタフィン、ザイモラーゼ、プロテアーゼ、グリカナーゼ又は細胞溶解を誘導することが知られている他の酵素が含まれるが、これらに限定されず、これにより血液又は他の生物学的若しくは実験室由来試料の細胞を保存するように作用する。
本明細書で使用される場合、用語「代謝阻害剤」は、単独で又は本開示の保存剤組成物において、細胞呼吸、細胞代謝及び代謝機能などの細胞プロセスを阻害する薬剤を指す。本開示の代謝阻害剤は、細胞代謝機能を阻害し、細菌の増殖を抑制することによって細胞の増殖を遅延させ、それによりセルフリー核酸の分解を減少させると考えられる。本開示の代謝阻害剤の例には、アジ化ナトリウム、チメロサール、プロクリン又はクロロヘキシジンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「血漿増量剤」は、高張性の（ｈｙｐｅｒｏｎｃｏｔｉｃ）又は高張性の（ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃ）溶液を生成する薬剤を指す。血漿増量剤の例には、グリセロール、デンプン、タンパク質コロイド（例えば、アルブミン、オボアルブミン及びゼラチン）及び非タンパク質コロイド（例えば、ヒドロキシエチルデンプン）が含まれるが、これらに限定されない。理論に束縛されることを望むものではないが、本開示の組成物の１種以上の血漿増量剤も血漿又は他の生物学的試料中の浸透圧を高めるのに役立ち、細胞から水を放出させ、不均衡をなくす。これにより、細胞は、収縮し、それによりさもなければ生物学的試料のセルフリー核酸の細胞核酸による汚染を引き起こすか、又は細胞のアッセイ及び分析を困難にする細胞溶解に対する抵抗性が増大する。
本明細書で使用される場合、用語「高張生理食塩水」は、生理的濃度よりも高い塩濃度を有する塩溶液を指す。高張生理食塩水の例には、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％及び２５％のＮａＣｌ溶液が含まれるが、これらに限定されない。高張生理食塩水は、ＮａＣｌ以外の塩、例えばＫＣｌ、ＣａＣｌ2及びＫＮＯ3（これらに限定されない）を特徴とすることもできる。
本明細書で使用される場合、用語「等張生理食塩水」は、生理的濃度に等しい塩濃度を有する塩溶液を指し、したがって正味の水の移動又は細胞のサイズの変化がない。等張生理食塩水の例には、０．５％、０．７％及び１％のＮａＣｌ溶液が含まれるが、これらに限定されない。等張生理食塩水は、ＮａＣｌ以外の塩、例えばＫＣｌ、ＣａＣｌ2及びＫＮＯ3（これらに限定されない）を特徴とすることもできる。
本明細書で使用される場合、「Ｆｉｃｏｌｌ」は、エピクロロヒドリンによる糖の重合から形成される水溶性高分子量スクロースポリマーを指す。例えば、Ｆｉｃｏｌｌ ４００及びＦｉｃｏｌｌ ７０である。
本明細書で使用される場合、「タンパク質コロイド」は、１種以上のタンパク質が溶液中に分散されている混合物を指す。本開示のタンパク質コロイドの例には、アルブミン、オボアルブミン又はゼラチンが含まれるが、これらに限定されない。アルブミンは、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はオボアルブミンとして提供され得る。ゼラチンの例には、尿素結合ゼラチン（例えば、Ｈａｅｍａｃｃｅｌ（登録商標））、コハク化ゼラチン（例えば、Ｇｅｌｏｆｕｓｉｎｅ（登録商標））及びオキシポリゼラチンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「非タンパク質コロイド」は、１種以上の大きい分子又は超微細粒子が溶液中に分散されている混合物を指す。非タンパク質コロイドの例には、ヒドロキシエチル化デンプン（ＨＥＳ）などのアミロペクチンの分岐天然ポリマー及びデキストラン、例えばデキストラン４０及び／又はデキストラン７０などの多糖が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「水溶性ポリマー」は、水溶液に可溶なポリマーを指す。水溶性ポリマーの例には、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリデキストロース、ポリグリシン、ポリエチレンイミン、ポリリシン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドのポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸ポリマー、ポリオキサゾリン、ポリリン酸塩、ポリホスファゼン、キサンタンガム、ペクチン、キトサン誘導体、デキストラン、カラギーナン、グアーガム、セルロースエーテル、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、ヒアルロン酸、アルブミン、デンプン又はデンプンベースの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本開示の水溶性ポリマーのさらなる非限定的な例については、Ｂｅｔａｇｅｒｉ，Ｇ．Ｖ．，Ｋａｄａｊｊｉ，Ｖ．Ｇ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２０１１，３，ｐｐ．１９７２－２００９を参照されたい。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」には、リボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の両方が含まれる。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡは、直鎖若しくは分枝鎖、一本鎖若しくは二本鎖又は断片であり得る。ＲＮＡ及びＤＮＡは、細胞ＲＮＡ（すなわちゲノムＲＮＡ）、細胞ＤＮＡ（すなわちゲノムＤＮＡ）、セルフリーＲＮＡ、セルフリーＤＮＡ又はこれらの組み合わせであり得る。核酸は、生物学的試料、特に血液試料中に見出される。
本明細書で使用される場合、用語「生物学的試料」は、核酸及び／又は細胞を含む、実験室由来の又は実験室で改変された細胞を含む、生物学的供給源から得られる試料を指す。生物学的試料は、細胞試料、培養物試料又は組織試料であり得る。さらに、生物学的試料は、体液、例えば血液、血漿、血清、尿、唾液、便、母乳、涙、汗、脳脊髄液、滑液、精液、膣液、腹水、羊水又は細胞培養培地などに由来し得る。
本明細書で使用される場合、用語「保存剤」は、生物学的試料に添加され、その試料中の核酸及び／又は細胞溶解物の分解を阻害するか、抑制するか又は遅らせる組成物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「処理された生物学的試料」は、本開示に記載されるような保存剤組成物と混合された生物学的試料を指す。
本明細書で使用される場合、用語「細胞」は、血液試料又は他の生物学的試料中に存在し得る任意の細胞を指す。細胞の種類には、幹細胞、骨細胞、血液細胞（例えば、赤血球又は白血球）、筋細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、神経細胞、内皮細胞、性細胞、膵臓細胞、癌細胞、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）並びに実験室由来細胞及び／又は改変細胞が含まれるが、これらに限定されない。
本開示の保存剤組成物
本開示の組成物は、生物学的試料中の核酸及び／又は細胞の保存及び安定化に有用である。本開示の保存剤組成物が核酸及び／又は細胞を含有する生物学的試料に添加されると、その試料中の核酸の分解及び／又は細胞溶解は、未処理の生物学的試料と比較して減少、遅延又は防止され、当技術分野で知られる従来の技術により、核酸及び／又は細胞のその後の単離及びより正確な分析が可能になる。さらに、本開示の保存剤組成物は、細胞溶解を阻害、遅延又は減少させ、試料中のセルフリー核酸が長期間にわたって量及び特性においてより一貫したままであることを可能にする。処理された生物学的試料における細胞溶解の減少は、ヌクレアーゼの放出も減少させ、それにより試料内の核酸及び／又は細胞の分解をさらに防止又は減少させる。本開示の組成物によって保存され得る核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はそれらの組み合わせが含まれる。ＲＮＡ及びＤＮＡは、細胞性若しくはセルフリー又はこれらの組み合わせ、すなわち細胞ＲＮＡ、細胞ＤＮＡ、セルフリーＲＮＡ、セルフリーＤＮＡ又はこれらの組み合わせであり得る。好ましくは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡは、セルフリーＤＮＡ及び／又はセルフリーＲＮＡである。本開示の組成物及び方法を用いて溶解を減少させる細胞は、幹細胞、骨細胞、血液細胞、筋細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、神経細胞、内皮細胞、性細胞、膵臓細胞、癌細胞、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞及び実験室由来細胞又は改変細胞であり得るが、これらに限定されない。
一態様では、本開示の保存剤組成物は、
ａ．１種以上の浸透圧剤、
ｂ．１種以上の酵素阻害剤、
ｃ．任意選択により、１種以上の代謝阻害剤、
ｄ．任意選択により、血漿増量剤、及び
ｅ．ヒドロキシエチルデンプン、Ｎ－ビニルピロリドン（ＮＶＰ）のポリマー、Ｆｉｃｏｌｌ、タンパク質コロイド、非タンパク質合成コロイド、エチレンジオール、プロピレングリコール、水溶性ポリマー及びカルボキシメチルセルロース又はその塩から選択される１種以上の薬剤
を含む。
理論に束縛されることを望むものではないが、ヒドロキシエチルデンプン、Ｎ－ビニルピロリドン（ＮＶＰ）のポリマー、Ｆｉｃｏｌｌ、タンパク質コロイド、非タンパク質合成コロイド、エチレンジオール、プロピレングリコール、水溶性ポリマー及びカルボキシメチルセルロース又はその塩から選択される１つ以上の薬剤は、クラウディング剤として作用し、細胞を溶液から追い出し、それにより細胞の溶解及びそれに続く細胞の分解又はさもなければ例えば試料内のセルフリー核酸を汚染し得る細胞核酸の試料中への放出を防止又は低減する。核酸及び／又は細胞は、その後、当技術分野で知られる従来の方法によって単離され、より正確に分析され得る。
いくつかの実施形態では、この１種以上の薬剤は、組成物の約１０重量％～約５０重量％の量で存在する。例えば、いくつかの実施形態では、この１種以上の薬剤は、組成物の約１０重量％～約４０重量％若しくは約１５重量％～約３５重量％又は約２０重量％～約３０重量％の量で存在する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の薬剤は、タンパク質コロイドである。
いくつかの実施形態では、１つ以上の薬剤は、非タンパク質コロイドである。
いくつかの実施形態では、１種以上の薬剤は、水溶性ポリマーである。
いくつかの実施形態では、浸透圧剤は、本開示の保存剤組成物中に組成物の約０．５重量％～約２０重量％の量で存在する。いくつかの実施形態では、浸透圧剤は、組成物の約１重量％～約１５重量％、約１重量％～約２０重量％又は約０．５重量％～約１０重量％の量で存在する。
いくつかの実施形態では、１種以上の浸透圧剤は、ナトリウム含有溶液、カリウム含有溶液、マグネシウム含有溶液及びカルシウム含有溶液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、アミノ酸、ソルビトール、グリセロール、マンニトール、スクロース若しくはグルコースなどの糖、酒石酸又はグルカル酸或いはこれらのいずれかの塩を含むが、これらに限定されない高張又は等張の塩溶液である。
いくつかの実施形態では、酵素阻害剤は、本開示の保存剤組成物中において、組成物に対して約０．５重量％～約３０重量％の量、いくつかの態様では約０．５重量％～約５重量％の量、他の態様では約１重量％～約３０重量％の量で存在する。いくつかの実施形態では、酵素阻害剤は、組成物の約１重量％～約２０重量％の量で存在する。別の実施形態では、酵素阻害剤は、組成物の約１重量％～約１０重量％の量で存在する。
いくつかの実施形態では、１種以上の酵素阻害剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）、酒石酸、グルカル酸又はこれらのいずれかの塩である。塩には、ナトリウム塩及びカリウム塩又はこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、１種以上の任意選択の代謝阻害剤は、本開示の保存剤組成物中に組成物の約０．０１重量％～約１０重量％の量で存在する。別の実施形態では、任意選択の代謝阻害剤は、組成物の約０．０１重量％～約５重量％の量で存在する。別の実施形態では、任意選択の代謝阻害剤は、組成物の約０．０１重量％～約２重量％の量で存在する。
いくつかの実施形態では、１種以上の任意選択の代謝阻害剤は、アジ化ナトリウム、チメロサール、プロクリン又はクロロヘキシジンである。
いくつかの実施形態では、任意選択の血漿増量剤は、本開示の保存剤組成物中に組成物の約０．５重量％～約４０重量％、例えば組成物の約０．５重量％、約１重量％、約１０重量％、約１５重量％、約２０重量％、約２５重量％、約３０重量％、約３５重量％又は約４０重量％の量で存在する。
いくつかの実施形態において、任意選択の血漿増量剤は、グリセロール、デンプン、タンパク質コロイド（例えば、アルブミン、オボアルブミン及びゼラチン）又は非タンパク質コロイド（例えば、ヒドロキシエチルデンプン）である。
いくつかの実施形態では、本開示の保存剤組成物の１つ以上の成分は、保存剤組成物の１つ以上の成分の役割又は機能を果たすことができる。例えば、酒石酸若しくはグルカル酸又はその塩は、本開示の組成物中に酵素阻害剤、浸透圧剤又はその両方として存在し得る。さらなる例として、ヒト血清アルブミンは、本開示の組成物中に１種以上の薬剤、任意選択の血漿増量剤又はその両方として存在し得る。さらなる例として、グリセロールは、本開示の組成物中に１種以上の薬剤、浸透圧剤、低分子量体積排除剤、血漿増量剤として存在するか、又はこれらの機能のいくつか若しくは全てを提供し得る。
本開示による保存剤組成物は、凍結乾燥粉末、顆粒、錠剤の形態又は溶液の形態であり得る（例えば、保存剤組成物は、好適なビヒクル中で再構成される）。凍結乾燥粉末、顆粒及び／又は錠剤は、生物学的試料に直接添加するか、又は生物学的試料に添加される前に再構成し得る。凍結乾燥粉末、顆粒及び／又は錠剤は、例えば、組成物を好適なビヒクルに溶解することによって再構成することができる。好適なビヒクルには、水、生理食塩水、リンゲル液、植物起源の固定油、脂肪酸のモノ及びジグリセリド、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール及び本開示の任意選択の血漿増量剤が含まれるが、これらに限定されない。代わりに、生物学的試料は、凍結乾燥粉末、顆粒、錠剤又は再構成組成物（すなわち溶液）に直接添加され得る。別の例として、生物学的試料が体液に由来する場合、体液は、保存剤組成物を可溶化するための許容可能なビヒクルとして役立ち得る。例えば、保存剤組成物の凍結乾燥粉末、顆粒及び／又は錠剤形態は、体液と混合し、それにより体液により可溶化することができる。いくつかの実施形態では、収集チューブ又は収集容器は、生物学的試料がチューブ又は容器に収集される前に、凍結乾燥粉末、顆粒、錠剤又は溶液として保存剤組成物を含有する。
いくつかの実施形態では、本開示の保存剤組成物は、水溶液の形態である。水溶液を生物学的試料と混合し得るか、又は生物学的試料を水溶液と混合し得る。
生物学的試料の核酸及び／又は細胞を保存する方法
一態様では、本開示は、生物学的試料中の核酸及び／又は細胞を保存する方法であって、本開示の保存剤組成物と、生物学的試料とを組み合わせることを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、細胞試料又は組織試料である。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、体液、例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、便、母乳、涙、汗、脳脊髄液、滑液、精液、膣液、腹水、羊水又は細胞培養培地に由来する。いくつかの実施形態では、生物学的流体は、血液である。生物学的試料は、細胞を含むか又はセルフリーであり得る。
別の態様では、本開示の保存剤組成物は、生物学的試料中の細胞溶解を低減又は阻害する。したがって、一態様では、本開示は、生物学的試料中の細胞を保存する方法であって、本開示の保存剤組成物と、生物学的試料とを組み合わせることを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、細胞試料又は組織試料である。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、体液、例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、便、母乳、涙、汗、脳脊髄液、滑液、精液、膣液、腹水、羊水若しくは細胞培養培地に由来する細胞試料又は実験室由来細胞若しくは改変細胞である。好ましい実施形態では、生物学的流体は、血液、例えば全血又はその画分である。
生物学的試料は、多くの方法で本開示の保存剤組成物と混合することができる。例えば、生物学的試料を好適な容器に収集した後、その容器に保存剤組成物を例えばシリンジ又はピペットによって添加することができる。代わりに、生物学的試料の収集前に、保存剤組成物を生物学的試料の収集に好適な容器に加えることができる。いくつかの実施形態では、保存剤組成物を生物学的試料に添加する。いくつかの実施形態では、生物学的試料を保存剤組成物に添加する。
本開示は、保存剤組成物の成分を生物学的試料に同時又は別々に添加する方法も企図する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、生物学的試料中の核酸及び／又は細胞を保存する方法であって、生物学的試料を任意の順序で又は同時に、１種以上の浸透圧剤、１種以上の酵素阻害剤、任意選択により１種以上の代謝作用薬、任意選択の血漿増量剤並びにヒドロキシエチルデンプン、Ｎ－ビニルピロリドン（ＮＶＰ）のポリマー、Ｆｉｃｏｌｌ、タンパク質コロイド、非タンパク質合成コロイド、エチレンジオール、プロピレングリコール、水溶性ポリマー及びカルボキシメチルセルロース又はそれらのいずれかの塩から選択される１種以上の薬剤と接触させて、処理された生物学的試料を得ることを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、生物学的試料の収集に好適な容器は、保存剤組成物の成分の１つ以上を既に含有し、残りの成分を生物学的試料の収集と連続して又は同時に生物学的試料に添加する。例えば、好適な酵素阻害剤（例えば、酒石酸、又はＥＤＴＡ若しくはその塩、又はグルカル酸）を既に含有する血液収集チューブを使用して、生物学的試料を収集し得る。生物学的試料の収集に続いて、残りの成分（すなわち浸透圧剤、任意選択により１種以上の代謝阻害剤、任意選択により血漿増量剤及び１種以上の薬剤）を生物学的試料に添加し得る。別の実施形態では、保存剤組成物の成分を、生物学的試料を収集した後、連続して又は同時に生物学的試料に添加する。いくつかの実施形態では、保存剤組成物の必要な成分の全てと、任意選択の成分とが任意選択により容器に入れられており、その後、その容器を使用して試料を収集する。
いくつかの実施形態では、試料の収集に使用される容器は、凍結乾燥粉末形態の保存剤組成物を含有する。いくつかの実施形態では、試料の収集に使用される容器は、顆粒形態の保存剤組成物を含有する。いくつかの実施形態では、試料の収集に使用される容器は、錠剤形態の保存剤組成物を含有する。いくつかの実施形態では、試料収集に使用される容器は、保存剤組成物及び好適なビヒクルを含有する。いくつかの実施形態では、試料収集に使用される容器は、保存剤組成物を水溶液として含有する。別の実施形態では、血液試料の収集に使用される容器は、抗凝固剤をさらに含む。抗凝固剤の例には、ＥＤＴＡ（酵素阻害剤としても機能し得る）、クエン酸ナトリウム、クエン酸－テオフィリン－アデノシン－ジピリダモール（ＣＴＡＤ）、ヘパリンリチウム、ヘパリンナトリウム、フッ化ナトリウム、クエン酸－デキストロース溶液（ＡＣＤ）及びポリアネトールスルホン酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、好適な容器は、真空血液試料収集チューブである。
生物学的試料と混合し得る保存剤組成物の量は、当業者であれば日常の実験によって決定することができる。いくつかの実施形態では、生物学的試料に対する保存剤組成物の比は、約１：１０～約１：１ｖ／ｖであり得る。いくつかの実施形態では、生物学的試料に対する保存剤組成物の比は、約１：８～約１：２ｖ／ｖであり得る。いくつかの実施形態では、生物学的試料に対する保存剤組成物の比は、約１：６～約１：３ｖ／ｖであり得る。いくつかの実施形態では、生物学的試料に対する保存剤組成物の比は、約１：５～約１：４ｖ／ｖであり得る。
生物学的試料が保存された後、核酸及び／又は細胞は、抽出、遠心分離及びクロマトグラフィー法を含む、当業者に知られた方法を使用して、分析のために生物学的試料から単離し得る。当業者は、生物学的試料から核酸及び／又は細胞を単離するために使用し得る多くの方法があることを認識するであろう。
本開示の保存剤組成物を使用して保存される核酸及び／又は細胞は、様々な温度条件下での長期間の保存後、処理された生物学的試料から単離され得る。いくつかの実施形態では、本開示の保存剤組成物と接触させた生物学的試料は、周囲条件下又は低温で少なくとも１日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間又は少なくとも４週間にわたって保存することができる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、約－２０℃～約３０℃の範囲の温度で長期間にわたり、生物学的試料（すなわち生物学的試料中の核酸及び／又は細胞）を保存することを可能にする。いくつかの実施形態では、保存剤組成物は、周囲温度で少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間又は少なくとも４週間にわたり、生物学的試料（すなわち生物学的試料中の核酸及び／又は細胞）を保存することができる。いくつかの実施形態では、保存剤組成物は、周囲温度で少なくとも２週間にわたり、生物学的試料を保存することができる。いくつかの実施形態では、本開示の保存剤組成物は、４℃で少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間又は少なくとも４週間にわたり、生物学的試料（すなわち生物学的試料中の核酸及び／又は細胞）を保存することができる。いくつかの実施形態では、本開示の保存剤組成物は、－２０℃で少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間又は少なくとも４週間にわたり、生物学的試料（すなわち生物学的試料中の核酸及び／又は細胞）を保存することができる。
本開示の組成物及び方法を使用して保存される核酸（ＲＮＡ及びＤＮＡ）は、良好な収率、純度、完全性及びＲＮＡについて増幅能を示す。
本開示の保存剤組成物を提供するためのキット
本開示による保存剤組成物は、使用者が受け取るキットの一部として提供され得る。キットは、本開示の保存剤組成物を生物学的試料と容易に混合することを可能にし、その結果、その生物学的試料中に存在する核酸及び／又は細胞は、長期間、例えば少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間又は少なくとも４週間にわたって保存される。保存剤組成物は、生物学的試料が収集された後に生物学的試料と混合されるように提供され得る。代わりに、保存剤組成物は、生物学的試料が収集される時点で生物学的試料と混合されるように提供される。
一実施形態では、本開示は、生物学的試料中の核酸及び／又は細胞を保存するためのキットを対象とする。いくつかの実施形態では、キットは、本開示に記載される保存剤組成物及び任意選択により前記保存剤組成物の使用説明書を含む。
いくつかの実施形態では、保存剤組成物は、分配手段における水溶液として提供される。いくつかの実施形態では、分配手段は、シリンジである。分配手段中の保存剤の量は、生物学的試料と混合される保存剤組成物の比が長期間にわたってその試料の核酸及び／又は細胞を保存することができるような所定の量であり得る。キットは、前記シリンジに取り付け可能な針をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、血液試料中の核酸及び／又は細胞を保存するためのものであり、任意選択により、所定量の抗凝固剤を含有する血液収集チューブをさらに含む。
いくつかの実施形態では、保存剤組成物は、密封されたアンプルで提供され、前記アンプルは、取り外し可能な密閉部材を含み、前記アンプルは使用者が密閉部材を取り外したときに分配手段を受け入れるように構成される。いくつかの実施形態では、分配手段は、ピペット又はシリンジである。いくつかの実施形態では、キットは、血液試料中の核酸及び／又は細胞を保存するためのものであり、所定量の抗凝固剤を含有する血液収集チューブをさらに含む。
さらなる実施形態では、キットは、血液試料中の核酸及び／又は細胞を保存し、任意選択により所定量の抗凝固剤を含有する血液収集チューブ及び本開示の保存剤組成物を含むことを対象とする。
均等物
前述の説明及び以下の実施例は、本開示のいくつかの特定の実施形態を詳述し、本発明者らが意図する本開示を実施する最良の形態を説明するものである。しかしながら、前述の内容が文章にどのように詳細に記載されていようと、本開示は、多くの方法で実施することができ、本開示は、添付の実施形態及びその均等物によって解釈されるべきであることが理解されるであろう。
本開示は、様々な用途、方法、化合物及び組成物に関して記載されているが、本明細書の開示から逸脱することなく、様々な変更形態及び修正形態がなされ得ることが理解されるであろう。以下の実施例は、本開示をより十分に説明するために提供されるものであり、本明細書で提示する教示の範囲を限定することを意図するものではない。本開示は、これらの例示的な実施形態に関して説明されてきたが、当業者であれば、これらの例示的な実施形態の多くの変形形態及び修正形態が過度の実験なしに可能であることを容易に理解するであろう。そのような変形形態及び修正形態は、全て本開示の範囲内である。
実施例１ － 周囲温度でのＲＮＡの保存
２人のドナーからの血液試料を６本の血液試料収集チューブに採取して、本開示による保存剤組成物のＲＮＡを保存する能力を評価する。各ドナーからの第１の血液試料を、２ｍＬの組成物１を含む血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第２の血液試料を、２ｍＬの組成物２を含む血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第３の血液試料を、２ｍＬの組成物３を含む血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第４の血液試料を、２ｍＬの組成物４を含む血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第５の血液試料を、ＥＤＴＡをコーティングした血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第６の血液試料を、対照とするために、未処理の血液収集チューブに採取する。
組成物１（代謝阻害剤含有、血漿増量剤非含有）：２５重量％のヒドロキシエチルデンプン、５重量％のＫＮＯ3、５重量％の酒石酸及び１重量％のチメロサール並びに残部の水。
組成物２（代謝阻害剤非含有、血漿増量剤非含有）：２５重量％のヒドロキシエチルデンプン、５重量％のＫＮＯ3、５重量％の酒石酸及び残部の水。
組成物３（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：２５重量％のヒドロキシエチルデンプン、５重量％のＫＮＯ3、５重量％の酒石酸、１重量％のチメロサール、１５重量％のヒト血清アルブミン及び残部の水。
組成物４（代謝阻害剤非含有、血漿増量剤含有）：２５重量％のヒドロキシエチルデンプン、５重量％のＫＮＯ3、５重量％の酒石酸、１５重量％のヒト血清アルブミン及び残部の水。
試料を室温で２８日間保存する。ＲＮＡを、直後並びに室温での７日間、１４日間、２１日間及び２８日間の貯蔵後に４つの試料の全てから単離する。ＲＮＡは、当技術分野で知られる抽出及び分離技術を使用して試料から単離する。
４つの試料からのＲＮＡの完全性を、アガロースゲル電気泳動を使用して分析する。バンドを比較し、保存血液試料（試料１～４）からのＲＮＡが室温での７日間、１４日間、２１日間及び２８日間の貯蔵後に保存されており、試料５及び６からのＲＮＡが同じ時間枠で分解されることを示す。
実施例２ － セルフリーＤＮＡの保存
２人のドナーからの血液試料を６本の血液試料収集チューブに採取して、本開示による保存剤組成物のｃｆＤＮＡを保存する能力を評価する。各ドナーからの第１の血液試料を、２ｍＬの組成物１を含む血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第２の血液試料を、２ｍＬの組成物２を含む血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第３の血液試料を、２ｍＬの組成物３を含む血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第４の血液試料を、２ｍＬの組成物４を含む血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第５の血液試料を、ＥＤＴＡをコーティングした血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第６の血液試料を、対照とするために、未処理の血液収集チューブに採取する。
組成物１（代謝阻害剤含有、血漿増量剤非含有）：２５重量％のヒドロキシエチルデンプン、５重量％のＫＮＯ3、５重量％の酒石酸及び１重量％のチメロサール並びに残部の水。
組成物２（代謝阻害剤非含有、血漿増量剤非含有）：２５重量％のヒドロキシエチルデンプン、５重量％のＫＮＯ3、５重量％の酒石酸及び残部の水。
組成物３（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：２５重量％のヒドロキシエチルデンプン、５重量％のＫＮＯ3、５重量％の酒石酸、１重量％のチメロサール、１５重量％のヒト血清アルブミン及び残部の水。
組成物４（代謝阻害剤非含有、血漿増量剤含有）：２５重量％のヒドロキシエチルデンプン、５重量％のＫＮＯ3、５重量％の酒石酸、１５重量％のヒト血清アルブミン及び残部の水。
各試料を、直後並びに７日間、１４日間、２１日間及び２８日間の貯蔵後に処理する。各試料からの血漿を遠心分離によって分離した後、新しいチューブに移す。次いで、試料ＤＮＡは、当業者に知られた技術を使用して単離する。
Ａｌｕ ２４７（２４７ｂｐの断片）及びＡｌｕｌ １５（１１５ｂｐの断片）遺伝子標的のリアルタイムＰＣＲ増幅を用いてＤＮＡを分析する。Ａｌｕ ２４７は、細胞ＤＮＡの存在を検出するために使用され、Ａｌｕ １５は、セルフリーＤＮＡを検出するために使用される。Ａｌｕ ２４７の増加は、細胞溶解が起こり、その結果、細胞外ＤＮＡが細胞ＤＮＡに汚染されたことを示す。細胞溶解が起こると、観察されるＡｌｕ ２４７遺伝子標的の周期閾値（Ｃｔ）が低下する。
リアルタイムＰＣＲ実験から生成された周期閾値（Ｃｔ）を評価し、周囲温度で２８日間までの貯蔵期間、保存剤が生物学的試料を保存できること及び細胞溶解が減少することを示す（試料１～４）。対照的に、保存剤を欠く試料は、経時的にＣｔ値が減少することを示し、これは、細胞溶解がより急速に起こり、細胞ＤＮＡによるセルフリーＤＮＡの汚染が生じたことを示す（試料５及び６）。
実施例３ － 処理された生物学的試料対未処理の生物学的試料における細胞溶解の測定
２人のドナーからの血液試料を６本の血液試料収集チューブに採取して、本開示による保存剤組成物のＲＮＡを保存する能力を評価する。各ドナーからの第１の血液試料を、２ｍＬの組成物１を含む血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第２の血液試料を、２ｍＬの組成物２を含む血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第３の血液試料を、２ｍＬの組成物３を含む血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第４の血液試料を、２ｍＬの組成物４を含む血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第５の血液試料を、ＥＤＴＡをコーティングした血液収集チューブに採取する。各ドナーからの第６の血液試料を、対照とするために、未処理の血液収集チューブに採取する。
組成物１（代謝阻害剤含有、血漿増量剤非含有）：２５重量％のヒドロキシエチルデンプン、５重量％のＫＮＯ3、５重量％の酒石酸及び１重量％のチメロサール並びに残部の水。
組成物２（代謝阻害剤非含有、血漿増量剤非含有）：２５重量％のヒドロキシエチルデンプン、５重量％のＫＮＯ3、５重量％の酒石酸及び残部の水。
組成物３（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：２５重量％のヒドロキシエチルデンプン、５重量％のＫＮＯ3、５重量％の酒石酸、１重量％のチメロサール、１５重量％のヒト血清アルブミン及び残部の水。
組成物４（代謝阻害剤非含有、血漿増量剤含有）：２５重量％のヒドロキシエチルデンプン、５重量％のＫＮＯ3、５重量％の酒石酸、１５重量％のヒト血清アルブミン及び残部の水。
各試料を、直後並びに７日間、１４日間、２１日間及び２８日間の貯蔵後に処理する。各試料からの血漿を遠心分離によって分離した後、新しいチューブに移す。
細胞溶解を、単離した血漿中の遊離ヘモグロビンの吸収（４１４ｎｍでの吸収）を測定することによって測定する。組成物１～４で処理した試料は、低いヘモグロビン吸収値を示し、これは、保存剤組成物が細胞溶解を抑制していることを示している。対照的に、ＥＤＴＡのみを含有する試料及び対照試料は、ヘモグロビン吸収の経時的な増加を示し、これは、細胞溶解の発生を示している。
実施例４ － 他の保存剤組成物
上記の実施例１～３において記載した実験を、以下の保存剤組成物を用いて繰り返す。生物学的試料中のＤＮＡ及びＲＮＡを保存するこれらの組成物の能力は、実施例１～３の組成物の能力と概ね同様である。
３０重量％のヒドロキシエチルデンプン、２０重量％のソルビトール、０．５重量％のクロロヘキシジン、２重量％のグルカル酸、１５重量％のヒト血清アルブミン、残部は、水である。
１０重量％のＦｉｃｏｌｌ ４００、２０重量％のマンニトール、１重量％のプロクリン、５重量％の酒石酸、残部は、水である。
２５重量％のオボアルブミン、１０重量％のＫＮＯ3溶液、７重量％の酒石酸、３０重量％のｇｅｌｏｆｕｓｉｎｅ、残部は、水である。
２０重量％のプロピレングリコール、７重量％のリシン、２重量％のグルカル酸、２重量％のチメロサール、残部は、水である。
４５重量％のデキストラン、３重量％のアルギニン、１５重量％の酒石酸、２重量％のチメロサール、残部は、水である。
１５重量％のポリビニルピロリドン、１５重量％のグリセロール、１０重量％のグルカル酸、３５重量％のヒト血清アルブミン、残部は、水である。
３５重量％のポリエチレングリコール、２重量％のＫＮＯ3、２０重量％の酒石酸、５重量％のクロロヘキシジン、残部は、水である。
２５重量％のエチレンジオール、５重量％のマンニトール、５重量％のグルカル酸、１０重量％の酒石酸、５重量％のｈａｅｍａｃｃｅｌ、残部は、水である。
２０重量％のｇｅｌｏｆｕｓｉｎｅ、５重量％のアルギニン、７重量％のグルカル酸、残部は、水である。
３０重量％のキサンタンガム、７重量％のグリセロール、３０重量％のグルカル酸、０．２５重量％のチメロサール、残部は、水である。
実施例５ － 保存剤組成物の他の実施形態
本開示の保存剤組成物の他の実施形態を調製した。
組成物５（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：２６．２重量％のＰＥＧ ８０００、５．７２重量％のＮａＣｌ、０．０２重量％のＮａＮ3、２．４４重量％の３Ｎａ－ＥＤＴＡ、０．６７重量％のグリセロール及び残部の水。
組成物６（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：２６．２重量％のＰＥＧ ８０００、５．７２重量％のＮａＣｌ、０．０２重量％のＮａＮ3、１．２４重量％の２Ｎａ－ＥＤＴＡ、１．２６重量％の４Ｎａ－ＥＤＴＡ、０．６７重量％のグリセロール及び残部の水。
組成物７（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：１５重量％のデキストラン４０、５．７２重量％のＮａＣｌ、０．０２重量％のＮａＮ3、１．５重量％の３Ｋ－ＥＤＴＡ、０．６７重量％のグリセロール及び残部の水。
組成物８（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：１５重量％のデキストラン７０、５．７２重量％のＮａＣｌ、０．０２重量％のＮａＮ3、１．５重量％の３Ｋ－ＥＤＴＡ、０．６７重量％のグリセロール及び残部の水。
組成物９（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：１５重量％のＰＶＰ１０、５．７２重量％のＮａＣｌ、０．０２重量％のＮａＮ3、２．５重量％の３Ｋ－ＥＤＴＡ、０．６７重量％のグリセロール及び残部の水。
組成物１０（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：１５重量％のＰＶＰ４０、５．７２重量％のＮａＣｌ、０．０２重量％のＮａＮ3、２．５重量％の３Ｋ－ＥＤＴＡ、０．６７重量％のグリセロール及び残部の水。
組成物１１（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：１０重量％のＦｉｃｏｌｌ ＰＭ４００、５．７２重量％のＮａＣｌ、０．０２重量％のＮａＮ3、１．２４重量％の２Ｎａ－ＥＤＴＡ、１．２６重量％の４Ｎａ－ＥＤＴＡ、０．６７重量％のグリセロール及び残部の水。
組成物１２（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：１０重量％のＦｉｃｏｌｌ ＰＭ４００、５．７２重量％のＮａＣｌ、０．０２重量％のＮａＮ3、１．５重量％の３Ｋ－ＥＤＴＡ、０．６７重量％のグリセロール及び残部の水。
組成物１３（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：２６．２重量％のＰＥＧ ８０００、０．７重量％のＮａＣｌ、０．０２重量％のＮａＮ3、１．２４重量％の２Ｎａ－ＥＤＴＡ、１．２６重量％の４Ｎａ－ＥＤＴＡ、０．６７重量％のグリセロール及び残部の水。
組成物１４（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：２重量％の１－ビニル－２－ピロリジノン（ＮＶＰ）、０．０５重量％のフェニルボロン酸、５．７２重量％のＮａＣｌ、０．０２重量％のＮａＮ3、１．２４重量％の２Ｎａ－ＥＤＴＡ、１．２６重量％の４Ｎａ－ＥＤＴＡ、０．６７重量％のグリセロール及び残部の水。
組成物１５（代謝阻害剤含有、血漿増量剤含有）：２重量％のカルボキシメチルセルロース、５．７２重量％のＮａＣｌ、０．０２重量％のＮａＮ3、１．２４重量％の２Ｎａ－ＥＤＴＡ、１．２６重量％の４Ｎａ－ＥＤＴＡ、０．６７重量％のグリセロール及び残部の水。
組成物１６（代謝阻害剤含有、血漿増量剤）：１０重量％のＦｉｃｏｌｌ ＰＭ４００、５．７２重量％のＮａＣｌ、０．０２重量％のＮａＮ3、１．２４重量％の２Ｎａ－ＥＤＴＡ、１．２６重量％の４Ｎａ－ＥＤＴＡ、０．６７重量％のグリセロール、０．５重量％のＤ－サッカリン酸カリウム塩、０．００１重量％のスペルミン（９９ｍＭストック溶液）、０．０００７重量％のスペルミジン（１３８ｍＭストック溶液）、０．０００８重量％のプトレシン二塩酸塩（１２４ｍＭストック溶液）及び残部の水。
実施例６ － 単離したｇＤＮＡとＲＮＡの分析
種々のドナーからの血液試料を血液試料収集チューブに収集して、本開示による保存剤組成物の他の実施形態のＤＮＡ及びＲＮＡを保存する能力を評価する。実施例５の種々の保存剤組成物を、２ｍＬの保存剤組成物を含有するチューブに血液試料を添加することによって試験する。
ｇＤＮＡ及びＲＮＡは、当技術分野で知られる抽出及び分離技術を使用して試料から単離する。このようなｇＤＮＡ抽出方法の１つは、Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ ＴｅｃｋのＭａｇ－Ｂｉｎｄ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ ＨＤＱ ９６キットを使用することを含む。このようなＲＮＡ抽出方法の１つは、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒのＲＮＡｄｖａｎｃｅ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔに基づく手順を使用することを含む。
単離されたｇＤＮＡ及びＲＮＡを１日目に分析し、０日目に採血する。核酸の量、純度及び完全性並びにＲＮＡの増幅能を分析して、保存剤組成物の特性を評価する。
単離された核酸の量又は収率を、Ｑｕｂｉｔ広範囲ＤＮＡアッセイ及び／又はＲＮＡアッセイを用いて特定する。
核酸の純度をＡ２６０／Ａ２８０及びＡ２６０／Ａ２３０のＮａｎｏｄｒｏｐ読み取りによって測定する。Ａ／２６０／Ａ２８０が約１．８であり、Ａ２６０／Ａ２３０が＞２である場合、ＤＮＡは、純粋であるとみなされる。Ａ／２６０／Ａ２８０が約２であり、Ａ２６０／Ａ２３０が＞１である場合、ＲＮＡは、純粋であるとみなされる。
ｇＤＮＡの完全性
ｇＤＮＡの完全性を長いＤＮＡ断片及び短いＤＮＡ断片のｑＰＣＲによって分析し、短い断片に対する長い断片の比によって特徴付ける。比が＞０．８である場合、ＤＮＡは、インタクトであるとみなされる。
ｇＤＮＡの１０倍希釈系列を標準曲線のために調製する。ｇＤＮＡ試料の濃度を１０ｎｇ／μＬに希釈する。５μＬの１００μＭのフォワードプライマー、５μＬの１００μＭのリバースプライマーを９０μＬのヌクレアーゼを含まない水と混合することにより、５μＭ濃度のフォワード及びリバースプライマーミックスを調製する。
混合物＃１中の１反応のためにそれぞれ１μＬの標準試料又はＤＮＡ試料及び８μＬのヌクレアーゼを含まない水、混合物＃２中の１反応のために１μＬのプライマー混合物及び１０μＬの２Ｘ ｑＰＣＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む２つの別々の混合物を調製する。９μＬの混合物＃１及び１１μＬの混合物＃２を９６ウェル光学プレートのウェルに加えて、リアルタイムＰＣＲを行う。熱サイクル条件を下の表に示す。
Figure 2023510252000001
ＲＮＡの完全性
試料からのＲＮＡの完全性を、アガロースゲル電気泳動を使用するＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによって分析し、ＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）によって特徴付ける。ＲＩＮは、１０（高度にインタクトなＲＮＡ）～１（完全に分解されたＲＮＡ）の範囲のＲＮＡの全体的な品質の客観的な測定基準である。試料をＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒにロードする前に、ＲＮＡ試料を３０ｎｇ／μＬ（Ｑｕｂｉｔ Ｑｕａｎｔに基づいて算出）に希釈する。
ＲＮＡ増幅能
試料からのＲＮＡの増幅能は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって分析する。
既知の濃度を有する対照全ＲＮＡの連続希釈物を標準曲線のために調製する。ＲＮＡ試料の濃度を５ｎｇ／μＬに希釈する。ＲＮＡ試料を逆転写（ＲＴ）によりｃＤＮＡに変換する。ＳＳＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及び水のマスターミックスを全ての試料及び標準について調製する。１８μＬのマスターミックス及び２μＬの標準又は希釈ＲＮＡ試料を、９６ウェル光学プレートのウェル又はＲＮアーゼを含まないチューブに加える。プレート又はチューブを弾き、回転させ、遠心分離した後、サーマルサイクラーに入れ、ｃＤＮＡを得るために次の条件を実行する：２５℃、１０分／５０℃、１０分／８５℃、５分／４℃、保持。
ＢＲＣＡ１及びＡＣＴＢ ２０Ｘ ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを、５．５μＬのマスターミックス及び４．５μＬのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのための９６ウェル光学プレートのウェルに添加することによって行う。熱サイクル条件を下の表に示す。
Figure 2023510252000002
実施例５の組成物を用いて保存した血液試料中のｇＤＮＡの特性
種々の個々の組成物５～１６を含有するチューブ中に保存された血液試料から抽出されたｇＤＮＡの収量は、２０～６０μｇ／ｍＬ（血液及びＰＢＳ）の範囲であることが観察される。異なるドナーから採取された血液試料の知られた変動性を考慮すると、これは、一般に良好な回収である。
種々の個々の組成物５～１６を含有するチューブ中に保存された血液試料から抽出されたｇＤＮＡの純度は、一般に高く、ほとんどのＡ２６０／Ａ２８０比は、１．８～１．９５の範囲であることが観察され、ほとんどのＡ２６０／Ａ２３０比は、２．０～２．５の範囲であることが観察される。
ｑＰＣＲアッセイからの短いフラグメントに対する長いフラグメントの比（２２２ｂｐ／９０ｂｐ）が１に近いことが観察されるため、種々の個々の組成物５～１６を含むチューブ中に保存された血液試料から抽出されたｇＤＮＡの完全性は、一般に高い。
実施例５の組成物を用いて保存した血液試料中のＲＮＡの特性
種々の個々の組成物５～１６を含有するチューブ中に保存された血液試料から抽出されたＲＮＡの収量は、２～１１μｇ／ｍＬ（血液及びＰＢＳ）の範囲であることが観察される。異なるドナーから採取された血液試料の知られた変動性を考慮すると、これは、良好な回収である。
種々の個々の組成物５～１６を含有するチューブ中に保存された血液試料から抽出されたＲＮＡの純度は、一般に高く、ほとんどのＡ２６０／Ａ２８０比は、１．７５～２．３５の範囲であることが観察され、ほとんどのＡ２６０／Ａ２３０比は、０．８～１．９の範囲であることが観察される。
種々の個々の組成物５～１６を含有するチューブ中に保存された血液試料から単離されたＲＮＡのＲＩＮは、一般に高く、大部分の試料が＞５、好ましくは＞７のＲＩＮを有することが観察される。
単離されたＲＮＡの増幅能は、一般に、良好であり、観察されるＰＣＲ量は、ＡＣＴＢについて５～２０ｎｇ、好ましくは８～２０ｎｇの範囲であり、ＢＲＣＡ １について０．３～１ｎｇ、好ましくは０．６～１ｎｇの範囲である。

Claims (55)

  1. 保存剤組成物であって、
    ａ．１種以上の浸透圧剤、
    ｂ．１種以上の酵素阻害剤、
    ｃ．任意選択により、１種以上の代謝阻害剤、
    ｄ．任意選択により、血漿増量剤、及び
    ｅ．ヒドロキシエチルデンプン、Ｎ－ビニルピロリドン（ＮＶＰ）のポリマー、Ｆｉｃｏｌｌ、タンパク質コロイド、非タンパク質合成コロイド、エチレンジオール、プロピレングリコール、水溶性ポリマー及びカルボキシメチルセルロース又はその塩から選択される１種以上の薬剤
    を含む保存剤組成物。
  2. 前記１種以上の薬剤は、前記組成物の約１０重量％～約５０重量％の量で存在する、請求項１に記載の保存剤組成物。
  3. 前記タンパク質コロイドは、アルブミン、オボアルブミン又はゼラチンコロイドから選択される、請求項１又は２に記載の保存剤組成物。
  4. 前記アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はオボアルブミンを含む、請求項３に記載の保存剤組成物。
  5. 前記ゼラチンコロイドは、尿素結合ゼラチン、コハク化ゼラチン又はオキシポリゼラチンである、請求項３に記載の保存剤。
  6. 前記非タンパク質コロイドは、ヒドロキシエチル化デンプン（ＨＥＳ）又はデキストランである、請求項１又は２に記載の保存剤組成物。
  7. 前記水溶性ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリデキストロース、ポリグリシン、ポリエチレンイミン、ポリリシン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ジビニルエーテル－無水マレイン酸、ポリオキサゾリン、ポリリン酸塩、ポリホスファゼン、キサンタンガム、ペクチン、キトサン誘導体、デキストラン、カラギーナン、グアーガム、セルロースエーテル、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、ヒアルロン酸、アルブミン、デンプン又はデンプンベースの誘導体である、請求項１又は２に記載の保存剤組成物。
  8. 前記１種以上の浸透圧剤は、ナトリウム含有溶液、カリウム含有溶液、マグネシウム含有溶液及びカルシウム含有溶液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、アミノ酸、ソルビトール、グリセロール、マンニトール、スクロース若しくはグルコースなどの糖、酒石酸並びにグルカル酸又はこれらのいずれかの塩を含むが、これらに限定されない高張又は等張の塩溶液である、請求項１～７のいずれか一項に記載の保存剤組成物。
  9. 前記浸透圧剤は、前記組成物の約０．５重量％～約１０重量％の量で存在する、請求項８に記載の保存剤組成物。
  10. 前記浸透圧剤は、前記組成物の約１重量％～約２０重量％の量で存在する、請求項９に記載の保存剤組成物。
  11. 前記浸透圧剤は、前記組成物の約０．５重量％～約１０重量％の量で存在する、請求項９に記載の保存剤組成物。
  12. 前記１種以上の酵素阻害剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、アウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）、酒石酸、グルカル酸又はナトリウム塩及びカリウム塩を含むが、これらに限定されない、これらのいずれかの塩である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の保存剤組成物。
  13. 前記酵素阻害剤は、前記組成物の約０．５重量％～約３０重量％の量で存在する、請求項１２に記載の保存剤組成物。
  14. 前記酵素阻害剤は、前記組成物の約１重量％～約３０重量％の量で存在する、請求項１３に記載の保存剤組成物。
  15. 前記酵素阻害剤は、前記組成物の約０．５重量％～約５重量％の量で存在する、請求項１３に記載の保存剤組成物。
  16. 前記１種以上の任意選択の代謝阻害剤は、アジ化ナトリウム、チメロサール、プロクリン又はクロロヘキシジンである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の保存剤組成物。
  17. 前記代謝阻害剤は、前記組成物の約０．０１重量％～約１０重量％の量で存在する、請求項１６に記載の保存剤組成物。
  18. 前記代謝阻害剤は、前記組成物の約０．０１重量％～約５重量％の量で存在する、請求項１７に記載の保存剤組成物。
  19. 前記任意選択の血漿増量剤は、グリセロール、タンパク質コロイド（例えば、アルブミン、オボアルブミン及びゼラチン）又は非タンパク質コロイド（例えば、ヒドロキシエチルデンプン）である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の保存剤組成物。
  20. 前記血漿増量剤は、前記組成物の約０．５重量％～約４０重量％の量で存在する、請求項１９に記載の保存剤組成物。
  21. 前記血漿増量剤は、前記組成物の約１重量％～約４０重量％の量で存在する、請求項２０に記載の保存剤組成物。
  22. ａ．前記タンパク質コロイドは、アルブミン、オボアルブミン又はゼラチンであり、及び
    ｂ．前記非タンパク質コロイドは、ヒドロキシエチルデンプンである、請求項１９に記載の保存剤組成物。
  23. 凍結乾燥された乾燥粉末の形態である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の保存剤組成物。
  24. 水溶液の形態である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の保存剤組成物。
  25. 生物学的試料をさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の保存剤組成物。
  26. 前記生物学的試料は、体液に由来する、請求項２５に記載の保存剤組成物。
  27. 前記体液は、血液、血漿、血清、尿、唾液、便、母乳、涙、汗、脳脊髄液、滑液、精液、膣液、腹水、羊水又は細胞培養培地である、請求項２６に記載の保存剤組成物。
  28. 前記体液は、全血又はその画分である、請求項２７に記載の保存剤組成物。
  29. 前記生物学的試料は、実験室由来細胞又は改変細胞である、請求項２６に記載の保存剤組成物。
  30. 前記生物学的試料は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はこれらの組み合わせの群から選択される核酸を含む、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の保存剤組成物。
  31. 前記核酸は、セルフリーＲＮＡ、セルフリーＤＮＡ又はこれらの組み合わせである、請求項３０に記載の保存剤組成物。
  32. 前記核酸は、細胞ＲＮＡ、細胞ＤＮＡ又はこれらの組み合わせである、請求項３０に記載の保存剤組成物。
  33. 前記生物学的試料に対する前記保存剤組成物の比は、約１：１０～約１：１ｖ／ｖである、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の保存剤組成物。
  34. 前記生物学的試料に対する前記保存剤組成物の比は、約１：５～約１：４ｖ／ｖである、請求項３３に記載の保存剤組成物。
  35. 周囲温度で少なくとも２週間にわたり、生物学的試料中の前記核酸及び／又は細胞を保存することができる、請求項１～３４のいずれか一項に記載の保存剤組成物。
  36. 生物学的試料中の核酸及び／又は細胞を保存する方法であって、請求項１～２４のいずれか一項に記載の保存剤組成物と、前記生物学的試料とを組み合わせる工程を含む方法。
  37. 前記生物学的試料は、体液に由来する、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記体液は、血液、血漿、血清、尿、唾液、便、母乳、涙、汗、脳脊髄液、滑液、精液、膣液、腹水又は羊水である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記体液は、全血又はその画分である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記細胞は、幹細胞、骨細胞、血液細胞、筋細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、神経細胞、内皮細胞、性細胞、膵臓細胞、癌細胞、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞又は実験室由来細胞若しくは改変細胞である、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はこれらの組み合わせである、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記核酸は、セルフリーＲＮＡ、セルフリーＤＮＡ又はこれらの組み合わせである、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記核酸は、細胞ＲＮＡ、細胞ＤＮＡ又はこれらの組み合わせである、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記生物学的試料に対する前記保存剤組成物の比は、約１：１０～約１：１ｖ／ｖである、請求項３６～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記生物学的試料に対する前記保存剤組成物の比は、約１：５～約１：４ｖ／ｖである、請求項３６～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 生物学的試料中の核酸及び／又は細胞を保存するためのキットであって、
    ａ．請求項１～２４のいずれか一項に記載の保存剤組成物、及び
    ｂ．任意選択により、前記保存剤組成物の使用説明書
    を含むキット。
  47. 前記生物学的試料は、体液に由来する、請求項４６に記載のキット。
  48. 前記体液は、血液、血漿、血清、尿、唾液、便、母乳、涙、汗、脳脊髄液、滑液、精液、膣液、腹水又は羊水である、請求項４７に記載のキット。
  49. 生物学的試料中の核酸及び／又は細胞を保存するためのキットであって、
    ａ．所定量の任意選択の抗凝固剤を含有する血液収集チューブ、
    ｂ．所定量の、請求項１～２２又は２４のいずれか一項に記載の保存剤組成物を含有するシリンジ、及び
    ｃ．任意選択により、前記シリンジに取り付け可能な針
    を含むキット。
  50. 生物学的試料中の核酸及び／又は細胞を保存するためのキットであって、
    ａ．任意選択により所定量の抗凝固剤を含有する血液収集チューブ、及び
    ｂ．所定量の、請求項１～２４のいずれか一項に記載の保存剤組成物を含有する密封アンプル
    を含み、前記アンプルは、取り外し可能な密閉部材を含み、前記アンプルは、使用者によって前記密閉部材が取り外されたときに分配手段を受け入れるように構成される、キット。
  51. 血液試料中の核酸及び／又は細胞を保存するためのキットであって、所定量の任意選択の抗凝固剤及び請求項１～２４のいずれか一項に記載の保存剤組成物を含有する血液収集チューブを含むキット。
  52. 前記核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はこれらの組み合わせである、請求項４６～５１のいずれか一項に記載のキット。
  53. 前記核酸は、セルフリーＲＮＡ、セルフリーＤＮＡ又はこれらの組み合わせである、請求項５２に記載のキット。
  54. 前記核酸は、細胞ＲＮＡ、細胞ＤＮＡ又はこれらの組み合わせである、請求項５２に記載のキット。
  55. 生物学的試料中の細胞を保存する方法であって、請求項１～２４のいずれか一項に記載の保存剤組成物と、前記生物学的試料とを組み合わせる工程を含む方法。
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