CN116569917B - 一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用 - Google Patents
一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116569917B CN116569917B CN202310854042.0A CN202310854042A CN116569917B CN 116569917 B CN116569917 B CN 116569917B CN 202310854042 A CN202310854042 A CN 202310854042A CN 116569917 B CN116569917 B CN 116569917B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- solution
- preservation
- time
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title abstract description 23
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims abstract description 25
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 229940095529 heparin calcium Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 claims abstract description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 229940090044 injection Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229940093181 glucose injection Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 96
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 claims description 12
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 claims description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 claims description 7
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 claims description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 5
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- ZLWYEPMDOUQDBW-UHFFFAOYSA-N 6-aminonicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=C(N)N=C1 ZLWYEPMDOUQDBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 3
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 abstract 1
- WNZSSNMAWSVPSV-UHFFFAOYSA-N hexaazanium phosphonato phosphate sulfate Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP(=O)([O-])[O-].S(=O)(=O)([O-])[O-].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+] WNZSSNMAWSVPSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- FVVLHONNBARESJ-NTOWJWGLSA-H magnesium;potassium;trisodium;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate;acetate;tetrachloride;nonahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[Mg+2].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[K+].CC([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O FVVLHONNBARESJ-NTOWJWGLSA-H 0.000 abstract 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 abstract 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 9
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- -1 6-amino nicotinoyl Chemical group 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 2
- PRRZDZJYSJLDBS-UHFFFAOYSA-N 3-bromo-2-oxopropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CBr PRRZDZJYSJLDBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 241001649247 Boehmeria Species 0.000 description 1
- 206010021034 Hypometabolism Diseases 0.000 description 1
- 101100261159 Oryza sativa subsp. japonica TPP10 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002806 hypometabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用,该细胞保藏方式包括冷藏或常温保存前的糖酵解抑制剂预处理以及海藻糖预处理过程,细胞保存液包括如下组分:人血白蛋白、低分子肝素钙、非必须氨基酸、硫酸铵焦磷酸、以及博脉力A注射液(Plasma lyte A)和右旋糖酐40‑葡萄糖注射液的混合物。本发明所述的细胞保存液及细胞保藏方法可以解决现有鲜活细胞保存时间短,无法长时间运输等问题。同时,该保存方法可以满足鲜活细胞产品的常温(18‑30℃)或低温(2‑8℃)长时间储存,有助于细胞产品的临床使用,整个过程中全部使用注射剂和药用辅料,具有很高的安全性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,尤其是涉及一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用。
背景技术
近年来针对各种疾病的细胞疗法取得了重大进展,但依旧存在许多挑战,例如作为常规的货架产品,很多细胞产品需要按批进行长期的低温(-80℃)或深低温(-196℃)储存,使用前还需要对细胞进行复苏清洗以除去冻存液组分,即便如此,所含组分(DMSO等)残留有可能影响安全性和治疗效果;而对于鲜活的细胞产品,常温或冷藏保存的细胞因时间短(通常不超过24h)导致应用范围受限。
发明内容
有鉴于此,本发明旨在克服现有技术中的缺陷,提出一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
一种细胞的低温、常温保存方法,包括如下步骤:
步骤1:收获培养的细胞前,将富含糖酵解抑制剂的溶液加入培养液中进行孵育、消化后,离心收集细胞;
步骤2:将步骤1收集的细胞,以富含海藻糖的溶液制备细胞悬液孵育、离心,经PBS缓冲液洗涤后收集细胞;
步骤3:将步骤2收集的细胞加入细胞保存液中,置于低温2-8℃下保存或室温18-30℃下保存。
进一步,所述的步骤1中的糖酵解抑制剂为2-脱氧葡萄糖、3-溴丙酮酸或6-氨基烟酰胺中的一种;所述的糖酵解抑制剂在所述的步骤1中的细胞悬液中的浓度为20-100nM;所述的糖酵解抑制剂使用磷酸盐缓冲液或无血清基础培养基配制;所述的步骤1中的孵育步骤的温度为37℃,时间为30-60min;所述的步骤1中消化步骤为酶消化方法;所述的步骤1中的离心步骤的离心力为2000g,时间为5min。
进一步,所述的步骤2中的富含海藻糖的溶液为含有3-5 w/v%海藻糖的PBS缓冲液;所述的步骤2中的孵育步骤的温度为4℃,时间为3-5min。
进一步,步骤3中加入细胞保存液后细胞的浓度为2-20×106细胞/ml。
进一步,所述的步骤3中的细胞保存液包括如下组分:人血白蛋白20-40 w/v%,低分子肝素钙30-100IU/ml,硫胺素焦磷酸 10-50nM,非必须氨基酸1-3 v/v%,余量为勃脉力A注射液与右旋糖酐40葡萄糖注射液的混合液;所述的非必须氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸中的至少一种。
进一步,所述的细胞为干细胞或免疫细胞。
本发明还提供了一种细胞保存液,该保存液包括如下组分:
人血白蛋白 20-40 w/v%,
低分子肝素钙 30-100IU/ml,
硫胺素焦磷酸 10-50nM;
非必须氨基酸 1-3 v/v%,
余量为勃脉力A注射液与右旋糖酐40葡萄糖注射液的混合液。
进一步,所述的非必须氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸中的至少一种。
本发明还提供了一种保存细胞,该细胞由所述的方法保存而成。
本发明还提供了一种所述的细胞的低温、常温保存方法的应用,所述的方法在生物样本库的样本保存和/或制备细胞药物领域中的应用。
不同于超低温储存,细胞的低温或常温储存以及运输仍然为细胞代谢提供条件。因此对于细胞代谢的缓慢过渡性抑制有助于细胞冷藏的长时间低代谢保存。因此,该保存方法首先在细胞收获前的细胞悬液,以代谢抑制剂进行细胞低代谢预适应过程,可减少细胞从代谢旺盛状态进入快速停止状态的细胞损伤,包括细胞凋亡以及细胞死亡;其次通过海藻糖等非细胞渗透剂进行细胞清洗预适应,经过两步预适应,细胞在简单的保存液中能保持更长久的细胞活率以及细胞性能。此外,细胞保存液成分为临床药用级成分,非常适用于鲜活细胞治疗产品的保存和运输,具有非常广泛的市场应用价值。
相对于现有技术,本发明具有以下优势:
本发明所述的细胞保存液及细胞保存方法可以解决现有鲜活细胞制剂仅能维持细胞活性不超过24小时,无法长时间储存的问题,该方法整个过程操作简单,具有很高的安全性,可以满足鲜活细胞产品的常温(18-30℃)或低温(2-8℃)长时间储存,将有助于细胞产品的临床使用。
附图说明
图1为本发明实施例4实验组3接种12h后细胞贴壁图;
图2为本发明实施例4实验组3接种24h后细胞贴壁图;
图3为本发明实施例4实验组3接种60h后细胞贴壁图;
图4为本发明实施例4实验组6接种12h后细胞贴壁图;
图5为本发明实施例4实验组6接种24h后细胞贴壁图;
图6为本发明实施例4实验组6接种60h后细胞贴壁图。
具体实施方式
除有定义外,以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
本发明实施例所述的非必须氨基酸购买自Gibco(货号:11140076)。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1:细胞收获前对糖酵解抑制剂的筛选与优化
按照三因素三水平的DOE实验设计对糖酵解抑制剂的种类、浓度、作用时间进行优化。细胞收获前,弃去培养上清,加入含有不同浓度的糖酵解抑制剂,于培养箱中继续孵育30-90min,然后经过消化后离心收获细胞。加入细胞保存液,将细胞悬液置于水平摇床上,速度为20rpm/min。将两组分别置于4℃和25℃。48h后,检测25℃样品细胞存活率;72h后,检测4℃样品细胞存活率。其中细胞保存液成分为人血白蛋白20w/v%,低分子肝素钙65IU/ml,硫胺素焦磷酸 20nM;非必须氨基酸2 v/v%, 注射用生理盐水。其中糖酵解抑制剂分别为A(2-脱氧葡萄糖)、B (3-溴丙酮酸)和C(6-氨基烟酰胺)。
表1 实验分组设置
表2 实验结果
SPSS软件分析可知:
K糖酵解A=84.22;K糖酵解B =81.03;K糖酵解c= 90.54;极差R糖酵解=9.51;
K浓度20=85.38;K浓度50=85.45;K浓度100=84.96;极差R细胞=0.49;
K时间30=85.91;K时间60=86.57 ;K时间90= 83.31;极差R时间=3.26;
其中:R糖酵解剂>R时间>R浓度,不同糖酵解剂的预处理对细胞冷藏和冷鲜保存均有促进作用,其中6-氨基烟酰胺保护作用最强。在实验范围内浓度似乎影响不大,考虑细胞使用安全性,建议不超过100nM即可,因处于非消化状态糖酵解抑制物浓度对细胞活力保护影响最大。作用时间延长导致保护力的下降,最优保护时间为60min。
最优实验组合为6-氨基烟酰50 nM,作用时间30min。
此外,虽然未分析细胞在25℃,48h的细胞活力,但较对照组均有提升。
实施例2:海藻糖预处理对细胞冷藏保护作用的筛选与优化
按照三因素三水平的DOE实验设计对海藻糖的浓度、作用时间以及细胞浓度三个条件进行优化,正常收获培养的细胞后,洗涤两次,在第一次洗涤时加入不同浓度海藻糖预处理。清洗结束后,加入细胞保存液,将细胞悬液置于水平摇床上,速度为20rpm/min。将两组分别置于4℃和25℃。对照组为无海藻糖的PBS缓冲液,48h后,检测25℃样品细胞存活率;72h后,检测4℃样品细胞存活率(以此组为数据分析关键点)细胞保存液成分为含人血白蛋白20w/v%的注射用生理盐水。
表3 DOE实验条件设计
表4 实验分组情况
SPSS软件分析可知:
K海藻糖3=72.04;K海藻糖5=71.91;K海藻糖8=70.63;极差R海藻糖=1.40;
K细胞2=71.12;K细胞10=71.62;K细胞20=711.84;极差R细胞=0.72;
K时间10=72.37;K时间20=72.70;K时间30= 69.51;极差R时间=3.18;
其中:R时间>R海藻糖>R细胞,和对照组相比,海藻糖预处理提高了细胞冷藏和常温保存的活率。其中作用时间延长到10分钟,显示出了保护力减弱的趋势。细胞浓度对活率影响因素较小,因此考虑趋势范围内浓度均可实现。活率随海藻糖浓度增加而下降的趋势,因此建议海藻糖浓度不超过5min。
最优组合为第三组和第六组,条件分别为海藻糖浓度为3%,作用时间5min,细胞浓度为20×106。以及海藻糖浓度为5%,作用时间3min,细胞浓度为20×106。
此外,各实验组细胞在25℃条件下,48h的存活率也显示出了与对照组提升的效果,支持常温保存应用。
实施例3:对冷藏组分进行筛选剂的筛选与优化
按四因素三水平的DOE实验设计对低分子肝素钙的浓度、白蛋白浓度以及硫胺素焦磷酸以及溶媒四个组分条件进行优化,正常培养收获细胞后,最后一次加入不同5w/v%海藻糖预处理后,加入不同配比细胞保存液,将细胞悬液置于水平摇床上,速度为20rpm/min。将两组分别置于4℃和25℃。对照组为不添加溶媒,不添加肝素钙,不添加TPP等,48h后,检测25℃样品细胞存活率;72h后,检测4℃样品细胞存活率(以此组为数据分析关键点)。
表5 DOE实验条件设计
表6 实验分组情况
SPSS软件分析可知:
K肝素钙20=82.96;K肝素钙50=86.70.37;K 肝素钙100=87.69;极差R肝素钙=4.73;
K白蛋白20=84.02;K白蛋白30=85.56;K白蛋白40=85.77;极差R白蛋白=3.54;
KTPP10=86.21;KTPP20=85.67;KTPP50= 85.46;极差RTPP=0.75;
K溶媒1=85.90;K溶媒2=85.83;K溶媒3= 85.61;极差溶媒=0.30;
其中:R肝素钙>R白蛋白>RTPP>R溶媒。和对照组1、2、3相比,实验组所选成分均有提高。其中肝素钙的对细胞影响较大。考虑到治疗的安全性建议不超过100IU/ml。白蛋白作为细胞保护剂以及防聚团效果,在30%体积分数具有最好的保护效果。高浓度细胞活率略有下降。TPP对细胞活力提升有一定帮助,和无TPP组相比明显。溶媒对细胞活力影响基本没有,因此可以考虑实验所用溶媒配比或独立使用。
最优实验组合为肝素钙100IU/ml;白蛋白体积分数30%;硫胺素焦磷酸 20nM,以右旋糖苷40做溶媒,含2%NEAA。
此外,该存存体系支持常温细胞保存,细胞活率在48h仍保持80%左右存活率
实施例4:发明方法的组合验证
以实施例1-实施例3筛选最优条件进行细胞保存。分为完全预处理工艺、无步骤1糖酵解预处理工艺、无步骤2海藻糖预处理工艺、以及本技术方案全工艺组合四组。其中步骤1工艺为:细胞收获前以50 nM 6-氨基烟酰孵育30min;步骤2工艺为:含质量分数5%的海藻糖 PBS缓冲液重悬细胞,细胞浓度为10×106,作用时间5min。新鲜细胞保存液:其成分为含肝素钙65IU/ml;白蛋白体积分数30%;硫胺素焦磷酸 20nM, 2%NEAA,以勃脉力A和右旋糖苷40(6:4混合液)做溶媒。将细胞悬液置于水平摇床上,速度为20rpm/min。将两组分别置于4℃和25℃。48h后,检测25℃样品细胞存活率;72h后,检测4℃样品细胞存活率重复三组实验,实验结果如下表所示。
表7 实验结果
结果表明:通过对间充质干细胞细胞的预处理以及细胞保存液的组合,对细胞冷藏和常温保存具有显著的保护作用。全工艺处理后,实验组细胞再接种后细胞仍可正常贴壁、增殖,如图1-图6所示。因此该技术也支持细胞的常温和低温保存应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种细胞的低温、常温保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
步骤1:收获培养的细胞前,将富含糖酵解抑制剂的溶液加入培养液中进行孵育、消化后,离心收集细胞;
步骤2:将步骤1收集的细胞,以富含海藻糖的溶液制备细胞悬液孵育、离心,经PBS缓冲液洗涤后收集细胞;
步骤3:将步骤2收集的细胞加入细胞保存液中,置于低温2-8℃下保存或室温18-30℃下保存;
所述的步骤1中的糖酵解抑制剂为6-氨基烟酰胺;所述的糖酵解抑制剂在所述的步骤1中的细胞悬液中的浓度为20-50nM;
所述的步骤2中的富含海藻糖的溶液为含有3-5 w/v%海藻糖的PBS缓冲液;
所述的糖酵解抑制剂使用磷酸盐缓冲液或无血清基础培养基配制;
所述的步骤1中的孵育步骤的温度为37℃,时间为30-60min;
所述的步骤2中的孵育步骤的温度为4℃,时间为3-5min。
2.根据权利要求1所述的细胞的低温、常温保存方法,其特征在于:所述的步骤1中消化步骤为酶消化方法;所述的步骤1中的离心步骤的离心力为2000g,时间为5min。
3.根据权利要求1所述的细胞的低温、常温保存方法,其特征在于:步骤3中加入细胞保存液后细胞的浓度为2-20×106细胞/ml。
4. 根据权利要求1所述的细胞的低温、常温保存方法,其特征在于:所述的步骤3中的细胞保存液包括如下组分:人血白蛋白20-40 w/v%,低分子肝素钙30-100IU/ml,硫胺素焦磷酸 10-50nM,非必须氨基酸1-3 v/v%,余量为勃脉力A注射液与右旋糖酐40葡萄糖注射液的混合液;所述的非必须氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的细胞的低温、常温保存方法,其特征在于:所述的细胞为干细胞或免疫细胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310854042.0A CN116569917B (zh) | 2023-07-13 | 2023-07-13 | 一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310854042.0A CN116569917B (zh) | 2023-07-13 | 2023-07-13 | 一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116569917A CN116569917A (zh) | 2023-08-11 |
CN116569917B true CN116569917B (zh) | 2023-11-28 |
Family
ID=87534506
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310854042.0A Active CN116569917B (zh) | 2023-07-13 | 2023-07-13 | 一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116569917B (zh) |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003066109A1 (en) * | 2002-02-08 | 2003-08-14 | Gambro, Inc. | Nitric oxide in a pathogen inactivation process |
CN101210232A (zh) * | 2006-12-28 | 2008-07-02 | 天津昂赛细胞基因工程有限公司 | 一种间充质干细胞保存液及其用途 |
CN110959606A (zh) * | 2018-09-28 | 2020-04-07 | 上海细胞治疗集团有限公司 | 一种免疫效应细胞冻存液及其用途 |
CN111248191A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-06-09 | 北京恒生佳合细胞科技有限公司 | 一种常温细胞保存液和注射用细胞制剂 |
CN112219838A (zh) * | 2020-10-20 | 2021-01-15 | 广州准优生物科技有限公司 | 外周血单个核细胞的冻存方法 |
CN114097770A (zh) * | 2021-12-12 | 2022-03-01 | 杭州中赢生物医疗科技有限公司 | 一种免疫细胞冻存液及其应用方法 |
CN114945667A (zh) * | 2020-01-10 | 2022-08-26 | Sio2医药产品公司 | 核酸和细胞保存剂组合物以及使用方法 |
CN115299431A (zh) * | 2022-07-21 | 2022-11-08 | 广东崖山生物科技有限公司 | 维持细胞活性的保存液及其制备方法和保存细胞的方法 |
-
2023
- 2023-07-13 CN CN202310854042.0A patent/CN116569917B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003066109A1 (en) * | 2002-02-08 | 2003-08-14 | Gambro, Inc. | Nitric oxide in a pathogen inactivation process |
CN101210232A (zh) * | 2006-12-28 | 2008-07-02 | 天津昂赛细胞基因工程有限公司 | 一种间充质干细胞保存液及其用途 |
CN110959606A (zh) * | 2018-09-28 | 2020-04-07 | 上海细胞治疗集团有限公司 | 一种免疫效应细胞冻存液及其用途 |
CN114945667A (zh) * | 2020-01-10 | 2022-08-26 | Sio2医药产品公司 | 核酸和细胞保存剂组合物以及使用方法 |
CN111248191A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-06-09 | 北京恒生佳合细胞科技有限公司 | 一种常温细胞保存液和注射用细胞制剂 |
CN112219838A (zh) * | 2020-10-20 | 2021-01-15 | 广州准优生物科技有限公司 | 外周血单个核细胞的冻存方法 |
CN114097770A (zh) * | 2021-12-12 | 2022-03-01 | 杭州中赢生物医疗科技有限公司 | 一种免疫细胞冻存液及其应用方法 |
CN115299431A (zh) * | 2022-07-21 | 2022-11-08 | 广东崖山生物科技有限公司 | 维持细胞活性的保存液及其制备方法和保存细胞的方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Iloprost液4℃保存兔胎脑皮层组织的细胞存活率及腺苷磷酸酯的含量变化;刘海鹏 等;《第三军医大学学报》;第18卷(第5期);第406-408页 * |
刘保池 等.《细胞治疗临床研究》.复旦大学出版社,2019,第129页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116569917A (zh) | 2023-08-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107926933B (zh) | 一种细胞保存液 | |
CN113016782B (zh) | 一种细胞保存液及其制备方法和应用 | |
CN101919380A (zh) | 一种改进的间充质干细胞保护液及其用途 | |
CN111248191A (zh) | 一种常温细胞保存液和注射用细胞制剂 | |
CN112167240A (zh) | 临床级细胞冷藏保存液及其制备方法和应用 | |
CN111602648B (zh) | 一种免疫细胞无血清冻存液及冻存方法 | |
CN110622956A (zh) | 一种脐带间充质干细胞保存液 | |
CN112889813A (zh) | 一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法 | |
Skiles et al. | Quantitative analysis of composite umbilical cord tissue health using a standardized explant approach and an assay of metabolic activity | |
CN111838139A (zh) | 一种无蛋白细胞冻存液及其应用 | |
CN116569917B (zh) | 一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用 | |
CN114250196A (zh) | 一种外泌体扩增及保存方法 | |
CN112167241A (zh) | 干细胞冻存液及干细胞冻存和复苏方法 | |
CN112450206A (zh) | 一种直接静脉使用的非程序细胞冻存液 | |
CN116569916B (zh) | 一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用 | |
CN107164306B (zh) | 角膜模型低温保存用固体培养基及制备方法和使用方法 | |
CN106190979A (zh) | 体外培养造血干/前驱细胞的方法及其组成物 | |
CN112741081B (zh) | 一种冻存降温效果优异的人脐带间充质干细胞的程序降温方法 | |
CN114097770B (zh) | 一种免疫细胞冻存液及其应用方法 | |
CN112219838B (zh) | 外周血单个核细胞的冻存方法 | |
CN108124853A (zh) | 一种间充质干细胞的保存方法 | |
CN115644169A (zh) | 一种nk细胞冻存液及冻存方法 | |
CN116569916A (zh) | 一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用 | |
CN115005199A (zh) | 一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用 | |
Lionetti et al. | Factors affecting the stability of cryogenically preserved granulocytes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |