CN115005199A

CN115005199A - 一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用

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Publication number: CN115005199A
Application number: CN202210829540.5A
Authority: CN
Inventors: 焦顺昌; 张嵘; 卢社莲
Original assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-07-14
Filing date: 2022-07-14
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2042-07-14
Also published as: CN115005199B

Abstract

本发明提供了一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用，涉及细胞冻存技术领域；所述冻存液以质量浓度为0.9％的氯化钠注射液为缓冲液，包括以下体积百分含量的组分：DMSO5％～12％和注射级右旋糖酐401％～5％。本发明的冻存液是针对于自然杀伤细胞有特异的保护作用的冻存液。利用本发明所述冻存液可进行SNK细胞和NK细胞的长期冻存，经5个月的冻存，细胞活力和表型无改变，因此所述冻存液对于自然杀伤细胞有特异的保护作用；而且所述冻存液不含血清和培养基成份，不会引起溶血和凝血，冻存剂可供血液回输使用，可直接应用于临床。

Description

一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用

技术领域

本发明属于细胞冻存技术领域，具体涉及一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用。

背景技术

细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与，而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃时会集体罢工，低温贮藏的目的是通过超低温使细胞代谢活动近乎停止。细胞因此进入休眠状态，使细胞“不会老”，所以可以长期保存，在生产和科学研究中，可以节约人力和物力，更重要的是可以保持细胞的特性不变。利用液氮冻存各种哺乳动物细胞，是当前应用较广的一种方法。细胞冻融过程对所有细胞和组织都是有一定伤害的，因此，需要开发出有效的技术来防止细胞死亡和损伤。

冷冻保护剂分为两类：一为渗透入细胞内起保护作用的，如甘油、二甲基亚砜、乙二醇、二乙基酰胺等，在冷冻时，保护剂进入细胞，可防止胞内电解质和其它物质的浓度过分增加而起保护作用；另一类额外非穿透性保护剂，如羟乙基淀粉、白蛋白、甲基纤维素、右旋糖酐40等。细胞内保护剂的作用机制包括：自由进入细胞，取代水，使冰点下降，充当盐的二次溶剂，提高细胞膜对水的通透性。但是，部分低温保护剂在缓慢冷冻过程中虽然会保护细胞，却也会引起细胞毒性，尤其是在室温下。因此，在标准的自制冻存液中，会含有血清，因为血清可以降低细胞毒性。但血清并不是完美的成分，因为血清中含有生长因子激素等未知成分，增加了污染几率且成本波动较大，所以不推荐用于细胞库及临床应用。作为细胞冷冻保存的保护剂，可替代胎牛血清的物质有甲基纤维素，右旋糖酐等，血清替代物不仅对细胞有保护性，且化学成分明确，较易向临床推广。

目前，尽管大多数研究和医学领域都存在优化的冷冻保存方案和已发表的配方，但技术问题依然存在。主要是复苏之后质量较差，包括细胞存活率降低，细胞出现凋亡、坏死；表观遗传改变；细胞功能丧失；基因表达和形态的改变；复苏后细胞增殖缓慢等。冷冻时，降温速度是影响细胞存活的重要条件之一。当快速冷冻时，细胞内外均出现结冰，细胞受冰晶的机械损伤而死亡；慢速冷冻时，细胞外出现冰晶并逐渐增大，渗透压改变，导致细胞脱水，脱水可达90％以上，细胞内电解质及其它物质的浓度大大增高，引起蛋白质和膜结构改变而致细胞死亡。

并且，不同的细胞有不同的保护剂，而且要求的浓度也不尽相同。如有穿透性的保护剂甘油，并非对所有的细胞都有穿透性，如对牛红细胞就不能穿透。

截止到目前，FDA批准的已上市的细胞和基因治疗药品一共有18种，其中有11种细胞产品涉及到细胞低温保存。关于脐血干细胞低温储存的冻存制剂配方为10％DMSO+1％Dextran40，关于T细胞低温储存的冻存制剂配方有DMSO，Dextran40，HSA，Plasma-LyteA，Dextrose和0.9％NaCl溶液。

免疫细胞冻存液制剂相关专利中的冻存液制剂配方的缓冲液主要有注射用生理盐水，勃脉力A或复方电解质溶液。其中大部分专利中用到了培养基或血清来保护低温保存的细胞，冻存液中其它的试剂包括DMSO，右旋糖酐40，海藻糖，维生素C，人血白蛋白，丙二醇，香菇多糖，甘油，IL-2，聚乙二醇，白酒草皂苷R，羟乙基淀粉，葡萄糖，拟缺香茶菜酮，非必须氨基酸，乙酰胺，茶多酚，甲基纤维素，谷胱甘肽，丙酮酸钠，gamma聚谷氨酸，珍珠草提取液，多元醇，氯化钙，氯化钾，乳酸钠，纤维蛋白原。并且，专利中有的冻存液制剂成分是在试验阶段使用，尚未用于临床。

目前，尚没有针对自然杀伤细胞的可应用于临床级别的冻存液。临床级别的冻存液制剂配方的每种成份应该是可直接应用于临床患者或根据以前的应用先例，使用剂量控制在一定范围内，如DMSO，在临床应用中剂量应该控制在低于1g/kg/天。

上述方案中，多是T细胞或混合免疫细胞的冻存制剂及方法，但不同细胞的特异性差异是非常大的，用现有的冻存液配方冻存自然杀伤细胞达不到理想的保存效果。有针对自然杀伤细胞的冻存液，但是制剂配方中含有培养基或血清，达不到临床级别的应用要求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用，所述冻存液可保证自然杀伤细胞的长期低温保存，并且长期保存细胞活力和表型无改变，并且能够达到临床级别的应用要求。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种自然杀伤细胞的冻存液，以质量浓度为0.9％的氯化钠注射液为缓冲液，包括以下体积百分含量的组分：DMSO5％～12％和注射级右旋糖酐401％～5％。

优选的，所述冻存液中DMSO的体积百分含量为8％。

优选的，所述冻存液中注射级右旋糖酐40的体积百分含量为2％～3％。

优选的，所述冻存液还包括注射用重组人白介素-2；所述冻存液中重组人白介素-2的有效浓度为50～400IU/mL。

优选的，所述冻存液还包括人血白蛋白；所述冻存液中人血白蛋白的有效质量浓度为1％～5％。

本发明还提供了上述方案所述细胞冻存液在长期冻存自然杀伤细胞中的应用。

本发明还提供了一种长期冻存自然杀伤细胞的方法，包括以下步骤：将自然杀伤细胞置于上述方案所述冻存液中，梯度降温至-80℃进行冻存。

优选的，每mL所述冻存液中包含2×10⁷～8×10⁷个自然杀伤细胞。

本发明还提供了一种能够直接注射用的自然杀伤细胞混合物，所述自然杀伤细胞混合物包括上述方案所述冻存液和自然杀伤细胞。

有益效果：本发明提供了一种自然杀伤细胞的冻存液，以质量浓度为0.9％的氯化钠注射液为缓冲液，包括以下体积百分含量的组分：DMSO5％～12％和注射级右旋糖酐401％～5％。本发明的冻存液是针对于自然杀伤细胞有特意的保护作用的。利用本发明所述冻存液可进行SNK细胞和NK细胞的长期冻存，经5个月的冻存，细胞活力和表型无改变，因此所述冻存液对于自然杀伤细胞有特异的保护作用；而且所述冻存液不含血清和培养基成份，不会引起溶血和凝血，冻存剂可供血液回输使用，可直接应用于临床。

附图说明

图1为实施例1中SNK细胞用8％DMSO+N％Dextran冻存液冻存复苏后细胞活力变化；

图2为实施例1中冻存3个月前后细胞活力变化；

图3为实施例1中冻存5个月前后细胞活力变化；

图4为实施例1中冻存4周前后NK细胞比例变化；

图5为实施例1中冻存3个月前后细胞中NK细胞比例变化；

图6为实施例1中冻存5个月前后NK细胞比例变化；

图7为实施例1中SNK细胞冻前及用8％DMSO+N％Dextran40冻存液冻存细胞4周复苏后对靶细胞的杀伤变化；

图8为实施例1中冻存3个月前后对靶细胞的杀伤变化；

图9为实施例1中冻存5个月前后对靶细胞杀伤效率的变化；

图10为实施例1中冻存1个月细胞活力变化比较；

图11为实施例1中冻存1个月NK细胞比例变化比较；

图12为实施例1中冻存1个月对肠癌细胞系DLD-1的杀伤差异比较；

图13为实施例2中细胞冻存4周前后的细胞活力变化；

图14为实施例2中冻存2个月前后细胞活力变化；

图15为实施例2中冻存前和复苏后细胞活率变化；

图16为实施例2中SNK冻存4周前后NK细胞变化；

图17为实施例2中细胞冻存4周前后NK中CD16+细胞比例变化；

图18为实施例2中冻存2个月前后NK细胞比例变化；

图19为实施例2中SNK-LB3冻存前和复苏后NK细胞比例变化；

图20为实施例2中冻存前和复苏后NK中CD16+细胞比例变化；

图21为实施例2中SNK冻存4周前后对肿瘤靶细胞的杀伤效果；

图22为实施例2中冻存2个月前后对靶细胞的杀伤变化；

图23为实施例2中细胞冻存前和复苏后杀伤变化；

图24为实施例3中细胞冻存前和复苏后活率变化；

图25为实施例3中细胞冻存前和复苏后NK细胞比例变化；

图26为实施例3中冻存前和复苏后NK中CD16+细胞比例变化；

图27为实施例3中冻存前和复苏后NK+NKT细胞比例变化；

图28为实施例3中细胞冻存前和复苏后杀伤变化(E:T＝20:1)。

具体实施方式

本发明所述冻存液中DMSO(DimethylSulfoxide)的体积百分含量优选为8。本发明对所述DMSO的来源并没有特殊限定，优选购自sigma(Cat.No.D2650100ml，Lot.#RNBJ400)。

本发明所述冻存液中注射级右旋糖酐40的体积百分含量优选为2％～3％，这里的体积百分含量以右旋糖酐40的纯品的含量计。本发明对所述注射级右旋糖酐40的来源并没有特殊限定，优选购自山东齐都药业有限公司(国药准字H20065232)。

本发明所述冻存液还优选的包括注射用重组人白介素-2；所述冻存液中重组人白介素-2的有效浓度优选为50～400IU/mL，更优选为100～150IU/mL。本发明所述IL-2对自然杀伤细胞的冻存有保护作用。本发明对所述注射用重组人白介素-2(¹²⁵Ala)的来源没有特殊限定，优选购自双鹭药业(国药准字S19991010)。

本发明所述冻存液优选的还包括人血白蛋白注射液；所述冻存液中人血白蛋白的有效质量浓度优选为1％～5％，更优选为2％～3％。本发明所述人血白蛋白对冻存自然杀伤细胞有保护作用，可提高自然杀伤细胞复苏后的活力和对靶细胞的杀伤能力。本发明所述人血白蛋白优选包括人血白蛋白静脉输注溶液。本发明所述人血白蛋白优选购自杰特贝林(生产批号：P100225458)，规格为10g/瓶(20％，50mL)。

本发明所述0.9％氯化钠注射液优选购自石家庄四药有限公司(国药准字H13023200)。

本发明所述冻存液针对自然杀伤细胞，且不包含培养基和血清，达到临床级别的应用要求。在本发明实施例中，利用所述细胞冻存液对NK细胞进行冻存，冻存5个月以上，NK细胞活性和细胞表型无变化。

本发明还提供了上述冻存液的制备方法，优选包括：在室温(18～26℃)条件下，在无菌工作台内避光配置所述冻存液，现配现用。且在配制时，优选将0.9％NaCl注射液、DMSO、右旋糖酐40氯化钠注射液(Dextran40)、人血白蛋白静脉输注溶液(HSA)和注射用重组人白介素-2(¹²⁵Ala)依次加入，每加入一种成分后轻轻晃动混匀。

本发明还提供了一种长期冻存自然杀伤细胞的方法，包括以下步骤：将自然杀伤细胞置于上述冻存液中，梯度降温至-80℃进行冻存。

本发明每mL所述冻存液中优选包含2×10⁷～8×10⁷个自然杀伤细胞。本发明所述自然杀伤细胞在使用前优选还包括洗涤，所述洗涤优选包括用225mL离心管收集所述细胞，1200g离心5min，室温离心后弃上清，用无菌的0.9％氯化钠注射液洗涤两次。本发明将所述自然杀伤细胞置于所述冻存液后进行梯度降温，所述梯度优选为-1℃/min。利用本发明所述方法，自然杀伤细胞可冻存的时间不低于5个月，经5个月的冻存，细胞活力和表型无改变。本发明所述自然杀伤细胞优选包括自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞或树突状细胞(DC细胞)。

本发明还提供了一种能够直接注射用的自然杀伤细胞混合物，所述自然杀伤细胞混合物包括上述冻存液和自然杀伤细胞。本发明所述混合物的比例优选为冻存前NK细胞和冻存液的比例，但是在冻存前或解冻后可直接应用于临床，如静脉注射或腹腔注射等。

术语解释：

自然杀伤细胞(Naturalkillercells,NKcells),是人体天然免疫细胞中的重要组分，NK细胞可以通过表面TCR和相关的CD3分子的缺失，以及CD56的表达来鉴定，在宿主抗肿瘤免疫中具有重要作用。

二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)，常用的有机溶剂，在细胞冻存过程中能渗透入细胞内起到保护作用。

海藻糖，在细胞冻存过程中，对细胞起保护作用。

右旋糖酐40(Dextran40)，是细胞的非穿透性保护剂，在细胞冻存过程中起到保护作用。

人血白蛋白(Humanserumalbumin,HSA)，在细胞冻存过程中，对其细胞起保护作用。

下面结合实施例对本发明提供的一种自然杀伤细胞冻存液、冻存方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

在本发明以下实施例中，各冻存液的配置方法均为：室温，在无菌工作台内避光配置冻存液，现配现用。0.9％NaCl、DMSO、Dextran40、HSA和IL-2依次加入，每加入一种成分后轻轻晃动混匀。

NK细胞冻存方法：NK细胞洗涤后加入冻存液，然后梯度降温-80℃(-1℃/min)。

试验用试剂：

(1)人血白蛋白静脉输注溶液，10g/瓶(20％，50mL)，杰特贝林，生产批号：P100225458。

(2)DimethylSulfoxide，sigma，Cat.No.D2650100ml，Lot.#RNBJ400。

(3)0.9％氯化钠注射液，国药准字H13023200，石家庄四药有限公司。

(4)右旋糖酐40氯化钠注射液(Dextran40，浓度6％)，国药准字H20065232，山东齐都药业有限公司。

(5)注射用重组人白介素-2(¹²⁵Ala)，国药准字S19991010，双鹭药业。

配置方法：

室温，在无菌工作台内避光配置冻存制剂，现配现用。0.9％NaCl、DMSO、Dextran40依次加入，每加入一种成份后轻轻晃动混匀。

实施例1

不同浓度的Dextran40对自然杀伤细胞冻存的影响

采用8％DMSO+N％Dextran冻存SNK细胞，Dextran的浓度由0.5％到5％共8个梯度。细胞冻存4周后，复苏，检测SNK细胞对靶细胞的杀伤，SNK的活力，表型来综合评价冻存液的冻存效果。

(1)对细胞活力的影响

1)冻存4周细胞活力变化

SNK细胞D19天和用8％DMSO+N％Dextran冻存液冻存细胞28天复苏后的细胞活力(图1)比较显示，使用8％DMSO+3％Dextran冻存液冻存的SNK细胞28天复苏后，细胞的活力为(82.9±2.4)％，细胞冻存前的活力均值为88.4％，两者相比分析P＝0.073>0.05，无统计学差异。

2)冻存3个月细胞活力变化

SNK细胞冻存后3个月后复苏检测细胞活力(图2)，各组细胞活力较冻前均有不同程度的降低，各组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。

3)冻存5个月细胞活力变化

SNK细胞冻存5个月后复苏，检测细胞活力(图3)，各组细胞活力较冻存前均有降低，总体趋势是含Dextran浓度越高，细胞活力也越高。活力最高的为含4％Dextran冻存液组，为82.3％。

(2)对细胞表型的影响

1)冻存4周细胞表型变化

PBMC20200331B-6批次外周血来源的单个核细胞培养的SNK细胞D19天和用8％DMSO+N％Dextran冻存液冻存细胞28天复苏后的细胞表型。流式分析冻存后NK细胞比例稍稍提高，由冻前的85.3％到87％～89％之间(图4)。

2)冻存3个月细胞表型变化

SNK细胞冻存后3个月后复苏检测细胞表型，NK细胞比例稍有升高(图5)。

3)冻存5个月细胞表型变化

20200331B-6(22-SNK)批次SNK细胞冻存5个月后复苏，检测细胞表型，NK细胞比例稍有升高(图6)。

(3)对细胞杀伤的影响

1)冻存4周对靶细胞的杀伤

PBMC20200331B-6批次外周血来源的单个核细胞培养的SNK细胞D19天及冻存28天复苏后对人结直肠腺癌上皮细胞(DLD-1)，效应细胞与靶细胞的比例为20:1。8％DMSO添加不同浓度的Dextran40冻存细胞4周，复苏后不同冻存组SNK细胞对靶细胞的杀伤效果差异如图7所示，其中最佳的一组冻存液配方为8％DMSO+3％Dextran40，使用8％DMSO+3％Dextran40冻存液复苏的细胞对DLD-1的杀伤效率由冻存前的71％降到64％，两组之间统计学分析的P＝0.1829>0.05。

2)冻存3个月对靶的细胞杀伤

SNK细胞冻存后3个月后复苏检测细胞，检测对靶细胞的杀伤效率(图8)，各组对靶细胞的杀伤均有降低，其中2％和3％Dextran40组对靶细胞的杀伤效果最好。

3)冻存5个月对靶细胞的杀伤

SNK细胞冻存5个月后复苏检测细胞，检测对靶细胞的杀伤效率(图9)，各组对靶细胞的杀伤均有降低，其中2％和3％Dextran40组对靶细胞的杀伤效果最好，两组之间的差异无统计学意义。

(4)和常用的10％DMSO+1％Dextran冻存制剂冻存效果相比

用本发明中的冻存制剂的剂量与现在已上市细胞产品常用的冻存制剂冻存SNK细胞，冻存一个月后检测，发现用8％DMSO+3％Dextran40冻存的细胞比用10％DMSO+1％Dextran冻存的细胞，细胞活力较高(图10)，NK细胞比例无明显变化(图11)，对肠癌细胞系DLD-1的杀伤较高(图12)。

综上来看，不同Dextran浓度的冻存液中，8％DMSO+2％～3％Dextran冻存液组对SNK细胞冻存效果最好，复苏后SNK细胞对靶细胞杀伤效果最好。

实施例2

8％DMSO+3％Dextran+NIL-2冻存液对SNK细胞冻存的影响

20200819S批次SNK细胞用含不同浓度IL-2的冻存液冻存两个月后，复苏细胞，检测细胞活力，表型和对靶细胞的杀伤。

(1)对细胞活力的影响

1)冻存4周细胞活力变化

含不同浓度IL-2的冻存冻存SNK细胞复苏前后的细胞活力(图13)显示，含100IU/mLIL-2的冻存液组冻存的细胞，4周后复苏细胞的活力最高为81.5％，是冻存前细胞活力的94.4％(冻存前细胞活力为86.3％)。

2)冻存2个月细胞活力变化

冻存两个月后检测细胞活力如图14所示，含100IU/mLIL-2的冻存液组细胞活力均值较高，与之前冻存一个月复苏检测结果相似。

3)冻存3个月细胞活力变化

SNK细胞添加不同浓度的IL-2，冻存3个月后细胞活力均有不同程度的降低，其中添加12.5IU/mL和100IU/mL组与不加IL-2组无明显差别(图15)。

(2)对细胞表型的影响

1)冻存4周细胞表型变化

添加不同浓度的IL-2的冻存液冻存SNK细胞4W后，流式检测细胞表型显示CD3-CD56+NK细胞的比例稍有降低，由冻前的95.07％降到94.3％～95.02％，各组冻存复苏后添加IL-2组比无IL-2组比例稍高(图16)。NK中CD16+细胞比例(图17)冻前为99.10％，冻存4周复苏后为96.6％～98.6％之间，各组之间无明显差异。

2)冻存2个月细胞表型变化

冻存两个月后检测细胞表型显示，冻存复苏后NK比例稍有升高，NK中CD16+细胞比例稍有降低，NKT细胞比例稍有降低，NKT中CD16+细胞比例降低，T细胞比例稍有降低，NK+NKT总细胞比例稍有升高，各组之间无明显变化(图18)。

3)冻存3个月细胞表型变化

SNK细胞添加不同浓度的IL-2，冻存3个月后复苏，NK细胞比例稍有降低，NK中CD16+细胞比例有所升高，含IL-2组比无IL-2组高(图19～20)。

(3)对细胞杀伤的影响

1)冻存4周对靶细胞的杀伤

SNK细胞用含IL-2的冻存液冻存前后对靶细胞的杀伤效果。含有IL-2的冻存液对靶细胞的杀伤效率比不含IL-2的冻存液冻存的细胞杀伤效率明显增强，添加50IU/mL至400IU/mLIL-2,复苏的SNK细胞对H358靶细胞的杀伤效率无统计学差异(图21)。

2)冻存2个月对靶细胞的杀伤

冻存前后对靶细胞的杀伤如图22所示，复苏后的SNK细胞对靶细胞的杀伤效率均有所降低，当效靶比为20：1时，含100IU/mLIL-2组对H358靶细胞的杀伤效率为48.7％(冻存前为74％)，与其它组的差异无统计学意义。

3)冻存3个月对靶细胞的杀伤

SNK细胞添加不同浓度的IL-2，冻存3个月后复苏后SNK细胞对靶细胞的杀伤效率均有减低，含有IL-2组比不含IL-2组细胞对靶细胞杀伤作用强，综合分析100IU/mLIL-2对靶细胞的杀伤效果较好(图23)。

综上来看，20200819S批次SNK细胞用含不同浓度IL-2的冻存液冻存两个月后观察，100IU/mLIL-2组细胞活力最高，但与其它组组之间的差异仍无统计学意义(P>0.05％)，细胞表型和杀伤各组之间差异不大。

细胞冻存3个月，不同组冻存液冻存复苏后细胞活率不同程度下降，冻存液为8％DMSO+3％Dextran+100IL-2复苏后活率最好。复苏后细胞表型基本保持一致。复苏后其杀伤效率都有降低，其中含IL-2组比无IL-2组降低的幅度较小。

实施例3

8％DMSO+3％Dextran+100IU/mLIL-2+N％HSA冻存液对SNK细胞冻存的影响

NK细胞洗涤后加入冻存液，然后梯度降温-80℃(-1℃/min)

(1)对细胞活力的影响

SNK细胞冻存一个月后，复苏检测细胞活力，分析结果显示，含5％HSA冻存液组细胞活力最高(图24)。

(2)对细胞表型的影响

SNK细胞冻存一个月后，复苏检测细胞表型，NK细胞大多升高，NK中CD16+细胞稍有降低，NK+NKT细胞比例升高，均在98％以上(图25～27)。

(3)对细胞杀伤的影响

SNK细胞冻存一个月后，复苏检测对靶细胞的杀伤作用，各组均有明显的降低，其中2.5％HSA和5％HSA冻存液组细胞具有相对较高的杀伤效果(图28)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种自然杀伤细胞的冻存液，以质量浓度为0.9％的氯化钠注射液为缓冲液，包括以下体积百分含量的组分：DMSO 5％～12％和注射级右旋糖酐40 1％～5％。

2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液中DMSO的体积百分含量为8％。

3.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液中注射级右旋糖酐40的体积百分含量为2％～3％。

4.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液还包括注射用重组人白介素-2；所述冻存液中重组人白介素-2的有效浓度为50～400IU/mL。

5.根据权利要求2～4任意一项所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液还包括人血白蛋白；所述冻存液中人血白蛋白的有效质量浓度为1％～5％。

6.权利要求1～5任一项所述细胞冻存液在长期冻存自然杀伤细胞中的应用。

7.一种长期冻存自然杀伤细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将自然杀伤细胞置于权利要求1～6任一项所述冻存液中，梯度降温至-80℃进行冻存。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，每mL所述冻存液中包含2×10⁷～8×10⁷个自然杀伤细胞。

9.一种能够直接注射用的自然杀伤细胞混合物，其特征在于，所述自然杀伤细胞混合物包括权利要求1～5任一项所述冻存液和自然杀伤细胞。