CN114097770A - 一种免疫细胞冻存液及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种免疫细胞冻存液，其组分包括：聚乙二醇3‑5mg/ml；壬基酚聚氧乙烯醚‑100.1‑0.5μg/ml；1,3‑丙二醇1.2‑3mg/ml；葡聚糖0.1‑0.5ml/ml；苜蓿素0.01‑0.05mg/ml；海藻糖0.2‑0.6mg/ml；姜黄素0.01‑0.06ml/ml；非必须氨基酸5‑8mg/ml；人血白蛋白10‑18mg/ml。本发明还公开了一种免疫细胞的冻存应用方法。本申请在冻存液中添加姜黄素，与海藻糖配合，不仅对冻存细胞具有极好的保护作用，同时细胞复苏后细胞活力极有优秀，即使对于大规模免疫细胞的冻存，细胞回收率也可保持较高水平，冻存时间可达几年甚至更长，有效保证冻存液成本。

Description

一种免疫细胞冻存液及其应用方法

技术领域

本发明涉及免疫细胞冻存技术领域，尤其涉及一种免疫细胞冻存液及其应用方法。

背景技术

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色，从血液中分离出来的单个核细胞包括：T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等，是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，经各类细胞因子诱导扩增培养，得到一群具有高效杀伤活性的免疫细胞群。

细胞冻存技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用，通过对供体的免疫细胞深低温保存保持其活力和功能，免疫细胞在-70℃～-80℃冻存，细胞活性会随着冷冻时间的延长迅速下降，在-196℃时细胞生物学过程几乎停止，因此要长期保存免疫细胞，液氮温度是最佳的储存温度。

细胞冷冻技术无论对临床还是基础研究均具有重要意义，细胞冻存经常采用渗透性保护剂，例如甘油和二甲基亚砜(DMSO)两种，而甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，但DMSO却可以迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，成为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂。目前DMSO作为常用的细胞冷冻保存剂，不能长时间有效保存大规模培养的免疫细胞，复苏后细胞数量及活力都无法满足临床应用的标准。

因而，发明人致力于寻找在未添加DMSO的前提下，能够促进冷冻保存下免疫细胞存活率，并达到能够长期保存免疫细胞效果的冻存液，具有极好的研究前景。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种免疫细胞冻存液及其应用方法。

本发明提出的一种免疫细胞冻存液，其组分包括：

优选地，所述非必须氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。

海藻糖广泛存在于低等动物、藻类、细菌、真菌、酵母中，是应激代谢的重要产物，具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、高渗透压、有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能。

姜黄素是一种天然化合物，是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种二酮类化合物，是植物界很稀少的具有二酮结构的色素，具有良好的抗炎和抗癌特性。

苜蓿素为类黄酮类植保素，是豆科植物紫苜蓿的浓缩提取物，是紫苜蓿受到外界刺激或感染病菌后合成并积累的具有抗逆活性的小分子化合物。

优选地，所述的免疫细胞冻存液，其组分包括：

优选地，所述的免疫细胞冻存液，其组分包括：

一种免疫细胞冻存液的应用方法，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，20-30℃离心30-40min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与权利要求1-4所述的免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存5-10h，然后转入液氮中冻存。

优选地，所述细胞悬浮液中细胞的浓度为1-5×10⁷个/ml。

复苏免疫细胞复苏包括如下步骤：取出冻存管快速置于37℃恒温水浴锅中1-2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤2-3次，得到复苏免疫细胞。

本发明的技术效果如下所示：

(1)本发明不添加DMSO，通过采用聚乙二醇与1,3-丙二醇、壬基酚聚氧乙烯醚-10复配，改变细胞膜的通透性，使细胞内自由水排出细胞外避免冻存对细胞的损害；

(2)苜蓿素与葡聚糖配合，可有效维持细胞外环境保温稳定渗透压，避免脱水后细胞结构紊乱，并促使细胞快速恢复活性，但发明人发现，细胞虽然可快速恢复活性，但增殖能力受限，增殖能力不理想；

目前海藻糖作为一种非渗透保护剂，在细胞的低温保温过程具有很好的保护作用，而对冷冻免疫细胞复苏后增殖能力还未见报道，本发明通过大量试验发现，海藻糖与葡聚糖、苜蓿素复配，在保证细胞快速恢复活性的基础上，其增殖能力极为优越，这是单独使用海藻糖所不具备的。

(3)同时发明人还发现在冻存液中添加姜黄素与海藻糖配合，不仅对冻存细胞具有极好的保护作用，同时细胞复苏后细胞活力极有优秀，即使对于大规模免疫细胞的冻存，细胞回收率也可保持较高水平，冻存时间可达几年甚至更长，有效保证冻存液成本。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

一种免疫细胞冻存液，其组分包括：

实施例2

一种免疫细胞冻存液，其组分包括：

实施例3

一种免疫细胞冻存液，其组分包括：

实施例4

一种免疫细胞冻存液，其组分包括：

实施例5

一种免疫细胞冻存液，其组分包括：

实施例6

一种免疫细胞冻存液，其组分包括：

实施例7

一种免疫细胞冻存液，其组分包括：

所述免疫细胞冻存液的应用方法，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，25℃离心30min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与上述的免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，所述细胞悬浮液中细胞的浓度为3×10⁷个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存10h，然后转入液氮中冻存。

复苏免疫细胞复苏包括如下步骤：取出冻存管快速置于37℃恒温水浴锅中2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤3次，得到复苏免疫细胞。

对比例1

一种免疫细胞冻存液，其组分包括：

所述免疫细胞冻存液的应用方法，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，25℃离心30min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与上述的免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，所述细胞悬浮液中细胞的浓度为3×10⁷个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存10h，然后转入液氮中冻存。

复苏免疫细胞复苏包括如下步骤：取出冻存管快速置于37℃恒温水浴锅中2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤3次，得到复苏免疫细胞。

对比例2

一种免疫细胞冻存液，其组分包括：

所述免疫细胞冻存液的应用方法，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，25℃离心30min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与上述的免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，所述细胞悬浮液中细胞的浓度为3×10⁷个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存10h，然后转入液氮中冻存。

复苏免疫细胞复苏包括如下步骤：取出冻存管快速置于37℃恒温水浴锅中2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤3次，得到复苏免疫细胞。

对比例3

一种免疫细胞冻存液，其组分包括：

所述免疫细胞冻存液的应用方法，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，25℃离心30min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与上述的免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，所述细胞悬浮液中细胞的浓度为3×10⁷个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存10h，然后转入液氮中冻存。

复苏免疫细胞复苏包括如下步骤：取出冻存管快速置于37℃恒温水浴锅中2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤3次，得到复苏免疫细胞。

性能测试

将实施例5和对比例1-3的冻存方法中所得细胞悬浮液进行台盼蓝染色计算活性，采用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将余下的细胞悬液加入冻存管中，每管1mL；分为10天、30天、60天三组，每组3管细胞，总共9管细胞；将冻存管放入-80℃冰箱中冻存10h，转移至液氮中冻存。

将分别在液氮中保存10天、30天、60天的免疫细胞取出，按各组复苏方法执行，将解冻后的CIK细胞进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将复苏后的细胞活性以及表面标记物取平均值与冻存前细胞的数值进行对比，其中细胞活性计算结果如下表1所示，细胞表面标记物表达率检测结果如下表2所示。

表1细胞活性

表2细胞表面标记物表达率

由以上表1、表2可知，对比例1未添加海藻糖，虽然细胞冻存后的存活率没有大的变动，但无法保证免疫细胞复苏后的增殖能力，而对比例2未添加葡聚糖、苜蓿素，其不仅细胞冻存后的存活率降低，同时免疫细胞复苏后的增殖能力差；而对比例3未添加姜黄素，不仅冻存细胞的细胞活力降低，细胞回收率降低，同时对于大规模细胞的冻存，冻存时间显著缩短，复苏后的细胞内具有可见异物，并遭受细菌、真菌、细菌内毒素、支原体的污染。

综上，通过实施例5与对比例1-3进行比较可以得出，采用本发明的冻存液可使得细胞复苏后具有更好的细胞活性，细胞生物学特性几乎不发生变化，保证了免疫细胞的生物学活性，2年的复苏后的存活率可达到95％以上，有效保证了免疫细胞长时间储存与运输。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，其组分包括：

2.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述非必须氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。

3.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，其组分包括：

4.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，其组分包括：

5.一种免疫细胞冻存液的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，20-30℃离心30-40min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与权利要求1-4所述的免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存5-10h，然后转入液氮中冻存。

6.根据权利要求5所述的免疫细胞冻存液的应用方法，其特征在于，所述细胞悬浮液中细胞的浓度为1-5×10⁷个/ml。