CN114009425A - 一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及其冻存方法 - Google Patents

一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及其冻存方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114009425A
CN114009425A CN202111491599.XA CN202111491599A CN114009425A CN 114009425 A CN114009425 A CN 114009425A CN 202111491599 A CN202111491599 A CN 202111491599A CN 114009425 A CN114009425 A CN 114009425A
Authority
CN
China
Prior art keywords
immune cell
solution
protective solution
cells
vitrification cryopreservation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111491599.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN114009425B (zh
Inventor
不公告发明人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Life Ark Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Life Ark Biomedical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Life Ark Biomedical Technology Co ltd filed Critical Hangzhou Life Ark Biomedical Technology Co ltd
Priority to CN202111491599.XA priority Critical patent/CN114009425B/zh
Publication of CN114009425A publication Critical patent/CN114009425A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114009425B publication Critical patent/CN114009425B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.5‑2.5v/v％、二甲基亚砜0.5‑1.0v/v％、丙三醇3‑6v/v％、乙二醇7‑12v/v％、葡萄糖3‑5w/v％、人血白蛋白0.5‑0.8w/v％、黄酮并木脂素类化合物15‑25mg/mL、蚕丝素低聚肽粉30‑50mg/mL，余量为培养液。本发明的免疫细胞玻璃化冻存保护液，将二甲基亚砜的含量降低至0.5‑1.0v/v％、可以有效降低其对细胞的伤害，有利于细胞复苏；加入了植物提取物黄酮并木脂素类化合物和蚕茧提取物蚕丝素低聚肽粉，两者共同使用，具有协同效果，可以显著提升免疫细胞的复苏率和存活率。

Description

一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及其冻存方法
技术领域
本发明涉及生物细胞技术领域，尤其涉及一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及其冻存方法。
背景技术
免疫细胞疗法是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法，它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，以激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于零下196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。传统的方法，细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％，15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。为了降低冻存过程中对细胞的伤害并提升细胞的存活率，国内外对免疫细胞冻存保护液进行了大量研究。
中国发明专利CN105123671A公开了一种细胞冻存液，使用人血白蛋白可以替代胎牛血清在冻存中发挥的作用同时添加了非必须氨基酸、维生素C和香菇多糖以保证复苏后细胞增殖活力不受影响，而葡萄糖和丙二醇可替代二甲基亚砜的保护作用，保证细胞在接近冰点时胞内水分不会结晶；中国发明专利CN106665559A公开了一种免疫细胞冻存液，包含：DMSO；HSA；血浆，以还加入白酒草皂苷R和培养基。该冻存液能够有效保存免疫细胞，并且保存时间长，细胞复苏后恢复能力强，细胞回收率高；中国发明专利CN106942200A公开了一种冻存保护液，在基础培养基加入胎牛血清、人血清白蛋白、二甲基亚砜、乙二醇、甲酰胺和葡萄糖。该冻存保护液可以进行玻璃化冻存优势：细胞复苏率达到90％以上，存活率达到85％以上；中国发明专利CN108142412A公开了一种冻存保护液，该冻存液，包括基础培养基、葡萄糖、丙二醇、乙酰胺、右旋糖酐、羟乙基淀粉、葡萄糖、肝素钠、珍珠草提取液和卡介菌复合多糖；该冻存液可保证复苏后细胞增殖活力不受影响，保证细胞在接近冰点时胞内水分不会结晶；中国发明专利CN110495447A公开了一种冻存保护液，在基础培养基RPMI1640培养液中加入聚乙烯醇、二甲基亚砜、丙三醇、乙二醇、葡萄糖、胎牛血清和人血清白蛋白。
为了进一步提升免疫细胞的复苏率和存活率，本发明提出了一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及其冻存方法。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种免疫细胞玻璃化冻存保护液。
本发明的技术方案如下：
一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，由以下成分组成：培养液、聚乙烯醇、二甲基亚砜、丙三醇、乙二醇、葡萄糖、人血白蛋白、黄酮并木脂素类化合物和蚕丝素低聚肽粉。
优选的，所述的免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.5-2.5v/v％、二甲基亚砜0.5-1.0v/v％、丙三醇3-6v/v％、乙二醇7-12v/v％、葡萄糖3-5w/v％、人血白蛋白0.5-0.8w/v％、黄酮并木脂素类化合物15-25mg/mL、蚕丝素低聚肽粉30-50mg/mL，余量为培养液。
优选的，所述的培养液为DMEM/F12培养液。
优选的，所述的黄酮并木脂素类化合物提取自垂穗披碱草。
进一步优选的，所述的黄酮并木脂素类化合物的化学式为：
Figure BDA0003399583500000031
优选的，所述的蚕丝素低聚肽粉提取自蚕茧。具体的提取方法参考中国发明专利CN107099570A的实施例1。
采用以上免疫细胞玻璃化冻存保护液冻存免疫细胞的方法，包括以下步骤：将免疫细胞加入冻存液中，然后将温度降至零下20-零下25℃冻存1-2h，然后以3-5℃/h的速率降温至零下80℃冻存过夜，最后转移至液氮中保存，即可。
优选的，所述的免疫细胞的冻存密度为8-15×106个/mL。
所述的免疫细胞包括但不限于：T细胞、NK细胞、单个核细胞、DC细胞、γδT细胞、CAR-T细胞。
本发明的有益之处在于：
1、本发明的免疫细胞玻璃化冻存保护液，将二甲基亚砜的含量降低至0.5-1.0v/v％、可以有效降低其对细胞的伤害，有利于细胞复苏。
2、本发明的免疫细胞玻璃化冻存保护液中加入了植物提取物黄酮并木脂素类化合物和蚕茧提取物蚕丝素低聚肽粉，两者共同使用，具有协同效果，可以显著提升免疫细胞的复苏率和存活率。
具体实施方式
实施例1
一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.8v/v％、二甲基亚砜0.7v/v％、丙三醇4.5v/v％、乙二醇8.5v/v％、葡萄糖3.2w/v％、人血白蛋白0.7w/v％、黄酮并木脂素类化合物18mg/mL、蚕丝素低聚肽粉45mg/mL，余量为培养液。
所述的培养液为DMEM/F12培养液。
所述的黄酮并木脂素类化合物提取自垂穗披碱草；所述的黄酮并木脂素类化合物的化学式为：
Figure BDA0003399583500000041
所述的蚕丝素低聚肽粉提取自蚕茧。具体的提取方法参考中国发明专利CN107099570A的实施例1。
实施例2
一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇2.5v/v％、二甲基亚砜0.5v/v％、丙三醇6v/v％、乙二醇7v/v％、葡萄糖5w/v％、人血白蛋白0.5w/v％、黄酮并木脂素类化合物25mg/mL、蚕丝素低聚肽粉30mg/mL，余量为培养液。
所述的培养液为DMEM/F12培养液。
所述的黄酮并木脂素类化合物提取自垂穗披碱草。
所述的黄酮并木脂素类化合物的化学式为：
Figure BDA0003399583500000051
所述的蚕丝素低聚肽粉提取自蚕茧。具体的提取方法参考中国发明专利CN107099570A的实施例1。
实施例3
一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.5v/v％、二甲基亚砜1.0v/v％、丙三醇3v/v％、乙二醇12v/v％、葡萄糖3w/v％、人血白蛋白0.8w/v％、黄酮并木脂素类化合物15mg/mL、蚕丝素低聚肽粉50mg/mL，余量为培养液。
所述的培养液为DMEM/F12培养液。
所述的黄酮并木脂素类化合物提取自垂穗披碱草。
所述的黄酮并木脂素类化合物的化学式为：
Figure BDA0003399583500000052
Figure BDA0003399583500000061
所述的蚕丝素低聚肽粉提取自蚕茧。具体的提取方法参考中国发明专利CN107099570A的实施例1。
对比例1
一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.8v/v％、二甲基亚砜0.7v/v％、丙三醇4.5v/v％、乙二醇8.5v/v％、葡萄糖3.2w/v％、人血白蛋白0.7w/v％、蚕丝素低聚肽粉45mg/mL，余量为培养液。
所述的培养液为DMEM/F12培养液。
所述的蚕丝素低聚肽粉提取自蚕茧。具体的提取方法参考中国发明专利CN107099570A的实施例1。
对比例2
一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.8v/v％、二甲基亚砜0.7v/v％、丙三醇4.5v/v％、乙二醇8.5v/v％、葡萄糖3.2w/v％、人血白蛋白0.7w/v％、黄酮并木脂素类化合物18mg/mL，余量为培养液。
所述的培养液为DMEM/F12培养液。
所述的黄酮并木脂素类化合物提取自垂穗披碱草；所述的黄酮并木脂素类化合物的化学式为：
Figure BDA0003399583500000062
对比例3
一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.8v/v％、二甲基亚砜0.7v/v％、丙三醇4.5v/v％、乙二醇8.5v/v％、葡萄糖3.2w/v％、人血白蛋白0.7w/v％，余量为培养液。
所述的培养液为DMEM/F12培养液。
测试例
以下的定量数据，设置年龄相近的三位不同的男志愿者进行重复实验，结果取平均值。
采用以上免疫细胞玻璃化冻存保护液冻存免疫细胞的方法，包括以下步骤：
A抽取健康志愿者外周血350ml，缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，500g离心20分钟，吸取白膜层细胞；用PBS洗涤两遍，计数；
B根据计数结果，分别用实施例1-3和对比例1-3配制好、预冷的冻存液悬浮PBMC细胞，使得细胞密度在1×107个/mL，将细胞转移至冻存袋；
C然后将温度降至零下20-零下25℃冻存1-2h，然后以4℃/h的速率降温至零下80℃冻存过夜，最后转移至液氮中保存，即可。
6个月后放入37℃水浴复苏，细胞计数仪检测细胞复苏率，台盼蓝染色检测存活率，结果如表1所示。
表1：玻璃化冻存的免疫细胞复苏结果；
Figure BDA0003399583500000071
Figure BDA0003399583500000081
由以上测试数据可以知道，本发明的免疫细胞玻璃化冻存保护液对免疫细胞具有非常好的冻存效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，其特征在于，由以下成分组成：培养液、聚乙烯醇、二甲基亚砜、丙三醇、乙二醇、葡萄糖、人血白蛋白、黄酮并木脂素类化合物和蚕丝素低聚肽粉。
2.如权利要求1所述的免疫细胞玻璃化冻存保护液，其特征在于，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.5-2.5v/v％、二甲基亚砜0.5-1.0v/v％、丙三醇3-6v/v％、乙二醇7-12v/v％、葡萄糖3-5w/v％、人血白蛋白0.5-0.8w/v％、黄酮并木脂素类化合物15-25mg/mL、蚕丝素低聚肽粉30-50mg/mL，余量为培养液。
3.如权利要求1或2所述的免疫细胞玻璃化冻存保护液，其特征在于，所述的培养液为DMEM/F12培养液。
4.如权利要求1或2所述的免疫细胞玻璃化冻存保护液，其特征在于，所述的黄酮并木脂素类化合物提取自垂穗披碱草。
5.如权利要求4所述的免疫细胞玻璃化冻存保护液，其特征在于，所述的黄酮并木脂素类化合物的化学式为：
Figure FDA0003399583490000011
6.如权利要求1所述的免疫细胞玻璃化冻存保护液，其特征在于，所述的蚕丝素低聚肽粉提取自蚕茧。
7.采用权利要求1-6任一所述的免疫细胞玻璃化冻存保护液冻存免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将免疫细胞加入冻存液中，然后将温度降至零下20-零下25℃冻存1-2h，然后以3-5℃/h的速率降温至零下80℃冻存过夜，最后转移至液氮中保存，即可。
8.如权利要求7所述的冻存方法，其特征在于，所述的免疫细胞的冻存密度为8-15×106个/mL。
CN202111491599.XA 2021-12-08 2021-12-08 一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及其冻存方法 Active CN114009425B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111491599.XA CN114009425B (zh) 2021-12-08 2021-12-08 一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及其冻存方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111491599.XA CN114009425B (zh) 2021-12-08 2021-12-08 一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及其冻存方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114009425A true CN114009425A (zh) 2022-02-08
CN114009425B CN114009425B (zh) 2022-12-13

Family

ID=80068032

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111491599.XA Active CN114009425B (zh) 2021-12-08 2021-12-08 一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及其冻存方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114009425B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115466682A (zh) * 2022-11-14 2022-12-13 中国医学科学院北京协和医院 一种微生物保存液及其使用方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170114324A1 (en) * 2008-06-24 2017-04-27 Parkinson's Institute Pluripotent cell lines and methods of use thereof
CN110495447A (zh) * 2019-09-10 2019-11-26 湖南思为康医药有限公司 一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及冻存免疫细胞的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170114324A1 (en) * 2008-06-24 2017-04-27 Parkinson's Institute Pluripotent cell lines and methods of use thereof
CN110495447A (zh) * 2019-09-10 2019-11-26 湖南思为康医药有限公司 一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及冻存免疫细胞的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
韩百翠等: "黄酮并木脂素类化合物的研究进展", 《沈阳药科大学学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115466682A (zh) * 2022-11-14 2022-12-13 中国医学科学院北京协和医院 一种微生物保存液及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114009425B (zh) 2022-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106665560B (zh) 一种直接静脉回输的免疫细胞冻存液及其应用
AU693339B2 (en) Cryopreservation solution
CN108617638B (zh) 组织和/或细胞冻存保护液及其制备与应用
CN107156108A (zh) 一种外周血干细胞保存液及制备方法
JP2000516963A (ja) 酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法
CN106818710A (zh) 一种细胞冻存液及其制备方法和应用
CN106665559B (zh) 一种免疫细胞冻存液及其应用
CN105076116A (zh) 一种细胞冻存液及其应用与巨核祖细胞的冻存方法
CN108142412B (zh) 一种免疫细胞冻存液及冻存方法
CN111789108B (zh) 一种冷冻保存液及其制备方法
CN108849854B (zh) 一种外周血单个核细胞冻存方法
CN111793107B (zh) 一种无dmso的冷冻保存液及其制备方法
CN107787959A (zh) 一种免疫细胞冻存液、其制备方法、冻存方法及应用
CN112400863A (zh) 一种临床用nk细胞冻存液及冻存方法
CN112544611A (zh) 细胞冻存剂及细胞的冻存方法
CN114009425B (zh) 一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及其冻存方法
CN112167240A (zh) 临床级细胞冷藏保存液及其制备方法和应用
CN111602648A (zh) 一种免疫细胞无血清冻存液及冻存方法
CN113925049B (zh) 一种保持细胞活性的细胞保存液及其制备方法和应用
CN108207934A (zh) 一种细胞冻存液
CN107711823B (zh) 一种常温保存的细胞冻存液及其应用
CN114073249A (zh) 一种人t淋巴细胞的慢速冻存方法
CN113854280B (zh) 一种低温保存液及其制备方法和应用
CN112868642A (zh) 一种t淋巴细胞冻存液
CN114190367B (zh) 冻存液及其制备方法与在免疫细胞的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant