CN112868642A - 一种t淋巴细胞冻存液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO1~5份,右旋糖苷40葡萄糖注射液5~15份,复方电解质注射液40~60份,人血白蛋白20~40份,杜氏培养基或杜氏改良培养基5~15份。还公布了其制备和冻存方法,降低了DMOS的含量,从而降低临床使用的风险性,且使T淋巴细胞依然保持良好的冻存效果,T淋巴细胞冻存复苏后具有高的存活率,同时保持更好的形态。另外,制备过程中还解决了人血白蛋白遇DMSO发生蛋白沉淀的现象,冻存液冻存的细胞可直接稀释后应用于临床,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,直接应用于临床给药,更加方便。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域,尤其涉及一种T淋巴细胞冻存液。
背景技术
细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法,主要是采用添加适量保护剂的缓慢冷冻法来冻存细胞,如采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)为保护剂,因为如果细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻,细胞内外的水分会很快形成冰晶,从而引起一系列不良反应。
T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞,成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居,并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环,发挥细胞免疫及免疫调节等功能。目前干细胞和免疫细胞技术广泛应用,干细胞和免疫细胞储存是整个细胞产业链中的重要环节。而T淋巴细胞细胞冻存需要使用保护剂,防止细胞在冻存和复苏过程中受到冰晶损伤、脱水和吸水损伤。
CN111657264A提供了一种T淋巴细胞冻存液及其制备方法和细胞冻存方法,冷冻液成分包括二甲基亚砜、无血清细胞培养基、血清替代物,但是二甲基亚砜的含量比较高,由于二甲基亚砜存在一定的毒性作用,因此高含量二甲基亚砜的冷冻液增大了临床使用的风险性。另外,冻存的细胞在应用于临床时,需要离心去除冻存液的成分,这增加了使用的繁琐性。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO 1~5份,右旋糖苷40葡萄糖注射液5~15份,复方电解质注射液40~60份,人血白蛋白20~40份,杜氏培养基5~15份。
作为一种优选的技术方案,所述DMSO与右旋糖苷40葡萄糖注射液的体积比为1:(1~2)。
作为一种优选的技术方案,所述DMSO与复方电解质注射液的体积比为1:(9~12)。
作为一种优选的技术方案,所述人血白蛋白与杜氏培养基的体积比为(2~3):1。
作为一种优选的技术方案,按体积份计,其制备原料包括DMSO 5份,复方电解质注射液56份,右旋糖苷40葡萄糖注射液8.5份,人血白蛋白25份,杜氏培养基10份。
作为一种优选的技术方案,所述杜氏培养基为杜氏改良培养基。
本发明的第二方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的制备方法,包括以下步骤:
S1、按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,边加边摇动直至混匀;
S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白,上下颠倒混匀即得所述T淋巴细胞冻存液。
作为一种优选的技术方案,T淋巴细胞冻存液的制备方法还包括将配置得到的T淋巴细胞冻存液置于医用冷藏箱中预冷30min以上。
作为一种优选的技术方案,所述医用冷藏箱的温度设置为2~8℃。
本发明的第三方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的冻存方法,包括以下步骤:
S1、取如权利要求1~6中任一项所述的T淋巴细胞冻存液;
S2、将T淋巴细胞重悬于冻存液中,然后灌装于冻存袋,经程序降温仪降温后存储于液氮罐。
有益效果:
1、通过加入复方电解质注射液、右旋糖苷40葡萄糖注射液、人血白蛋白、杜氏培养基,降低了DMOS的含量,从而降低临床使用的风险性,且细胞依然保持良好的冻存效果。
2、本发明冻存液冻存的细胞可直接稀释后应用于临床,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,直接应用于临床给药,更加方便。
3、本发明冻存液的成分能够更好的维持T淋巴细胞的生物学功能,使T淋巴细胞冻存复苏后具有高的存活率,同时保持更好的形态。
附图说明
图1为本发明实施例1中T淋巴细胞的细胞形态图;
具体实施方式
结合以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可进一步地理解本发明的内容。除非另有说明,本文中使用的所有技术及科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本发明中提供的任何定义不一致,则以本发明中提供的术语定义为准。
在本文中使用的,除非上下文中明确地另有指示,否则没有限定单复数形式的特征也意在包括复数形式的特征。还应理解的是,如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义,“包括”、“包括有”、“具有”、“包含”和/或“包含有”,当在本说明书中使用时表示所陈述的组合物、步骤、方法、制品或装置,但不排除存在或添加一个或多个其它组合物、步骤、方法、制品或装置。此外,当描述本发明的实施方式时,使用“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指,在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而,在相同的情况下或其他情况下,其他实施方案也可能是优选的。除此之外,对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用,也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
为了解决上述问题,本发明的第一方面提供了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO 1~5份,右旋糖苷40葡萄糖注射液5~15份,复方电解质注射液40~60份,人血白蛋白20~40份,杜氏培养基5~15份。
二甲基亚砜(DMSO)是一种含硫有机化合物,分子式为C2H6OS,常温下为无色无臭的透明液体,具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性,能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物,被誉为“万能溶剂”。
在细胞冻存液中,DMSO是常用的冻存液保护剂。为了使细胞冻存效果良好,往往添加占总冻存液10%体积分数的DMSO,但是DMSO存在一定的毒性作用,因此高含量DMSO的冷冻液增大了临床使用的风险性。
为了降低冷冻液中DMSO的毒性作用,降低冷冻液在临床使用的风险性,本发明中,所述DMSO的加入量不高于总冻存液体积分数的5%,DMSO能够渗入T淋巴细胞内,使T淋巴细胞内的水分大量渗出,但低含量的DMSO不足以使T淋巴细胞内的水分充分渗出,从而造成T淋巴细胞内的水分在冷冻过程中形成的冰晶会损伤细胞,从而降低细胞的存活率。
为了解决上面问题,在一些优选的实施方式,所述DMSO与右旋糖苷40葡萄糖注射液的体积比为1:(1~2),有利于右旋糖苷40在T淋巴细胞外形成高渗,从而在DMSO用量降低的情况下,进一步促进了T淋巴细胞脱水,保护T淋巴细胞不受冰晶形成的损伤。
为了维持冷冻液的稳定性,在一些优选的实施方式,所述DMSO与复方电解质注射液的体积比为1:(9~12),在DMSO、复方电解质和右旋糖苷40的共同作用下,使T淋巴细胞内和T淋巴细胞外电解质达到平衡,更好的维持T淋巴细胞离子渗透压,从而更大限度的T淋巴细胞的增值能力和分化能力。
在一些优选的实施方式,所述人血白蛋白与杜氏培养基的体积比为(2~3):1。在为细胞冻存复融过程提供了足够的碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素等所需养分的同时,还维持了T淋巴细胞胶体渗透压,为T淋巴细胞的进一步增殖分化提供了有力的条件保障。
在一些优选的实施方式,一种T淋巴细胞冻存液的制备原料,按体积份计,包括DMSO 5份,复方电解质注射液56份,右旋糖苷40葡萄糖注射液8.5份,人血白蛋白25份,杜氏培养基10份。
为了提高杜氏培养基在冷冻液中的稳定性,在一些优选的实施方式,所述杜氏培养基还可以替换为杜氏改良培养基,更优选选自含有吡哆醇的杜氏改良培养基。
本发明的第二方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的制备方法,包括以下步骤:
S1、按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,边加边摇动直至混匀;
S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白,上下颠倒混匀即得所述T淋巴细胞冻存液。
该方法还解决了人血白蛋白遇DMSO发生蛋白沉淀的现象。
为了降低冷冻液中DMSO在常温环境中对细胞造成的伤害,在一些优选的实施方式,T淋巴细胞冻存液的制备方法还包括将配置得到的T淋巴细胞冻存液置于医用冷藏箱中预冷30min以上。
作为一种优选的技术方案,所述医用冷藏箱的温度设置为2~8℃。
本发明的第三方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的冻存方法,包括以下步骤:
S1、取如权利要求1~6中任一项所述的T淋巴细胞冻存液;
S2、将T淋巴细胞重悬于冻存液中,然后灌装于冻存袋,经程序降温仪降温后存储于液氮罐。
在使用时,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,取出后直接稀释后应用于临床,更加方便快捷。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是,以下实施例只用于对本发明作进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整,仍属于本发明的保护范围。
另外,如果没有其它说明,所用原料都是市售的。
实施例
以下通过实施例对本发明技术方案进行详细说明,但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1
实施例1提供了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO 5份,复方电解质注射液56份,右旋糖苷40葡萄糖注射液8.5份,人血白蛋白25份,杜氏改良培养基10份。
所述DMSO为临床级DMSO,购自WAK-Chemie公司;
所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司;
所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司;
所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司;
所述杜氏改良培养基含有盐酸吡哆醇,购自上海恒斐生物科技有限公司,型号为D5546。
实施例1的第二方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的制备方法,包括以下步骤:
S1、按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,边加边摇动直至混匀;
S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白,上下颠倒混匀即得所述T淋巴细胞冻存液。
实施例1的第三方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的冻存方法,包括以下步骤:
S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的T淋巴细胞冻存液;
S2、将T淋巴细胞重悬于冻存液中,然后灌装于冻存袋,经程序降温仪降温后存储于液氮罐。
在使用时,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,取出后直接稀释后应用于临床。
实施例2
实施例2提供了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO 5份,复方电解质注射液56份,右旋糖苷40葡萄糖注射液8.5份,人血白蛋白25份,杜氏培养基10份。
所述DMSO为临床级DMSO,购自WAK-Chemie公司;
所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司;
所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司;
所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司;
所述杜氏培养基购自上海恒斐生物科技有限公司,型号为D5523。
实施例2的第二方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的制备方法,包括以下步骤:
S1、按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,边加边摇动直至混匀;
S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白,上下颠倒混匀即得所述T淋巴细胞冻存液。
实施例2的第三方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的冻存方法,包括以下步骤:
S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的T淋巴细胞冻存液;
S2、将T淋巴细胞重悬于冻存液中,然后灌装于冻存袋,经程序降温仪降温后存储于液氮罐。
在使用时,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,取出后直接稀释后应用于临床。
实施例3
实施例3提供了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO 5份,复方电解质注射液45份,右旋糖苷40葡萄糖注射液8.5份,人血白蛋白25份,杜氏改良培养基10份。
所述DMSO为临床级DMSO,购自WAK-Chemie公司;
所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司;
所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司;
所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司;
所述杜氏改良培养基含有盐酸吡哆醇,购自上海恒斐生物科技有限公司,型号为D5546。
实施例3的第二方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的制备方法,包括以下步骤:
S1、按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,边加边摇动直至混匀;
S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白,上下颠倒混匀即得所述T淋巴细胞冻存液。
实施例3的第三方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的冻存方法,包括以下步骤:
S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的T淋巴细胞冻存液;
S2、将T淋巴细胞重悬于冻存液中,然后灌装于冻存袋,经程序降温仪降温后存储于液氮罐。
在使用时,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,取出后直接稀释后应用于临床。
实施例4
实施例4提供了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO 5份,复方电解质注射液56份,右旋糖苷40葡萄糖注射液5份,人血白蛋白25份,杜氏培养基10份。
所述DMSO为临床级DMSO,购自WAK-Chemie公司;
所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司;
所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司;
所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司;
所述杜氏培养基含有盐酸吡哆醇,购自上海恒斐生物科技有限公司,型号为D5546。
实施例4的第二方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的制备方法,包括以下步骤:
S1、按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,边加边摇动直至混匀;
S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白,上下颠倒混匀即得所述T淋巴细胞冻存液。
实施例4的第三方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的冻存方法,包括以下步骤:
S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的T淋巴细胞冻存液;
S2、将T淋巴细胞重悬于冻存液中,然后灌装于冻存袋,经程序降温仪降温后存储于液氮罐。
在使用时,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,取出后直接稀释后应用于临床。
实施例5
实施例5提供了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO 5份,复方电解质注射液56份,右旋糖苷40葡萄糖注射液8.5份,人血白蛋白20份,杜氏培养基10份。
所述DMSO为临床级DMSO,购自WAK-Chemie公司;
所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司;
所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司;
所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司;
所述杜氏培养基含有盐酸吡哆醇,购自上海恒斐生物科技有限公司,型号为D5546。
实施例5的第二方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的制备方法,包括以下步骤:
S1、按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,边加边摇动直至混匀;
S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白,上下颠倒混匀即得所述T淋巴细胞冻存液。
实施例5的第三方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的冻存方法,包括以下步骤:
S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的T淋巴细胞冻存液;
S2、将T淋巴细胞重悬于冻存液中,然后灌装于冻存袋,经程序降温仪降温后存储于液氮罐。
在使用时,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,取出后直接稀释后应用于临床。
实施例6
实施例6提供了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO 4份,复方电解质注射液60份,右旋糖苷40葡萄糖注射液6份,人血白蛋白20份,杜氏培养基10份。
所述DMSO为临床级DMSO,购自WAK-Chemie公司;
所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司;
所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司;
所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司;
所述杜氏培养基含有盐酸吡哆醇,购自上海恒斐生物科技有限公司,型号为D5546。
实施例6的第二方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的制备方法,包括以下步骤:
S1、按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,边加边摇动直至混匀;
S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白,上下颠倒混匀即得所述T淋巴细胞冻存液。
实施例6的第三方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的冻存方法,包括以下步骤:
S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的T淋巴细胞冻存液;
S2、将T淋巴细胞重悬于冻存液中,然后灌装于冻存袋,经程序降温仪降温后存储于液氮罐。
在使用时,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,取出后直接稀释后应用于临床。
对比例1
对比例1提供了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO 5份,复方电解质注射液56份,人血白蛋白25份,杜氏改良培养基10份。
所述DMSO为临床级DMSO,购自WAK-Chemie公司;
所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司;
所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司;
所述杜氏改良培养基含有盐酸吡哆醇,购自上海恒斐生物科技有限公司,型号为D5546。
对比例1的第二方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的制备方法,包括以下步骤:
S1、按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,边加边摇动直至混匀;
S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白,上下颠倒混匀即得所述T淋巴细胞冻存液。
对比例1的第三方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的冻存方法,包括以下步骤:
S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的T淋巴细胞冻存液;
S2、将T淋巴细胞重悬于冻存液中,然后灌装于冻存袋,经程序降温仪降温后存储于液氮罐。
在使用时,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,取出后直接稀释后应用于临床。
对比例2
对比例2提供了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO 5份,复方电解质注射液56份,右旋糖苷40葡萄糖注射液3份,人血白蛋白25份,杜氏改良培养基10份。
所述DMSO为临床级DMSO,购自WAK-Chemie公司;
所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司;
所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司;
所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司;
所述杜氏改良培养基含有盐酸吡哆醇,购自上海恒斐生物科技有限公司,型号为D5546。
对比例2的第二方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的制备方法,包括以下步骤:
S1、按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,边加边摇动直至混匀;
S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白,上下颠倒混匀即得所述T淋巴细胞冻存液。
对比例2的第三方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的冻存方法,包括以下步骤:
S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的T淋巴细胞冻存液;
S2、将T淋巴细胞重悬于冻存液中,然后灌装于冻存袋,经程序降温仪降温后存储于液氮罐。
在使用时,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,取出后直接稀释后应用于临床。
对比例3
对比例3提供了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO 2份,复方电解质注射液56份,右旋糖苷40葡萄糖注射液8.5份,人血白蛋白25份,杜氏改良培养基10份。
所述DMSO为临床级DMSO,购自WAK-Chemie公司;
所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司;
所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司;
所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司;
所述杜氏改良培养基含有盐酸吡哆醇,购自上海恒斐生物科技有限公司,型号为D5546。
对比例3的第二方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的制备方法,包括以下步骤:
S1、按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,边加边摇动直至混匀;
S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白,上下颠倒混匀即得所述T淋巴细胞冻存液。
对比例3的第三方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的冻存方法,包括以下步骤:
S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的T淋巴细胞冻存液;
S2、将T淋巴细胞重悬于冻存液中,然后灌装于冻存袋,经程序降温仪降温后存储于液氮罐。
在使用时,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,取出后直接稀释后应用于临床。
对比例4
对比例4提供了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO 5份,复方电解质注射液56份,右旋糖苷40葡萄糖注射液8.5份,人血白蛋白25份,杜氏改良培养基4份。
所述DMSO为临床级DMSO,购自WAK-Chemie公司;
所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司;
所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司;
所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司;
所述杜氏改良培养基含有盐酸吡哆醇,购自上海恒斐生物科技有限公司,型号为D5546。
对比例4的第二方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的制备方法,包括以下步骤:
S1、按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,边加边摇动直至混匀;
S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白,上下颠倒混匀即得所述T淋巴细胞冻存液。
对比例4的第三方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的冻存方法,包括以下步骤:
S1、取在5℃的医用冷藏箱中预冷50min的T淋巴细胞冻存液;
S2、将T淋巴细胞重悬于冻存液中,然后灌装于冻存袋,经程序降温仪降温后存储于液氮罐。
在使用时,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,取出后直接稀释后应用于临床。
对比例5
对比例5提供了一种T淋巴细胞冻存液,按体积份计,其制备原料包括DMSO 5份,复方电解质注射液56份,右旋糖苷40葡萄糖注射液8.5份,人血白蛋白25份,杜氏改良培养基10份。
所述DMSO为临床级DMSO,购自WAK-Chemie公司;
所述复方电解质注射液购自河北天成药业股份有限公司;
所述右旋糖苷40葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司;
所述人血白蛋白购自奥克特珐玛AB公司;
所述杜氏改良培养基含有盐酸吡哆醇,购自上海恒斐生物科技有限公司,型号为D5546。
对比例5的第二方面提供了一种T淋巴细胞冻存液的制备方法,包括以下步骤:
按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入人血白蛋白、复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,然后摇动直至混匀得到T淋巴细胞冻存液;发现冻存液出现蛋白沉淀现象。
性能评价
1、T淋巴细胞存活率测试
检测实施例1~6和对比例1~4中T淋巴细胞冻存复苏后的细胞存活率,存活率≥90%的记为A级,存活率≥85%但<90%的记为B级,存活率<85%记为C级,检测结果见表1。
2、T淋巴细胞形态测试
检测实施例1~6冻存液中的T淋巴细胞的细胞形态,其中图1是实施例1中T淋巴细胞的细胞形态图,实施例2~6的细胞形态与图1类似。
表1
实施例 | 存活率 |
实施例1 | A |
实施例2 | A |
实施例3 | A |
实施例4 | B |
实施例5 | A |
实施例6 | A |
对比例1 | C |
对比例2 | C |
对比例3 | C |
对比例4 | C |
通过上述实施例和对比例可以得知,本发明提供了一种T淋巴细胞冻存液及其制备和冻存方法,降低了DMOS的含量,从而降低临床使用的风险性,且使T淋巴细胞依然保持良好的冻存效果,T淋巴细胞冻存复苏后具有高的存活率,同时保持更好的形态。另外,制备过程中还解决了人血白蛋白遇DMSO发生蛋白沉淀的现象,冻存液冻存的细胞可直接稀释后应用于临床,不需要离心去除冻存液的成分,冻存液可以作为辅料,直接应用于临床给药,更加方便。
最后指出,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种T淋巴细胞冻存液,其特征在于:按体积份计,其制备原料包括DMSO1~5份,右旋糖苷40葡萄糖注射液5~15份,复方电解质注射液40~60份,人血白蛋白20~40份,杜氏培养基5~15份。
2.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞冻存液,其特征在于:所述DMSO与右旋糖苷40葡萄糖注射液的体积比为1:(1~2)。
3.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞冻存液,其特征在于:所述DMSO与复方电解质注射液的体积比为1:(9~12)。
4.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞冻存液,其特征在于:所述人血白蛋白与杜氏培养基的体积比为(2~3):1。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的一种T淋巴细胞冻存液,其特征在于:按体积份计,其制备原料包括DMSO 5份,复方电解质注射液56份,右旋糖苷40葡萄糖注射液8.5份,人血白蛋白25份,杜氏培养基10份。
6.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞冻存液,其特征在于:所述杜氏培养基为杜氏改良培养基。
7.一种根据权利要求1~6任意一项所述的T淋巴细胞冻存液的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、按配方,吸取DMSO加至500mL接收器中,然后向其中缓慢加入复方电解质注射液,右旋糖苷40葡萄糖注射液,杜氏培养基,边加边摇动直至混匀;
S2、然后缓慢加入配方量人血白蛋白,上下颠倒混匀即得所述T淋巴细胞冻存液。
8.根据权利要求7所述的T淋巴细胞冻存液的制备方法,其特征在于:还包括将配置得到的T淋巴细胞冻存液置于医用冷藏箱中预冷30min以上。
9.根据权利要求8所述的T淋巴细胞冻存液的制备方法,其特征在于:所述医用冷藏箱的温度设置为2~8℃。
10.一种根据权利要求1~6任意一项所述的T淋巴细胞冻存液的冻存方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、取如权利要求1~6中任一项所述的T淋巴细胞冻存液;
S2、将T淋巴细胞重悬于冻存液中,然后灌装于冻存袋,经程序降温仪降温后存储于液氮罐。
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