CN115176796B - 一种脂肪间充质干细胞储存液 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种脂肪间充质干细胞储存液，其特征在于，所述储存液包括ε‑聚赖氨酸‑g‑丙氨酸‑g‑海藻糖、海藻糖、山梨糖醇、1,2‑丙二醇和胎牛血清蛋白。本发明的脂肪间充质干细胞储存液充分利用并改善海藻糖的低温保护作用，通过合成的含有疏水氨基酸的ε‑聚赖氨酸‑g‑丙氨酸‑g‑海藻糖，ε‑聚赖氨酸‑g‑丙氨酸‑g‑海藻糖具有膜扰动活性，与细胞膜相互作用可在细胞膜局部形成微孔，提高了细胞中海藻糖载入量。ε‑聚赖氨酸‑g‑丙氨酸‑g‑海藻糖与海藻糖搭配，在降温冷冻过程时，海藻糖可以在细胞内外更有效地防止冰晶损伤，提高细胞冷冻的存活率，山梨糖醇的存在能够更大程度地改善上述作用，进一步改善冷冻效果。

Description

一种脂肪间充质干细胞储存液
技术领域
本发明涉及细胞储存领域，具体涉及脂肪间充质干细胞储存液。
背景技术
从脂肪组织中获取间充质干细胞是成体干细胞来源的最佳途径，它在体外增殖快、衰亡率低、分化能力强，同时具有储备量大、取材容易、经体外扩增后具有较低的免疫原性和良好的免疫调节功能等优点，非常具有临床应用潜力，可以治疗多种疑难病症并已取得了突破性进展。因此，脂肪间充质干细胞的储存有重要意义。
目前，多采用二甲亚砜(10％)和胎牛血清蛋白(FBS)(90％)的冻存液冷冻保存干细胞，但是，这些冷冻剂中高浓度冷冻剂的细胞毒性作用，如二甲亚砜不利于细胞的恢复。也有人研究通过1，2-丙二醇、甘油替换二甲亚砜作为冷冻液，但是冷冻效果尚且不如二甲亚砜。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种脂肪间充质干细胞储存液。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种脂肪间充质干细胞储存液，所述储存液包括ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖、海藻糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为(3％～5％)：(97％～95％)；
所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为0.2～1mg/mL；
所述海藻糖的浓度为0.25～0.5mol/L；
所述山梨糖醇的质量浓度为2w/v％～4w/v％。
海藻糖是由两分子葡萄糖组成的非还原性二糖，其化学性质十分稳定，对酸、热都呈化学惰性，对多种生物体具有非特异性保护作用，可以稳定细胞膜、蛋白质、核酸等生物活性物质。海藻糖还有低温保护作用，是一种良好的冷冻保护剂。细胞内海藻糖的存在可以增强细胞冻存的存活率，即在结冰过程中，细胞内海藻糖的存在可减弱渗透压变化带来的破坏作用。海藻糖属于非渗透型二糖，很难穿过细胞膜到细胞内。
本发明充分利用并改善海藻糖的低温保护作用，通过合成的含有疏水氨基酸的ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖，ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖具有膜扰动活性，与细胞膜相互作用可在细胞膜局部形成微孔，提高了细胞中海藻糖载入量。ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖与海藻糖搭配，在降温冷冻过程时，海藻糖可以在细胞内外更有效地防止冰晶损伤，提高细胞冷冻的存活率，山梨糖醇的存在能够更大程度地改善上述作用，进一步改善冷冻效果。
优选地，所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的制备方法包括以下步骤：
(1)将叔丁氧羰基-β-丙氨酸(BOC-Ala-OH)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于二甲亚砜(DMSO)溶剂中搅拌25～40分钟得到二甲亚砜溶液体系；加入ε-聚赖氨酸水溶液，于20～30℃搅拌反应48～96小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为1800Da～2200Da，得到ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸的前体物，所述前体物中的丙氨酸基团的氨基由叔丁氧羰基保护；
(2)还原前体物上叔丁氧羰基保护的氨基，得到ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸；
(3)将羧基化海藻糖(Tre-COOH)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中搅拌25～40分钟活化得到羧基化海藻糖反应体系；加入ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸二甲亚砜溶液，于20～30℃搅拌反应48～96小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为1800Da～2200Da，得到ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖；
羧基化海藻糖的分子结构为：
Figure GDA0004205891600000021
ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖采用上述方法合成，主要分两步，即制备ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸；将ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸与羧基化海藻糖进行聚合，合成流程图如图1。上述方法通过ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸对海藻糖进行改性，更有利于增强与细胞膜的扰动作用。改善脂肪间充质干细胞储存液的冷冻存活率，降低毒性。
作为本领域技术人员，可以采用以下方法制备羧基化海藻糖：
(a)在三口烧瓶中15～25mg/mL海藻糖无水N,N’-二甲基乙酰胺(DMF)溶液，放入75～85℃加热，通氮气，磁子搅拌；
(b)加入40～60mg/mL丁二酸酐无水N,N’-二甲基乙酰胺(DMF)溶液，加入三乙胺混合；海藻糖与丁二酸酐的质量比为(3.5～4):1
(c)三口瓶密封，75～85℃下反应12h；
(d)反应结束后减压蒸馏出DMF，浓缩溶液后用过量乙醚沉淀产物；
(e)再次用少量无水DMF溶解沉淀产物后用过量乙醚沉淀纯化，将沉淀物不高于50℃干燥，得到乳白色泡沫状固体，即为羧基化海藻糖。
作为本领域技术人员，可以明白选择叔丁氧羰基-β-丙氨酸作为原料聚合目的在与ε-聚赖氨酸聚合反应过程中，保护丙氨酸上的氨基。在制备得到叔丁氧羰基保护的聚合物后，需要还原前体物上叔丁氧羰基保护的氨基，才能够通过脱保护后的氨基与羧基化的海藻糖反应。对于还原前体物上叔丁氧羰基保护的氨基，可以采用如下方法：
将ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸的前体物溶于三氟乙酸，并在室温下搅拌反应4h。反应完毕后，依次经过量乙醚沉淀，离心，水透析(透析袋规格，2000Da)3天，冻干得到ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸。
优选地，所述步骤(1)中，叔丁氧羰基-β-丙氨酸与ε-聚赖氨酸的质量比为(1.5～2)：1；
上述比例有利于提高ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸产率。
优选地，所述步骤(3)中，羧基化海藻糖与ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸的质量比为(1.2～1.5)：1
上述比例有利于提高ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的产率。
优选地，所述步骤(1)中，二甲亚砜溶液体系中，叔丁氧羰基-β-丙氨酸的浓度为30～45g/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为70～100g/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为40～60g/L。
优选地，所述步骤(1)中，所述ε-聚赖氨酸水溶液的浓度为80～150mg/L。
优选地，所述步骤(3)中，羧基化海藻糖反应体系中，羧基化海藻糖的浓度为80～150g/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为40～60g/L、N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为20～30g/L。
优选地，所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸二甲亚砜溶液的浓度为0.08～0.12mg/mL。
优选地，所述ε-聚赖氨酸的平均分子量为3500～4500Da。
优选地，所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为0.5～0.8mg/mL。
脂肪间充质干细胞储存液中，ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为0.5～0.8mg/mL时，能够更大程度地增大细胞膜的扰动，提高了细胞中海藻糖载入量的同时不损伤细胞膜，具有更好的冷冻存活率。
优选地，所述海藻糖的浓度为0.35～0.4mol/L。
通过研究发现，上述脂肪间充质干细胞储存液中，海藻糖的浓度为0.35～0.4mol/L时具有更好的冷冻效果。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种脂肪间充质干细胞储存液，本发明的脂肪间充质干细胞储存液充分利用并改善海藻糖的低温保护作用，通过合成的含有疏水氨基酸的ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖，ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖具有膜扰动活性，与细胞膜相互作用可在细胞膜局部形成微孔，提高了细胞中海藻糖载入量。ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖与海藻糖搭配，在降温冷冻过程时，海藻糖可以在细胞内外更有效地防止冰晶损伤，提高细胞冷冻的存活率，山梨糖醇的存在能够更大程度地改善上述作用，进一步改善冷冻效果。
附图说明
图1为本发明的脂肪间充质干细胞储存液中ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的合成路线图。
图2为本发明的脂肪间充质干细胞储存液的存活率效果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
作为本发明实施例1的一种脂肪间充质干细胞储存液，所述储存液包括ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖、海藻糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为5％：95％；
所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为0.5mg/mL；
所述海藻糖的浓度为0.35mol/L；
所述山梨糖醇的质量浓度为3w/v％。
本实施例中，ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的制备方法包括以下步骤：
(1)将1.5g叔丁氧羰基-β-丙氨酸(BOC-Ala-OH)、3.56g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、2.14gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于40mL二甲亚砜(DMSO)溶剂中搅拌30分钟得到二甲亚砜溶液体系；加入10mL的0.1mg/mLε-聚赖氨酸(平均分子量4000Da)水溶液，于25℃搅拌反应72小时；将反应后的产物水透析3天，透析袋的规格为2000Da，得到ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸的前体物，所述前体物中的丙氨酸基团的氨基由叔丁氧羰基保护；
(2)还原前体物上叔丁氧羰基保护的氨基，将ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸的前体物溶于三氟乙酸，并在室温下搅拌反应4h。反应完毕后，依次经过量乙醚沉淀，离心，水透析(透析袋规格，2000Da)3天，冻干得到ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸；
(3)将1.2g羧基化海藻糖、0.48g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.29gN-羟基琥珀酰亚胺溶于10mL水中搅拌30分钟活化得到羧基化海藻糖反应体系；加入10mL的0.1mg/mLε-聚赖氨酸-g-丙氨酸二甲亚砜溶液，于25℃搅拌反应72小时；将反应后的产物水透析3天，透析袋的规格为2000Da，得到ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖；
羧基化海藻糖的分子结构为：
Figure GDA0004205891600000061
羧基化海藻糖的制备方法包括以下步骤：
(a)在三口烧瓶中加入20mg/mL的160mL海藻糖无水N,N’-二甲基乙酰胺(DMF)溶液，放入80℃加热，通氮气，磁子搅拌；
(b)加入20mL的50mg/mL丁二酸酐无水N,N’-二甲基乙酰胺(DMF)溶液，加入1.5mL三乙胺混合；
(c)三口瓶密封，80℃下反应12h；
(d)反应结束后减压蒸馏出DMF，浓缩溶液少于35mL后用过量乙醚沉淀产物；
(e)再次用少量无水DMF溶解沉淀产物后用过量乙醚沉淀纯化，将沉淀物不高于50℃干燥，得到乳白色泡沫状固体，即为羧基化海藻糖。
实施例2
作为本发明实施例1的一种脂肪间充质干细胞储存液，本实施例的脂肪间充质干细胞储存液与实施例1的唯一区别为：所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为0.2mg/mL。
实施例3
作为本发明实施例1的一种脂肪间充质干细胞储存液，本实施例的脂肪间充质干细胞储存液与实施例1的唯一区别为：所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为0.4mg/mL。
实施例4
作为本发明实施例1的一种脂肪间充质干细胞储存液，本实施例的脂肪间充质干细胞储存液与实施例1的唯一区别为：所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为0.8mg/mL。
实施例5
作为本发明实施例1的一种脂肪间充质干细胞储存液，本实施例的脂肪间充质干细胞储存液与实施例1的唯一区别为：所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为1.0mg/mL。
实施例6
作为本发明实施例1的一种脂肪间充质干细胞储存液，本实施例的脂肪间充质干细胞储存液与实施例1的唯一区别为：所述海藻糖的浓度为0.25mol/L。
实施例7
作为本发明实施例1的一种脂肪间充质干细胞储存液，本实施例的脂肪间充质干细胞储存液与实施例1的唯一区别为：所述海藻糖的浓度为0.30mol/L。
实施例8
作为本发明实施例1的一种脂肪间充质干细胞储存液，本实施例的脂肪间充质干细胞储存液与实施例1的唯一区别为：所述海藻糖的浓度为0.40mol/L。
实施例9
作为本发明实施例1的一种脂肪间充质干细胞储存液，本实施例的脂肪间充质干细胞储存液与实施例1的唯一区别为：所述海藻糖的浓度为0.50mol/L。
对比例1
作为本发明对比例的一种脂肪间充质干细胞储存液，所述储存液包括海藻糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为5％：95％；
所述海藻糖的浓度为0.35mol/L；
所述山梨糖醇的质量浓度为3w/v％。
对比例2
作为本发明对比例的一种脂肪间充质干细胞储存液，所述储存液包括ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为5％：95％；
所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为0.5mg/mL；
所述山梨糖醇的质量浓度为3w/v％。
对比例3
作为本发明对比例的一种脂肪间充质干细胞储存液，所述储存液包括ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖、海藻糖、山梨糖醇、二甲亚砜和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述二甲亚砜和胎牛血清蛋白的体积比为5％：95％；
所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为0.5mg/mL；
所述海藻糖的浓度为0.35mol/L；
所述山梨糖醇的质量浓度为3w/v％。
对比例4
作为本发明对比例的一种脂肪间充质干细胞储存液，所述储存液包括ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖、海藻糖、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为5％：95％；
所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为0.5mg/mL；
所述海藻糖的浓度为0.35mol/L。
实验例
一、实验材料
1、猪皮肤脂肪干细胞：
剖取40-45天猪胎背部皮肤并切成小块用。收集后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗，皮肤组织被盛放在100毫米培养皿中，在37℃，5％CO2条件下，用Dulbecco's modifiedEagle's medium(SDSCs培养基，DMEM与F12(1:1)、1％B-27细胞培养添加剂、20ng/ml含有表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)和40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))。
四天后，组织碎片用移液管收集和分离。通过40μm不锈钢细胞过滤器，细胞被再次用SDSCs培养基重新悬浮。在100毫米培养皿中孵化48小时，形成非粘附的细胞簇。用于冷冻实验。
2、冷冻实验
将猪皮肤脂肪干细胞分别加入1mL实施例1-9、对比例1-4的冷冻液中，调整细胞浓度为5×106，3个平行样品，采用程序降温方法，在4℃保持1小时，-20℃保持1小时，降温至-80℃保存30天。
3、解冻程序
储存后的细胞样品以2℃/min的升温速率升温至-20℃，放入0℃冰水混合物中解冻20分钟，在37℃恒温培养箱解冻45分钟。
4、细胞存活率测试
冷冻保存细胞之前和之后使用台盼蓝染色法和流式评估细胞存活率。
(1)台盼蓝染色法，混合等分试样的细胞悬液用等量的0.4％台盼蓝染色剂在室温下孵育2分钟。使用细胞计数器测试活细胞。存活细胞百分比计算为活细胞数/总细胞数。
(2)流式评估细胞存活率，分析冷冻保存后的细胞存活率使用流式细胞仪。将100μl细胞等分试样重悬于添加100μg/ml培养液(DMSO(10％V)和胎牛血清蛋白(90％))。孵化后在室温下孵育3分钟，样品在流式细胞仪上运行，激光激发波长为488nm。
使用574/526nm带通滤波器收集发射。门控是对PI阴性(未处理)细胞和冷冻的细胞分别在含有150mM NaCl的100μg/ml培养液(DMSO(10％V)和胎牛血清蛋白(90％))中进行高电导率电穿孔。测量结果在获取10,000个事件时完成。获得的数据使用Attune NxT软件进行分析，其中细胞存活率通过荧光强度直方图评估。
5、实验结果如表1所示。
表1
Figure GDA0004205891600000101
Figure GDA0004205891600000111
由表1、图2可知，实施例的储存液相比于对比例1和对比例2相比，存活率显著提高，说明ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖具有膜扰动活性，与细胞膜相互作用可在细胞膜局部形成微孔，与海藻糖搭配作为细胞储存液，提高了细胞中海藻糖载入量。ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖与海藻糖搭配，在降温冷冻过程时，海藻糖可以在细胞内外更有效地防止冰晶损伤，提高细胞冷冻的存活率。实施例与对比例4相比，存活率显著提高，说明山梨糖醇的存在能够更大程度地改善上述作用，进一步改善冷冻效果。通过比较实施例1-9，说明脂肪间充质干细胞储存液中，ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为0.5～0.8mg/mL时，能够更大程度地增大细胞膜的扰动，提高了细胞中海藻糖载入量的同时不损伤细胞膜，具有更好的冷冻存活率，海藻糖的浓度为0.35～0.4mol/L时具有更好的冷冻效果。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种脂肪间充质干细胞储存液，其特征在于，所述储存液包括ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖、海藻糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为(3％～5％)：(97％～95％)；
所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为0.2～1mg/mL；所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的制备方法包括以下步骤：
(1)将叔丁氧羰基-β-丙氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶于二甲亚砜溶剂中搅拌25～40分钟得到二甲亚砜溶液体系；
其中，二甲亚砜溶液体系中，叔丁氧羰基-β-丙氨酸的浓度为30～45g/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为70～100g/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为40～60g/L；
加入ε-聚赖氨酸水溶液，所述ε-聚赖氨酸水溶液的浓度为80～150mg/L；于20～30℃搅拌反应48～96小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为1800Da～2200Da，得到ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸的前体物，所述前体物中的丙氨酸基团的氨基由叔丁氧羰基保护；
(2)还原前体物上叔丁氧羰基保护的氨基，得到ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸；
(3)将羧基化海藻糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中搅拌25～40分钟活化得到羧基化海藻糖反应体系；
其中，羧基化海藻糖反应体系中，羧基化海藻糖的浓度为80～150g/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为40～60g/L、N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为20～30g/L；
加入浓度为0.08～0.12mg/mL的ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸二甲亚砜溶液，于20～30℃搅拌反应48～96小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为1800Da～2200Da，得到ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖；
羧基化海藻糖的分子结构为：
Figure FDA0004205891590000011
所述羧基化海藻糖的制备工艺为：
(a)在三口烧瓶中加入15～25mg/mL海藻糖无水N,N’-二甲基乙酰胺(DMF)溶液，放入75～85℃加热，通氮气，磁子搅拌；
(b)在三口烧瓶中再加入40～60mg/mL丁二酸酐无水N,N’-二甲基乙酰胺(DMF)溶液，加入三乙胺混合；海藻糖与丁二酸酐的质量比为(3.5～4):1；
(c)三口瓶密封，75～85℃下反应12h；
(d)反应结束后减压蒸馏出DMF，浓缩溶液后用过量乙醚沉淀产物；
(e)再次用少量无水DMF溶解沉淀产物后用过量乙醚沉淀纯化，将沉淀物不高于50℃干燥，得到乳白色泡沫状固体，即为羧基化海藻糖；
所述海藻糖的浓度为0.25～0.5mol/L；
所述山梨糖醇的质量浓度为2w/v％～4w/v％。
2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞储存液，其特征在于，所述步骤(1)中，叔丁氧羰基-β-丙氨酸与ε-聚赖氨酸的质量比为(1.5～2)：1。
3.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞储存液，其特征在于，所述步骤(3)中，羧基化海藻糖与ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸的质量比为(1.2～1.5)：1。
4.根据权利要求1所述的的脂肪间充质干细胞储存液，其特征在于，所述ε-聚赖氨酸的平均分子量为3500～4500Da。
5.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞储存液，其特征在于，所述ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸-g-海藻糖的浓度为0.5～0.8mg/mL。
6.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞储存液，其特征在于，所述海藻糖的浓度为0.35～0.4mol/L。
7.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞储存液，其特征在于，所述步骤(2)中，对于还原前体物上叔丁氧羰基保护的氨基，采用如下方法：
将ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸的前体物溶于三氟乙酸，并在室温下搅拌反应4h；反应完毕后，依次经过量乙醚沉淀，离心，水透析3天，冻干得到ε-聚赖氨酸-g-丙氨酸。
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