CN112106765A - 一种干细胞保护液及干细胞保存方法 - Google Patents

一种干细胞保护液及干细胞保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种干细胞保护液及干细胞保存方法。所述干细胞保护液包括A液和B液，所述A液由PBS缓冲液和魔芋胶配制而成，所述B液包括人血白蛋白、聚赖氨酸、厚朴酚、牡丹酚、聚乙二醇、甘油和基础培养基采用本发明的干细胞保护液作为干细胞的冷冻保护剂，复苏后的细胞存活率高且不会抑制细胞的增殖。

Description

一种干细胞保护液及干细胞保存方法
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种干细胞保护液及干细胞保存方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，如胚胎干细胞、诱导多能干细胞以及间充质干细胞等，其在特定的条件下能分化成体内多种类型的细胞。干细胞具有多种用途和功能，可用于体外研究组织器官的生长发育、建立疾病模型、药物筛选，也可用于疾病治疗，如组织修复与再生等。干细胞的长期保存需要进行冷冻保存，但冷冻保存的过程对细胞具有一定的损伤。冷冻保护剂可保护细胞免受低温冻存中的冷冻损伤，能更好地保存细胞的生物性能。
组织和细胞虽可在-196℃低温下长期保存，但易在降温和复温过程中受溶液冻结、融化以及溶液渗透压变化等因素的作用而受到损害。冷冻损伤通常发生在0℃到-60℃的温度范围内。对于引起冷冻损伤的机制一直是低温生物医学的研究热点，目前认为引起细胞冷冻损伤的因素主要有：(1)细胞内冰晶的形成：高速率冷却状态下的细胞内水分子被快速冻结后，细胞不再进一步脱水，使其内部的水分子不能玻璃化，进而提高了细胞内冰晶的形成程度。冰晶会对细胞内的多种生物膜产生机械或者生物化学应力，导致细胞产生不可逆的损伤。研究表明，大的内部冰晶的存在是致命的；复温解冻时，缓慢升温将使细胞内冰晶玻璃化之后的水形成结晶或重结晶，这将会对细胞造成致死性损伤。(2)溶液效应损伤：冰晶会诱导细胞内和细胞外溶液性质的改变，细胞长时间暴露于改变的内外溶液中将会产生低温损伤，这些改变或溶液效应包括溶质的浓度、酸碱平衡、细胞膜内外渗透压的改变以及严重脱水后溶质浓缩沉淀。
中国专利文献CN 111480645A公开了一种脂肪干细胞的储存方法，其所采用的干细胞储存液的成分包括羧化多聚-L-赖氨酸、海藻糖、DMSO、甘油、无血清培养基、低分子右旋糖酐、葡萄糖、青霉素、链霉素和缓冲液，该储存液和储存方法虽可实现脂肪干细胞的冻存，但需要以聚-L-赖氨酸和琥珀酰胺为原料、经化学反应来制备羧化多聚-L-赖氨酸，造成该脂肪干细胞的储存液制备步骤繁琐，使用不便。
发明内容
本发明提供一种干细胞保护液，以解决上述技术问题，该干细胞保护液用于干细胞的冻存时，复苏后的细胞存活率高。
本发明的目的还在于提供了一种干细胞保存方法。
本发明的干细胞保护液采用如下技术方案：一种干细胞保护液，所述干细胞保护液包括A液和B液，所述A液由PBS缓冲液和魔芋胶配制而成，所述B液包括人血白蛋白、聚赖氨酸、厚朴酚、牡丹酚、聚乙二醇、甘油和基础培养基，所述魔芋胶的终浓度为0.2-1wt％、所述厚朴酚的终浓度为0.005-0.01％、所述牡丹酚的终浓度为0.003-0.06％、所述人血白蛋白的终浓度为5-15wt％、所述聚赖氨酸的终浓度为0.1-3wt％、所述聚乙二醇的终浓度为0.5-3wt％，所述甘油的终浓度为体积分数1-8％，所述PBS缓冲液与所述基础培养基的体积比为1:(4-5)。其中，上述各物质的终浓度是指A液和B液混合后各物质的终浓度。
作为进一步优选的技术方案，所述魔芋胶、聚赖氨酸和聚乙二醇的用量之和与所述甘油的质量体积比为(1-3):(1-5)，所述魔芋胶、聚赖氨酸和聚乙二醇的用量以g计，所述甘油的体积以mL计。
作为进一步优选的技术方案，所述魔芋胶和聚赖氨酸的质量比为(0.5-1):1。
作为进一步优选的技术方案，所述干细胞保护液包括A液和B液，所述A液通过将魔芋胶均匀分散于所述PBS缓冲液中配制得到；所述B液通过将所述人血白蛋白、聚赖氨酸、厚朴酚、牡丹酚、聚乙二醇、甘油和基础培养基均匀混合制备得到。
作为进一步优选的技术方案，所述A液按照下述方法配制得到：将所述PBS缓冲液加热到50-80℃；加入魔芋胶保温搅拌5-10min；自然冷却至室温即得所述A液。
本发明的干细胞保存方法采用如下技术方案：一种干细胞保存方法，将干细胞置于如上述任意一项所述的干细胞保护液中之后，再进行干细胞冻存。
作为进一步优选的技术方案，包括下述步骤：(1)先向待冻存的干细胞中加入所述A液并使所述A液与干细胞均匀混合；(2)加入B液，并混合均匀。
本发明的有益效果是：采用本发明的干细胞保护液作为干细胞的冷冻保护剂，复苏后的细胞存活率高。本发明的干细胞保护液不含二甲基亚砜，可有效避免对细胞增殖造成抑制。本发明的干细胞保护液制备方法简单，无需对各原料进行化学反应处理。
本发明的干细胞保护液中的魔芋胶不仅可起到非渗透性冷冻保护剂，减少低温冻存对细胞的伤害的作用，其分布于干细胞表面还可一定程度上阻挡氧气与细胞的接触，避免干细胞的氧化损伤的作用，进而提高干细胞复苏后的细胞存活率；所述聚赖氨酸具有一定的抗菌作用，可有效避免干细胞冻存/复苏过程中被杂菌污染，且聚赖氨酸与魔芋胶、厚朴酚和牡丹酚配合使用，可起到协同的、提高细胞复苏率的作用；所述甘油作为渗透性保护剂，可弱化水结晶过程以及减少对细胞结构和功能的破坏；所述聚乙二醇则可通过降低溶质浓度，减少低温冻存对细胞的伤害。
魔芋胶、聚赖氨酸和聚乙二醇的用量之和与甘油的质量体积比为(1-3):(1-5)时，对细胞的保护作用更好。
魔芋胶和聚赖氨酸的质量比为(0.5-1):1时，可使魔芋胶与聚赖氨酸协同提高细胞复苏后的细胞存活率的效果最好。
通过将所述A液和B液分别存放，用于干细胞的冻存时，先将A液与干细胞混合，可使魔芋胶分布于干细胞表面，此时，魔芋胶的浓度较大，有助于在干细胞表面形成一层膜，一定程度上减少细胞与氧气的接触，进而减少细胞的氧化损伤；相较于将A液和B液混合均匀后再与干细胞混合的方法，复苏后的细胞的存活率更高。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、样品制备
实施例1
1.1干细胞保护液的制备：
A液的制备：将20mLPBS缓冲液(pH7.0)加热至60℃，加入魔芋胶0.2g，保温搅拌5min，自然冷却至室温即得A液；
B液的制备：将人血白蛋白冻干粉5g、聚赖氨酸0.1g、厚朴酚0.0055g、牡丹酚0.0066g、聚乙二醇3g、甘油5mL和DMEM基础培养基80mL混合均匀，得到B液。
1.2将1.1制备得到的干细胞保护液与脂肪干细胞混合，分别按照下述两种方法混合：
1.2.1先将A液与干细胞混合均匀，再加入B液，混合均匀，得到样品1-1(样品中干细胞的浓度为1×106cells/mL)
1.2.2将A液与B液混合均匀后，再将A液和B液的混合溶液加入干细胞中，与干细胞混合均匀，得到样品1-2(样品中干细胞的浓度为1×106cells/mL)。
实施例2
2.1干细胞保护液的制备：
A液的制备：将20mLPBS缓冲液(pH7.0)加热至60℃，加入魔芋胶1g，保温搅拌5min，自然冷却至室温即得A液；
B液的制备：将人血白蛋白冻干粉15g、聚赖氨酸3g、厚朴酚0.0070g、牡丹酚0.0040g、聚乙二醇1g、甘油8mL和DMEM基础培养基100mL混合均匀，得到B液。
2.2将2.1制备得到的干细胞保护液与脂肪干细胞混合，分别按照下述两种方法混合：
2.2.1先将A液与干细胞混合均匀，再加入B液，混合均匀，得到样品2-1(样品中干细胞的浓度为1×106cells/mL)
2.2.2将A液与B液混合均匀后，再将A液和B液的混合溶液加入干细胞中，与干细胞混合均匀，得到样品2-2(样品中干细胞的浓度为1×106cells/mL)。
实施例3
3.1干细胞保护液的制备：
A液的制备：将20mLPBS缓冲液(pH7.0)加热至60℃，加入魔芋胶0.8g，保温搅拌5min，自然冷却至室温即得A液；
B液的制备：将人血白蛋白冻干粉10g、聚赖氨酸1.5g、厚朴酚0.0060g、牡丹酚0.0050g、聚乙二醇0.5g、甘油7mL和DMEM基础培养基90mL混合均匀，得到B液。
3.2将3.1制备得到的干细胞保护液与脂肪干细胞混合，分别按照下述两种方法混合：
3.2.1先将A液与干细胞混合均匀，再加入B液，混合均匀，得到样品3-1(样品中干细胞的浓度为1×106cells/mL)
3.2.2将A液与B液混合均匀后，再将A液和B液的混合溶液加入干细胞中，与干细胞混合均匀，得到样品3-2(样品中干细胞的浓度为1×106cells/mL)。
实施例4
4.1干细胞保护液的制备：
A液的制备：将20mLPBS缓冲液(pH7.0)加热至60℃，加入魔芋胶0.8g，保温搅拌5min，自然冷却至室温即得A液；
B液的制备：将人血白蛋白冻干粉10g、聚赖氨酸1.5g、厚朴酚0.0090g、牡丹酚0.0035g、聚乙二醇0.5g、甘油6mL和DMEM基础培养基90mL混合均匀，得到B液。
4.2将4.1制备得到的干细胞保护液与脂肪干细胞混合，分别按照下述两种方法混合：
4.2.1先将A液与干细胞混合均匀，再加入B液，混合均匀，得到样品4-1(样品中干细胞的浓度为1×106cells/mL)
4.2.2将A液与B液混合均匀后，再将A液和B液的混合溶液加入干细胞中，与干细胞混合均匀，得到样品4-2(样品中干细胞的浓度为1×106cells/mL)。
实施例5
5.1干细胞保护液的制备：
A液的制备：将20mLPBS缓冲液(pH7.0)加热至60℃，加入魔芋胶0.5g，保温搅拌5min，自然冷却至室温即得A液；
B液的制备：将人血白蛋白冻干粉10g、聚赖氨酸1g、厚朴酚0.0085g、牡丹酚0.0040g、聚乙二醇1.5g、甘油4.5mL和DMEM基础培养基80mL混合均匀，得到B液。
5.2将5.1制备得到的干细胞保护液与脂肪干细胞混合，分别按照下述两种方法混合：
5.2.1先将A液与干细胞混合均匀，再加入B液，混合均匀，得到样品5-1(样品中干细胞的浓度为1×106cells/mL)
5.2.2将A液与B液混合均匀后，再将A液和B液的混合溶液加入干细胞中，与干细胞混合均匀，得到样品5-2(样品中干细胞的浓度为1×106cells/mL)。
实施例6
6.1干细胞保护液的制备：
A液的制备：将20mLPBS缓冲液(pH7.0)加热至60℃，加入魔芋胶0.5g，保温搅拌5min，自然冷却至室温即得A液；
B液的制备：将人血白蛋白冻干粉10g、聚赖氨酸0.5g、厚朴酚0.0065g、牡丹酚0.0035g、聚乙二醇2g、甘油1mL和DMEM基础培养基80mL混合均匀，得到B液。
6.2将6.1制备得到的干细胞保护液与脂肪干细胞混合，分别按照下述两种方法混合：
6.2.1先将A液与干细胞混合均匀，再加入B液，混合均匀，得到样品6-1(样品中干细胞的浓度为1×106cells/mL)
6.2.2将A液与B液混合均匀后，再将A液和B液的混合溶液加入干细胞中，与干细胞混合均匀，得到样品6-2(样品中干细胞的浓度为1×106cells/mL)。
对比例1：与样品5-1的区别仅在于将聚赖氨酸替换为等量的赖氨酸，并加入青霉素和链霉素以避免细胞被杂菌污染，青霉素和链霉素的用量均为80U/mL，得到样品7。
对比例2：与样品5-1的区别仅在于用等量的刺云实胶替代魔芋胶，得到样品8。
对比例3：与样品5-1的区别仅在于用等量的槐豆胶替代魔芋胶，得到样品9。
对比例4：与样品5-1的区别仅在于用等量的厚朴酚替代牡丹酚，得到样品10。
对比例5：与样品5-1的区别仅在于用等量的牡丹酚替代厚朴酚，得到样品11。备注：上述实施例1-6及对比例1-3所选用的干细胞均为生长良好且更换全量新鲜培养基的脂肪干细胞，取样测定细胞存活率(测定结果详见下表1)，并在短时间内用于上述样品的制备。
二、样品的冻存：分别取上述实施例1-6及对比例1-3制备得到的样品1mL于冻存管中并做好标记，进行冻存。冻存的具体步骤为：将冻存管置于4℃保温10分钟；-20℃保温30分钟；-80℃过夜；之后直接存储于液氮槽中。
三、样品的复苏：冻存180天后，从液氮罐中取出冻存管，并进行细胞复苏(取出冻存管，立即放入37℃水槽中快速解冻，清摇冻存管使其在1分钟内全部融化，以70％酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内)；取出解冻的细胞悬浮液，缓慢加入有培养基的培养容器内(稀释比例1:10)，混合均匀，放入CO2培养箱内培养。取0.1mL解冻细胞悬浮液作存活测试。
细胞冻存前和复苏后的存活测试均采用台盼蓝染色法，具体步骤为：取0.1mL细胞悬浮液与0.1mL台盼蓝(0.4％w/v)试剂等体积均匀混合于1.5mL小离心管中；取少许混合液自血球计数盘上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色；计数四个大方格之间的细胞总数，再除4，乘以稀释倍数，最后乘以104,即为每mL中细胞悬浮液的细胞数。
四、采用本发明的干细胞的保存方法对脂肪干细胞进行冻存后，复苏后的细胞存活情况如下表1所示。
表1细胞存活率
Figure BDA0002737163410000071
Figure BDA0002737163410000081
由上表1可知，本发明的干细胞保护液用于干细胞的冻存时，可使复苏后的细胞存活率维持在92％以上；且冻存时，将A液与B液先后与干细胞混合的干细胞保存方法相对于将A液与B液混合后、再将A液与B液的混合液用于干细胞的保存方法，对干细胞的保护作用更好，复苏后细胞的存活率更高；由上述对比例1-3及实施例5可知，本发明的保护液中的聚赖氨酸、魔芋胶、厚朴酚和牡丹酚可起到协同提高复苏后的细胞存活率的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种干细胞保护液，其特征在于，所述干细胞保护液包括A液和B液，所述A液由PBS缓冲液和魔芋胶配制而成，所述B液包括人血白蛋白、聚赖氨酸、厚朴酚、牡丹酚、聚乙二醇、甘油和基础培养基，所述魔芋胶的终浓度为0.2-1wt％、所述厚朴酚的终浓度为0.005-0.01％、所述牡丹酚的终浓度为0.003-0.006％、所述人血白蛋白的终浓度为5-15wt％、所述聚赖氨酸的终浓度为0.1-3wt％、所述聚乙二醇的终浓度为0.5-3wt％，所述甘油的终浓度为体积分数1-8％，所述PBS缓冲液与所述基础培养基的体积比为1:(4-5)。
2.根据权利要求1所述的干细胞保护液，其特征在于，所述魔芋胶、聚赖氨酸和聚乙二醇的用量之和与所述甘油的质量体积比为(1-3):(1-5)，所述魔芋胶、聚赖氨酸和聚乙二醇的用量以g计，所述甘油的体积以mL计。
3.根据权利要求1所述的干细胞保护液，其特征在于，所述魔芋胶和聚赖氨酸的质量比为(0.5-1):1。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的干细胞保护液，其特征在于，所述干细胞保护液包括A液和B液，所述A液通过将魔芋胶均匀分散于所述PBS缓冲液中配制得到；所述B液通过将所述人血白蛋白、聚赖氨酸、厚朴酚、牡丹酚、聚乙二醇、甘油和基础培养基均匀混合制备得到。
5.根据权利要求4所述的干细胞保护液，其特征在于，所述A液按照下述方法配制得到：将所述PBS缓冲液加热到50-80℃；加入魔芋胶保温搅拌5-10min；自然冷却至室温即得所述A液。
6.一种干细胞保存方法，其特征在于，将干细胞置于如权利要求1-5中任意一项所述的干细胞保护液中之后，再进行干细胞冻存。
7.根据权利要求6所述的干细胞保存方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)先向待冻存的干细胞中加入所述A液并使所述A液与干细胞均匀混合；(2)加入B液，并混合均匀。
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