CN117159729B - 一种多孔的可负载干细胞的生物材料及其在疼痛治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多孔的可负载干细胞的生物材料及其在疼痛治疗中的应用，属于生物医用材料的技术领域。本发明将胶原蛋白与改性枸杞多糖制成溶液后混合，然后加入京尼平进行交联，调节pH后得到水溶胶。本发明的生物材料通过京尼平与胶原蛋白和改性枸杞多糖共价交联，影响蛋白与多糖间的相互作用，形成以短链京尼平为交联桥的网络结构聚合物，表现出多孔且致密的结构，孔隙率增加，提高了其稳定性。利用本发明的生物材料，可在人体温度下迅速形成凝胶，高孔隙率能更好的负载干细胞，交联后形成的聚合物不易被降解，有利于干细胞长期、高效地分泌外泌体作用于各种疼痛的治疗中。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料的技术领域，具体涉及一种多孔的可负载干细胞的生物材料及其在疼痛治疗中的应用。
背景技术
干细胞具有自我更新和增殖分化的能力，可产生多种类型的细胞，具有多向分化的潜能。同时，干细胞具有免疫调节能力，能够分泌出外泌体等多种生物活性物质并起到抗炎、修复等功效。公开号为CN109985064A的中国发明专利公开了一种间充质干细胞分泌提取物在制备抑制疼痛药物中的应用，干细胞在体内增殖分化，分泌活性物质修复机体，抑制疼痛。但干细胞在体内的生存率与活性不稳定，受体内环境影响，无法长期、高效的发挥作用，因此需要一个合适的载体。
水溶胶是以水为分散介质的溶胶，分散的粒子可为单个大分子或分子聚集体，利用水溶胶材料上的微孔，可负载药物或干细胞，应用于医学治疗中。具有流动性的溶胶通过进一步的缩聚反应，可形成不能流动的凝胶体系，呈现出三维的网络结构。多糖类与多肽类作为天然的亲水高分子，具有较好的生物相容性，可形成无细胞毒性的溶胶材料，利用微孔负载干细胞，在生物医学领域有巨大的潜力。
胶原蛋白作为人体中含量最多、分布最广的功能性蛋白，有良好的生物活性且无排异反应，利于人体内细胞黏附与增殖生长。胶原蛋白分子由三股螺旋结构的多肽链组成，其中含有许多脆弱的氨基酸键，制成的溶胶能在体温下快速形成凝胶。但氨基酸键在体内易被胶原蛋白酶切割，分解成小分子的多肽链，因此单纯用胶原蛋白制成的凝胶稳定性差，易被降解，不能长期负载干细胞发挥作用。多糖具有优异的流变性、持水性和增稠性等特点，与蛋白质在溶液中以带电分子的形式存在，可通过静电相互作用、氢键等非共价相互作用进行交联，从而改善溶胶的结构。但非共价键较弱，交联度低，孔隙率较低，结构易受环境影响，干细胞难以固定，不能很好的吸附在材料中，负载率低。通过引入共价键，可实现胶原蛋白与多糖间的进一步交联，解决原料的缺陷，获得一种新的生物材料。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种多孔的可负载干细胞的生物材料，胶原蛋白与多糖能够通过静电相互作用、氢键等方式交联，京尼平是天然的生物交联剂，与胶原蛋白和多糖的氨基反应后通过共价交联，形成桥梁，从而呈现出更多孔致密的网络结构，孔隙率和稳定性更高，能更好的负载干细胞。
本发明的目的之二在于提供一种多孔的可负载干细胞的生物材料的制备方法，操作工艺简单，反应条件温和，成本较低，可广泛应用。
本发明的目的之三在于提供一种多孔的可负载干细胞的生物材料在疼痛治疗中的应用，所述生物材料孔隙率高，能更好的负载干细胞，在人体温度下迅速成胶，且不易降解，可使干细胞长期、高效的分泌外泌体来修复机体，治疗各种疼痛。
为实现上述目的之一，本发明采用技术方案如下：
一种多孔的可负载干细胞的生物材料，主要包含胶原蛋白、改性枸杞多糖和京尼平。
为实现上述目的之二，本发明采用技术方案如下：
一种多孔的可负载干细胞的生物材料的制备方法，包括以下步骤：
S1、室温下，称取胶原蛋白和改性枸杞多糖分别溶解于醋酸溶液中，搅拌至溶解，分别得到胶原蛋白溶液和改性枸杞多糖溶液，备用；
S2、将胶原蛋白溶液和改性枸杞多糖溶液混合均匀后得到胶原蛋白-改性枸杞多糖溶液；
S3、在胶原蛋白-改性枸杞多糖溶液中添加京尼平共价交联，搅拌后备用；
S4、调节S3步骤所得溶液的pH至7.0，获得胶原蛋白-改性枸杞多糖溶胶。
所述改性枸杞多糖通过羧甲基化制备所得，包括以下步骤：
S1：称取枸杞多糖加入浓度为1～4mol/L的NaOH溶液，搅拌1～2h，得到枸杞多糖溶液；
S2：在枸杞多糖溶液中加入质量浓度为1～5％的一氯乙酸，置于60～80℃的水浴锅中反应4～6h，然后冷却；
S3：用冰乙酸调节冷却后溶液的pH至6.0～8.0，透析2～3d；
S4：将透析后的溶液在-80℃冷冻后干燥，获得羧甲基化枸杞多糖。
其中，所述胶原蛋白为动物源胶原蛋白、重组人源化胶原蛋白、重组人胶原蛋白、重组类胶原蛋白中的一种。
进一步地，所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的浓度为50～250g/L。
优选地，胶原蛋白的浓度为100～200g/L。
进一步地，所述改性枸杞多糖溶液中改性枸杞多糖的浓度为10～200g/L。
优选地，改性枸杞多糖的浓度为50～150g/L。
进一步地，所述胶原蛋白溶液和改性枸杞多糖溶液按体积比1:1～4混合均匀。
进一步地，磁力搅拌转速在200～600rpm，时间为1～4h。
优选地，转速为400rpm，时间为4h。
进一步地，所述京尼平的浓度为0.1～3g/L。
优选地，京尼平的浓度为0.5～2g/L。
进一步地，用1～4mol/LNaOH溶液调节pH至7.0～7.5。
进一步地，胶原蛋白-改性枸杞多糖溶胶可置于37℃恒温加热成胶。
为实现上述目的之三，本发明采用技术方案如下：
一种多孔的可负载干细胞的生物材料在疼痛治疗中的应用，包括以下步骤：
S1、在无菌条件下，用干细胞培养液重悬干细胞，得到干细胞悬浮溶液；
S2、在无菌条件下，将上述胶原蛋白-改性枸杞多糖溶胶与干细胞悬浮溶液混合，然后在恒温箱中加热，获得负载干细胞的胶原蛋白-改性枸杞多糖水凝胶。
所述干细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、牙髓间充质干细胞中的一种。
进一步地，所述干细胞溶液中干细胞的浓度为1×106-1×108个/mL。
所述干细胞培养液包含以下几种组分：α-MEM培养基、人血清蛋白、长梗秦艽酮、牡丹酚、聚赖氨酸。
进一步地，所述干细胞培养液包含以下几种组分：α-MEM培养基，人血清蛋白2～5g/L、长梗秦艽酮1～5μmol/L、牡丹酚1～10mg/L、聚赖氨酸10～30mg/L。
进一步地，所述α-MEM培养基中包含二十种人体必需氨基酸、十种维生素和谷氨酰胺。
进一步地，所述胶原蛋白-改性枸杞多糖溶液与干细胞溶液按体积比1～5:1混合。
进一步地，干细胞能够通过分泌外泌体治疗各种疼痛。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明的生物材料，具有多孔和不易降解的优势。胶原蛋白与改性枸杞多糖通过静电相互作用交联，易受环境影响，被胶原蛋白酶分解。京尼平作为一种天然的生物交联剂，生物可降解且毒性远低于戊二醛，具有抗炎、镇痛的效果。京尼平上的C3烯碳原子受到多糖与蛋白上氨基基团的亲核攻击，打开二氢吡喃，形成杂环胺化合物，而京尼平的酯基团与氨基反应可形成酰胺键，共价交联。短链京尼平可成为蛋白与多糖间的交联桥，形成多孔的网状结构的聚合物，有更高的孔隙率，使干细胞吸附在孔隙中，且共价键不易被打破，提高了材料的稳定性和抗降解性。
(2)本发明的生物材料，具有更好的抗炎效果。枸杞多糖生物相容性好，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、免疫调节的能力，羧甲基化修饰枸杞多糖主要是在多糖的分子链上引入亲水的羧甲基功能基团，进一步提高枸杞多糖的抗炎和抗菌的效果；京尼平生物相容性好，交联后对干细胞毒性较小，具有镇痛、抗炎的效果。
(3)本发明的生物材料可负载干细胞，在人体温度下快速成胶，长期、高效地分泌外泌体来调节人体免疫力，起到抗炎、抗肿瘤、镇痛和修复的功效，用于慢性疼痛、急性疼痛、炎性痛、神经病理性疼痛及癌痛等治疗中。
附图说明
图1是本发明实施例2～4与对比例1～2制备的凝胶的硬度；
图2是本发明实施例2～4与对比例1～2制备的凝胶的胶黏性；
图3是本发明实施例2～4与对比例1～2制备的凝胶的黏聚性；
图4是本发明实施例2～4与对比例1～2制备的凝胶的孔隙率；
图5是本发明实施例2～4与对比例1～2制备的凝胶的溶胀率；
图6是本发明实施例2～4与对比例1～2制备的凝胶的降解率；
图7是本发明实施例2～4与对比例1～2制备的凝胶中干细胞的增殖率；
图8是本发明实施例2～4与对比例1～2制备的凝胶微观结构。
具体实施方式
下面，为了更清晰的展示本发明的效果，结合具体实施例，对本发明做进一步描述。值得一提的是，以下描述的各实施例只是用来说明本发明的一种多孔可负载干细胞的生物材料制备方法的举例说明，并不能代表本发明的全部。
本发明所有原料，对来源没有特别的限制，可通过在市场购买或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备即可。
本发明原则上对胶原蛋白的选择没有特别的限制。胶原蛋白可以从猪蹄、牛皮、鱼皮、软骨等富含胶质的食物中通过酶解法、热水法等方式获取，也可以通过DNA重组技术制成重组胶原蛋白。本领域技术人员可根据实际需求和产品性能等进行选择与调整。本发明所述胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白。
本发明所述干细胞为间充质干细胞，对其来源没有特别的限制，可根据实际需求和在疼痛治疗中的应用进行选择，采用现有技术的培养方法得到。
实施例1
本实施例的目的在于探索改性枸杞多糖溶液，包括以下步骤：
S1、称取0.8g枸杞多糖加入50ml浓度为3mol/L的NaOH溶液，搅拌1h；
S2、在步骤S1所得溶液中加入质量浓度为1％的一氯乙酸，置于70℃的水浴锅中反应5h，然后冷却；
S3、重复步骤S2，分别加入质量浓度为2％、3％、4％和5％的一氯乙酸；
S4、用冰乙酸调节步骤S2和S3溶液的pH至7.0，透析3d；
S5、将透析后的溶液在-80℃冷冻后干燥，获得羧甲基化枸杞多糖。
S6、取10mg羧甲基化枸杞多糖，加入10mL 0.01mol/L的NaOH，搅拌1h使其充分溶解。滴入1～3滴酚酞溶液，用0.01mol/L的HCL滴定至红色消失，维持30s以上不变色则终止滴定，计算羧甲基取代度。
计算公式为：DS＝0.162A/(1-0.058A)
A＝(C1V1-C2V2)/W
式中：DS为羧甲基取代度；A为羧甲基含量(％)；W为羧甲基化枸杞多糖质量(g)；C1为NaOH的浓度(mol/L)；V1为NaOH的体积(mL)；C2是HCL的浓度(mol/L)；V2为样品滴定过程中消耗HCL的体积(mL)。结果如表1所示。
表1一氯乙酸添加量对羧甲基取代度的影响
| 一氯乙酸添加量(％) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 羧甲基取代度 | 0.582 | 0.796 | 1.021 | 0.975 | 0.687 |
由上表可知，一氯乙酸的添加量影响枸杞多糖羧甲基的取代率，随着添加量的增加，呈现先上升后下降的趋势，在一氯乙酸质量浓度为3％时取代度最高。羧甲基基团通过取代多糖大分子链中单糖分子上的某一个或几个羟基，对枸杞多糖进行修饰，从而提高枸杞多糖的溶解性和抗氧化活性，因此，选择一氯乙酸浓度为3％时效果最佳。
实施例2
本实施例的目的在于制备一种多孔的可负载干细胞的生物材料，包括以下步骤：
S1、室温下，称取胶原蛋白和改性枸杞多糖分别溶解于体积浓度1％的醋酸溶液中，在转速400rpm下搅拌4h至充分溶解，分别得到浓度为200g/L的胶原蛋白溶液和浓度为150g/L的改性枸杞多糖溶液，备用；
S2、将胶原蛋白溶液和改性枸杞多糖溶液按体积比1:1混合，在转速200rpm搅拌1h，得到胶原蛋白-改性枸杞多糖溶液；
S3、在胶原蛋白-改性枸杞多糖溶液中添加京尼平(浓度为0.5g/L)，在转速400rpm下交联4h后备用；
S4、调节S3步骤所得溶液的pH至7.0，获得胶原蛋白-改性枸杞多糖溶胶。
S5、将S4步骤所得胶原蛋白-改性枸杞多糖溶胶置于恒温箱中，在37℃下热诱导3min，获得胶原蛋白-改性枸杞多糖水凝胶。
实施例3
本实施例的目的在于制备一种多孔的可负载干细胞的生物材料，包括以下步骤：
S1、室温下，称取胶原蛋白和改性枸杞多糖分别溶解于体积浓度1％的醋酸溶液中，在转速400rpm下搅拌4h至充分溶解，分别得到浓度为200g/L的胶原蛋白溶液和浓度为150g/L的改性枸杞多糖溶液，备用；
S2、将胶原蛋白溶液和改性枸杞多糖溶液按体积比1:1混合，在转速200rpm搅拌1h，得到胶原蛋白-改性枸杞多糖溶液；
S3、在胶原蛋白-改性枸杞多糖溶液中添加京尼平(浓度为1.0g/L)，在转速400rpm下交联4h后备用；
S4、调节S3步骤所得溶液的pH至7.0，获得胶原蛋白-改性枸杞多糖溶胶。
S5、将S4步骤所得胶原蛋白-改性枸杞多糖溶胶置于恒温箱中，在37℃下热诱导3min，获得胶原蛋白-改性枸杞多糖水凝胶。
实施例4
本实施例的目的在于制备一种多孔的可负载干细胞的生物材料，包括以下步骤：
S1、室温下，称取胶原蛋白和改性枸杞多糖分别溶解于体积浓度1％的醋酸溶液中，在转速400rpm下搅拌4h至充分溶解，分别得到浓度为200g/L的胶原蛋白溶液和浓度为150g/L的改性枸杞多糖溶液，备用；
S2、将胶原蛋白溶液和改性枸杞多糖溶液按体积比1:1混合，在转速200rpm搅拌1h，得到胶原蛋白-改性枸杞多糖溶液；
S3、在胶原蛋白-改性枸杞多糖溶液中添加京尼平(浓度为2.0g/L)，在转速400rpm下交联4h后备用；
S4、调节S3步骤所得溶液的pH至7.0，获得胶原蛋白-改性枸杞多糖溶胶。
S5、将S4步骤所得胶原蛋白-改性枸杞多糖溶胶置于恒温箱中，在37℃下热诱导3min，获得胶原蛋白-改性枸杞多糖水凝胶。
对比例1
一种胶原蛋白凝胶的制备方法，包含以下步骤：
S1、室温下，称取胶原蛋白溶解于体积浓度1％的醋酸溶液中，在转速400rpm下搅拌4h至充分溶解，得到浓度为200g/L的胶原蛋白溶液；
S2、调节S1步骤所得溶液pH至7.0，得到胶原蛋白溶胶，然后置于恒温箱中，在37℃下热诱导3min，获得胶原蛋白凝胶。
对比例2
一种胶原蛋白-改性枸杞多糖凝胶的制备，包含以下步骤：
S1、室温下，称取胶原蛋白和改性枸杞多糖分别溶解于体积浓度1％的醋酸溶液中，在转速400rpm下搅拌4h至充分溶解，分别得到浓度为200g/L的胶原蛋白溶液和浓度为150g/L的改性枸杞多糖溶液；
S2、将胶原蛋白溶液和改性枸杞多糖溶液按体积比1:1混合，在转速200rpm搅拌1h，得到胶原蛋白-改性枸杞多糖溶液；
S3、调节S2步骤所得溶液pH至7.0，得到胶原蛋白-改性枸杞多糖溶胶，置于恒温箱中，在37℃下热诱导3min，获得胶原蛋白-改性枸杞多糖凝胶；
实验例
实施例2～4与对比例1～7所得生物材料的特征与参数：
1、凝胶质构特性测试：取实施例2～4和对比例1～2中的水凝胶，通过质构仪两次下压的模式测定凝胶的质构，选用P/0.5圆柱型探头。设置探头测试前、测试中及测试后的速率为1.0、2.0和5.0mm/s；下压距离为7.0mm，触发力为5.0g。凝胶质地以Bourne定义计算，主要包括凝胶的硬度、胶黏性、黏聚性。
测试结果如图1～3所示，对比例1为仅用胶原蛋白溶胶制备的凝胶，其凝胶硬度、黏聚性和胶黏性最弱。对比例2添加改性枸杞多糖后，多糖与蛋白在静电相互作用下通过氢键结合，凝胶质地有所提升。实施例2、3、4的凝胶硬度、黏聚性和胶黏性随着京尼平含量的增加而有显著的提升，随着京尼平的加入，与氨基共价交联，形成共价键，短链京尼平交联桥提供了更加稳定的网络结构聚合物，凝胶机械强度增加。
2、凝胶孔隙率测试：取实施例2～4和对比例1～2中的水凝胶，进行冷冻干燥。在烧杯中装入无水乙醇中，称取烧杯与乙醇的总质量为W1。将冷冻干燥后的样品浸没于乙醇中，记录此时烧杯的总重量为W2。静置40min后取出样品，称取烧杯与剩余乙醇的重量，记为W3。孔隙率＝(W2-W3)/(W2-W1)*100％。
测试结果如图4所示，胶原蛋白与改性枸杞多糖经过京尼平交联后，短链京尼平在多糖与蛋白间提供桥梁，形成多孔的三维网络结构，且随着京尼平浓度的增加，孔隙率不断提高，结构更为致密。
3、凝胶溶胀率测试：取实施例2～4和对比例1～2中的水凝胶，冷冻干燥后称取其重量，记为W0。将前述制备冻干粉的水凝胶浸没于pH 7.4的PBS缓冲液中，每隔半小时取出水凝胶，称取其重量，直至凝胶溶胀完全，重量不再改变，称取最终重量，记为W2。溶胀度＝(W2-W0)/W0*100％。
测试结果如图5所示，所有样品的溶胀率低于180％。随着京尼平浓度的增加，胶原蛋白与改性枸杞多糖的交联程度越高，凝胶结构更加致密稳定，因此凝胶溶胀率越低。
4、凝胶降解率测试：取实施例2～4和对比例1～2中的水凝胶，检测凝胶分别浸泡在0.1g/mL胶原蛋白酶溶液中一定时间后质量的变化，得到降解性能。
测试结果如图6所示，未交联的胶原蛋白凝胶降解速率较快，稳定性差。这是因为胶原蛋白是由三股螺旋结构的多肽链组成的，氨基酸肽键脆弱，很容易被胶原蛋白酶识别和结合，切割分解成小分子肽链。随着胶原蛋白与改性枸杞多糖的交联和京尼平浓度的增加，水凝胶的降解速率变慢，在132h后仍可稳定存在于溶液中。交联后形成的网络结构聚合物分子量较大，形成的共价键不易被酶打破，抗降解能力强，能更好的满足应用的需求
5、凝胶中干细胞的增殖率测试：取实施例2～4和对比例1～2中的生物材料负载干细胞，包括以下步骤：
S1、在无菌条件下，配置干细胞培养液，包含以下组分：α-MEM培养基，人血清蛋白4g/L、长梗秦艽酮3μmol/L、牡丹酚8mg/L、聚赖氨酸20mg/L。
S2、在无菌条件下，用干细胞培养液重悬干细胞，得到干细胞的浓度为1×108个/mL的干细胞悬浮溶液；
S3、在无菌条件下，将实施例2～4和对比例1～2中的生物材料溶胶与干细胞悬浮溶液按体积比4:1混合，搅拌均匀得到负载干细胞的生物材料；
S4、将S3步骤所得生物材料在37℃恒温箱中加热3min，获得负载干细胞的水凝胶。
S5、通过CCK-8法评估不同凝胶中干细胞的增殖情况。
测试结果如图7所示，吸光度体现了干细胞增殖情况，结果表明，京尼平交联胶原蛋白与改性枸杞多糖后的凝胶干细胞存活率更高。长梗秦艽酮、牡丹酚、改性枸杞多糖和京尼平具有抗炎抗菌的功效，减少了干细胞受杂菌影响，提供了更适宜的生长环境。交联后的凝胶多孔，结构致密，能更好的负载干细胞，有利于干细胞的增殖，从而可实现干细胞长期、高效分泌外泌体，更好的应用到疼痛治疗中。
6、凝胶的微观结构测试：取实施例2～4和对比例1～2中的水凝胶，取凝胶横截面固定喷金后，通过扫描电镜观察凝胶的微观结构，放大倍数为250。
测试结果如图8所示，可以观察到胶原蛋白凝胶孔隙较大，经过京尼平交联后的凝胶孔隙率增加，随着京尼平浓度的增加，呈现出更加多孔的结构，结构更加致密，与前述实验结果一致。
所述说明书与具体实施例对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员可以根据本发明的技术思想，进行不同的变形与修改，以适应实际应用中的需求，而这些改进均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种多孔的可负载干细胞的生物材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、室温下，称取胶原蛋白和改性枸杞多糖分别溶解于醋酸溶液中，搅拌至溶解，分别得到胶原蛋白溶液和改性枸杞多糖溶液，备用；
S2、将胶原蛋白溶液和改性枸杞多糖溶液混合均匀后得到胶原蛋白-改性枸杞多糖溶液；
S3、在胶原蛋白-改性枸杞多糖溶液中添加京尼平，搅拌后备用；
S4、调节S3步骤所得溶液的pH至7.0，获得胶原蛋白-改性枸杞多糖溶胶；
所述改性枸杞多糖通过羧甲基化制备所得，包括以下步骤：
称取枸杞多糖加入NaOH溶液，搅拌均匀，然后加入质量浓度为3%的一氯乙酸，置于水浴锅中反应，冷却后用冰乙酸调节pH，透析后将溶液冷冻干燥，获得羧甲基化枸杞多糖；
所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的浓度为200 g/L；
所述改性枸杞多糖溶液中改性枸杞多糖的浓度为150 g/L；
所述胶原蛋白溶液和改性枸杞多糖溶液按体积比1:1混合均匀；
所述京尼平浓度为0.5～2 g/L。
2.根据权利要求1所述的一种多孔的可负载干细胞的生物材料的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白为动物源胶原蛋白、重组人源化胶原蛋白、重组人胶原蛋白、重组类胶原蛋白中的一种。
3.一种采用权利要求1～2任一项所述方法制备得到的多孔的可负载干细胞的生物材料。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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