CN101721691A - 一种用于感染创面治疗和修复的制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体的说涉及一种感染创面治疗和修复的生物制剂及其制备方法。本发明公开的制剂组成及其重量百分含量包括溶葡萄球菌酶0.1-30％，壳聚糖或壳聚糖衍生物3-50％，胶原蛋白30-95％。本发明以天然可生物降解的壳聚糖衍生物和胶原蛋白为敷料进行交联，形成水凝胶作为载体，将溶葡萄球菌酶载入水凝胶中，制备既具有促进创面愈合功能又具有杀菌作用的新型制剂。

Description

一种用于感染创面治疗和修复的制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体的说涉及一种感染创面治疗和修复的生物制剂及其制备方法。

背景技术

重建或恢复皮肤屏障是受伤创面治疗的最终目标，一个性能优良的创面覆盖物可暂时起到皮肤屏障功能的部分作用，提供一个有利于创面愈合的环境。理想的创面敷料首先应该有效阻止细菌感染尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的感染，提高植皮的成功率和加速创面愈合，同时应有良好的生物相容性、控制和吸收创面渗液、适合气体和水蒸气透过、保护新生组织、加速创面愈合等特性。

现有敷料的种类很多，大致分为以下三种：1、惰性敷料即传统性敷料，如纱布。但是纱布不能持久保持创面湿润，有可能造成创面延迟愈合，而且浸透的敷料容易使病原体通过，引起继发感染。另外，敷料纤维易脱落，造成异物反应，影响了创面的愈合。2、双相作用性敷料，这类敷料可利用它所造成的局部环境促进伤口愈合。(1)半通透性膜(塑胶类敷料)：由多氨基甲酸乙酪材料制成的吸收膜，其中敷料的一侧加有粘性材料；(2)多氨基甲酸乙醋泡沫；(3)水凝胶敷料：是由明胶、多糖、多种电解质复合物和甲基丙烯酸树脂组成的三维立体网状吸水性多聚体。双相作用性敷料普遍存在吸水性较差，与创面的粘附能力较差，更主要的是缺少抗感染能力的缺点。3、生物活性敷料(密闭性敷料)，这类敷料因能与创周紧密粘连，防止创面干燥又称为密闭性敷料。它是一种维持伤口湿润环境的敷料，它的吸收性与其结构有关。它可与局部应用的药剂和机体内源性分子相作用，促进伤口愈合，但对于细菌感染性创面的杀菌效果也较差，无法有效治疗此类创面。

上述敷料普遍存在不能有效杀灭引起创面感染的病原菌，或者不能有效控制和吸收创面渗液等的缺点。因此，开发一种既能有效杀菌，特别是MRSA，同时又能有效的控制和吸收创面渗液，保护新生组织、加速创面愈合的外用感染创面治疗和修复制剂显得非常迫切。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一是提供一种用于感染创面治疗和修复的生物制剂，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明需要解决的另一个技术问题是提供一种用于感染创面治疗和修复的生物制剂的制备方法。

本发明的发明构思是这样的：

溶葡萄球菌酶(lysostaphin)是一种含锌的金属蛋白酶，专一降解细胞壁的甘氨酸肽键，能裂解金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的细胞壁，从而起到彻底杀死细菌的目的，不易产生耐药性，尤其对目前烧伤临床感染率最高的耐药性金黄色葡萄球菌等难以根除的致病菌的效果非常好。

生物敷料是当前被重视的创面覆盖物，其中壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰后得到的线性黏多糖。它是一种结构与细胞外基质中的主要成分糖胺聚糖十分类似的优良天然生物材料，也是现今所发现的惟一带有正电荷的天然多糖。壳聚糖及其衍生物制成的人造皮肤是比较理想的，它比较柔软、舒适，与创面的贴合性好，既透气、又吸水，具有抑制疼痛和止血功能，有抑菌消炎作用，随着创伤慢慢愈合和自身皮肤生长，它能自行溶解被机体吸收，免除了解除时流血多及病人的痛苦，也不会留下碎屑而延缓伤口的愈合，相反会促进皮肤的再生，对治疗高热创伤特别有效。但壳聚糖类物质的保湿性和强度相对较差，对创面渗出液的吸收效果不好。

胶原蛋白是细胞外基质的一种主要结构蛋白，具有低抗原性、可被人体吸收、体内降解产物无毒副作用的优点，在作为生物材料方面的应用受到广泛关注。它支持很多不同种类的组织生长，能赋予它们良好的特性，如机械强度。胶原敷料有多种形式，如膜片、海绵状及粒状等，能重新溶解，能吸收创伤渗出液，可与宿主细胞外基质相互作用，以促进细胞在新结缔组织上的粘附、移动、生长和沉积；能诱导分化、诱导成纤维细胞的趋化性，延迟伤口收缩，加速创伤修复。但是其在水溶液中降解速度太快，从而限制了它的应用。

本发明的技术方案是这样的：

一种用于感染创面治疗和修复的制剂，以重量百分比计，包括溶葡萄球菌酶0.1-30％，壳聚糖或壳聚糖衍生物3-50％，胶原蛋白30-95％。

优选的制剂组分及重量百分含量包括溶葡萄球菌酶1-20％，壳聚糖或壳聚糖衍生物8-30％，胶原蛋白50-90％。

所述及的用于感染创面治疗和修复的制剂，还包含水，水的用量为溶葡萄球菌酶、壳聚糖或壳聚糖衍生物和胶原蛋白总重量的3-50倍。

所述及的壳聚糖衍生物为壳聚糖盐酸盐、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖季铵盐、谷胺酸盐、羧甲基壳聚糖或羧化壳聚糖的一种以上。

所述及的胶原蛋白为I、II或III型胶原蛋白的一种以上。

制备所述及的用于感染创面治疗和修复制剂的方法，包括如下步骤：

(1)先将壳聚糖或壳聚糖衍生物溶解于水中，加入胶原蛋白，搅拌，加入交联剂碳二亚胺盐酸盐或京尼平，使得溶液中碳二亚胺盐酸盐或京尼平的浓度达到0.01mol/L～0.1mol/L，制得壳聚糖-胶原蛋白水凝胶。

(2)将溶葡萄球菌酶加入步骤(1)制得的壳聚糖-胶原蛋白水凝胶中，搅拌，即制得载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶。

还可将上述制备步骤制得的载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶冷冻干燥，制得载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶支架。

所述及的用于感染创面治疗和修复制剂的应用，当感染创面的渗出液较少或没有渗出液时，可将上述步骤(2)制得的载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶直接涂抹在创面上；当感染创面的渗出液量较多时，可将上述经冷冻干燥制得的载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶固体支架直接敷于创面，载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶支架具有较高的膨胀度，能有效吸收创面的渗出液，形成的水凝胶体系也有利于溶葡萄球菌酶和胶原蛋白对创面的杀菌及修复作用的发挥。

本发明制得的载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶及载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶支架，由于溶葡萄球菌酶蛋白分子被分散包裹在壳聚糖和胶原蛋白所形成的体系中，避免了创面组织中存在的分解蛋白的酶类物质对溶葡萄球菌酶的降解，同时水凝胶体系所形成的湿润环境也使得溶葡萄球菌酶的杀菌活性得到有效保持。另一方面，壳聚糖经溶胀形成的水凝胶形态，能显著减缓胶原蛋白的降解速率，并且有效降低胶原蛋白与创面组织中存在的分解胶原蛋白的酶类物质的接触几率，使得胶原蛋白能够在创面维持较长时间的修复作用。本发明的用于感染创面修复的制剂，具有良好的生物相容性、吸湿性、保湿性和生物黏附性，既能有效杀灭MRSA等致病菌，又能促进成纤维细胞的增长，加速创面修复，加快伤口愈合，是一种高效、安全的新型的感染创面修复制剂。

本发明的感染创面治疗和修复制剂的制备方法简单，适合大规模生产，所使用的材料易得，成本低廉，产品使用方便。

附图说明：

图1不同壳聚糖与胶原蛋白质量比制备的水凝胶支架扫描电镜照片

A 1∶1；B 1∶3；C 1∶6；D 1∶8

图2载溶葡萄球菌酶水凝胶支架的扫描电镜照片

图3壳聚糖与胶原蛋白质量比(1∶1)制备的水凝胶的模量

图4壳聚糖与胶原蛋白质量比(1∶6)制备的水凝胶的模量

图5不同壳聚糖与胶原蛋白质量比制备的水凝胶水中的膨胀比

图6不同壳聚糖与胶原蛋白质量比制备的水凝胶在饱和硫酸铵溶液中的吸湿性

图7MTT法测定壳聚糖-胶原蛋白水凝胶与人肺成纤维细胞作用后的细胞活力

具体实施方式

实施例1 载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶的制备

称取0.1g的壳聚糖盐酸盐溶解于10ml水中，加入0.3g水解胶原蛋白(分子量3000Da)，搅拌均匀，加入0.12g水溶性碳二亚胺盐酸盐(EDAC)，室温搅拌反应2h。

将0.1g的溶葡萄球菌酶加入制得的壳聚糖-胶原蛋白水凝胶中，搅拌均匀，制得载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶。

实施例2载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶支架的制备

将实施例1制得的载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶倾入培养皿(40×25mm)中，冷冻干燥得水凝胶支架。

实施例3：壳聚糖-胶原蛋白水凝胶支架扫描电镜

取壳聚糖-胶原蛋白水凝胶支架(其中壳聚糖与胶原蛋白的质量比分别为1∶1、1∶3、1∶6和1∶8)和载溶葡萄球菌酶水凝胶支架(1∶6)喷金，扫描电镜观察，拍照。结果如图1和图2所示。可见水凝胶支架中有较多的孔隙(图1)，而溶葡萄球菌酶均匀地分散于孔隙中(图2)。

实施例4：壳聚糖-胶原蛋白水凝胶流变学性质表征

将壳聚糖-胶原蛋白水凝胶(壳聚糖与胶原蛋白的质量比分别为1∶1和1∶6)其中经流变扩展系统，35℃，圆筒法测定，结果如图3和4所示。图3所示的比例为1∶1时，在整个频率范围内粘性模量均大于弹性模量。图4可见比例为1∶6的水凝胶中，弹性模量在整个频率范围内均大于粘性模量。

实施例5：水凝胶支架的膨胀度测定

取不同配比的冷冻干燥样品，称重(W_d)，置于水中。于不同时间点取出样品，称重(W_s)。按凝胶溶胀率定义计算不同时间的溶胀率(Q)：

Q＝(W_s-W_d)/W_d，

其中Ws是溶胀后的水凝胶膜质量，Wd是干水凝胶膜质量

结果见图5。可见比例为1∶6时，膨胀比最大，为60。

实施例6：水凝胶支架吸湿性试验

将水凝胶支架分别置于由饱和硫酸铵的干燥器中，精确称取干燥试样(W_o)，不同时间点称取各试样质量(W_t)，用下式求出吸湿度：吸湿度(％)＝100×(W_t-W_o)/W_o。结果见图6。可见壳聚糖与胶原蛋白的质量比为1∶3和1∶6时，其吸湿性较质量比为1∶1和1∶8时高。

实施例7：水凝胶杀菌率试验

将含有不同溶葡萄球菌酶重量比的载溶葡萄球菌酶水凝胶与含菌膜分别接触10min和1h后，测定杀菌率，结果如表1。可见含有不同溶葡萄球菌酶重量比的载溶葡萄球菌酶水凝胶对金黄色葡萄球菌的杀菌率均为95％以上。

表1 载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶杀菌率结果

^a载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶中溶葡萄球菌酶的重量百分比

^b未计数

实施例8：细胞相容性

将壳聚糖-胶原蛋白水凝胶与人肺成纤维细胞直接接触，即将人肺成纤维细胞次代培养于多孔组织培养板上，细胞以DMEM培养基培养，当细胞长到单层细胞是，分别将0、10、30和50μl水凝胶加入，培养24h后，以MTT法测定。结果如图7。可见壳聚糖-胶原蛋白水凝胶可促进细胞的增长，48h时加入30和50μl水凝胶组，细胞增长太高，以致无法测出。

Claims (7)

1.一种用于感染创面治疗和修复的制剂，其特征在于，以重量百分比计，包括溶葡萄球菌酶0.1-30％，壳聚糖或壳聚糖衍生物3-50％，胶原蛋白30-95％。

2.如权利要求1所述的用于感染创面治疗和修复的制剂，其特征在于，优选的组分及重量百分含量包括溶葡萄球菌酶0.1-20％，壳聚糖或壳聚糖衍生物8-30％，胶原蛋白50-90％。

3.如权利要求1所述的用于感染创面治疗和修复的制剂，其特征在于，还包含水，水的用量为溶葡萄球菌酶、壳聚糖或壳聚糖衍生物和胶原蛋白总重量的3-50倍。

4.如权利要求1或3所述的用于感染创面治疗和修复的制剂，其特征在于，所述的壳聚糖衍生物为壳聚糖盐酸盐、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖季铵盐、谷胺酸盐、羧甲基壳聚糖或羧化壳聚糖中的一种以上。

5.如权利要求1或3所述的用于感染创面治疗和修复的制剂，其特征在于，所述的胶原蛋白为I、II或III型胶原蛋白的一种以上。

6.制备如权利要求1或3所述的用于感染创面治疗和修复的制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)先将壳聚糖或壳聚糖衍生物溶解于水中，加入胶原蛋白，搅拌，加入交联剂碳二亚胺盐酸盐或京尼平，使得溶液中碳二亚胺盐酸盐或京尼平的浓度达到0.01mol/L～0.1mol/L，制得壳聚糖-胶原蛋白水凝胶；

(2)将溶葡萄球菌酶加入步骤(1)制得的壳聚糖-胶原蛋白水凝胶中，搅拌，即制得载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶。

7.如权利要求6所述的制备用于感染创面治疗和修复的制剂的方法，其特征在于，将制得的载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶冷冻干燥，制得载溶葡萄球菌酶壳聚糖-胶原蛋白水凝胶支架。

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