CN110495450A

CN110495450A - 一种细胞冻存运输液及其应用

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Publication number: CN110495450A
Application number: CN201910907391.8A
Authority: CN
Inventors: 许澎; 黄巧; 胡清云
Original assignee: Hunan Feng Hui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Feng Hui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-09-24
Filing date: 2019-09-24
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2039-09-24
Also published as: CN110495450B

Abstract

本发明提供了一种细胞冻存运输液及其应用，所述细胞冻存运输液的组分以质量百分数计，包括：1～15％PLL‑COOH(0.65)、3～9％海藻糖、0.5～2.5％葡萄糖、15～35％人血白蛋白、0.005～0.02％复方氨基酸溶液、55～70％的0.9％氯化钠注射液和余量为水。该细胞冻存运输液，将细胞冻存液和细胞运输液统一为一种，减少了操作流程，节约成本和时间。

Description

一种细胞冻存运输液及其应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种细胞冻存运输液及其应用。

背景技术

目前，干细胞和免疫细胞技术广泛应用，细胞储存是整个细胞产业链中的重要环节。常用的细胞冻存液中通常含有血清(FBS，Fetal Bovine Serum)，二甲基亚砜(DMSO，Dimethyl Sulfoxide)和培养基，DMSO是一种广泛使用的渗透性保护剂，能够防止冻存过程中细胞内冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。然而研究表明，DMSO能与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，对细胞具有一定的毒性，并需要经过较长时间代谢细胞才能将其排出，此时，细胞才可以进行下一步应用。FBS可以通过保护细胞膜，提高冻存复苏过程的细胞存活率，但却可能含有疯牛病病毒、内毒素和外毒素，还有潜在的未知病毒风险。培养基是细胞生长的基础营养物质，成分复杂并且难以明确，然而由于FBS、DMSO和培养基的这些缺点，使得现有技术中的细胞冻存液在实际应用中受到很大限制。因此，研发新型的更安全的冷冻保护剂至关重要。

除需冻存外，细胞在应用过程中还会涉及到需要在实验室与医院等不同地点之间的运输问题。现有技术中常用的运输方式包括冻存细胞运输和复苏细胞运输，前者主要是将细胞冻存后用干冰或液氮进行运输，后者是用细胞培养瓶灌满培养液后进行常温运输。这两种运输方法各有优缺点：1)细胞冻存后采用干冰或液氮运输可以使细胞在超低温状态下保持较高的生物活性，然而由于干冰或液氮易挥发，在进行长距离或长时间运输时消耗量很大，导致成本较高，并且干冰和液氮运输还存在一定的安全风险；2)复苏细胞灌装培养基运输方式单次运输细胞数量少，细胞培养基耗费过多，细胞对环境温度要求较高。

综上所述，现有技术在细胞冻存和细胞运输技术方面存在成分不明确、细胞活性影响大、安全性低和成本高等诸多问题，这也使得细胞冻存盒运输技术成为各项科研及药物研究中长久以来存在的普遍难题。尽管市面上出现了部分无FBS无DMSO的细胞冻存液和细胞运输液，然而由于冻存液和细胞运输液成分不同，功能不同，需要将冻存的细胞进行复苏，培养好以后消化处理再用运输液悬浮。增加了细胞复苏和培养的操作，使得生产成本和时间都大大增加。因此研发一种既可以用来冻存细胞有可以用来作为运输液的混合液显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是：提供一种不含毒性及病原性成分且能够兼具细胞运输和冻存双功能的细胞冻存运输液。

本发明所要解决的第二个技术问题是：提供上述细胞冻存运输液的应用。

根据本发明的第一方面实施例的一种细胞冻存运输液，所述细胞冻存运输液中含有以下组分：PLL-COOH、海藻糖、葡萄糖、人血白蛋白、复方氨基酸和氯化钠，其中，所述复方氨基酸的组成包括：异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸醋酸盐、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、L-缬氨酸(C₅H₁₁NO₂)、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、门冬酰胺、门冬氨酸、N-乙酰-L-半胱氨酸、谷氨酸、盐酸鸟氨酸、丝氨酸和N-乙酰-L-络氨酸。

根据本发明的一些实施例，所述复方氨基酸是以复方氨基酸溶液的形式添加到所述细胞冻存运输液中的，每升所述复方氨基酸溶液中含有异亮氨酸8.8g、亮氨酸13.6g、赖氨酸醋酸盐10.6g、甲硫氨酸1.2g、苯丙氨酸1.6g、苏氨酸4.6g、色氨酸1.5g、L-缬氨酸(C₅H₁₁NO₂)10.6g、精氨酸8.8g、组氨酸4.7g甘氨酸6.3g、丙氨酸8.3g、脯氨酸7.1g、门冬酰胺0.55g、门冬氨酸2.5g、N-乙酰-L-半胱氨酸0.8g、谷氨酸5.7g、盐酸鸟氨酸1.66g、丝氨酸3.7g和N-乙酰-L-络氨酸0.86g。

根据本发明的一些实施例，所述细胞冻存运输液由以下质量百分数计的组分组成：

1～15％PLL-COOH溶液、3～9％海藻糖、0.5～2.5％葡萄糖、15～35％人血白蛋白、0.005～0.02％复方氨基酸溶液和55～70％的0.9％氯化钠注射液，余量为水，所有组分的质量百分数之和为100％。

根据本发明的一些实施例，所述细胞冻存运输液由以下质量百分数计的组分组成：PLL-COOH 7.5％、海藻糖5％、葡萄糖1％、复方氨基酸0.01％、人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液61％、余量为蒸馏水。

根据本发明的一些实施例，所述PLL-COOH溶液的配制方法为：将质量百分数为25％(w/w)的ε-多聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine，PLL)水溶液和65％摩尔比的琥珀酐(Succinic anhydride)水溶液混合在50℃条件下反应1h即得。

根据本发明实施例的细胞冻存运输液，本发明的有益效果至少包括：该细胞冻存运输液中不含有DMSO和血清，成分明确，更安全稳定，将细胞冻存液和细胞运输液统一为一种，减少了操作流程，节约成本和时间，该细胞冻存运输液，在常规冻存及运输温度下保存的效果良好，不亚于使用DMSO和血清冻存的效果；本发明方案的细胞冻存液通过复方氨基酸与其他组分间的复配能够有效缓解细胞内外渗透压剧烈变化以减少渗透体积变化对细胞的损伤，在低温冻存过程中，通过复方氨基酸与其他成分间的复配还能够抑制细胞外冰晶的形成，减少细胞受到冰晶损伤，提升细胞活力；在存储运输过程中，通过复方氨基酸与其他成分间的复配，既为细胞提供了维持基本代谢所需的能量底物，又能较好地维持细胞内外的渗透压，同时还能快速清除氧自由基，避免细胞正常生理过程中产生的氧自由基与脂质过氧化物对细胞产生伤害。

根据本发明的二方面实施例的一种细胞冻存和/或运输的方法，将细胞与上述细胞冻存运输液混合后，进行冻存和/或运输操作。

根据本发明的一些实施例，所述细胞冻存操作包括以下步骤：

S1、将细胞和所述细胞冻存运输液混合，制成细胞悬液；

S2、将上述步骤S1制得的细胞悬液进行冻存。

根据本发明的一些实施例，冻存后的细胞悬液若需取用，则需在使用前先将细胞悬液中的细胞置于37℃下复苏。

根据本发明的一些实施例，所述运输操作将含有细胞和所述细胞冻存运输液的细胞悬液置于(10±2)℃环境运输；该细胞悬液可以是直接配制的，也可以是采用经冻存或冻存复苏后的细胞悬液置于(10±2)℃环境运输。

根据本发明的一些实施例，所述细胞悬液中细胞的浓度为(1～100)*10⁶个/mL；优选为5*10⁶个/mL。

根据本发明的一些实施例，所述细胞包括Hela细胞、MG63细胞、ARPE-19细胞、HK2细胞、HUMSC细胞或BMSC细胞中的至少一种。

根据本发明实施例的细胞冻存和/或运输的方法，本发明的有益效果至少包括：采用本发明方案的细胞冻存运输液进行冻存和/或运输操作，使得操作更为简便，既能够保障细胞保存和运输过程中的安全、稳定和高效性，同时还能够较大程度地保留细胞的活性。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。

本发明的实施例一为：一种细胞冻存运输液的配制，包括以下步骤：

一、配制前溶液准备：

1、PLL-COOH的配制：将25％(w/w)的PLL水溶液和65％摩尔比的琥珀酐水溶液混合在50℃条件下反应1h，得到PLL-COOH(0.65)。

ε-多聚L-赖氨酸(ε-poly-L-lysine，PLL)是一种由单一赖氨酸α-羧基和ε-氨基通过酰胺键链接而成聚氨基酸。具有天然无毒，水溶性好，热稳定性强，抑菌等特点。KazuakiMatsumura等人于2009年通过研究发现将25％的PLL与不同比例的琥珀酐(Succinicanhydride，SA)在50℃进行反应，使PLL氨基转化为羧基，形成具有抗冻蛋白(antifreezeproteins，AFPs)相似特性的PLL-COOH。

2、复方氨基酸溶液的配制：称取异亮氨酸8.8g、亮氨酸13.6g、赖氨酸醋酸盐10.6g、甲硫氨酸1.2g、苯丙氨酸1.6g、苏氨酸4.6g、色氨酸1.5g、L-缬氨酸(C₅H₁₁NO₂)10.6g、精氨酸8.8g、组氨酸4.7g、甘氨酸6.3g、丙氨酸8.3g、脯氨酸7.1g、门冬酰胺0.55g、门冬氨酸2.5g、N-乙酰-L-半胱氨酸0.8g、谷氨酸5.7g、盐酸鸟氨酸1.66g、丝氨酸3.7g、N-乙酰-L-络氨酸0.86g，用蒸馏水溶解后定容至1L。

3、平衡缓冲液的配制：向超纯水中依次加入NaCl 100mmol、KCl 10mmol、MgCl₂13mmol、CaCl₂ 0.25mmol，溶解完全后以此加入甘露糖醇15mmol、维生素C1mmol、谷胱甘肽3mmol、N-乙酰-L-半胱氨酸5mmol、叔丁基对苯二酚5μmol、组氨酸24.5mmol、谷氨酸16.3mmol、α-酮戊二酸1mmol、腺苷5mmol，人血清白蛋白15g，完全溶解。然后用10mol/L的NaOH水溶液调整上述反应液的pH至7.0～7.6；用超纯水定容至1L。

二、细胞冻存运输液的配制：

冻存运输液1(w/w)：PLL-COOH(0.65)溶液3％、海藻糖3％、葡萄糖1％、复方氨基酸溶液0.005％、人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液61％、余量为蒸馏水；

冻存运输液2(w/w)：PLL-COOH(0.65)溶液7.5％、海藻糖3％、葡萄糖1％、复方氨基酸溶液0.005％、人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液61％、余量为蒸馏水；

冻存运输液3(w/w)：PLL-COOH(0.65)溶液15％、海藻糖3％、葡萄糖1％、复方氨基酸溶液0.005％、人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液61％、余量为蒸馏水；

冻存运输液4(w/w)：PLL-COOH(0.65)溶液7.5％、海藻糖5％、葡萄糖1％、复方氨基酸溶液0.005％、人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液61％、余量为蒸馏水；

冻存运输液5：PLL-COOH(0.65)溶液7.5％、海藻糖5％、葡萄糖1％、复方氨基酸溶液0.01％、人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液61％、余量为蒸馏水；

冻存运输液6：PLL-COOH(0.65)溶液7.5％、海藻糖5％、葡萄糖1％、复方氨基酸溶液0.02％、人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液61％、余量为蒸馏水；

冻存运输液7(w/w)：PLL-COOH(0.65)溶液7.5％、海藻糖9％、葡萄糖1％、复方氨基酸溶液0.02％、人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液61％、余量为蒸馏水；

三、对照液的配制：

对照液1(参照专利CN 109221082A)：PLL 114mg/mL、甘油0.05％(v/v)、葡萄糖0.02mmol/ml、平衡缓冲液70％；

对照液2(传统冻存液)：FBS 15％，DMSO 10％，基础培养基75％；

对照液3(直接购得)：Cellmate^TM 1702。

本发明的实施例二为：细胞的培养和冻存实验，具体操作如下：

一、细胞的培养：

购买2种肿瘤细胞(人骨髓瘤细胞(MG63)和人子宫颈癌细胞(HeLa))、2种干细胞(人脐带间充质干细胞(Human Umbilical Mesenchymal Stem Cells，HUMSC)和大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSC，Bone Mesenchymal Stem Cells))以及2种上皮类细胞(人视网膜上皮细胞(ARPE-19)和人肾皮质/近曲小管细胞(HK2))，其中，HeLa、ARPE-19和HK2用DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养基，MG63用MEM培养基，HUMSC和BMSC用DMEM-F12培养基，补充10％FBS，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

二、细胞冻存和运输实验：

当细胞峰度达到90％时，用1％的胰酶进行消化，1000转离心10min收集细胞。按照5×10⁶个/ml的细胞密度，加入上述组分比例不同的冻存运输液，重悬、吹散沉淀的细胞，分装入细胞冻存管中进行冻存。冻存14天后，一部分细胞直接取出进行细胞存活率检测，一部份置于(10±2)℃放置，3天，6天，分别测定放置不同天数的细胞活性。

三、细胞存活率检测实验：

1、台盼蓝染色法进行检测：首先取200μl细胞悬液加入等量的新鲜配制的0.1％台盼蓝溶液，室温下染3min；再取一滴细胞悬液置玻片上，加盖玻片后放高倍镜下观察；死亡的细胞着浅蓝色并膨大，无光泽。活细胞不着色并保持正常形态，有光泽；计数1000个细胞中的活细胞和死细胞数目；统计未染色细胞。可按公式计算出细胞活率：

细胞活率(％)＝未染色的细胞数/观察的细胞总数×100。

2、统计实验结果：

1)取1ml上续10种不同冻存运输液，冻存上续6种细胞，经过-80℃冰箱冻存1天，后转置液氮罐中，14天后取出，37℃解冻后(时间为5min)进行细胞存活率检测得到以下结果如下表1所示：

表1

从上表1中可以看出，冻存运输液5和6的效果最佳，与对照液1和2传统的冻存液相比没有显著差异。表明本方案的冻存运输液在细胞冻存效果上与现有技术使用的冻存液相当。此外，上述冻存操作，同样可以使用按常规操作流程依次经4℃、-20℃、-80℃直至液氮罐或程序降温仪的逐级降温冻存。本方案的细胞冻存液即使不使用逐级降温依旧不影响其效果，因此在操作上更具有便捷性。

2)10℃放置3天后的细胞存活率结果如下表2所示：

表2

从表2中可以看出，将细胞从液氮中取出后，在10℃下放置3天后，冻存运输液5和6显著好于其他组。

3、10℃放置6天后的细胞存活率结果如下表3所示：

表3

从表3中可以看出，将细胞从液氮中取出后，在10℃下放置6天后，冻存运输液5在不同的细胞类型中都显示>85％的细胞存活率，显著高于其他类别(尤其是现有技术中的常用冻存液)，由此表明，本发明方案的细胞冻存运输液在细胞运输过程中具有良好的应用前景。细胞冻存运输液1至7主要对比了复方氨基酸、PLL-COOH和海藻糖在组分中的比例变化对细胞冻存和运输效果的影响，复方氨基酸0.005～0.02％，PLL-COOH 5～15％，海藻糖3～9％，对比显示当上述三种组分比例为复方氨基酸0.01％、PLL-COOH 7.5％和海藻糖5％时有最佳的细胞冻存和运输效果，如实施例3中细胞存活率检测结果，细胞冻存运输液5结果最佳。由此可见，最优的组分配比为：PLL-COOH 7.5％、海藻糖5％、葡萄糖1％、复方氨基酸0.01％、人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液61％、余量为蒸馏水。

在实施例2中，细胞冻存运输液的效果测定在作为运输液的效果测定过程中，事实上模拟的是一个先冻存后运输的在实际应用过程中常见的情形，在这个过程中，不管是前期的冻存还是后期冻存后运输，都能够在这个过程中长时间地保持细胞活力。与常规的冻存液或者运输液相比较，本方案中的细胞冻存运输液能够兼具两种作用，在使用过程中更为便捷高效。同时，容易理解的是，该细胞冻存运输液也可以直接用在细胞运输过程中。

上述实施例中，ε-多聚L-赖氨酸(ε-poly-L-lysine，PLL)是一种由单一赖氨酸α-羧基和ε-氨基通过酰胺键链接而成聚氨基酸。具有天然无毒，水溶性好，热稳定性强，抑菌等特点。海藻糖是由两个葡萄糖分子以α，α，1，1-糖苷键构成非还原性糖，自身性质非常稳定，能够在细胞表面形成保护膜，有效地保护蛋白质分子不变形，并维持生命体的生命过程和生物特征。在本发明实施例方案的组分配方中，以PLL和海藻糖替代DMSO和牛血清，成分明确，毒性较低，更安全稳定。同时，通过其他成分的添加剂配比调和，使得该试剂同时满足了细胞冻存液和运输液的双重功能，在实际操作过程中更为经济实用。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种细胞冻存运输液，其特征在于，所述细胞冻存运输液中含有以下组分：PLL-COOH、海藻糖、葡萄糖、人血白蛋白、复方氨基酸和氯化钠，其中，所述复方氨基酸中的组分包括：异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸醋酸盐、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、L-缬氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、门冬酰胺、门冬氨酸、N-乙酰-L-半胱氨酸、谷氨酸、盐酸鸟氨酸、丝氨酸和N-乙酰-L-络氨酸。

2.如权利要求1所述的一种细胞冻存运输液，其特征在于，所述复方氨基酸是以复方氨基酸溶液的形式添加到所述细胞冻存运输液中的，每升所述复方氨基酸溶液中含有异亮氨酸8.8g、亮氨酸13.6g、赖氨酸醋酸盐10.6g、甲硫氨酸1.2g、苯丙氨酸1.6g、苏氨酸4.6g、色氨酸1.5g、L-缬氨酸10.6g、精氨酸8.8g、组氨酸4.7g、甘氨酸6.3g、丙氨酸8.3g、脯氨酸7.1g、门冬酰胺0.55g、门冬氨酸2.5g、N-乙酰-L-半胱氨酸0.8g、谷氨酸5.7g、盐酸鸟氨酸1.66g、丝氨酸3.7g和N-乙酰-L-络氨酸0.86g。

3.如权利要求1所述的一种细胞冻存运输液，其特征在于，所述细胞冻存运输液由以下质量百分数计的组分组成：1～15％PLL-COOH溶液、3～9％海藻糖、0.5～2.5％葡萄糖、15～35％人血白蛋白、0.005～0.02％复方氨基酸溶液、55～70％的0.9％氯化钠注射液，余量为水，所有组分的质量百分数之和为100％。

4.如权利要求3所述的一种细胞冻存运输液，其特征在于，所述细胞冻存运输液由以下质量百分数计的组分组成：PLL-COOH(0.65)7.5％、海藻糖5％、葡萄糖1％、复方氨基酸0.01％、人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液61％、余量为蒸馏水。

5.如权利要求3所述的一种细胞冻存运输液，其特征在于，所述PLL-COOH溶液的配制方法为：将质量百分数为25％的PLL水溶液和65％摩尔比的琥珀酐水溶液混合在50℃条件下反应1h即得。

6.一种细胞冻存和/或运输的方法，其特征在于，将细胞与如权利要求1至5中任一项所述的细胞冻存运输液混合后，进行冻存和/或运输操作。

7.根据权利要求6所述的一种细胞冻存和/或运输的方法，其特征在于，所述细胞冻存操作包括以下步骤：

S1、将细胞和所述细胞冻存运输液混合，制成细胞悬液；

S2、将上述步骤S1制得的细胞悬液进行冻存。

8.根据权利要求6所述的一种细胞冻存和/或运输的方法，其特征在于，所述运输操作包括以下步骤：将含有细胞和所述细胞冻存运输液的细胞悬液置于(10±2)℃环境运输。

9.根据权利要求7或8所述的一种细胞冻存和/或运输的方法，其特征在于，所述细胞悬液中细胞的浓度为(1～100)*10⁶个/mL；优选为5*10⁶个/mL。

10.根据权利要求7或8所述的一种细胞冻存和/或运输的方法，其特征在于，所述细胞包括Hela细胞、MG63细胞、ARPE-19细胞、HK2细胞、HUMSC细胞或BMSC细胞中的至少一种。